JP6632822B2 - 造血幹細胞の生着手順を強化するための材料および方法 - Google Patents

Description

優先権主張
本出願は、２００８年１１月６日提出の米国仮特許出願第６１／１１２，０１８号の利
益を主張し、これは参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。

政府の権利に関する記述
本発明の開発の一部は、助成金番号ＨＬ０６９６６９、ＨＬ０７９６５４およびＤＫ０
７５１９の下にＮＩＨから政府の援助を受けてなされたものである。米国政府は本発明に
一定の権利を有する。

本発明の分野
本明細書に開示の態様および実施形態は、造血幹細胞および前駆細胞の生着を強化する
ための材料および方法に関する。

造血幹細胞および前駆細胞（hematopoietic stem and progenitor cell, ＨＳＰＣ）の
移植は特定の悪性および非悪性の血液疾患および代謝障害の治療のための確立された療法
である。移植用ＨＳＰＣの供給源は、骨髄、動員された末梢血および臍帯血（ＵＣＢ）を
含む（ＧｏｌｄｍａｎおよびＨｏｒｏｗｉｔｚ、２００２年；ＦｒｕｅｈａｕｆおよびＳ
ｅｇｇａｗｉｓｓ、２００３年：Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒら、２００６年）。医師は、骨髄、
動員された末梢血幹細胞および臍帯血の移植を日常的に実施している。これらの手順は、
健康で正常なドナーから、または所与の病態を発症する前もしくは緩解にある間の患者か
ら採取された十分な数の造血幹および前駆細胞を必要とする。採取した材料は、後に、造
血系およびおそらくその疾患または奇形の組織および細胞が根絶された患者に投与される
。移植後、移植された幹細胞は、適切な骨髄微小環境ニッチへ移行または「ホーミング」
し、このようなニッチ内へ定着し、新しい幹細胞を増殖および産生し、このプロセスは自
己再生と呼ばれる（Ｐｏｒｅｃｈａら、２００６年；Ｂｒｏｘｍｅｙｅｒ、２００６年；
Ｈａｌｌら、２００６年）。これらの細胞は、系統が制限された前駆細胞および成熟細胞
に分化もし、そうして、レシピエントの健康にとって必要な造血系を形成する血液を復元
する。前駆細胞は、普通、移植された材料の中に存在し、成熟細胞を産生するためにこれ
らの生着を必要とすると思われる。しかし、前駆細胞は幹細胞ではなく、自己再生できな
いので、それらは限られた期間だけしか移植療法に参加できない。

移植手順は移植された材料にストレスをかけるので、移植の成功には手順の間に死亡す
るまたは損傷する細胞を計上した十分な細胞が移植されることを必要とする。このことは
、臍帯血の移植体は非常に限られた数の幹細胞しか含まないので、臍帯血移植体の移植に
大きな問題を提示する。この理由から、普通は臍帯血移植体を使用して成人移植を成功さ
せることはできない。同様に、患者および正常なドナーの１０〜２５％は、移植手順にお
ける使用のための十分な細胞を動員することができない。患者集団の一部において、特に
いくつかの化学療法薬を用いて処置された患者集団において、動員の失敗は患者の５０％
以上において見られる。一般に、移植できる細胞が多いほど、移植が成功する可能性は大
きくなり、例えば、最新の最も優れた実務では、末梢血幹細胞移植手順が、レシピエント
患者の体重１キログラムあたり最少でもおよそ２００万のＣＤ３４^＋細胞の投与を通常必
要とし、獲得でき、その後移植できるＣＤ３４^＋細胞が多いほど、患者の転帰はよくなる
と推奨している（Ｐｕｌｓｉｐｈｅｒ、２００９年）。

不十分な幹細胞数、適切な骨髄ニッチへの遊走／ホーミングできないこと、または造血
幹細胞および前駆細胞の生着効率および自己再生が弱いことにより、再構築（repopulati
on）の多段階プロセスにより測定した移植結果に悪影響を与える可能性がある。単離され
た移植体内のヒト造血幹細胞および前駆細胞の数をｅｘ ｖｉｖｏ設定で試み増加させよ
うとする多くの取組みがなされてきたが、成功は限定的である。ＨＳＰＣの移植効率を改
善する戦略が、医療専門家が直面する挑戦を克服するために必要である。本明細書に開示
する、本発明のいくつかの態様および実施形態は、この必要性に対処する。

本開示のいくつかの態様は、造血幹細胞および前駆細胞の採取および／または生着の強
化を対象とし、これらの態様のいくつかは、限定するものではないが、造血幹細胞および
前駆細胞療法の成功率を増加させるための、ｅｘ ｖｉｖｏの生存、自己再生および適切
な骨髄ニッチへのホーミングを含む。

本開示のいくつかの態様は、ドナーから採取した、長期再構築能力を有する造血幹細胞
および前駆細胞の数の増加を対象とする方法を含む。これらの方法のいくつかは、プロス
タグランジン、例えばプロスタグランジンＥの生合成を阻害する化合物またはプロスタグ
ランジン応答に関与する少なくとも１種のプロスタグランジン受容体と拮抗する化合物を
特定するステップ、ならびにドナーの末梢血または骨髄から造血幹細胞および前駆細胞を
採取する前に、医薬有効量のこの化合物（複数可）をドナーに提供するステップを含む。
一実施形態において、プロスタグランジンＥ生合成阻害剤および／またはプロスタグラン
ジンＥの受容体アンタゴニストの適用は、１種または複数種の、臨床的に承認された造血
幹細胞および前駆細胞の動員剤、例えば、顆粒球−コロニー刺激因子（Ｇ−ＣＳＦ）と組
み合わせ、造血移植体移植のためのアフェレーシスにより回収され得る造血幹細胞および
前駆細胞の数を増加させる。一実施形態において、この化合物は、例えば、インドメタシ
ン（２−｛１−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−５−メトキシ−２−メチル−１
Ｈ−インドール−３−イル｝酢酸）または医薬として許容可能なその塩を含むシクロオキ
シゲナーゼ阻害剤から選択される。さらに他の実施形態において、シクロオキシゲナーゼ
阻害剤は、アスピリン、イブプロフェン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、メロキシカム
、エトリコキシブ、バルデコキシブ、ナプロキセン、ジクロフェナク、リコフェロン、エ
トドラク、ケトロラクまたは医薬として許容可能なそれらの塩からなる群から選択される
。いくつかの実施形態において、シクロオキシゲナーゼ阻害剤はＣＯＸ−１およびＣＯＸ
−２の両方に対して作用し、多くの場合ＣＯＸ−２を好む。いくつかの実施形態において
、使用可能なさらに別の化合物はメロキシカムである。

本開示の他の態様は、レシピエントにおいて、採取した造血幹細胞および／または前駆
細胞の移植体の長期再構築能力を強化する方法を含む。これは、レシピエントが造血系に
障害を有する状況において特に有用であり得る。この方法は、ａ）プロスタグランジンＥ
_２の生合成を阻害する化合物および／またはプロスタグランジンＥ_２受容体のアンタゴニ
ストの有効量を用いてドナーを処置し、ドナーから移植体を採取するステップ、ｂ）移植
体と、有効量のプロスタグランジンＥ_２または１種もしくは複数種のその誘導体とを、ｅ
ｘ ｖｉｖｏにおいて接触させるステップ、およびｃ）処置された移植体をレシピエント
に適用するステップを含む。一実施形態において、この方法は、有効量のプロスタグラン
ジンＥ_２もしくはその誘導体の１種またはＰＧＥ_２活性を有する任意の分子を、移植体材
料のそれらの適切な治療的ニッチへのホーミングを強化するために、移植レシピエントに
対して供給するステップをさらに含む。

本開示の他の態様は、幹細胞においてウィルス導入（viral transduction）効率を強化
する方法を含む。これらの方法のいくつかは、形質導入（transduction）のための少なく
とも１種の対象遺伝子を含有するウィルスベクターを提供するステップ、有効量のプロス
タグランジンＥ_２またはその誘導体によってｅｘ ｖｉｖｏにおいて処置された少なくと
も１種の幹細胞を提供するステップ、およびウィルスベクターを、ＰＧＥ_２またはその誘
導体によって処置された幹細胞にトランスフェクションするステップを含み得る。

いくつかの実施形態は、造血幹細胞および／または前駆細胞の供給源を特定するステッ
プ、ＰＧＥ_２の生合成および／または活性を減少させる化合物を提供するステップ、なら
びに造血幹細胞および／または前駆細胞の供給源と、該細胞のＰＧＥ_２の生合成および／
または活性を減少させる有効量の前記化合物とを接触させるステップを含む、造血幹細胞
および／または前駆細胞の動員を強化する方法を含む。いくつかの実施形態において、Ｐ
ＧＥ_２活性を減少させる化合物は、非ステロイド系抗炎症性化合物であり、この非ステロ
イド系抗炎症性化合物はシクロオキシゲナーゼ−１およびシクロオキシゲナーゼ−２の両
方に対して作用する。いくつかの実施形態において、この非ステロイド系抗炎症性化合物
は、主にシクロオキシゲナーゼ−２に対して作用する。いくつかの実施形態において、非
ステロイド系抗炎症性化合物は、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコ
キシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、エトドラク
、ケトロラクおよびリコフェロンからなる群から選択される。さらに他の実施形態におい
て、非ステロイド系抗炎症性化合物はインドメタシンであり、さらに他の実施形態におい
て、非ステロイド系抗炎症性化合物はメロキシカムである。

いくつかの実施形態において、非ステロイド系抗炎症性化合物は、造血幹細胞および前
駆細胞の動員を強化する少なくとも１種の追加の化合物との同時処置で、オーバーラップ
した期間患者に投与される。いくつかの実施形態において、造血幹細胞および前駆細胞の
動員を強化する化合物は、Ｇ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルからなる群から選択される
。いくつかの実施形態において、非ステロイド系抗炎症性化合物は、少なくとも３日間患
者に投与される。

さらに他の実施形態は、少なくとも１種のＰＧＥ_２受容体のアンタゴニストである化合
物を提供するステップ、ならびにドナーから造血幹細胞または前駆細胞を採取する前に、
有効量の前記化合物を造血幹細胞または前駆細胞ドナーに投与するステップを含む、ドナ
ー由来の造血幹細胞および／または前駆細胞の動員を強化する方法を含む。いくつかの実
施形態において、少なくとも１種のＰＧＥ_２受容体のアンタゴニストは、Ｎ−［［４’−
［［３−ブチル−１，５−ジヒドロ−５−オキソ−１−［２−（トリフルオロメチル）フ
ェニル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル］メチル］［１，１’−ビフェニ
ル］−２−イル］スルホニル］−３−メチル−２−チオフェンカルボキシアミド（Ｌ−１
６１，９８２）および４−（４，９−ジエトキシ−１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ
−ベンズ［ｆ］イソインドール−２−イル）−Ｎ−（フェニルスルホニル）−ベンゼンア
セトアミド（ＧＷ６２７３６８Ｘ）からなる群から選択される。

さらに別の実施形態は、供給源においてＰＧＥ_２の生合成および／または活性を減少さ
せる少なくとも１種の化合物を用いて処置された、当該供給源由来の造血幹細胞および前
駆細胞を含む細胞の群を採取するステップ、造血幹細胞のセットと、ＰＧＥ_２活性を有す
る化合物とをｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させるステップ、およびｅｘ ｖｉｖｏにおい
てＰＧＥ_２活性を増加させる前記化合物と接触させた、前記造血幹細胞および前駆細胞を
レシピエント内に移植するステップを含む、レシピエントにおいて造血幹細胞および／ま
たは前駆細胞を生着させることを含む。いくつかの実施形態において、造血幹細胞は、骨
髄ドナーから取り出される。一方、さらに他の実施形態において、造血幹細胞は血液ドナ
ーから取り出された血液試料から採取される。そして、さらに他の実施形態において、細
胞は、臍帯または胎盤から取り出される。

いくつかの実施形態は、ＰＧＥ_２活性を有する化合物を提供するステップ、ならびにＰ
ＧＥ_２活性を有する化合物と、造血幹細胞および／または前駆細胞の集団をｅｘ ｖｉｖ
ｏで接触させるステップを含む、造血幹細胞および／または前駆細胞の生着率を増加させ
る方法を含む。いくつかの実施形態において、ＰＧＥ_２活性を有する化合物は、任意のＥ
シリーズのプロスタグランジンまたはＥシリーズのプロスタグランジンの任意の誘導体、
例えばＰＧＥ_１、ＰＧＥ_２、ＰＧＥ_３または例えばジメチル１６，１６−ジメチルＰＧＥ
_２を含む、ＰＧＥ_１、ＰＧＥ_２、ＰＧＥ_３のジメチル誘導体などからなる群から選択され
る。いくつかの実施形態において、ＰＧＥ_２活性を有する化合物は、造血幹細胞および／
または前駆細胞集団と少なくとも１時間接触する。いくつかの実施形態は、ＰＧＥ_２活性
を有する化合物と接触させた造血幹細胞および／または前駆細胞を、実質的にＰＧＥ_２活
性を有さない緩衝液を用いて、少なくとも１回洗浄するステップを含む。一方、さらに他
の実施形態は、ＰＧＥ_２活性を有する化合物と接触させた造血幹細胞および／または前駆
細胞を、患者内に導入するステップをさらに含む。

本発明のこれらおよび他の特徴、態様および有利性は、以下の限定されない図面、説明
および特許請求の範囲を参照してさらによく理解され得る。

造血幹細胞の生着を強化するＰＧＥ_２の効果を試験するための実験の概要（上段パネル）；ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２細胞の集団を例示する代表的なフロープロット（下段パネル）を示す図である。 陰性細胞のパーセント対移植細胞の数のグラフ（上段パネル）；キメラ現象のパーセント対競合率の散布図（下段左パネル）；ならびに様々な条件下で測定したＣＲＵ／１００Ｋ細胞の棒グラフ（下段右パネル）である。 ｄｍＰＧＥ_２を用いて処置した細胞、および処置しなかった細胞に関する２０週にわたってプロットした、細胞の再構築頻度を要約する表である。 多系統の再構築の代表的ＦＡＣＳプロット（骨髄、Ｂリンパ球およびＴリンパ球、上段左パネル）。数／ＣＤ３プロット（上段右パネル）。一次レシピエントにおいて３２週目に測定した合計ＷＢＣ（中段左パネル）および二次レシピエントにおいて１２週目に測定した合計ＷＢＣ（中段右パネル）のパーセントの棒グラフ。一次レシピエントにおいて２０週目に測定したキメラ現象のパーセントのプロットおよび二次レシピエントにおいて１２週目に測定したキメラ現象のパーセントのプロット（下段パネル）である。 Ｌｉｎ^ｎｅｇゲーティングされた細胞のｃ−ｋｉｔ^＋およびＳｃａ−１^＋ゲーティングを示す、ＭＡＣＳマイクロビーズにより枯渇させたＬｉｎ^ｎｅｇ骨髄の代表的ＦＡＣＳゲーティング（左パネル）。様々なＥＰ受容体に関してプロットしたカウント（中央パネル）および様々な受容体に関してプロットしたｍＲＮＡ対周期数の変化（右パネル）を示す図である。 ＳＳＣ対ＣＤ３４の代表的ＦＡＣＳ（左パネル）；様々なＥＰ受容体に関してプロットしたカウント（中央パネル）、および様々な受容体に関するサイクル数に対してプロットしたｍＲＮＡの変化（右パネル）を示す図である。 実験の概要（上段）；様々な処置に関してプロットしたＣＦＳＥ^＋の％（下のパネル）を示す図である。 実験のプロトコルを例示する略図であり；ホーミング効率のパーセント（下左パネル）ならびに１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ_２（ｄｍＰＧＥ_２）および様々な対照に曝露後に測定した倍数変化（下右パネル）を示す図である。 実験の概要（左パネル）；様々な処置に関するＣＤ４５．２対ＣＤ４５．１のＦＡＣＳプロット（中央パネル）；様々な処置に関してプロットしたホーミング効率のパーセント（右パネル）を示す図である。 灰色で示したＣＸＣＲ４受容体発現のアイソタイプ対照の代表的フロープロット（上段）；ＣＸＣＲ４の発現に関して、マウスおよびヒトのＨＳＰＣをＰＧＥ_２にパルス曝露した結果を示す、ＣＸＣＲ４の変化が様々な条件に関してプロットされた棒グラフである（下段）。 様々な処置に関するホーミング効率のパーセントの棒グラフである。 ｄｍＰＧＥ_２濃度の関数としてプロットしたアネキシンＶ＋ＳＫＬのパーセントを示す図である。 様々な条件に関してプロットした、サバイビンにおける倍数増加を示す図である。 ｄｍＰＧＥ_２に対する様々な時間の曝露に関してプロットした、対照の活性に対して正規化した変化のパーセントを示す図である。 ゲーティングされたＳＫＬ細胞のＤＮＡ含有量（７ＡＡＤ染色）、Ｓ＋Ｇ_２Ｍ期におけるＳＫＬのパーセントおよびｄｍＰＧＥ_２により処置されたＳＫＬの循環における倍数増加を示す代表的フロープロット（左のパネル）；３つの実験によるデータを組み合わせて示すチャート（右のパネル）である。 実験の概略図および様々な処置を施して測定した、Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期のホーミングしたＳＫＬ細胞における倍数増加をプロットした棒グラフである。漫画は、実験プロトコルを示し（左パネル）、棒グラフはｄｍＰＧＥ_２を用いて、または用いずに測定した、Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期の倍数増加を示す。 様々な処置後に測定したＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍＬをプロットした棒グラフである。 様々な処置後に測定したＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍＬをプロットした棒グラフである。 ＰＧＥ_２が、ＳＬＡＭ ＳＫＬの循環をもたらすことを例示するデータを要約した表である。 対照およびｄｍＰＧＥ_２処置細胞の遊走対ＳＤＦ−１濃度のグラフである。 ＣＤ３４^＋細胞の遊走パーセント対ＳＤＦ−１濃度および／または商品名Ｍｏｚｏｂｉｌ（登録商標）で市販されているＡＭＤ３１００（１，１’−［１，４−フェニレンビス（メチレン）］ビス［１，４，８，１１−テトラアザシクロテトラデカン］オクト臭化水素酸二水和物）のグラフである。 ＳＫＬ細胞のホーミング効率のパーセント対ｄｍＰＧＥ_２および／またはＡＭＤ３１００を用いた処置および様々な対照の棒グラフである。 ｄｍＰＧＥ_２を用いて、または用いずに測定した、ＳＫＬ循環における倍数変化を例示する、ＦＡＣＳプロット（左パネル）；および棒グラフ（右パネル）である。 実験プロトコルの概略図（左パネル）；ｄｍＰＧＥ_２を加えて、および加えずに測定した、Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期における増加を示す棒グラフである。 ｄｍＰＧＥ_２（四角）または対照（ビヒクル、ひし形）に初期曝露後、連続移植において継時的に測定したキメラ現象のパーセントを示すグラフである。 ビヒクル（明るい灰色）、インドメタシン（暗い灰色）またはバイカレイン（灰色）を用いて測定したＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍｌの棒グラフ（左パネル）；Ｇ−ＣＳＦ（明るい灰色）；Ｇ−ＣＳＦ＋インドメタシン（灰色のハッチング）またはＧ−ＣＳＦ＋バイカレイン（灰色）を用いて収集したデータのグラフである。 Ｇ−ＣＳＦおよびＧ−ＣＳＦ＋インドメタシンを用いて測定した、Ｇ−ＣＳＦに対するＣＦＵ／血液ｍｌの倍数増加の棒グラフである。 Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシンのどちらかを用いて処置した後に測定した、ＳＫＬ細胞（左側）またはＳＬＡＭ ＳＫＬ細胞（右側）のどちらかの動員細胞の表現型分析の棒グラフである。 ビヒクルもしくはインドメタシン（左パネル）；またはＡＭＤ３１００もしくはＡＭＤ３１００＋インドメタシン（右パネル）のどちらかを用いてプロットしたＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍｌの棒グラフである。 ビヒクル、インドメタシン、ＡＭＤ３１００；Ｇ−ＣＳＦ；ＡＭＤ３１００＋ＧＲＯベータ；ＡＭＤ３１００＋インドメタシンまたはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシンを用いて処置した後に測定し、プロットした、ＣＦＵ−ＧＭ／末梢血ｍｌの棒グラフである。 ビヒクル（白抜き）、Ｇ−ＣＳＦ（黒）、Ｇ−ＣＳＦ＋メロキシカム（（８Ｅ）−８−［ヒドロキシ−［（５−メチル−１，３−チアゾール−２−イル）アミノ］メチリデン］−９−メチル−１０，１０−ジオキソ−１０λ^６−チア−９−アザビシクロ［４．４．０］デカ−１，３，５−トリエン−７−オン）（明るい灰色）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（灰色）を用いて処置した後のＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍｌの棒グラフである。 Ｇ−ＣＳＦ（明るい灰色）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（灰色）のどちらかを用いて測定した競合再構築単位の棒グラフ（左パネル）；およびビヒクル、Ｇ−ＣＳＦ；時間差無し（no Stagger）、１日の時間差、または２日の時間差で測定した、ＳＫＬ細胞に関するＭＦＩＣＸＣＲ４の棒グラフ（右パネル）である。 Ｇ−ＣＳＦ（ひし形）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（四角）のどちらかを用いて測定したキメラ現象のパーセント対ＰＢＭＣ：ＢＭ比のグラフ（左パネル）；Ｇ−ＣＳＦ（明るい灰色）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（灰色）のどちらかを用いて測定した２００万ＰＢＭＣに対して調整したＣＲＵを示すグラフである。 ＰＭＮ対Ｇ−ＣＳＦ（ひし形）またはＧ−ＣＳＦ＋Ｍｅｔａｃａｍ（メロキシカム）（四角）によって動員されたＰＢＭＣの移植後の日数のグラフである。 ＰＬＴ対Ｇ−ＣＳＦ（ひし形）またはＧ−ＣＳＦ＋Ｍｅｔａｃａｍ（メロキシカム）（四角）によって動員されたＰＢＭＣの移植後の日数のグラフである。 Ｇ−ＣＳＦ単独またはＧ−ＣＳＦ＋メロキシカムのどちらかを用いてヒヒを処置することの効果を試験するために設計された実験を要約した漫画である。 Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ＋メロキシカムのどちらかを用いて処置された４匹の異なるヒヒから採取したＣＤ３４^＋細胞（左側）またはＣＦＵ−ＧＭ（右側）／血液ｍＬのプロットである。 ＣＯＸ−１またはＣＯＸ−２のどちらかに関するそれらの選択性の点で異なる、様々な化合物を使用して試験したＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍＬの棒グラフである。 Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ＋様々な量のアスピリンもしくはイブプロフェンのどちらかを用いて処置後試験した、Ｇ−ＣＳＦに対するＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍＬの倍数変化の棒グラフである。 Ｇ−ＣＳＦまたは様々なレベルのメロキシカムのどちらかを用いて処置後の末梢血において測定したＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍＬの棒グラフである。 Ｇ−ＣＳＦまたは様々なレベルのメロキシカムのどちらかを用いて処置後の骨髄において測定したＣＦＵ−ＧＭ／大腿骨の棒グラフである。

新規な技術の原理の理解を促進する目的の為に、それらの好ましい実施形態をここに参
照するものでありそれらを説明するために特化された言語を使用する。それにもかかわら
ず、新規な技術の範囲は、その結果限定されないものとして意図され、新規な技術の原理
のこのような変更、改良およびさらなる応用は、新規な技術が関連する分野の技術者が通
常思いつくものとして企図されると理解されるものである。

プロスタグランジンＥ_２（ＰＧＥ_２）は、潤沢な生理学的エイコサノイドであり、がん
、炎症および他の多数の生理学系の公知のメディエーターである。造血におけるＰＧＥ_２
の役割は、様々な研究チームにより探求されているが、結果の調整は困難である。例えば
、ｉｎ ｖｉｔｒｏおよびｉｎ ｖｉｖｏの研究により、ＰＧＥ_２は骨髄造血を負に制御
できること、すなわちＰＧＥ_２は、ＢＦＵ−ＥおよびＣＦＵ−ＧＥＭＭのコロニー形成を
促進し、ＣＦＵ−ＳおよびＣＦＵ−ＧＭの増殖を強化することが実証されている。他方、
ＰＧＥ_２は、ＨＳＰＣを刺激でき、造血に関して二相効果を有する。すなわち短期ｅｘ
ｖｉｖｏにおいて、骨髄細胞のＰＧＥ_２処置は、休止細胞、おそらく幹細胞またはより未
発達な前駆細胞の集団から循環ヒトＣＦＵ−ＧＭの産生を刺激することが示された。さら
に近年、１６，１６−ジメチルＰＧＥ_２に対するｅｘ ｖｉｖｏの曝露が、マウス骨髄細
胞の再構築能力およびゼブラフィッシュの腎臓における髄の回復を増加させることが示さ
れた（Ｎｏｒｔｈら、２００７年）。これらの研究は、造血の制御におけるＰＧＥ_２に関
係するが、ＰＧＥ_２と造血幹細胞のホーミングとを関連付けることはできない。むしろ、
先の研究は、ＰＧＥ_２がＨＳＰＣの分化の調節に関与し、ＰＧＥ_２は細胞のホーミングに
関して直接効果を有さないことを示す傾向がある。

本明細書において実証されるように、ＰＧＥ_２は、ＨＳＰＣの長期再構築に関して直接
の安定化効果を有し、自己再生ＨＳＰＣの生存、ホーミングおよび増殖を強化することに
よって、生着を容易にする。

本明細書に開示した一態様は、造血幹細胞および前駆細胞の末梢血系における循環の頻
度を増加するシクロオキシゲナーゼの活性の阻害である。限定されない一実施例において
、造血ドナーが一用量の動員剤を投与される１日前および毎日、造血ドナーに経口経路ま
たは全身経路によってシクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えば、５０マイクログラムのイン
ドメタシンを毎日投与することは、末梢において幹細胞および前駆細胞の動員を強化する
。シクロオキシゲナーゼ阻害剤、例えばインドメタシンと、臨床的に承認された動員剤、
例えばＧ−ＣＳＦとの同時使用は、前駆細胞の動員に対して相乗効果を生み出す。

造血幹細胞および前駆細胞の動員は、ドナーに有効量のプロスタグランジンＥ受容体ア
ンタゴニストを提供することによっても達成できる。

開示したいくつかの態様は、ＰＧＥ_２に対するｅｘ ｖｉｖｏの曝露は移植後のＨＳＰ
Ｃ頻度を強化し、ＰＧＥ_２処置ＨＳＰＣに競合的有利性を提供することを示す。骨髄幹細
胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいてＰＧＥ_２で処置することは、マウスにおいて生着する幹細胞
の合計を強化し、幹細胞の生存を強化し、幹細胞のホーミング効率を増加させ、幹細胞の
自己再生を増加させる。ｄｍＰＧＥ_２によって誘導されたＨＳＰＣの頻度の強化は、同じ
動物内の直接一対一分析において対照およびｄｍＰＧＥ_２処置細胞の生着を比較する、限
界希釈競合的移植モデルを使用することによって実証された。例えば、未処置造血移植体
または精製造血幹細胞集団（例えば、マウス中のＳＫＬ細胞またはヒト中のＣＤ３４^＋細
胞）と、真のＰＧＥ_２またはより安定な類似体の１６，１６−ジメチルＰＧＥ_２（または
任意のさらなる活性ＰＧＥ類似体）とを、１ｍｌの培養培地、例えば、ＩＭＤＭ中、１０
０万から１０００万細胞あたり０．００１〜１０マイクロモル濃度（Molar）のＰＧＥ_２
の濃度で、１〜６時間、氷上でインキュベートした。インキュベート後、細胞を滅菌生理
食塩水で３回洗浄し、レシピエントに静脈内投与した。この方法により、Ｐｏｉｓｓｏｎ
統計および競合的再構築単位（ＣＲＵ）の分析によるＨＳＰＣ頻度の計算に基づき、ＰＧ
Ｅ_２をパルスしたＨＳＰＣの約４倍の競合的有利性を実証した。頻度分析により、対照細
胞に対して１／４の数のＰＧＥ_２処置細胞を使用して同等の再構成が実証されている。加
えて、対照細胞またはＰＧＥ_２処置細胞のどちらかを使用する、二次移植レシピエントに
おいて、全造血再構成が観察され、ＨＳＰＣ自己再生についてＰＧＥ_２の悪影響はないこ
とが示された。実際、ＬＴＲＣ活性の増加傾向が見られ、段階移植の前に細胞または動物
にさらなる処置は実施していないので、一次移植において観察された、ＨＳＰＣに関する
短期ＰＧＥ_２曝露の強化効果が長続きすることが示された。ＰＧＥ_２処置細胞の生着の強
化は、２８週間にわたって安定であった。移植後９０日の、二次移植動物における分析に
より、完全な多系統の再構成が実証され、より高いＨＳＰＣ頻度が続き、長期再構築ＨＳ
ＰＣに関する短期ＰＧＥ_２処置の安定した効果が示された。

生着の強化は、ＨＳＰＣの頻度、ホーミング、生存および／または増殖の変化によりも
たらされ得る。ＰＧＥ_２は、ＨＳＰＣのホーミングに影響を与えないことが、Ｎｏｒｔｈ
らによって示唆されたが、彼らの研究は、ＨＳＰＣを明確に評価していなかった。本明細
書において実証されたように、予想外に、ＰＧＥ_２により誘導されたＨＳＰＣ頻度の強化
は、２０週間を超えて安定であり、二次移植において維持された。競合的移植モデルにお
ける直接比較は、ＨＳＰＣをＰＧＥ_２に対して短期曝露することにより、約４倍の競合的
有利性がもたらされることを示した。合計移植細胞は、対照とＰＧＥ_２処置細胞との間に
ホーミング効率の差はなかったが、ＰＧＥ_２処置され、分類されたＳＫＬ細胞のホーミン
グ効率の強化が観察され、ＰＧＥ_２が、ＨＳＰＣのホーミングに直接効果を有することが
強く示唆された。

これらの結果は、先行する研究により提唱された短期だけの効果より優れた、ＨＳＰＣ
またはＨＳＰＣの長期再構築能に対するＰＧＥ_２の効果を示唆する。

説明の目的で提示される、限定されない１つの可能性は、ＨＳＰＣの機能に対するＰＧ
Ｅ_２の効果がアルファケモカイン受容体のＣＸＣＲ４ケモカイン受容体の上方制御を介し
て仲介されると思われ、ＨＳＰＣのホーミングおよび自己再生ならびにＨＳＰＣの生存お
よび増殖を制御する、アポトーシス阻害剤タンパク質である、サバイビンに関与すること
である。

フローサイトメトリおよびＱＲＴ−ＰＣＲは、Ｓｃａ−１^＋、ｃ−ｋｉｔ^＋、Ｌｉｎｅ
ａｇｅ^ｎｅｇ（ＳＫＬ）マウス骨髄細胞および受容体サブタイプの発現において明白な差
のないＣＤ３４^＋ヒト臍帯血細胞（ＵＣＢ）において、４種のＰＧＥ_２受容体（ＥＰ１〜
ＥＰ４）すべての発現を示す。ＨＳＰＣ機能に関するいくつかの機能特性を分析した場合
、ＳＫＬ（２６．８％）およびＣＤ３４^＋ＵＣＢ（１７．３％）の両方におけるＣＸＣＲ
４の発現の有意な増加が、ＰＧＥ_２曝露後に見られ、曝露後６時間においてＣＸＣＲ４
ｍＲＮＡの有意な上方制御が見られた。ＣＸＣＲ４の増加は、ＰＧＥ_２処置移植体のｉｎ
ｖｉｖｏの骨髄ホーミング効率の約２倍の増加と完全に一致し、操作していない骨髄（
ｐ＜０．００１、３実験、ｎ＝６マウス／群／実験、個別にアッセイ）および同じ動物中
の１対１競合で精製ＳＫＬ細胞（ｐ＜０．００１、２実験、ｎ＝５マウス／群／実験、個
別にアッセイ）において観察され、ＨＳＰＣに関するＰＧＥ_２の直接効果を示唆した。ホ
ーミング効率の増加は、選択的ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００を用いて処置
することによって有意に減少した。

ＰＧＥ_２処置は、ＳＫＬ細胞のＣＸＣＲ４ ｍＲＮＡおよび表面発現を増加させた。加
えて、ＣＸＣＲ４アンタゴニストのＡＭＤ３１００は、ホーミングに対するＰＧＥ_２の効
果の強化を有意に減少させ、ＣＸＣＲ４発現の強化および骨髄ＳＤＦ−１に対する化学誘
引は、ホーミングの強化に大いに関与するが、接着分子の発現または機能に対するさらな
る効果は排除され得ないことを示唆している。

本明細書に開示した一態様は、レシピエントのＰＧＥ_２処置により、レシピエントに移
植された幹細胞の生存がｉｎ ｖｉｖｏで強化されることである。ＰＧＥ_２または活性類
似体のレシピエントに対する、移植時の非経口投与および幹細胞の強化のための毎日の投
与を続けることは、移植されたＨＳＰＣの生存を増加させ得る。例えば、ＰＧＥ_２または
その活性類似体は、０．０００１〜１０マイクロモル濃度で、造血移植体の供与直前およ
びその後毎日患者に投与できる。

ｉｎ ｖｉｔｒｏのＰＧＥ_２処置は、細胞周期において活性なＳＫＬ細胞の集団におい
て、処置後２４時間以内に増加をもたらす。加えて、ＢｒｄＵ処置レシピエントマウスに
おけるＰＧＥ_２処置細胞の移植は、ビヒクルだけをパルスした移植細胞と比較して、細胞
周期のＳ＋Ｇ_２／Ｍ期において約２倍を超えるドナーＳＫＬ細胞を示した。

サバイビンは、ＨＳＰＣが細胞周期に進入し、進行するために必要と考えられており、
コンディショナルノックアウトマウスにおけるサバイビンの欠損は、ＨＳＰＣの維持にサ
バイビンが必要であることを示す。本明細書に記載の研究は、ＰＧＥ_２処置ＳＫＬ細胞に
おいてｍＲＮＡおよびサバイビンのタンパク質レベルの上昇、同時に起こる、アポトーシ
スを仲介するプロテアーゼである、活性カスパーゼ−３の減少を見出した。生存アッセイ
は、ＰＧＥ_２が、ｉｎ ｖｉｔｒｏでＳＫＬ細胞のアポトーシスを用量依存的に減少させ
ること、同時に起こる、サバイビンのタンパク質発現の１．７倍の増加および活性カスパ
ーゼ−３の減少（２３〜５９％の減少；曝露後２４〜７２時間）を示した。

サバイビンにより仲介されたＨＳＰＣの生存の強化は、生着の強化に寄与する可能性が
高い。ＰＧＥ_２に対するパルス曝露は、細胞周期においてＨＳＰＣの割合を約２倍増加し
、ＢｒｄＵ^＋ＳＫＬ細胞のＨＳＰＣ頻度、ＣＲＵおよびホーミングを増加し、一次および
二次移植においてＨＳＰＣ頻度の強化を維持する。これらの結果の限定されない１つの説
明は、ＰＧＥ_２のパルス曝露が、ＨＳＰＣの自己再生の単一ラウンドを開始できることで
ある。例えば、ＥＰ２およびＥＰ４の受容体の活性化は、グリコーゲン合成キナーゼ−３
（ＧＳＫ−３）のリン酸化に関与し、β−カテニンのシグナル伝達を増加させ（Ｈｕｌｌ
ら、２００４年；Ｒｅｇａｎ、２００３年）、これはＷｎｔ経路の下流であり、ＨＳＰＣ
の生存および自己再生に関係している（Ｆｌｅｍｉｎｇら、２００８年；Ｋｈａｎおよび
Ｂｅｎｄａｌｌ、２００６年）。ＰＧＥ_２によるシグナル伝達は、おそらくＥＰ４を介す
るが、ＥＰ４が直接β−カテニンを増加させ得ることを排他的に限定するものではない。
ＣＯＸ−２およびＷｎｔ経路との間の相乗的クロストークが示唆されている（Ｗａｎｇら
、２００４年）。

サバイビンはさらに、ｐ２１^{ＷＡＦ１／ＣＤＫＮ１}を介してＨＳＰＣの細胞循環を促進
し（Ｆｕｋｕｄａら、２００４年）、ＨＳＰＣ機能に関与し（Ｃｈｅｎｇら、２０００年
）、カスパーゼ−３活性をブロックする（Ｌｉら、１９９８年；Ｔａｍｍら、１９９８年
）ことが公知である。近年、ｐ２１は、ＨＳＰＣの自己再生に関係する（Ｊａｎｚｅｎら
、２００８年）。本明細書に報告した研究から引き出された１つの発見は、ＰＧＥ_２がサ
バイビンを上方制御し、カスパーゼ−３を減少させることであり、サバイビン経路が、自
己再生の増加に関するＰＧＥ_２の効果に関係し得ることを示唆している。サバイビン（Ｐ
ｅｎｇら、２００６年）およびＣＸＣＲ４（Ｓｔａｌｌｅｒら、２００３年；Ｚａｇｚａ
ｇら、２００５年）の転写が、転写因子の低酸素誘導因子−１アルファ（ＨＩＦ−１アル
ファ）により上方制御され、低酸素誘導因子−１アルファは、ＰＧＥ_２によって安定化さ
れ得（Ｌｉｕら、２００２年；Ｐｉｃｃｏｌｉら、２００７年）、おそらくいくつかのＰ
ＧＥ_２応答経路と、ＨＳＰＣの細胞生存、ホーミングおよび増殖／自己再生がリンクして
いることに留意するとさらに興味深い。

これらの研究は、ＰＧＥ_２処置後に観察されるＨＳＰＣ頻度の約４倍の増加が、約２倍
またはそれを超えるＨＳＰＣのレシピエント骨髄へのホーミングおよびＨＳＰＣの自己再
生の約２倍の増大によって生じることを示唆している。これらの結果は、それによってＰ
ＧＥ_２がＨＳＰＣの機能を強化する作用の新規な機序を規定する役に立つことができ、こ
れらの結果は、造血移植、特に限定された細胞数が生着の乏しい見込みにつながる造血移
植体を容易にするための予期せぬ治療的取組みを示唆する。

本明細書に開示の一態様は、幹細胞遺伝子療法におけるウィルス導入効率を強化する方
法である。幹細胞のｅｘ ｖｉｖｏのＰＧＥ_２処置は、自己再生分裂およびこのような細
胞の生存を増加し、これは、ウィルスベクターにより仲介される遺伝子組み込みの成功に
とって重要な因子である。ＰＧＥ_２により促進された幹細胞の自己再生分裂／生存は、最
新の幹細胞形質導入プロトコルに組み込むことができ、したがって、幹細胞遺伝子療法に
おける遺伝子形質導入効率全体を増加する。

本明細書において、ＨＳＰＣ生着を強化するためのいくつかのＰＧＥ_２の使用方法、ド
ナー細胞の動員、ＨＳＰＣの維持およびレシピエントの体内におけるＨＳＰＣのホーミン
グを含む多段階方法を報告する。いくつかの条件下で、これらの方法は、ＨＳＰＣ頻度に
おいて４倍の増加をもたらし、生着は、おそらく、例えば、ＨＳＰＣのホーミングにおけ
る約２倍の増加およびＰＧＥ_２の直接影響下のＨＳＰＣの細胞周期活性における２倍の増
加の累積効果に起因する。正確なシグナル伝達経路がさらに決定されるべきであるが、こ
の効果の限定されない１つの説明は、生着の強化は、ＣＸＣＲ４およびサバイビンなどの
因子の上方制御によることである。

ＨＳＰＣのホーミングならびに生存および／または増殖を改善するＰＧＥ_２の能力は、
特にＨＳＰＣの数が限定されている状況、例えば、ＵＣＢおよびいくつかの動員されたＰ
Ｂ産物において、または幹細胞遺伝子療法におけるウィルス遺伝子形質導入を設定するの
に臨床的に有意であり得る。本発明者らの限界希釈移植研究は、同等の生着結果を、ＰＧ
Ｅ_２処置されていない対照と比較して、ＰＧＥ_２処置細胞が１／４の数で達成し得ること
を例示する。これらの結果は、ＨＳＰＣの数が限定されている条件下でＰＧＥ_２を使用す
ることの有用性を実証する。４種のＥＰ受容体サブタイプすべてが、ＨＳＰＣにおいて発
現されると思われるが、これらの受容体のどれ（または４種すべて）が生着機能に関係し
ているかは明らかでない。生着／回復の強化が、ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＧＥ_２を投与
することによって、またはｉｎ ｖｉｖｏで使用されるＰＧＥ_２が、ｅｘ ｖｉｖｏでＰ
ＧＥ_２に曝露されたＨＳＰＣの生着をさらに容易にできる場合に得られることは、これら
の結果と一致する。

材料および方法
材料
マウス Ｃ５７Ｂ１／６マウスは、Ｊａｃｋｓｏｎ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ（Ｂａ
ｒ Ｈａｒｂｏｒ、ＭＥ、ＵＳＡ）から購入した。Ｂ６．ＳＪＬ−ＰｔｒｃＡＰｅｐ３Ｂ
／ＢｏｙＪ（ＢＯＹＪ）およびＦ１ Ｃ５７Ｂ１／６／ＢＯＹＪハイブリッドを、研究所
内で繁殖させた。すべての動物を、食物および酸性化水を連続提供されるマイクロアイソ
レーターケージにおいて飼育した。移植研究に使用するマウスは、放射時、および移植後
３０日の間、ドキシサイクリンの供給を受けた。Ｔｈｅ Ａｎｉｍａｌ Ｃａｒｅ ａｎ
ｄ Ｕｓｅ Ｃｏｍｍｉｔｔｅｅ ｏｆ Ｉｎｄｉａｎａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ Ｓｃ
ｈｏｏｌ ｏｆ Ｍｅｄｉｃｉｎｅは、すべての動物プロトコルを承認した。

フローサイトメトリ すべての抗体は、特に明記していない限り、ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉ
ｅｎｃｅｓから購入した。マウスＫＬおよびＳＫＬ細胞の検出および選別のために、ＰＥ
−Ｃｙ７と結合したストレプトアビジン（ビオチン化ＭＡＣＳ系統抗体の染色用（Ｍｉｌ
ｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ａｕｂｕｒｎ、ＣＡ））、ｃ−ｋｉｔ−ＡＰＣ、Ｓｃａ−
１−ＰＥまたはＡＰＣ−Ｃｙ７、ＣＤ４５．１−ＰＥおよびＣＤ４５．２−ＦＩＴＣを使
用した。ＵＣＢ ＣＤ３４^＋細胞は、抗ヒト−ＣＤ３４−ＡＰＣを使用して検出した。多
系列分析のために、ＡＰＣ−Ｃｙ７−Ｍａｃ−１、ＰＥ−Ｃｙ７−Ｂ−２２０およびＡＰ
Ｃ−ＣＤ３を使用した。ＥＰ受容体は、抗ＥＰ１、ＥＰ２、ＥＰ３およびＥＰ４ウサギＩ
ｇＧ（Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌｓ）を用いて検出し、ＦＩＴＣ−ヤギ−抗−ウサ
ギＩｇＧ（Ｓｏｕｔｈｅｒｎ Ｂｉｏｔｅｃｈ、Ｂｉｒｍｉｎｇｈａｍ、ＡＬ）を用いて
二次染色した。ＣＸＣＲ４の発現は、ストレプトアビジン−ＰＥＣｙ７、ｃ−ｋｉｔ−Ａ
ＰＣ、Ｓｃａ−ｌ−ＡＰＣ−Ｃｙ７およびＣＸＣＲ４−ＰＥを使用して分析した。アポト
ーシスは、ＦＩＴＣ−アネキシン−Ｖを用いて測定した。サバイビンおよび活性カスパー
ゼ−３の検出のために、細胞を透過処理し、ＣｙｔｏＦｉｘ／ＣｙｔｏＰｅｒｍ ｋｉｔ
（ＢＤ）を使用して固定し、抗活性カスパーゼ−３−ＦＩＴＣ Ｆｌｏｗ Ｋｉｔ（ＢＤ
）またはサバイビン−ＰＥ（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ）を用いて染色した。

細胞周期分析のために、細胞を、７ＡＡＤ またはＦＩＴＣ−ＢｒｄＵ Ｆｌｏｗ Ｋ
ｉｔ（ＢＤ）を用いて染色した。すべての分析はＬＳＲＩＩにおいて実施し、選別は、Ｆ
ＡＣＳＡｒｉａソーターまたはＦＡＣＳＶａｎｔａｇｅソーター（ＢＤ）のどちらかにお
いて実施した。Ｃｅｌｌ Ｑｕｅｓｔ ＰｒｏおよびＤｉｖａ ｓｏｆｔｗａｒｅ（ＢＤ
）を、データの収集および分析に使用した。

方法
限界希釈競合的および非競合的移植
ＷＢＭ細胞（ＣＤ４５．２）を、１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２（Ｃａｙｍａｎ
Ｃｈｅｍｉｃａｌ、Ａｎｎ Ａｒｂｏｒ、ＭＩ）／１×１０^６細胞または滅菌、非発熱性
ＰＢＳ中０．０１％のＥＴＯＨのどちらかを用いて、氷上において２時間処置した。イン
キュベーション後、細胞を２回洗浄し、２×１０^５のコンジェニックＣＤ４５．１競合骨
髄細胞と、０．０７５：１、０．２５：１、１：１および２．５：１の割合で混合し、致
死的に放射線（１１００−ｃＧｙ分割線量）を浴びたＣＤ４５．１マウスに、尾静脈注射
により移植した（５マウス／希釈）。ＰＢ中のＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２細胞を、
フローサイトメトリによって、月１回決定した。１対１競合移植のために、ＣＤ４５．１
マウスおよびＣＤ４５．２マウス由来のＷＢＭを、ビヒクルまたはｄｍＰＧＥ_２を用いて
処置しＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウス由来の２×１０^５の競合骨髄細胞と、０．０７
５：１、０．２５：１、１：１および２．５：１の割合で混合し、致死的に放射線を浴び
たＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウスに移植した。ＰＢ中のＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２
およびＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２細胞の一部（proportion）を、月１回決定した。ＨＳ
ＰＣの頻度を、Ｌ−ＣＡＬＣソフトウェア（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｉ
ｅｓ、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を使用して、Ｐｏｉｓｓｏｎ統計によ
って定量化し、キメラ現象に対する寄与は＜５％であり、陰性レシピエントと考えられる
。競合的再構築単位（ＣＲＵ）を、記載のように（Ｈａｒｒｉｓｏｎ、１９８０）計算し
た。二次移植のために、移植後２０週に、すでに移植を受けた１：１比のＦ１ハイブリッ
ドマウス由来の２×１０^６のＷＢＭを、致死的に放射線を浴びたＦ１ハイブリッドマウス
に非競合的様式で注射し、ＰＢのキメラ現象および三血球系の再構成を月１回評価した。

ｉｎ ｖｉｖｏのＨＳＰＣの骨髄へのホーミングの分析 ＣＤ４５．２ＷＢＭを、ＣＦ
ＳＥ（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ、Ｅｕｇｅｎｅ、ＯＲ）を用いて標識し、洗浄
し、１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルのどちらかを用いて氷上で処置し
た。処置後、細胞を洗浄し、２×１０^７の細胞を、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．２
マウスに移植した。１６時間後、大腿骨および脛骨を洗い流し、マウス骨髄Ｌｉｎ^＋細胞
の一部を、ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を使用して枯
渇させ、ビオチン（系統）、ｃ−ｋｉｔ（Ｋ）およびＳｃａ−１（Ｓ）に特異的な蛍光色
素標識抗体を用いて染色し、ＣＦＳＥ^＋ＷＢＭ（非系統枯渇）、ＫＬおよびＳＫＬ細胞の
合計数を決定した。コンジェニックホーミング研究のために、Ｌｉｎ^ｎｅｇ ＣＤ４５．
１細胞を、１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２、ビヒクルまたはＰＢＳを用いて、氷上で
処置した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、２×１０^６の細胞をＣＤ４５．２マウ
スに移植した。１６時間後、レシピエントの骨髄を採取し、系統を枯渇し、染色し、ドナ
ーのＣＤ４５．１ＳＫＬ細胞を決定した。選別されたＳＫＬ細胞を使用する競合的１対１
ホーミングの研究では、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１マウス由来のＬｉｎ^ｎｅｇ細胞
をＦＡＣＳ選別し、細胞を、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルのどちらかを用いて２時間処置
し、洗浄し、３×１０^４のＣＤ４５．１（ビヒクルまたはｄｍＰＧＥ_２処置）＋３×１０
^４のＣＤ４５．２（ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクル処置）ＳＫＬ細胞を、致死的に放射線を
浴びたＦ１ハイブリッドマウスに移植した。ホーミング研究においてＣＸＣＲ４の役割を
評価するために、Ｌｉｎ^ｎｅｇ ＣＤ４５．２細胞を、ビヒクルまたは１マイクロモル濃
度のｄｍＰＧＥ_２＋１０マイクロモル濃度のＡＭＤ３１００（ＡｎｏｒＭｅｄ Ｉｎｃ．
、Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ、ＢＣ、Ｃａｎａｄａ）を用いて氷上で処置し、２×１０^６の処置
細胞を、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．１マウスに注射した。移植後１６時間で、ホ
ーミングしたＳＫＬ細胞を分析した。

ＥＰ受容体、ＣＸＣＲ４およびサバイビンの発現 ＣＤ４５．２マウス由来の複製Ｌｉ
ｎ^ｎｅｇ細胞試料を、ＳＫＬについて染色し、ＫＬおよびＳＫＬ細胞における個々のＥＰ
受容体および表面受容体の発現を、ＦＡＣＳによって決定した。ヒトＥＰ受容体のために
、ＵＣＢを、Ｉｎｓｔｉｔｕｔｉｏｎａｌ Ｒｅｖｉｅｗ Ｂｏａｒｄの承認によりＷｉ
ｓｈａｒｄ Ｈｏｓｐｉｔａｌ、Ｉｎｄｉａｎａｐｏｌｉｓ、ＩＮから入手した。単核細
胞を、Ｆｉｃｏｌｌ−Ｐａｑｕｅ（商標）Ｐｌｕｓ（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｂｉｏｓｃｉｅ
ｎｃｅｓ）において単離し、ＣＤ３４^＋細胞を、ＭＡＣＳマイクロビーズ（Ｍｉｌｔｅｎ
ｙｉ Ｂｉｏｔｅｃｈ）を用いて正に選択した（ＦｕｋｕｄａおよびＰｅｌｕｓ、２００
１年）。複製細胞を、ＣＤ３４に対して染色し、個々のＥＰ受容体および表面発現を、Ｆ
ＡＣＳによって決定した。ＣＸＣＲ４、サバイビンおよび活性カスパーゼ−３を評価する
ために、Ｌｉｎ^ｎｅｇ細胞またはＣＤ３４^＋ＵＣＢを、１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ
_２またはビヒクル対照を用いて、氷上で２時間処置し、洗浄し、次いでＲＰＭＩ−１６４
０＋１０％ＦＢＳ中で、３７℃において２４時間培養した。細胞を、上記のように、ＳＫ
Ｌ（マウス細胞）およびＣＸＣＲ４、サバイビンおよび／または活性カスパーゼ−３に対
して染色し、ＦＡＣＳによって分析した。

細胞周期分析 ｉｎ ｖｉｔｒｏの細胞周期分析のために、Ｌｉｎ^ｎｅｇ細胞を、１マ
イクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルのどちらかを用いて２時間処置し、洗浄し
、Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｐｒｏ Ｍｅｄｉａ（Ｓｔｅｍ Ｃｅｌｌ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇ
ｉｅｓ）中で、ｒｍＳＣＦ（５０ｎｇ／ｍｌ）（Ｒ＆Ｄ Ｓｙｓｔｅｍｓ、Ｍｉｎｎｅａ
ｐｏｌｉｓ、ＭＮ）、ｒｈＦｌｔ−３およびｒｈＴＰＯ（それぞれ１００ｎｇ／ｍｌ）（
Ｉｍｍｕｎｅｘ、Ｓｅａｔｔｌｅ、ＷＡ）と一緒に培養した。２０時間後、細胞を、ＳＫ
Ｌを用いて染色し、固定し、透過処理し、７ＡＡＤ（ＢＤ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ、Ｓ
ａｎ Ｊｏｓｅ、ＣＡ）を用いて染色した。Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期のＳＫＬ細胞の一部をＦＡＣ
ＳによりＤＮＡ含有量を測定することによって決定した。ｉｎ ｖｉｖｏの細胞周期分析
のために、ＣＤ４５．２マウスに致死的に放射線を浴びせ、１マイクロモル濃度のｄｍＰ
ＧＥ_２またはビヒクルのどちらかを用いて２時間処置したＣＤ４５．１マウス由来の、５
×１０^６のＬｉｎ^ｎｅｇ細胞を移植した。移植時に、レシピエントマウスに、飲料水中１
ミリグラム／ｍＬのＢｒｄＵ（Ｓｉｇｍａ Ａｌｄｒｉｃｈ、Ｓｔ． Ｌｏｕｉｓ、ＭＯ
）および１ｍｇ／マウスのＢｒｄＵ Ｉ．Ｐを与えた。１６時間後、レシピエントの骨髄
を単離し、系統を枯渇させ、ＣＤ４５．１、ＳＫＬおよびＢｒｄＵに対して染色した。Ｂ
ｒｄＵ^＋である、ホーミングした（ＣＤ４５．１^＋）ＳＫＬ細胞の一部を、個々のマウス
においてＦＡＣＳによって決定した。

アポトーシスアッセイ Ｌｉｎ^ｎｅｇ細胞を、０．１ナノモル濃度から１マイクロモル
濃度のｄｍＰＧＥ_２またはビヒクル対照を用いて、氷上で処置し、洗浄し、成長因子を含
まずに、３７℃においてＲＰＭＩ−１６４０＋２％ＦＢＳ中でインキュベートし、アポト
ーシスを誘導した。２４時間後、細胞を、ＳＫＬおよびアネキシンＶに対して染色し、ア
ネキシンＶ^＋ＳＫＬ細胞の一部をＦＡＣＳにより決定した。

逆転写およびＱＲＴ−ＰＣＲ トータルＲＮＡを、完全ＲＮＡ精製キット（Ｓｔｒａｔ
ａｇｅｎｅ、Ｌａ Ｊｏｌｌａ、ＣＡ）を使用して得た。一定量のＲＮＡを、（Ｆｕｋｕ
ｄａおよびＰｅｌｕｓ、２００１年）に記載のように、１ミリモル濃度のｄＮＴＰおよび
ＲＮａｓｅ阻害剤を含む５０マイクロリットルの体積中でランダムプライマー（Ｐｒｏｍ
ｅｇａ、Ｍａｄｉｓｏｎ、ＷＩ）およびＭＭＬＶ逆転写酵素（Ｐｒｏｍｅｇａ）を用いて
逆転写した。ＤＮａｓｅおよびＲＮａｓｅ非含有水（Ａｍｂｉｏｎ、Ａｕｓｔｉｎ、ＴＸ
）を加え、１０ナノグラムのＲＮＡ／マクロリットルと同等の最終濃度を得、５マイクロ
リットルをＱＲＴ−ＰＣＲのために使用した。ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ＱＲＴＰＣＲのた
めのプライマーを設計し、７５〜１５０ｂｐのサイズの増幅産物を作製した。ＱＲＴ−Ｐ
ＣＲを、Ｐｌａｔｉｎｕｍ ＳＹＢＲ Ｇｒｅｅｎ ｑＰＣＲ ｓｕｐｅｒｍｉｘ ＵＤ
Ｇ ｗｉｔｈ Ｒｏｘ（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）を使用して、
合計容量３０マイクロリットルで、ＡＢＩ−７０００（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉｏｓｙｓｔ
ｅｍｓ、Ｃａｒｌｓｂａｄ、ＣＡ）において、活性化ステップが５０℃で２分間、変性が
９５℃で２分間および増幅が９５℃で１５秒、５０℃で３０秒、７２℃で３０秒を４５サ
イクルで実施し、その後解離によって唯一の産物が選られたことを確認した。

本発明のいくつかの態様の実践に使用できる非ステロイド系抗炎症性化合物は、限定す
るものではないが、商品名Ｃｅｌｅｂｒｅｘ（登録商標）の名前で販売されているセレコ
キシブ（４−［５−（４−メチルフェニル）−３−（トリフルオロメチル）ピラゾール−
１−イル］ベンゼンスルホンアミド）；商品名Ｖｉｏｘｘ（登録商標）の名前で販売され
ているロフェコキシブ（４−（４−メチルスルホニルフェニル）−３−フェニル−５Ｈ−
フラン−２−オン）；アスピリン（２−アセトキシ安息香酸）；エトリコキシブ（５−ク
ロロ−６’−メチル−３−［４−（メチルスルホニル）フェニル］−２，３’−ビピリジ
ン）；商品名Ｂｅｘｔｒａ（登録商標）の名前で販売されているバルデコキシブ（４−（
５−メチル−３−フェニルイソオキサゾール−４−イル）ベンゼンスルホンアミド）；イ
ブプロフェン（（ＲＳ）−２−（４−イソブチルフェニル）プロパン酸）；ナプロキセン
（（＋）−（Ｓ）−２−（６−メトキシナフタレン−２−イル）プロパン酸）；商品名Ｖ
ｏｌｔａｒｅｎ（登録商標）の名前で市販されているジクロフェナク（２−（２−（２，
６−ジクロロフェニルアミノ）フェニル）酢酸）；リコフェロン（［６−（４−クロロフ
ェニル）−２，２−ジメチル−７−フェニル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロリジン−５
−イル］酢酸）；インドメタシン（２−｛１−［（４−クロロフェニル）カルボニル］−
５−メトキシ−２−メチル−１Ｈ−インドール−３−イル｝酢酸）；商品名Ｍｅｔａｃａ
ｍの名前で販売されているメロキシカム（（８Ｅ）−８−［ヒドロキシ−［（５−メチル
−１，３−チアゾール−２−イル）アミノ］メチリデン］−９−メチル−１０，１０−ジ
オキソ−１０λ^６−チア−９−アザビシクロ［４．４．０］デカ−１，３，５−トリエン
−７−オン）；エトドラク（２−（１，８−ジエチル−４，９−ジヒドロ−３Ｈ−ピラノ
［３，４−ｂ］インドール−１−イル）酢酸）；商品名Ｔｏｒａｄｏｌの名前で市販され
ているケトロラク（（±）−５−ベンゾイル−２，３−ジヒドロ−１Ｈ−ピロリジン−１
−カルボン酸，２−アミノ−２−（ヒドロキシメチル）−１，３−プロパンジオール）な
どの化合物を含む。

少なくとも１種のＰＧＥ_２受容体に対してアンタゴニストとして作用する化合物は、限
定するものではないが、Ｃａｙｍａｎ Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｃｏｍｐａｎｙ （Ａｎｎ
Ａｒｂｏｒ、ＭＩ、Ｕ．Ｓ．Ａ．）または化学品供給会社によって維持／販売される他の
リストから利用可能な化合物を含む。

統計解析 プールしたすべての値は、平均±ＳＥＭで表す。統計的有意差は、必要に応
じて、Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｅｘｃｅｌ（Ｍｉｃｒｏｓｏｆｔ Ｃｏｒｐ、Ｓｅａｔｔｌ
ｅ、ＷＡ）の対応のある、または対応のない両側ｔ検定関数を使用して決定した。本明細
書において使用する場合、特にいくつかの図において、「ｄｍＰＧＥ_２」と「ｄｍＰＧＥ
」という用語は交換可能に使用される。

[実施例１．ＰＧＥ_２は、長期再構築ＨＳＰＣの頻度および生着を増加させる。]
ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２ハイブリッドマウスに移植されたＣＤ４５．２およびＣＤ
４５．１のコンジェニック移植体を利用する限界希釈競合移植モデルの使用により、ＨＳ
ＰＣをＰＧＥ_２に短期曝露することが、ＨＳＰＣおよび競合的再構築単位（ＣＲＵ）の頻
度の長期強化を生み出すことが実証された。ここで図１Ａを参照すると、ＣＤ４５．１ま
たはＣＤ４５．２マウス由来の骨髄は、それぞれ、ビヒクルまたはｄｍＰＧＥ_２を用いて
処置された。ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２ハイブリッド骨髄細胞を競合相手として使用し
た。限界希釈を、致死的に放射線（１１００ｃＧｙｓ、分割線量）を浴びたＣＤ４５．１
／ＣＤ４５．２ハイブリッドマウスに移植し、ＰＢ中のキメラ現象を２０週間にわたって
分析した。個々の細胞集団を検出する代表的フロープロットを示す（下段パネル）。

ここで図１Ｂを参照すると、１２週目にＰｏｉｓｓｏｎ統計によって決定された、ビヒ
クル（赤色）またはｄｍＰＧＥ_２（青色）をパルスした細胞に関する頻度分析（上段）は
、；Ｐ_０＝８５，５６０（ビヒクル）およびＰ_０＝２３，９１１（ｄｍＰＧＥ_２処置）。
ＰＢおよびＣＲＵの分析におけるキメラ現象を、１２週において示す（平均±ＳＥＭ）。
データは２つのプールされた実験を表す、ｎ＝５マウス／群／実験であり、それぞれ個別
にアッセイした。

ここで図１Ｃを参照すると、ビヒクルまたは２０週にわたってＰＧＥ_２処置した骨髄の
レシピエントにおけるＨＳＰＣの頻度分析である。倍数変化は、ビヒクルと比較したｄｍ
ＰＧＥ_２−パルスした細胞の生着頻度において増加を示す。

ここで図１Ｄを参照すると、多系統再構成（骨髄、ＢおよびＴリンパ球）の代表的ＦＡ
ＣＳプロットである。ここで図１Ｄを参照すると、中央のパネルは、一次移植のための多
系統分析（３２週、左パネル）および一次移植されたマウスから２０週目に移植を受けた
４マウスを、１２週間後に分析したコホート（右パネル）である。ビヒクルに対するｄｍ
ＰＧＥ_２処置細胞のキメラ現象の増加は、一次移植に関して２０週目（二次移植の時）お
よび二次移植の１２週目に示される（下パネル）。２０週目の一次移植に関するデータは
、２つのプールされた実験からであり、ｎ＝５マウス／群／実験、それぞれ個別にアッセ
イした。１２週目の二次移植に関するデータは、ｎ＝４マウス／群、それぞれ個別にアッ
セイした。

さらに、図１Ｄを参照すると、段階移植により、移植された造血移植体中の自己再生お
よびＨＳＰＣの拡大を評価している。ｅｘ ｖｉｖｏでｄｍＰＧＥ_２およびビヒクルへの
曝露された長期再構築細胞（ＬＴＲＣ）の拡大を調査するために、骨髄を、一次移植され
た動物から移植後２０週目に採取し、二次レシピエントに移植した。二次移植後１２週目
のＰＢの分析により、移植を受けたすべてのマウスに由来する細胞により多系統の再構成
が示され、一次移植されたＬＴＲＣの自己再生を示した。一次移植ドナーにおいて見られ
る、ｄｍＰＧＥ_２への曝露からもたらされるキメラ現象の増加は、任意の追加の処置をし
なくても二次移植においても見られた。さらに、ｄｍＰＧＥ_２を用いてすでに処置された
ＨＳＰＣの競合力が増加する傾向が二次移植において観察され、骨髄細胞系列の再構成に
対してわずかにバイアスがあった。

このモデルは、生着および同じ動物内における対照とｄｍＰＧＥ_２処置群とに由来する
ＨＳＰＣの競合力（図１Ａ），ならびに宿主細胞の内因性再構成の定量的比較を可能にす
る。移植１２週後に、末梢血（ＰＢ）の分析により、ビヒクル処置細胞と比較して、ｄｍ
ＰＧＥ_２処置細胞にキメラ現象の増加が示され、ＨＳＰＣ頻度および競合的再構成単位（
ＣＲＵ）が約４倍増加し、長期再構成能力の測定が認識された（図１Ｂ）。移植後に続く
２０週間を通して、ＨＳＰＣの頻度は約４倍の増加を維持し、ｄｍＰＧＥ_２のパルス曝露
の効果は安定であった（図１Ｃ）。移植後３２週目に、ＰＢ中のＢリンパ系列およびＴリ
ンパ系列ならびに骨髄系列に関して再構成が見られ、未処置の競合細胞、ｄｍＰＧＥ_２処
置細胞またはビヒクル処置細胞の間に認識可能な差はなかった（図１Ｄ）。

[実施例２．マウスおよびヒトの造血幹細胞および前駆細胞（ＨＳＰＣ）は、ＰＧＥ_２受
容体を発現する。]
伝えられるところでは、ＰＧＥ_２は、４種の特異的な、高度に保存されたＧタンパク質
共役受容体；ＥＰ１〜ＥＰ４と相互作用する（ＳｕｇｉｍｏｔｏおよびＮａｒｕｍｉｙａ
、２００７年；Ｔｓｕｂｏｉら、２００２年）。ＥＰ受容体のレパートリーは、多重の、
時としてＰＧＥ_２に起因する逆の応答の原因となる（Ｂｒｅｙｅｒら、２００１年）。Ｈ
ＳＰＣにおけるＰＧＥ_２受容体サブタイプの発現は今まで知られていない。ここで図２Ａ
を参照すると、造血前駆細胞（ＨＰＣ）に富んだｃ−ｋｉｔ^＋Ｌｉｎ^ｎｅｇ（ＫＬ）細胞
およびＨＳＰＣに富んだＳｃａ−１^＋ｃ−ｋｉｔ^＋Ｌｉｎ^ｎｅｇ（ＳＫＬ）細胞における
ＥＰ受容体の分析は、４種すべてのＥＰ受容体（ＥＰ３＋、ＥＰ２、ＥＰ１およびＥＰ４
）が発現されたことを示した。さらにここで図２Ａ（右パネル）を参照すると、ＱＲＴ−
ＰＣＲによりＦＡＣＳにより選別されたＫＬおよびＳＫＬ細胞中に、４種すべてのＥＰ受
容体に関するｍＲＮＡが検出されていた。ここで図２Ａ（中央パネル）を参照すると、Ｅ
Ｐ３に関する解離曲線はいくつかのピークを示し、ＥＰ３の公知の多重スプライス変異体
と一致する（Ｎａｍｂａら、１９９３年）。ＫＬまたはＳＫＬ細胞に関して、任意のＥＰ
受容体サブタイプの表面発現またはｍＲＮＡレベルの間に、有意な定量的差異は見られな
かった。ここで図２Ｂを参照すると、ヒトＣＤ３４^＋ＵＣＢ細胞の表面において、マウス
細胞の類似体（右パネル）は４種すべての受容体サブタイプを発現し、ＱＲＴ−ＰＣＲ分
析により、４種すべてのＥＰ受容体のｍＲＮＡが検出されていた（図２Ｂ）。

[実施例３．短期ＰＧＥ_２曝露はＨＳＰＣのホーミング効率を増加させる。]
ＰＧＥ_２に対するパルス曝露において観察されるＨＳＰＣの生着の強化は、ＨＳＰＣの
数および／または細胞の促進をもたらす、または宿主の骨髄におけるＨＳＰＣのホーミン
グもしくは増殖をもたらす細胞周期状態に起因すると思われる。その原因と無関係に、骨
髄ニッチはＨＳＰＣにとって自己再生および増殖に必要であり、これらのニッチへのＨＳ
ＰＣのホーミングだけが長期再構築を提供し得る可能性が非常に高い。さらにここで図３
Ａを参照すると、ＨＳＰＣのホーミングを評価するために、ＣＦＳＥ標識された全骨髄（
ＷＢＭ）ＣＤ４５．２細胞は、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルを氷上で２時間パルスされ、
洗浄され、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．２宿主にＩＶ注射された。１６時間後、骨
髄にホーミングするＣＦＳＥ^＋細胞の合計およびＫＬおよびＳＫＬ細胞集団内のホーミン
グ事象の数を定量した。総ＷＢＭ細胞を評価した場合、骨髄へのＣＦＳＥ^＋細胞のホーミ
ングのパーセントにおいて、ｄｍＰＧＥ_２処置細胞およびビヒクル処置細胞の間に差異は
観察されなかったが、対照よりも有意に多くのＳＫＬ細胞が骨髄にホーミングした。ここ
で図３Ｂを参照すると、ビヒクル処置細胞または未操作細胞と比較して、コンジェニック
モデルにおいて、ｄｍＰＧＥ_２処置細胞に関してＳＫＬ細胞の有意により大きなパーセン
トが観察された。未処置細胞およびビヒクル−処置細胞の間にホーミング効率の差は見ら
れなかった。

ここで図３Ｃを参照すると、ＳＫＬ細胞のホーミングに対するｄｍＰＧＥ_２の強化効果
が直接であったか間接であったかを決定するために、１対１移植モデルにおける豊富なＨ
ＳＰＣのホーミングが他の細胞と比較された。ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１マウスの
両方から高度に精製されたＳＫＬ細胞を、ＦＡＣＳ選別によって単離し、ｄｍＰＧＥ_２ま
たはビヒクルを用いて処置し、３×１０^４のビヒクル処置ＣＤ４５．１細胞＋３×１０^４
のｄｍＰＧＥａ処置ＣＤ４５．２細胞を、ＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウスに移植した
。さらなるコホートに、コンジェニック系を同時に移植し、処置群を交換し、系統のホー
ミングにおける任意のバイアスを試験した。ＷＢＭを使用した研究と同様に、精製ＳＫＬ
細胞のｄｍＰＧＥ_２パルス曝露は、それらのホーミング効率を２倍増加させ、ＨＳＰＣに
対するＰＧＥ_２の直接効果を強く示唆する。ＳＫＬ細胞は、均質なＨＳＰＣ集団ではない
が、ＳＫＬ細胞は、ＬＴＲＣに高度に富んでいる（Ｏｋａｄａら、１９９２年；Ｓｐａｎ
ｇｒｕｄｅおよびＳｃｏｌｌａｙ、１９９０年）。

[実施例４．ＰＧＥ_２はＨＳＰＣ ＣＸＣＲ４を増加させ、ＣＸＣＲ４アンタゴニストＡ
ＭＤ３１００は、ホーミングの強化をブロックする。]
ここで図４Ａを参照すると、ストロマ細胞由来因子−１アルファ（ＳＤＦ−１ａ）／Ｃ
ＸＣＲ４軸は、ＨＳＰＣの輸送およびホーミングと関係している。本研究は、ｄｍＰＧＥ
_２処置ＨＳＰＣのホーミングの改善は、ＳＤＦ−１ａ／ＣＸＣＲ４のシグナル伝達の増加
の結果であったかどうかを評価した。Ｌｉｎ^ｎｅｇ細胞のｄｍＰＧＥ_２に対するパルス曝
露は、ＫＬおよびＳＫＬ細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を増加させ（図４Ａ）；同様に、
ｄｍＰＧＥ_２のパルス曝露は、予想通りＣＤ３４^＋ＵＣＢ細胞におけるＣＸＣＲ４の発現
を増加させた。ＱＲＴ−ＰＣＲは、ビヒクルと比較してｄｍＰＧＥ_２処置細胞においてＣ
ＸＣＲ４ ｍＲＮＡレベルが上昇し、最大の上昇は６時間目に観察されたことを実証した
（データ非掲載）。

ここで図４Ｂを参照すると、ＣＸＣＲ４の上方制御が、ＰＧＥ_２処置後に観察されるホ
ーミングの強化において役割を果たすかどうか決定するために、ＳＤＦ−１へのｉｎ ｖ
ｉｔｒｏの遊走およびｉｎ ｖｉｖｏのＨＳＰＣのホーミングを阻害する選択的ＣＸＣＲ
４アンタゴニストＡＭＤ３１００が使用された。ＰＧＥ_２のパルス曝露は、ＳＫＬ細胞の
ホーミングを約２倍増加させ、ビヒクルまたはｄｍＰＧＥ_２をパルスされた細胞をＡＭＤ
３１００と一緒にインキュベートすることによりＳＫＬ細胞のホーミングは減少し、ｄｍ
ＰＧＥ_２パルス細胞のホーミング効率の改善は抑制された。

[実施例５．サバイビンの増加と一致して、ＰＧＥ_２はＨＳＰＣのアポトーシスを減少さ
せる。]
ＰＧＥ_２処置は、ＨＳＰＣの頻度およびＣＲＵを４倍増加させる（図１）が、ホーミン
グはわずか２倍強化され（図３）、他の事象が生着の強化に関与していることを示唆する
。アポトーシスは、正常な造血または悪性の造血において重要な制御過程であり、ＰＧＥ
_２は抗アポトーシスシグナル伝達に関係している。さらに、ＥＰ受容体の下流シグナル伝
達分子であるｃＡＭＰの活性化は、ＣＤ３４^＋細胞においてアポトーシスを阻害する。こ
れらの結果に一致する１つの仮説は、ｄｍＰＧＥ_２処置が、ＨＳＰＣの生存および／また
は増殖に影響を与え、生着の強化に寄与するというものである。ＨＳＰＣの生存に対する
ｄｍＰＧＥ_２の効果を評価するために、Ｌｉｎ^ｎｅｇ細胞に、０．１ナノモル濃度〜１マ
イクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルをパルスし、成長因子を含まない低血清培
養培地において培養した。ｄｍＰＧＥ_２に対するパルス曝露は、用量依存性様式でＳＫＬ
細胞においてアポトーシスを低下させ（図５Ａ）１マイクロモル濃度で約６５％の阻害に
達した。

アポトーシスタンパク質の阻害剤であるサバイビンは、正常造血細胞および悪性造血細
胞の両方において、アポトーシスおよび増殖の重要な制御因子である。ここで図５Ｂを参
照すると、これらの結果が、ＰＧＥ_２がＨＳＰＣにおいてサバイビンに影響を与えたこと
を実証している。ｄｍＰＧＥ_２のパルス２４時間後、細胞内サバイビンレベルは、対照と
比較して、マウスのＳＫＬ細胞およびＣＤ３４^＋ＵＣＢ細胞の両方において有意に高く（
それぞれ１．７および２．４倍）、ＱＲＴ−ＰＣＲ分析により、対照と比較してサバイビ
ンｍＲＮＡの上昇が示された。

ここで図５Ｃを参照すると、サバイビンの増加と一致する、対照と比較した活性カスパ
ーゼ−３の減少が、ＳＫＬ細胞をｄｍＰＧＥ_２に曝露後２４、４８および７２時間におい
て見られた。

[実施例６．ＰＧＥ_２処置がＨＳＰＣの増殖を増加させる。]
サバイビンは、ＨＳＰＣが細胞周期に進入し、進行することを制御する。さらに、ＨＳ
ＰＣの増殖および自己再生に関係するβ−カテニンは、ＥＰ受容体経路の下流に位置する
。これらの細胞周期制御因子を調節するＰＧＥ_２の能力は、ＨＳＰＣの自己再生および増
殖における増加が、ｄｍＰＧＥ_２をパルスされた細胞の生着の強化に寄与しうることを示
唆している。この仮説を試験するために、ｉｎ ｖｉｔｒｏでｄｍＰＧＥ_２またはビヒク
ルをパルスされたＳＫＬ細胞の細胞周期状態を分析した。ここで図６Ａを参照すると、ｄ
ｍＰＧＥ_２に対するパルス曝露が、細胞循環の増加の指標である、ＳＫＬ細胞中のＤＮＡ
含有量を増加させた（左パネル、右上の象限）。３つの実験において、対照と比較してｄ
ｍＰＧＥ_２処置後に６０％を超えるＳＫＬ細胞が細胞周期のＳ＋Ｇ_２／Ｍ期にあった（図
６Ａ、右パネル）。ＫＬまたはＬｉｎ^ｎｅｇ細胞の細胞周期速度に関して有意な効果は見
られず（非掲載）、ｄｍＰＧＥ_２が初期ＨＳＰＣのサイクル状態を選択的に増加させるこ
とを示唆している。

ｉｎ ｖｉｔｒｏで観察されたＨＳＰＣの細胞周期の強化に対するｄｍＰＧＥ_２の効果
を確認するために、骨髄細胞にｄｍＰＧＥ_２をパルスし、移植後ＢｒｄＵを用いて処置し
たコンジェニックマウスに注射し、１６時間後、ドナーのＢｒｄＵ^＋ＳＫＬ細胞の一部を
決定した。ここで図６Ｂを参照すると、Ｓ＋Ｇ_２／Ｍ期にあるホーミングしたＳＫＬ細胞
の一部において約２倍の増加が、移植前ｄｍＰＧＥ_２をパルスした細胞に関して観察され
、ＨＳＰＣのｄｍＰＧＥ_２に対する短期曝露が、ｉｎ ｖｉｖｏでＨＳＰＣが細胞周期に
進入し、進行することを刺激することが確認された。

[実施例７．ＣＯＸ１／ＣＯＸ２二重阻害剤のインドメタシンがＨＳＰＣを動員すること
による、ＰＧＥ_２の内因性生合成の阻害]
ＰＧＥ_２は、ＣＸＣＲ４受容体の発現を増加させるので、骨髄において、ＳＤＦ−１／
ＣＸＣＲ４のシグナル伝達はＨＳＰＣの輸送および保有にとって重要である。これらの結
果と一致する１つの仮説は、ＣＯＸ１／ＣＯＸ２二重阻害剤のインドメタシンによるＰＧ
Ｅ_２の内因性生合成の阻害もまたＨＳＰＣを動員することである。ここで図７Ａおよび７
Ｂを参照すると、図７Ａおよび７Ｂは、１５０μｇ／ｋｇのインドメタシンまたは１５０
ｕｇ／ｋｇのバイカレインを単独で（図７Ａ）またはＧ−ＣＳＦと一緒に（図７Ｂ）４日
間、毎日ＳＣ投与することによる、ＣＦＵ−ＧＭの動員に関する効果を示す。ここで図７
Ａを参照すると、１５０μｇ／ｋｇのインドメタシンをＳＣで１日１回４日間の投与する
ことにより、動員される前駆細胞の数が４倍増加した。ここで図７Ｂを参照すると、イン
ドメタシンとＧ−ＣＳＦとを同時投与することにより、末梢血幹細胞の動員において高度
に相乗的な増加が起こった。リポキシゲナーゼの阻害剤であるバイカレインは、ベースラ
インまたはＧ−ＣＳＦ誘導性ＣＦＵ−ＧＭ動員に関して効果を有さず、観察された効果が
、シクロオキシゲナーゼ経路の阻害に特異的であったことを示唆する。データは、それぞ
れ個別にアッセイしたＮ＝３マウスに関する、動員されたＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍｌの平均
±ＳＥＭを表す。

[実施例８．マウスおよびヒトのＨＳＰＣをＰＧＥ_２にパルス曝露することにより、ＣＸ
ＣＲ４の発現が増加する。]
ＣＸＣＲ４を評価するために、Ｌｉｎｅａｇｅ^ｎｅｇマウスの骨髄細胞またはＣＤ３４
^＋ＵＣＢを、１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２またはビヒクル対照のどちらかを用いて
２時間氷上で処置し、洗浄し、次いでＲＰＭＩ−１６４０／１０％ＨＩ−ＦＢＳ中で３７
℃において２４時間培養し、ＳＫＬ（マウス細胞）またはＣＤ３４（ヒト）およびＣＸＣ
Ｒ４に関して染色し、ＦＡＣＳにより分析した。ここで図４Ａを参照すると、ｄｍＰＧＥ
_２を用いて処置後２４時間のＫＬおよびＳＫＬ細胞ならびにヒトＣＤ３４^＋ＵＣＢ細胞に
おけるＣＸＣＲ４の発現である。データは、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルを用いた処置に
よる、ＣＸＣＲ４の平均蛍光強度（ＭＦＩ）の変化の平均±ＳＥＭで表す（ｎ＝３）。Ｑ
ＲＴ−ＰＣＲによる分析で、ＣＸＣＲ４ｍＲＮＡの２．６５倍の増加が実証される。

[実施例９．マウスＳＫＬ細胞をＰＧＥ_２にパルス曝露することは、ＳＤＦ−１αへの遊
走を増加させる。]
新たに単離されたＬｉｎｅａｇｅ^ｎｅｇマウス骨髄細胞に、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒク
ルを２時間パルスし、洗浄し、１０％ＨＩ−ＦＣＳを含む培地に再懸濁し、３７℃におい
て１６時間培養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ／０．５％ＢＳＡ
に再懸濁し、トランスウェルにおいてｒｍＳＤＦ−１αに４時間遊走させた。細胞遊走の
合計を、フローサイトメトリにより測定した。ここで図９を参照すると、ＳＫＬ細胞遊走
の合計は、ｄｍＰＧＥ_２をパルスした細胞がより高かった。データは、３つの実験に関す
る遊走パーセントの平均±ＳＥＭである。ビヒクルを用いて処置した細胞と比較したｄｍ
ＰＧＥ_２処置細胞に関して、†Ｐ＜０．０５。

[実施例１０．ヒトＣＤ３４^＋細胞をＰＧＥ_２にパルス曝露することは、ＳＤＦ−１αへ
の遊走を増加させる。]
新たに単離されたＵＣＢ ＣＤ３４^＋細胞に、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルを２時間パ
ルスし、洗浄し、１０％ＨＩ−ＦＣＳを含む培地に再懸濁し、３７℃において１６時間培
養した。インキュベーション後、細胞を洗浄し、ＲＰＭＩ／０．５％ＢＳＡに再懸濁し、
ｒｈＳＤＦ−１への遊走をフローサイトメトリにより測定した。遊走アッセイの前に、Ｃ
ＸＣＲ４受容体をブロックするために、複製細胞を、５マイクログラム／ｍｌのＡＭＤ３
１００と共に３０分間インキュベートした。ここで図１０を参照すると、データは、３つ
の実験に関する遊走パーセントの平均±ＳＥＭである。

[実施例１１．ＣＸＣＲ４受容体をブロックすることにより、ＳＫＬ細胞のホーミングの
ＰＧＥ_２による強化がブロックされる。]
ホーミングにおけるＣＸＣＲ４の役割を評価するために、Ｌｉｎｅａｇｅ^ｎｅｇＣＤ４
５．２細胞を、ビヒクルまたは１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２＋１０マイクロモル濃
度のＡＭＤ３１００を用いて処置し、２×１０^６の処置細胞を、致死的に放射線を浴びた
ＣＤ４５．１マウスに注射し、移植後１６時間でホーミングしたＳＫＬ細胞を回収しＦＡ
ＣＳにより分析した。ここで図１１を参照すると、１０マイクロモル濃度のＡＭＤ３１０
０不在下または存在下の、ビヒクルおよびｄｍＰＧＥ_２処置細胞の骨髄へのホーミング効
率である。ホーミングアッセイの前に、細胞を、ＡＭＤ３１００と共に３０分間インキュ
ベートした。

[実施例１２．ＰＧＥ_２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏでマウスＳＫＬ細胞の細胞周期速度を増加
させる。]
Ｌｉｎｅａｇｅ^ｎｅｇ細胞を、ビヒクルまたは１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２どち
らかを用いて２時間処置し、洗浄し、ｒｍＳＣＦ、ｒｈＦｌｔ３およびｒｈＴｐｏを含む
培地において培養した。２０時間後、細胞を、ＳＫＬおよびＨｏｅｃｈｓｔ−３３３４２
およびＰｙｒｏｎｉｎ−Ｙに対して染色した。細胞周期におけるＳＫＬ細胞の割合を、Ｆ
ＡＣＳにより測定した。ここで図１２を参照すると、ゲーティングされたＳＫＬ細胞の細
胞周期分布を示す代表的フロープロットであり、それぞれ個別にアッセイした平均±ＳＥ
Ｍ、ｎ＝９マウスの３つの実験による、ビヒクル対照と比較した、ｄｍＰＧＥ_２処置細胞
に関する細胞周期における倍数増加を組み合わせたデータである。細胞周期におけるＳＫ
Ｌ細胞の割合を、ＦＡＣＳにより測定した。ゲーティングされたＳＫＬ細胞の細胞周期分
布を示す代表的フロープロットであり、それぞれ個別にアッセイした平均±ＳＥＭ、ｎ＝
９マウスの３つの実験による、ビヒクル対照と比較した、ｄｍＰＧＥ_２処置細胞に関する
細胞周期における倍数増加を組み合わせたデータである。

[実施例１３．ＰＧＥ_２は、ｉｎ ｖｉｔｒｏの高度に精製されたＣＤ１５０^＋４８⁻（
ＳＬＡＭ）ＳＫＬ細胞の細胞周期速度を増加させる。]
ここで図８を参照すると、ビヒクルまたは１マイクロモル濃度のｄｍＰＧＥ_２どちらか
を用いて２時間処置し、成長因子（５０ｎｇ／ｍｌのｒｍＳＣＦ、それぞれ１００ｎｇ／
ｍｌのｒｈＦｌｔ−３およびｒｈＴＰＯ）の存在下で２０時間培養し、ＳＬＡＭ ＳＫＬ
、Ｈｏｅｃｈｓｔ−３３３４２およびＰｙｒｏｎｉｎ−Ｙに対して染色し、細胞周期のＧ
_０、Ｇ_１、ＳおよびＧ_２／Ｍ期にあるＳＬＡＭ ＳＫＬ細胞の割合を、ＦＡＣＳによるＤ
ＮＡおよびＲＮＡ含有量の定量化によって決定したＬｉｎ^ｎｅｇ骨髄細胞を使用して収集
したデータを要約した表である。データは、それぞれ個別にアッセイしたｎ＝９マウスに
関する平均±ＳＥＭである。^（ｂ）Ｇ_１＋Ｓ＋Ｇ_２Ｍにある細胞のパーセント；ｎ＝９マ
ウスに関する組み合わせデータ。^（＊）ビヒクル対照と比較してＰ＜０．０５。

[実施例１４．ＰＧＥ_２へのパルス曝露は、ｉｎ ｖｉｖｏでホーミングしたＳＫＬ細胞
の増殖および細胞周期速度を増加させる。]
ＣＤ４５．１Ｌｉｎｅａｇｅ^ｎｅｇ骨髄細胞を、ｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルを用いて
処置し、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．２マウスに移植した。移植直後、ＢｒｄＵを
飲料水中に提供し、ＩＰ注射によって投与した。１６時間後骨髄を分析し、ＢｒｄＵ^＋で
あったＣＤ４５．１^＋、ＳＫＬ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析により分析した。ここで図１
３を参照すると、ＣＤ４５．１Ｌｉｎ^ｎｅｇ骨髄細胞をｄｍＰＧＥ_２またはビヒクルを用
いて処置し、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．２マウスに移植した。移植直後、Ｂｒｄ
Ｕを飲料水中に提供し、ＩＰ注射によって投与した。１６時間後骨髄を分析し、ＢｒｄＵ
^＋であったＣＤ４５．１^＋、ＳＫＬ細胞の割合を、ＦＡＣＳ分析により分析した。ＰＧＥ
_２を用いて処置したＳＫＬ細胞がより高い割合で骨髄にホーミングした。データは、平均
±ＳＥＭ、ｎ＝５／マウス／群であり、それぞれ個別にアッセイした。

[実施例１５．幹細胞の長期再構築活性は、ＰＧＥ_２のパルス曝露後に維持される。]
１対１競合分析のために、ＣＤ４５．１およびＣＤ４５．２マウス由来のＷＢＭを、ビ
ヒクルまたはｄｍＰＧＥ_２を用いて処置し、様々な割合で２×１０^５のＣＤ４５．１／Ｃ
Ｄ４５．２マウス由来の競合骨髄細胞と混合し、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．１／
ＣＤ４５．２マウスに移植した。ＰＢ中のＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．
１／ＣＤ４５．２細胞の割合を、月１回決定した。二次、三次および四次移植のために、
１：１比ですでに移植されたＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウス由来の２×１０^６のＷＢ
Ｍを、致死的に放射線を浴びたＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２マウスに非競合的様式で注射
した。ＰＢ中のＣＤ４５．１、ＣＤ４５．２およびＣＤ４５．１／ＣＤ４５．２細胞の割
合を、月１回決定した。ここで図１４を参照すると、一次移植の２０週目（二次移植の時
）およびサブコホートにおける３２週目（二次移植の１２週目分析の時）、二次移植の１
２週および２４週目、三次および四次移植も同様にそれぞれ１２週目に関する、ｄｍＰＧ
Ｅ_２処置細胞対ビヒクルのキメラ現象の増加である。２０週の一次移植に関するデータは
、それぞれ個別にアッセイした、ｎ＝５マウス／群／実験の２つのプールした実験からで
ある。二次、三次および四次移植に関するデータは、それぞれ個別にアッセイした、ｎ＝
５マウス／群からである。

[実施例１６．インドメタシンおよびＧ−ＣＳＦに関する末梢血幹細胞（ＰＢＳＣ）の動
員レジメン。]
マウスに、ゼラチン中の１５０マイクログラム／ｋｇのインドメタシンまたは１５０マ
イクログラム／ｋｇのバイカレイン（リポキシゲナーゼ阻害剤）を、Ｇ−ＣＳＦと共に、
または無しで４８時間ごとに４日間のＳＣ処置を与えた。ＣＦＵ−ＧＭの動員を、すでに
記載のように決定した（Ｐｅｌｕｓら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇ
ｙ３３巻（２００５年）２９５〜３０７頁）。ここで図７Ａおよび７Ｂを参照すると、シ
クロオキシゲナーゼ二重阻害剤のインドメタシンおよびＧ−ＣＳＦの併用は、マウスＨＳ
ＰＣを相乗的に動員している。１５０μｇ／ｋｇインドメタシンまたは１５０ｕｇ／ｋｇ
のバイカレイン（リポキシゲナーゼ阻害剤）を単独で（図７Ａ）、またはＧ−ＣＳＦと一
緒に（図７Ｂ）４日間、毎日ＳＣ投与することによるＣＦＵ−ＧＭの動員に関する効果で
ある。データは、それぞれアッセイした、Ｎ＝３マウスの動員されたＣＦＵ−ＧＭ／血液
ｍｌの平均±ＳＥＭとして表す。

ここで図１６を参照すると、マウスは、Ｇ−ＣＳＦ（１マイクログラム／マウス）また
はＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（５０マイクログラム／マウス）を４日間、１日２回の（
bid）ＳＣ注射で毎日与えられた。ＣＦＵ−ＧＭの動員を記載（Ｐｅｌｕｓら、Ｅｘｐｅ
ｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３３巻（２００５年）２９５〜３０７頁）の
ように決定した。併用して処置されたマウスは、Ｇ−ＣＳＦだけで処置された動物よりも
ＣＦＵ−ＧＭ／単位においてより大きな倍数増加を実証した。

上記のレジメンにより動員されたマウスの末梢血に由来する低密度の単核細胞を、ＦＡ
ＣＳ分析によりＨＳＰＣに関して分析した。ＳＫＬおよびＳＬＡＭ−ＳＫＬの検出のため
に、細胞を、Ｓｃａ−１−ＰＥ−Ｃｙ７、ｃ−ｋｉｔ−ＡＰＣ、ＣＤ１５０−ＰＥＣｙ５
、ＣＤ４８−ＦＩＴＣ、Ｌｉｎｅａｇｅ Ｃｏｃｋｔａｉｌ−Ｂｉｏｔｉｎを用いて染色
し、ストレプトアビジン−ＡＰＣ−Ｃｙ７を用いて二次染色した。ここで図１７を参照す
ると、分析は、ＢＤ−ＬＳＲＩＩにおいて実施された。Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦおよ
びインドメタシンの併用により処置されたマウスの末梢血において、表現型的に規定され
たＨＳＰＣのフローサイトメトリ分析である。それぞれ個別にアッセイされたＮ＝５マウ
ス／群。

[実施例１７．インドメタシン＋ＡＭＤ３１００による併用動員がＨＳＰＣを動員する。]
マウスに、ビヒクルまたはインドメタシン（５０マイクログラム／マウス）を、４日間
毎日、１日２回（bid）ＳＣ注射した。５日目に、マウスに、ビヒクルまたはＡＭＤ３１
００（５ｍｇ／ｋｇ）のどちらかを与えた。１時間後、マウスを犠牲にし、ＣＦＵ−ＧＭ
の動員を、先に記載（Ｐｅｌｕｓら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ
３３巻（２００５年）２９５〜３０７頁）のように決定した。ここで図１８を参照する
と、ビヒクルまたはインドメタシン処置単独によるＣＦＵ−ＧＭの動員である（左パネル
）。ＡＭＤ３１００またはインドメタシン処置＋ＡＭＤ３１００の単回投与によるＣＦＵ
−ＧＭの動員のグラフである（右パネル）。データは、それぞれ個別にアッセイされたＮ
＝５マウス／群の平均±ＳＥＭとして表す。

[実施例１８．インドメタシンを、様々な動員レジメンと併用して用いた動員効率の比較]
マウスを、ビヒクル、インドメタシン（５０マイクログラム／マウス、１日２回ＳＣ、
４日間）、ＡＭＤ３１００（５ｍｇ／ｋｇ、５日目）、Ｇ−ＣＳＦ（１マイクログラム／
マウス、１日２回ＳＣ、４日間）、ＡＭＤ３１００＋ＧＲＯβ（それぞれ、５ミリグラム
／ｋｇおよび２０ミリグラム／ｋｇ、５日目）、ＡＭＤ３１００＋インドメタシン（イン
ドメタシン５０マイクログラム／マウス、１日２回４日間；ＡＭＤ３１００ ５ミリグラ
ム／ｋｇ ５日目）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（それぞれ、１マイクログラムお
よび５０マイクログラム、１日２回ＳＣ、４日間）により処置した。ＣＦＵ−ＧＭの動員
を、先に記載（Ｐｅｌｕｓら、Ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３３
巻（２００５年）２９５〜３０７頁）のように決定した。ここで図１９を参照すると、上
に要約した様々な処置レジメンに関してプロットしたＣＦＵ−ＧＭ／末梢血ｍＬである。

マウスを、ビヒクル、Ｇ−ＣＳＦ（１マイクログラム／マウス、１日２回 ＳＣ、４日
間）、Ｇ−ＣＳＦ＋インドメタシン（５０マイクログラム／マウス、１日２回 ＳＣ、４
日間）またはＧ−ＣＳＦ＋メロキシカム（０．３ｍｇ／ｋｇ、１日２回 ＳＣ、４日間）
により処置した。ＣＦＵ−ＧＭの動員を、先に記載（Ｐｅｌｕｓら、 Ｅｘｐｅｒｉｍｅ
ｎｔａｌ Ｈｅｍａｔｏｌｏｇｙ ３３巻（２００５年）２９５〜３０７頁）のように決
定した。ここで図２０を参照すると、インドメタシン＋Ｇ−ＣＳＦおよび同様に作用する
ＮＳＡＩＤのメロキシカム＋Ｇ−ＣＳＦにより誘導される動員の比較を例示する棒グラフ
である。データは、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝５マウス／群の平均±ＳＥＭと
して表す。

[実施例１９．ＮＳＡＩＤを時間差投与（staggered dosing）することにより、ＨＳＰＣ
におけるＣＸＣＲ４の発現の回復が可能になる。]
ＣＤ４５．１マウスを、Ｇ−ＣＳＦ（１マイクログラム／マウス、１日２回、ＳＣ、４
日間）またはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（５０マイクログラム／マウス、１日２回、Ｓ
Ｃ、４日間）を用いて動員し、末梢血単核細胞（ＰＢＭＣ）を５日目に採取した。ＰＢＭ
Ｃを、様々な比率でＣＤ４５．２骨髄と混合し、致死的に放射線を浴びた（１１００ｃＧ
ｙ、分割線量）ＣＤ４５．２マウスに移植した。ここで図２１を参照すると、移植後１２
週目の競合的再構築単位を示す（左パネル）。データは、それぞれ個別にアッセイされた
Ｎ＝５マウス／群／実験の２つの実験から、平均±ＳＥＭとして表す。Ｇ−ＣＳＦ単独と
比較して、インドメタシンとＧ−ＣＳＦとの同時投与により動員されたＰＢＭＣの生着に
改善がなかったので、ホーミングの欠損は、ＣＸＣＲ４受容体の発現の減少の結果として
起こると思われ、これは、インドメタシン処置とＧ−ＣＳＦ処置とに時間差を与えること
によって緩和できるという仮説を立てた。ＣＤ４５．２マウスを、Ｇ−ＣＳＦ（１マイク
ログラム／マウス、１日２回、ＳＣ、４日間）、時間差無しのＧ−ＣＳＦ＋インドメタシ
ン（５０マイクログラム／マウス、１日２回、ＳＣ、４日間）、１日の時間差のＧ−ＣＳ
Ｆ＋インドメタシン（インドメタシンを１日目に開始し４日間与え、Ｇ−ＣＳＦをインド
メタシン処置の２日目から開始して４日間与え、ＰＢＭＳの採取前に、Ｇ−ＣＳＦを与え
るが、インドメタシンは与えない日を１日作る）または２日の時間差のＧ−ＣＳＦ＋イン
ドメタシン（インドメタシンを１日目に開始し４日間与え、Ｇ−ＣＳＦをインドメタシン
処置の３日目から開始して４日間与え、ＰＢＭＳの採取前に、Ｇ−ＣＳＦを与えるが、イ
ンドメタシンは与えない日を２日作る）により動員した。ここで図２１を参照すると（右
パネル）、ＳＫＬ細胞におけるＣＸＣＲ４の発現を示す。データは、それぞれ個別にアッ
セイされた、Ｎ＝５マウス／群の平均±ＳＥＭとして表す。

[実施例２０．Ｇ−ＣＳＦ＋ＮＳＡＩＤ処置マウス由来の動員ＰＢＳＣは、Ｇ−ＣＳＦ単
独により動員されたＰＢＳＣと比較して、有意に強化された長期幹細胞機能を示す。]
ＣＤ４５．１マウスを、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ＋インドメタシン（１日ずらして
）を用いて動員し、ＰＢＭＣを、ＣＤ４５．２競合骨髄細胞と共に致死的に放射線を浴び
たＣＤ４５．２マウスに移植した。ここで図２２を参照すると、移植後１２週目における
、複数ドナーのキメラ現象：競合相手の比（左パネル）および競合的再構築単位（右パネ
ル）を示す。データは、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝５マウス／群の平均±ＳＥ
Ｍとして表す。

[実施例２１．Ｇ−ＣＳＦ＋ＮＳＡＩＤにより動員されたマウス由来のＰＢＳＣは、致死
的に放射線を浴びたマウスに移植した場合、Ｇ−ＣＳＦ単独により動員されたＰＢＳＣと
比較して、末梢血好中球のカウントがより早く復元される。]
マウスを、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦ＋メロキシカム（１日ずらして）を用いて動員
し、２×１０^６のＰＢＭＣを、致死的に放射線を浴びたレシピエントに移植した。血中好
中球を、Ｈｅｍａｖｅｔ９５０ＦＳ（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、（対照
のサブセットと比較して）完全に回復するまで１日おきに数えた。血中血小板を、Ｈｅｍ
ａｖｅｔ９５０ＦＳ（Ｄｒｅｗ Ｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃ）により、（対照のサブセットと
比較して）完全に回復するまで１日おきに数えた。ここで図２３を参照すると、末梢血（
ＰＢ）中の好中球は、（対照のサブセットと比較して）完全に回復するまで１日おきに数
えられた。これらのデータは、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝１０マウス／群の平
均±ＳＥＭとして表す。ここで図２４を参照すると、末梢血（ＰＢ）中の血小板は（対照
のサブセットと比較して）完全に回復するまで１日おきに数えられた。これらのデータは
、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝１０マウス／群の平均±ＳＥＭとして表す。

[実施例２２．Ｇ−ＣＳＦおよびメロキシカムの、ヒヒにおける細胞動員に関する効果の
決定]
ここで図２５を参照すると、ヒヒの第１群を、以下の１０ｕｇ／体重ｋｇのＧ−ＣＳＦ
の投与レジメン処置を用いて動員し、次いで２週間の洗い流し期間後に、動物を、１０ｕ
ｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ＋０．１ｍｇ／ｋｇのメロキシカムを用いて処置した。ヒヒの第２
群を、以下の１０ｕｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦ＋０．１ｍｇ／ｋｇのメロキシカムのレジメン
を用いて動員し、２週間の洗い流し期間後、１０ｕｇ／ｋｇのＧ−ＣＳＦを用いる期間で
あった。ここで図２６を参照すると、ＰＢ中のＣＤ３４^＋細胞がＦＡＣＳ分析により決定
され、先に記載のようにＣＦＵ−ＧＭ／血液ｍｌを決定した。Ｇ−ＣＳＦとメロキシカム
との同時投与は、ＣＤ３４^＋細胞の動員を増加させ（左パネル）、取り出した血液単位当
たりのＣＦＵ−ＧＭを測定した。

[実施例２３．マウスにおけるＰＢＳＣ動員の最適な強化は、ＣＯＸ１およびＣＯＸ２の
酵素両方の阻害を必要とする。]
マウスを、Ｇ−ＣＳＦ用いて動員し、ＰＢ中のＣＦＵ−ＧＭを、Ｇ−ＣＳＦおよび様々
なＮＳＡＩＤＳ（アスピリン［ＣＯＸ−１およびＣＯＸ−２］；リコフェロン［ＣＯＸ−
２および５−ＬＯＸ］；ＳＣ−５６０［ＣＯＸ１］；サリチル酸バレリル［ＣＯＸ−１］
；バルデコキシブ［ＣＯＸ−２］；ＮＳ−３９８［ＣＯＸ−２］）との併用による動員レ
ジメンと比較した。ここで図２７を参照すると、これら試験の結果が要約されており、こ
れらのデータは、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝４マウス／群の平均±ＳＥＭとし
て表される。ＣＯＸ１および２の両方を阻害することが公知である化合物は、２種のアイ
ソザイムの１種だけに対して高度に選択性であると思われる化合物より、コロニー形成細
胞の動員においてより優れていた。２種の一般的に使用されるＣＯＸ阻害剤の効率を試験
するために、マウスを、Ｇ−ＣＳＦまたはＧ−ＣＳＦと、アスピリンまたはイブプロフェ
ンとの併用により動員した（ＰＯ、１日２回、４日間）。ＣＦＵ−ＧＭを先に記載のよう
に決定した。ここで図２８を参照すると、Ｇ−ＣＳＦ＋アスピリンおよびＧ−ＣＳＦ＋イ
ブプロフェンによる、ＣＦＵ−ＧＭの末梢血への動員の用量反応分析は、Ｇ−ＣＳＦだけ
で処置したマウスの対照群；Ｇ−ＣＳＦ＋１０、２０または４０ミリグラム／ｋｇのアス
ピリンを用いて処置したマウス；およびＧ−ＣＳＦ＋１０、２０または４０ミリグラム／
ｋｇのイブプロフェンを用いて処置したマウスに関して棒グラフの形態で提示される。デ
ータは、それぞれ個別にアッセイされた、ｎ＝４マウス／群の平均±ＳＥＭとして表す。

[実施例２４．マウスにおけるＣＦＵに対するメロキシカムの用量依存性効果の測定]
マウスを、Ｇ−ＣＳＦおよび以下のメロキシカム用量、メロキシカムに対して０．０（
対照）、０．０２、０．２、０．５、１．５および３ミリグラム／体重ｋｇを用いて動員
し（１日２回、ＳＣ、４日間）、ＣＦＵ−ＧＭを先に記載のように決定した。ここで図２
９を参照するとＨＳＰＣに対するメロキシカムの用量反応は、動物の末梢血、または動物
の骨髄において測定された（図３０）。これらのデータは、それぞれ個別にアッセイされ
た、ｎ＝３マウス／群の平均±ＳＥＭとして表す。

図面および前述の説明において、新規な技術を例示し、詳細に説明したが、それらは例示として考えるべきであり、特徴を限定するものではなく、好ましい実施形態が示され説明されただけで、新規の技術の精神の範囲内で思いつくすべての変更および改良は、保護されることが望ましいと理解されるべきである。同様に、新規の技術を、特定の実施例、理論的議論、根拠および図解を使用して例示したが、これらの例示および添付の考察は、決して技術を限定するように解釈されない。本出願において参照したすべての特許、特許出願およびテキスト、科学論文、刊行物に対する参考文献などは、参照によりそれらの全体が本明細書に組み込まれる。

本発明は以下の態様を含み得る。
［１］
造血幹細胞および／または前駆細胞の供給源を特定するステップ、
ＰＧＥ _２ の活性を減少させる化合物を提供するステップ、ならびに
造血幹細胞および／または前駆細胞の供給源と、前記細胞および周辺のＰＧＥ _２ 活性を減少させる有効量の前記化合物とを接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する方法。
［２］
ＰＧＥ _２ 活性を減少させる化合物が非ステロイド系抗炎症性化合物である、請求項１に記載の方法。
［３］
非ステロイド系抗炎症性化合物が、シクロオキシゲナーゼ−１およびシクロオキシゲナーゼ−２の両方に作用する、請求項２に記載の方法。
［４］
非ステロイド系抗炎症性化合物が、主にシクロオキシゲナーゼ−２に作用する、請求項３に記載の方法。
［５］
非ステロイド系抗炎症性化合物が、アスピリン、セレコキシブ、ロフェコキシブ、エトリコキシブ、バルデコキシブ、イブプロフェン、ナプロキセン、ジクロフェナク、エトドラク、ケトロラクおよびリコフェロンからなる群から選択される、請求項２に記載の方法。
［６］
非ステロイド系抗炎症性化合物がインドメタシンである、請求項２に記載の方法。
［７］
非ステロイド系抗炎症性化合物がメロキシカムある、請求項２に記載の方法。
［８］
非ステロイド系抗炎症性化合物が、造血幹細胞および前駆細胞の動員を強化する少なくとも１種の追加の化合物との同時処置で、オーバーラップした期間患者に投与される、請求項２に記載の方法。
［９］
造血幹細胞および／または前駆細胞の動員を強化する追加の化合物が、Ｇ−ＣＳＦおよびプレリキサフォルからなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
［１０］
非ステロイド系抗炎症性化合物が少なくとも３日間患者に投与される、請求項２に記載
の方法。
［１１］
少なくとも１種のＰＧＥ _２ 受容体のアンタゴニストである化合物を提供するステップ、ならびに
ドナーから造血幹細胞および前駆細胞を採取する前に、有効量の前記化合物を造血幹細胞および／または前駆細胞ドナーに投与するステップ、
を含む、ドナー由来の造血幹細胞および／または前駆細胞の動員を強化する方法。
［１２］
少なくとも１種のＰＧＥ _２ 受容体のアンタゴニストが、Ｎ−［［４’−［［３−ブチル−１，５−ジヒドロ−５−オキソ−１−［２−（トリフルオロメチル）フェニル］−４Ｈ−１，２，４−トリアゾール−４−イル］メチル］［１，１’−ビフェニル］−２−イル］スルホニル］−３−メチル−２−チオフェンカルボキシアミドおよび４−（４，９−ジエトキシ−１，３−ジヒドロ−１−オキソ−２Ｈ−ベンズ［ｆ］イソインドール−２−イル）−Ｎ−（フェニルスルホニル）−ベンゼンアセトアミドからなる群から選択される、請求項１１に記載の方法。
［１３］
供給源においてＰＧＥ _２ 活性を減少させる少なくとも１種の化合物を用いて処置された、当該供給源由来の造血幹細胞および／または前駆細胞を含む細胞の群を採取するステップ、
造血幹細胞および前駆細胞のセットと、ＰＧＥ _２ 活性とをｅｘ ｖｉｖｏにおいて接触させるステップ、および
ｉｎ ｖｉｖｏにおいてＰＧＥ _２ 活性を有する前記化合物と接触させた、前記造血幹細胞および前駆細胞をレシピエント内に移植するステップ、
を含む、レシピエントにおいて造血幹細胞および／または前駆細胞の生着を強化する方法。
［１４］
造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、骨髄ドナーから取り出される骨髄の試料である、請求項１３に記載の方法。
［１５］
造血幹細胞および前駆細胞の供給源が、血液ドナーから取り出される血液の試料である、請求項１３に記載の方法。
［１６］
細胞の供給源が、臍帯または胎盤である、請求項１３に記載の方法。
［１７］
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物を提供するステップ、ならびに
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物と、造血幹細胞および前駆細胞の集団をｅｘ ｖｉｖｏで接触させるステップ、
を含む、造血幹細胞および前駆細胞の生着率を増加させる方法。
［１８］
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物が、ＰＧＥ _２ またはｄｍＰＧＥ _２ からなる群から選択される、請求項１７に記載の方法。
［１９］
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物が、細胞集団と少なくとも１時間接触する、請求項１７に記載の方法。
［２０］
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、実質的にＰＧＥ _２ 活性を有さない緩衝液を用いて、少なくとも１回洗浄するステップをさらに含む、請求項１７に記載の方法。
［２１］
ＰＧＥ _２ 活性を有する化合物と接触させた細胞集団の少なくとも一部を、患者内に導入するステップをさらに含む、請求項１６に記載の方法。
［２２］
形質導入のための少なくとも１種の対象遺伝子を含有するウィルスベクターを提供するステップ、
有効量の、ＰＧＥ _２ 活性を有する分子によってｅｘ ｖｉｖｏにおいて処置された少なくとも１種の幹細胞を供給するステップ、および
ウィルスベクターで、ＰＧＥ _２ 活性を有する分子によって処置された幹細胞をトランスフェクションするステップ、
を含む、幹細胞におけるウィルス導入効率を強化する方法。
［２３］
ＰＧＥ _２ 活性を有する分子が、ＥシリーズのプロスタグランジンおよびＥシリーズのプロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
［２４］
ＰＧＥ _２ 活性を有する分子が、ＰＧＥ _２ およびｄｍＰＧＥ _２ からなる群から選択される、請求項２２に記載の方法。
［２５］
ＰＧＥ _２ 活性を有する分子を提供するステップ、
造血幹細胞または前駆細胞の移植レシピエントを特定するステップ、および
治療有効量の、ＰＧＥ _２ を有する分子を、移植レシピエントに投与するステップ、
を含む、移植レシピエントにおいて造血幹細胞および／または前駆細胞の生存を強化する方法。
［２６］
ＰＧＥ _２ 活性を有する分子が、ＥシリーズのプロスタグランジンおよびＥシリーズのプロスタグランジンのジメチル誘導体からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。
［２７］
ＰＧＥ _２ 活性を有する分子が、ＰＧＥ _２ およびｄｍＰＧＥ _２ からなる群から選択される、請求項２５に記載の方法。

（参考文献）

Claims (6)

1. 有効量の、ＰＧＥ _２ または１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ _２ で、少なくとも１種の造血幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて処置するステップ、および
   形質導入のための少なくとも１種の対象遺伝子を含有するレトロウィルスベクターで、前記造血幹細胞を形質導入するステップ、
   を含み、前記造血幹細胞のレトロウィルスの導入効率が未処置の造血幹細胞と比較して強化される、
   幹細胞遺伝子治療用の造血幹細胞におけるレトロウィルスベクターの導入効率を強化する方法。
2. 前記ＰＧＥ _２ または１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ _２ で、造血幹細胞を１〜6時間処置する、請求項１に記載の方法。
3. 遺伝子療法のための造血幹細胞におけるレトロウィルスベクターの導入効率を強化する方法に使用するための、ＰＧＥ _２ または１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ _２ を含む剤。
4. 前記方法が、
   有効量の、ＰＧＥ _２ または１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ _２ で、少なくとも１種の造血幹細胞をｅｘ ｖｉｖｏにおいて処置するステップ、および
   形質導入のための少なくとも１種の対象遺伝子を含有するレトロウィルスベクターで、前記造血幹細胞を形質導入するステップ、
   を含む、請求項３に記載の剤。
5. 前記ＰＧＥ _２ または１６，１６−ジメチルプロスタグランジンＥ _２ で、造血幹細胞を１〜6時間処置する、請求項４に記載の剤。
6. 前記方法が、形質導入された造血幹細胞を患者に生着させることをさらに含む、請求項３に記載の剤。