JP2022512540A - Ｆｌｔ３ｌ系キメラタンパク質 - Google Patents

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Abstract

本発明は、特に、がんなどの疾患の治療において使用が見出される、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、キメラタンパク質を含む、組成物及び方法に関する。

Description

優先権
本出願は、２０１８年８月２９日に出願された米国仮出願第６２／７２４，５９６号の利益及び優先権を主張し、その内容は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、特に、がん及び自己免疫のための免疫療法など、疾患の治療において使用が見出されるキメラタンパク質を含む組成物及び方法に関する。
電子的に提出されたテキストファイルの記載
本出願は、配列表を含む。それは、「ＳＨＫ－０１０ＰＣ＿ＳｅｑｕｅｎｃｅＬｉｓｔｉｎｇ＿ＳＴ２５」と題されたＡＳＣＩＩテキストファイルとしてＥＦＳ－Ｗｅｂを経由して電子的に送信されている。配列表は、サイズが４０，８３９バイトであり、２０１９年８月２８日に作製された。配列表は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
免疫系は、疾患の原因となり得る異物に対する体の応答及びがん細胞に対する体の応答の中核である。しかしながら、多くの抗がん療法は、免疫応答を直接的に刺激及び／または活性化しない。したがって、少なくとも患者の抗がん免疫応答を直接的に刺激及び／または活性化する療法を開発する必要性が残っている。
したがって、様々な態様では、本発明は、がん免疫療法に有用な組成物及び方法を提供する。例えば、本発明は、部分的に、例えば樹状細胞を拡充及び活性化するような、免疫活性化または共刺激シグナルを提供する特異的キメラタンパク質に関する。
本発明は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、キメラタンパク質に関する。実施形態では、かかるキメラタンパク質は、キメラタンパク質の各ドメインが独立して単一の免疫系細胞を刺激することができるか、または一対の免疫系細胞を同時にまたは同時期に刺激することができるため、「二重共刺激」能力を有する。
ＦＬＴ３Ｌを含む、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、タンパク質のアミノ末端に位置し（非限定的な例として、図１Ａの左のタンパク質を参照されたい）、一方でＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、タンパク質のカルボキシ末端に位置する（非限定的な例として、図１Ａの右のタンパク質を参照されたい）。ＦＬＴ３Ｌを含む、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含み（図１Ｂ、左のタンパク質を参照されたい）、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインには、細胞外環境で他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む（図１Ｂ、右のタンパク質を参照されたい）。
本発明の態様は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般的な構造を含むキメラタンパク質を提供し、式中、（ａ）は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカー、例えば、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含む、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーであり、（ｃ）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは、第１のドメイン及び第２のドメインを接続する。非限定的な例として、図１Ｃ及び図１Ｄを参照されたい。
本発明の態様は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般的な構造を含むキメラタンパク質を提供し、式中、（ａ）は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカー、例えば、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含む、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーであり、（ｃ）は、ＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、ＴＬ１Ａ、ＣＤ７０、及びＧＩＴＲＬのうちのいずれか１つの細胞外ドメインを含む、第２のドメインである。これらの態様のキメラタンパク質は、図１Ｃまたは図１Ｄに示される構造を有し得る。
本発明の他の態様は、本明細書に開示されるようなキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。
本発明のさらに他の態様は、本明細書に開示される発現ベクターを含む宿主細胞を提供する。
態様では、本発明は、治療有効量の本明細書に開示されるキメラタンパク質を含む薬学的組成物を提供する。
他の態様では、本発明は、ウイルス感染に起因するがんを治療する、または炎症性疾患を治療するための方法を提供する。本方法は、有効量の本明細書に開示されるような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
さらに他の態様では、本発明は、患者の免疫応答を調節するための方法を提供する。本方法は、有効量の本明細書に開示されるような薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
Ａ～Ｄは、Ｉ型膜貫通タンパク質（図１Ａ及び図１Ｂ、左のタンパク質）及びＩＩ型膜貫通タンパク質（図１Ａ及び図１Ｂ、右のタンパク質）の概略図を示す。Ｉ型膜貫通タンパク質及びＩＩ型膜貫通タンパク質は、それらの膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインが取り除かれ、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインがリンカー配列を使用して隣接し、単一のキメラタンパク質を生成するように操作され得る。図１Ｃ及び図１Ｄに示されるように、Ｉ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、例えば、ＦＬＴ３Ｌ、ならびにＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、単一のキメラタンパク質に組み合わせる。図１Ｃは、各タンパク質の膜貫通ドメイン及び細胞内ドメインを取り除いたＩ型膜貫通タンパク質及びＩＩ型膜貫通タンパク質の連結を示し、各タンパク質から遊離した細胞外ドメインがリンカー配列によって隣接されている。この描写における細胞外ドメインは、典型的には細胞膜の外側に局在するＩ型タンパク質（例えば、ＦＬＴ３Ｌ）及び／またはＩＩ型タンパク質のアミノ酸配列全体、あるいは意図された受容体またはリガンドとの結合を保持するその任意の一部を含み得る。さらに、キメラタンパク質は、第１の細胞外ドメイン（図１Ｃ及び図１Ｄのキメラタンパク質の左端に示される）がその受容体／リガンドと立体的に結合することができ、及び／または第２の細胞外ドメイン（図１Ｃ及び図１Ｄのキメラタンパク質の右端に示される）がその受容体／リガンドと立体的に結合することができるように、ドメイン間の十分な全体的柔軟性及び／または物理的距離を含む。図１Ｄは、キメラタンパク質の各細胞外ドメインが「外向き」に面する、線形キメラタンパク質における隣接する細胞外ドメインを示す。 本発明に関連する免疫抑制性及び免疫刺激性シグナル伝達タンパク質ならびに相互作用を示す（Ｍａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１５：１４；５６１－５８５から）。 ウエスタンブロットによるネズミＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ ＢＢＬキメラタンパク質の特徴付けを示し、キメラタンパク質の天然状態及び多量体を形成する傾向を示す。ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を伴わない）、例えば、対照を、すべてのブロットのレーン２に負荷した。レーン３中の試料を、還元剤、β－メルカプトエタノールで処理した。レーン４中の試料を、脱グリコシル化剤及び還元剤で処理した。キメラタンパク質の各個々のドメインは、それぞれ抗ＦＬＴ３Ｌ、抗Ｆｃ、または抗４－１ＢＢＬ抗体を使用してプローブした。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬのｍＦＬＴ３Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬのｍＦｃドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬの４－１ＢＢＬドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ウエスタンブロットによるネズミＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示し、キメラタンパク質の天然状態及び多量体を形成する傾向を示す。ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を伴わない）、例えば、対照を、すべてのブロットのレーン２に負荷した。レーン３中の試料を、還元剤、β－メルカプトエタノールで処理した。レーン４中の試料を、脱グリコシル化剤及び還元剤で処理した。キメラタンパク質の各個々のドメインは、それぞれ抗ＦＬＴ３Ｌ、抗Ｆｃ、または抗ＣＤ４０Ｌ抗体を使用してプローブした。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０ＬのｍＦＬＴ３Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０ＬのｍＦｃドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０ＬのｍＣＤ４０Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ウエスタンブロットによるネズミＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示し、キメラタンパク質の天然状態及び多量体を形成する傾向を示す。ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を伴わない）、例えば、対照を、すべてのブロットのレーン２に負荷した。レーン３中の試料を、還元剤、β－メルカプトエタノールで処理した。レーン４中の試料を、脱グリコシル化剤及び還元剤で処理した。キメラタンパク質の各個々のドメインは、それぞれ抗ＦＬＴ３Ｌ、抗Ｆｃ、または抗ＯＸ４０Ｌ抗体を使用してプローブした。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬのｍＦＬＴ３Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬのｍＦｃドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０ＬのｍＯＸ４０Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 図６Ａは、ウエスタンブロットによるネズミＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質の特徴付けを示し、キメラタンパク質の天然状態及び多量体を形成する傾向を示す。ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質の未処理試料（すなわち、還元剤または脱グリコシル化剤を伴わない）、例えば、対照を、すべてのブロットのレーン２に負荷した。レーン３中の試料を、還元剤、β－メルカプトエタノールで処理した。レーン４中の試料を、脱グリコシル化剤及び還元剤で処理した。キメラタンパク質の各個々のドメインは、それぞれ抗ＦＬＴ３Ｌ、抗Ｆｃ、または抗ＧＩＴＲＬ抗体を使用してプローブした。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬのｍＦＬＴ３Ｌドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬのｍＦｃドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬのｍＧＩＴＲＬドメインのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を示すＥＬＩＳＡデータを示す。 Ａは、図３Ｂ、図４Ｂ、図５Ｂ、及び図６ＢからのｍＦＬＴ３ＬドメインＥＬＩＳＡアッセイデータを収集した。Ｂは、図３Ｃ、図４Ｃ、図５Ｃ、及び図６ＣからのｍＦｃドメインＥＬＩＳＡデータを収集した。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ、及びＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌの二重ＥＬＩＳＡデータを示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。ｍＣＤ４０－ｈｉｓ捕捉による親和性を測定するためのＯｃｔｅｔシステムからの結果を示す（上の曲線はｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌであり、中央の曲線はｍＣＤ４０Ｌ－Ｆｃであり、下の曲線はブランクである）。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。ｍＦＬＴ３－ｈｉｓ捕捉による親和性を測定するためのＯｃｔｅｔシステムからの結果を示す（上の曲線はｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌであり、中央の曲線はｍＣＤ４０Ｌ－Ｆｃであり、下の曲線はブランクである）。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。図９Ａ及び図９Ｂのデータの要約を示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。ＮＦｋＢ－ｍＣＤ４０ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。ＣＤ４０Ｌシグナル伝達についてのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｕ２ＯＳ細胞系アッセイを示す（ＮＦｋＢ活性、非標準、上の曲線はｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌであり、中央の曲線はｍＣＤ４０Ｌ－Ｆｃであり、下の曲線は陰性対照である）。 ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付けを示す。Ｆｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。点線は、未処理細胞の最大増殖を示す。有意性は、一方向独立Ｔ検定を使用して決定した。 ＣＨＯ－Ｋ１細胞にマウスＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦｋＢ－ルシフェラーゼレポーターベクターの両方を安定的にトランスフェクトすることによって生成されたＮＦｋＢ－ｍＧＩＴＲレポーター細胞株によるＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ活性の特徴付けを示す（左のバーはｍＧＩＴＲＬ－Ｆｃであり、中央のバーはｍＦＬＴ３－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬであり、右のバーはｍＦＬＴ３－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌである）。 ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。点線は、未処理の細胞の最大増殖を示し、有意性は、一方向独立Ｔ検定を使用して決定した。 ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。点線は、未処理の細胞の最大増殖を示し、有意性は、一方向独立Ｔ検定を使用して決定した。 ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。点線は、未処理の細胞の最大増殖を示し、有意性は、一方向独立Ｔ検定を使用して決定した。 様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの樹状細胞活性化を示す。 様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの血清サイトカインを示す。マウスに９日または１１日間連続して注入し、次いで１０日目または１２日目に腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）／脾臓を単離し、フローサイトメトリで分析した。 様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの血清サイトカインを示す。マウスに９日または１１日間連続して注入し、次いで１０日目または１２日目にＭＬＮ／脾臓を単離し、フローサイトメトリで分析した。
本発明は、部分的に、キメラタンパク質が、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外、またはエフェクター領域、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外、またはエフェクター領域から操作することができるという発見に基づく。これらのＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質は、少なくともがんの治療において、免疫活性化または共刺激シグナルを提供する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の数を増加させる。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示、例えば、腫瘍抗原提示を増強する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫細胞、例えば、樹状細胞に二重共刺激効果を提供する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、サイトカイン発現及び／または分泌を増強する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の活性化、及び抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の増殖の同時効果を提供する。例えば、実施形態では、本発明のキメラタンパク質からのＦＬＴ３系シグナルは、樹状細胞の数を増加させ得、この集団は、刺激シグナル（例えば、本発明のキメラタンパク質からのＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、及び４－１ＢＢＬ）を介して活性化され得る。
興味深いことに、本発明者らは、本発明のキメラタンパク質のどちらの側の活性も失うことなく、または実際に、本発明のキメラタンパク質の個々の側によるシグナル伝達活性を増加させる、本発明のキメラタンパク質のこの二重作用を実証している。別の言い方をすれば、本発明のキメラタンパク質は、活性を犠牲にせず、さらにそれを増加させる方法で、単一の構築物で樹状細胞の同時調節を提供する。
本発明のキメラタンパク質は、使用の容易さ及び産生の容易さを含むがこれらに限定されない利点を提供する。これは、２つの異なる免疫療法剤が、２つの独立した製造プロセスの代わりに単一の製造プロセスを可能にし得る単一の生成物に組み合わせるからである。さらに、２つの別々の薬剤の代わりに単一の薬剤を投与することは、より容易な投与及びより高い患者コンプライアンスを可能にする。
加えて、キメラタンパク質は、２つの免疫調節ドメインを有し得るため、それは２つの異なる免疫刺激経路を活性化または共刺激することができる、したがって、この二重作用は、患者において任意の抗腫瘍効果を提供する、及び／または患者において増強された抗腫瘍効果を提供する可能性がより高い。さらに、本方法は複数の異なる経路によって機能するため、少なくとも、経路のうちの１つを標的とする治療に応答しない、応答が不十分である、または抵抗性となる患者において有効であり得る。したがって、２つの経路のうちの１つを介して作用する治療に対して不十分な応答者である患者は、複数の経路を標的とすることによって治療効果を達成することができる。
キメラタンパク質
本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含み、そのそれぞれが抗がん免疫細胞に対して免疫刺激特性を有する。したがって、キメラタンパク質は、抗がん免疫細胞への免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／または刺激するように設計される。
ＦＬＴ３Ｌは、免疫系細胞の増殖を活性化及び誘導する、サイトカインとして、ならびに成長因子として機能するＩ型膜貫通タンパク質である。ＦＬＴ３Ｌは、その膜貫通形態及びその可溶性形態の両方において生物学的に活性であり、これは、タンパク質の細胞外ドメインをその膜貫通ドメインからタンパク質分解切断した後に生成される。ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（残基１～１３４）は、その受容体結合部位を含み、生物活性に十分であることが示されている。例えば、Ｓａｖｖｉｄｅｓ ｅｔ ａｌ．，“Ｆｌｔ３ ｌｉｇａｎｄ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ａｎｄ ｕｎｅｘｐｅｃｔｅｄ ｃｏｍｍｏｎａｌｉｔｉｅｓ ｏｆ ｈｅｌｉｃａｌ ｂｕｎｄｌｅｓ ａｎｄ ｃｙｓｔｉｎｅ ｋｎｏｔｓ”Ｎａｔ Ｓｔｒｕｃｔ Ｂｉｏｌ．７（６）：４８６－９１（２０００）を参照されたい。
理論に拘束されることを望まないが、ほとんどのＩ型タンパク質とは異なり、ＦＬＴ３Ｌは免疫刺激性であり、ＩＩ型タンパク質と対合される場合、典型的には免疫刺激性でもあるが、二重共刺激免疫効果を提供する。
本発明の態様は、Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端の一般的な構造を含むキメラタンパク質を提供し、式中、（ａ）は、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、（ｂ）は、第１のドメイン及び第２のドメインに隣接するリンカー、例えば、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含む、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカーであり、（ｃ）は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインであり、リンカーは、第１のドメイン及び第２のドメインを接続する。
本発明のキメラタンパク質では、第１のドメインが実質的にＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン全体を含み得、及び／または第２のドメインが実質的にＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含み得る。
本発明のキメラタンパク質では、第１のドメイン及び／または第２のドメインは、免疫刺激シグナルを活性化することが可能であり得る。
本発明のキメラタンパク質では、キメラタンパク質は、組換え融合タンパク質、例えば、本明細書に開示される細胞外ドメインを有する単一のポリペプチドである。例えば、実施形態では、キメラタンパク質は、原核細胞、真核細胞、または無細胞発現系において単一の単位として翻訳される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、分泌可能及び完全な機能性単一ポリペプチド鎖として哺乳動物宿主細胞において生成可能である。
実施形態では、キメラタンパク質は、複数のポリペプチド、例えば、本明細書に開示される複数の細胞外ドメインの組換えタンパク質を指し、それらを組み合わせて（共有または非共有結合を介して）、例えば、インビトロで単一の単位（例えば、本明細書に開示される１つ以上の合成リンカーと共に）を生成する。
実施形態では、キメラタンパク質は、１つのポリペプチドとして化学的に合成されるか、または各ドメインは、別々に化学的に合成され、次いで組み合わされ得る。実施形態では、キメラタンパク質の一部が翻訳され、一部が化学的に合成される。
実施形態では、細胞外ドメインは、細胞外環境と相互作用することが可能である膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態では、細胞外ドメインは、リガンドまたは受容体と結合するのに十分であり、細胞にシグナルを伝達するのに有効である膜貫通タンパク質の一部を指す。実施形態では、細胞外ドメインは通常、細胞または細胞膜の外部に存在する膜貫通タンパク質のアミノ酸配列全体である。実施形態では、細胞外ドメインは、細胞または細胞膜の外部にあり、当技術分野で既知である方法を使用してアッセイされ得るような（例えば、インビトロでのリガンド結合及び／または細胞活性化アッセイ）、シグナル伝達及び／またはリガンド結合に必要とされる膜貫通タンパク質のアミノ酸配列の一部である。
膜貫通タンパク質は典型的に、細胞外ドメイン、１つまたは一連の膜貫通ドメイン、及び細胞内ドメインからなる。理論に拘束されることを望まないが、膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、可溶性受容体またはリガンドまたは膜結合受容体またはリガンド（すなわち、隣接する細胞の膜）との相互作用に関与する。理論に拘束されることを望まないが、膜貫通ドメイン（複数可）は、膜貫通タンパク質を原形質膜に局在化させる原因となる。理論に拘束されることを望まないが、膜貫通タンパク質の細胞内ドメインは、細胞内シグナル伝達分子との相互作用を調整して、細胞内応答を細胞外環境と調整する（またはその逆）原因となる。
シングルパス膜貫通タンパク質には、一般的に２つの種類があり、細胞外アミノ末端及び細胞内カルボキシ末端を有するＩ型膜貫通タンパク質（図１Ａ、左のタンパク質を参照されたい）、及び細胞外カルボキシ末端及び細胞内アミノ末端を有するＩＩ型膜貫通タンパク質（図１Ａ、右のタンパク質を参照されたい）である。Ｉ型及びＩＩ型膜貫通タンパク質は、受容体またはリガンドのいずれかであり得る。Ｉ型膜貫通タンパク質について、タンパク質のアミノ末端は、細胞の外側を向いており、したがって、細胞外環境において他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む（図１Ｂ、左のタンパク質を参照されたい）。ＩＩ型膜貫通タンパク質について、タンパク質のカルボキシ末端は、細胞の外側を向いており、したがって、細胞外環境において他の結合パートナー（リガンドまたは受容体のいずれか）との相互作用に関与する機能ドメインを含む（図１Ｂ、右のタンパク質を参照されたい）。したがって、これらの２つの種類の膜貫通タンパク質は、細胞膜に対して互いに反対の配向を有する。
本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む。したがって、本発明のキメラタンパク質は、少なくとも、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインを含む第１のドメインを含み、これは、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む第２のドメインと直接的にまたはリンカーを介して接続される。図１Ｃ及び図１Ｄに示されるように、ドメインがアミノ末端からカルボキシ末端の配向に連結される場合、第１のドメインは、キメラタンパク質の「左」に位置し、かつ「外向き」となり、第２ドメインは、キメラタンパク質の「右」に位置し、かつ「外向き」となる。
第１及び第２のドメインの他の構成、例えば、第１のドメインが外向きであり、かつ第２のドメインが内向きであること、第１のドメインが内向きであり、かつ第２のドメインが外向きであること、第１及び第２のドメインが両方とも内向きであることが想定される。両方のドメインが「内向き」である場合、キメラタンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン、リンカー、及びＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインを含む、アミノ末端からカルボキシ末端への構成を有するであろう。かかる構成では、それは、キメラタンパク質がその受容体／リガンドの一方または両方と結合することを可能にするために、本明細書の他の場所に記載されるように、キメラタンパク質が余分な「緩み」を含むことが必要であり得る。
構築物は、３つの断片をコードする核酸（ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、それに続くリンカー配列、それに続くＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン）をベクター（プラスミド、ウイルス、またはその他）にクローニングすることによって生成でき、完全な配列のアミノ末端は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインを含む分子の「左側」に対応しており、完全な配列のカルボキシ末端は、ＩＩ型膜貫通タンパク質を含む分子の「右側」に対応する。上記に記載されるように、他の構成の１つを有するキメラタンパク質の実施形態では、構築物は、生成される翻訳されたキメラタンパク質が所望の構成、例えば、二重の内向きのキメラタンパク質を有するように、３つの核酸を含むであろう。したがって、実施形態では、キメラタンパク質は、そのように操作される。
本発明のキメラタンパク質は、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第１のドメイン、及び／またはそのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第２のドメインを有する。これは、細胞外ドメインのリガンド／受容体結合ドメインがそのリガンド／受容体の結合を立体的に妨げられないように、キメラタンパク質及び／または細胞外ドメイン（またはその一部）と残りのキメラタンパク質との間の物理的距離に十分な全体的な柔軟性があることを意味する。この柔軟性及び／または物理的距離（本明細書では「緩み」と称される）は通常、細胞外ドメイン（複数可）に存在し、通常はリンカーに存在し、及び／または通常はキメラタンパク質に（全体として）存在し得る。代替的にまたは追加的に、キメラタンパク質は、立体障害を回避するために必要な追加の緩みを提供する１つ以上の追加のアミノ酸配列（例えば、以下に記載される結合リンカー）または合成リンカー（例えば、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカー）を含むことによって修飾され得る。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、Ｍａｈｏｎｅｙ，Ｎａｔｕｒｅ Ｒｅｖｉｅｗｓ Ｄｒｕｇ Ｄｉｓｃｏｖｅｒｙ ２０１５：１４；５６１－５８５に記載される免疫調節剤のうちの１つ以上の細胞外ドメインを含み、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＦＬＴ３Ｌの既知のアミノ酸配列、例えば、ヒトＦＬＴ３Ｌと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ｚｏｒｎ，ｅｔ ａｌ．（２０１５）“Ｃｒｙｓｔａｌ Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ＦＬＴ３ Ｋｉｎａｓｅ Ｄｏｍａｉｎ Ｂｏｕｎｄ ｔｏ ｔｈｅ Ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ Ｑｕｉｚａｒｔｉｎｉｂ（ＡＣ２２０）．”ＰＬｏＳ ＯＮＥ １０（４）：ｅ０１２１１７７、及びＧｒａｄｄｉｓ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ－Ｆｕｎｃｔｉｏｎ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ＦＬＴ３ Ｌｉｇａｎｄ－ＦＬＴ３ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ｉｎｔｅｒａｃｔｉｏｎｓ Ｕｓｉｎｇ ａ Ｒａｐｉｄ Ｆｕｎｃｔｉｏｎａｌ Ｓｃｒｅｅｎ”Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２７３，１７６２６－１７６３３などの文献（その各々は、全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＦＬＴ３Ｌの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＴＱＤＣＳＦＱＨＳＰＩＳＳＤＦＡＶＫＩＲＥＬＳＤＹＬＬＱＤＹＰＶＴＶＡＳＮＬＱＤＥＥＬＣＧＧＬＷＲＬＶＬＡＱＲＷＭＥＲＬＫＴＶＡＧＳＫＭＱＧＬＬＥＲＶＮＴＥＩＨＦＶＴＫＣＡＦＱＰＰＰＳＣＬＲＦＶＱＴＮＩＳＲＬＬＱＥＴＳＥＱＬＶＡＬＫＰＷＩＴＲＱＮＦＳＲＣＬＥＬＱＣＱＰＤＳＳＴＬＰＰＰＷＳＰＲＰＬＥＡＴＡＰＴＡＰＱＰ（配列番号５７）：
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５７の既知のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアントは、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の数を増加させる。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、活性化された樹状細胞、例えば、ＣＤ１１ｃ＋及び／またはＣＤ１０３＋樹状細胞の数を増加させる。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示、例えば、樹状細胞による、例えば、活性化された樹状細胞、例えば、ＣＤ１１ｃ＋及び／またはＣＤ１０３＋樹状細胞による腫瘍抗原提示を増強する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫細胞、例えば、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞に二重共刺激効果を提供する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、サイトカイン発現及び／または分泌を増強する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の活性化、及び抗原提示細胞、例えば、樹状細胞の増殖の同時効果を提供する。例えば、実施形態では、本発明のキメラタンパク質からのＦＬＴ３系シグナルは、樹状細胞の数を増加させ得、この集団は、刺激シグナル（例えば、なかでも本発明のキメラタンパク質からのＣＤ４０Ｌ、ＯＸ４０Ｌ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ３０Ｌ、ＴＲＡＩＬ、ＦａｓＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＴＷＥＡＫ、及び４－１ＢＢＬ）を介して活性化され得る。
本発明のキメラタンパク質では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ７０、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＬＥＣ）ファミリーメンバー、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴａ、ＬＴａ１ｂ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦａ、及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、４－１ＢＢＬである。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＣＤ４０Ｌである。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＣＤ７０である。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＧＩＴＲＬである。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＯＸ４０Ｌである。実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質は、ＴＬ１Ａである。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、本明細書に開示されるＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、本明細書に開示されるようなＩＩ型膜貫通タンパク質、例えば、ヒトＩＩ型膜貫通タンパク質の開示された細胞外ドメインのうちのいずれかの既知のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＩＩ型膜貫通タンパク質：４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、またはＴＬ１Ａのうちの１つの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、またはＴＬ１Ａの細胞外ドメイン、例えば、４－１ＢＢＬ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、ＧＩＴＲＬ、ＯＸ４０Ｌ、またはＴＬ１Ａのヒト細胞外ドメインのうちのいずれかの既知のアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及び４－１ＢＢＬの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及び４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、４－１ＢＢＬ、例えば、ヒト４－１ＢＢＬと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ｔｈｅ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ Ｔ ｃｅｌｌ ｇｅｎｅ ４－１ＢＢ：ａ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ａｎ ｅｍｅｒｇｉｎｇ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ．”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２３（１０），２６３１－２６４１（１９９３）、Ａｌｄｅｒｓｏｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ ａｎｄ ｉｔｓ ｌｉｇａｎｄ．”Ｅｕｒ．Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．２４（９），２２１９－２２２７（１９９４）、及びＡｒｃｈ ａｎｄ Ｔｈｏｍｐｓｏｎ“４－１ＢＢ ａｎｄ Ｏｘ４０ ａｒｅ ｍｅｍｂｅｒｓ ｏｆ ａ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ（ＴＮＦ）－ｎｅｒｖｅ ｇｒｏｗｔｈ ｆａｃｔｏｒ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｂｆａｍｉｌｙ ｔｈａｔ ｂｉｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ－ａｓｓｏｃｉａｔｅｄ ｆａｃｔｏｒｓ ａｎｄ ａｃｔｉｖａｔｅ ｎｕｃｌｅａｒ ｆａｃｔｏｒ ｋａｐｐａＢ．”Ｍｏｌ．Ｃｅｌｌ．Ｂｉｏｌ．１８（１），５５８－５６５（１９９８）、及びＧｉｌｂｒｅｔｈ ｅｔ ａｌ．Ｃｒｙｓｔａｌ ｓｔｒｕｃｔｕｒｅ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ４－１ＢＢ／４－１ＢＢＬ ｃｏｍｐｌｅｘ Ｊ Ｂｉｏｌ Ｃｈｅｍ．２０１８ Ｊｕｎ ２２；２９３（２５）：９８８０－９８９１などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、４－１ＢＢＬの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒト４－１ＢＢＬの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＡＣＰＷＡＶＳＧＡＲＡＳＰＧＳＡＡＳＰＲＬＲＥＧＰＥＬＳＰＤＤＰＡＧＬＬＤＬＲＱＧＭＦＡＱＬＶＡＱＮＶＬＬＩＤＧＰＬＳＷＹＳＤＰＧＬＡＧＶＳＬＴＧＧＬＳＹＫＥＤＴＫＥＬＶＶＡＫＡＧＶＹＹＶＦＦＱＬＥＬＲＲＶＶＡＧＥＧＳＧＳＶＳＬＡＬＨＬＱＰＬＲＳＡＡＧＡＡＡＬＡＬＴＶＤＬＰＰＡＳＳＥＡＲＮＳＡＦＧＦＱＧＲＬＬＨＬＳＡＧＱＲＬＧＶＨＬＨＴＥＡＲＡＲＨＡＷＱＬＴＱＧＡＴＶＬＧＬＦＲＶＴＰＥＩＰＡＧＬＰＳＰＲＳＥ（配列番号５８）：
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５８と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、４－１ＢＢＬの細胞外ドメインのバリアントは、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＣＤ４０Ｌ、例えば、ヒトＣＤ４０Ｌと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ａｎ，ｅｔ ａｌ．“Ｃｒｙｓｔａｌｌｏｇｒａｐｈｉｃ ａｎｄ Ｍｕｔａｔｉｏｎａｌ Ａｎａｌｙｓｉｓ ｏｆ ｔｈｅ ＣＤ４０－ＣＤ１５４ Ｃｏｍｐｌｅｘ ａｎｄ Ｉｔｓ Ｉｍｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｆｏｒ Ｒｅｃｅｐｔｏｒ Ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ”，Ｔｈｅ Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ ２８６，１１２２６－１１２３５などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＣＤ４０Ｌの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＨＲＲＬＤＫＩＥＤＥＲＮＬＨＥＤＦＶＦＭＫＴＩＱＲＣＮＴＧＥＲＳＬＳＬＬＮＣＥＥＩＫＳＱＦＥＧＦＶＫＤＩＭＬＮＫＥＥＴＫＫＥＮＳＦＥＭＱＫＧＤＱＮＰＱＩＡＡＨＶＩＳＥＡＳＳＫＴＴＳＶＬＱＷＡＥＫＧＹＹＴＭＳＮＮＬＶＴＬＥＮＧＫＱＬＴＶＫＲＱＧＬＹＹＩＹＡＱＶＴＦＣＳＮＲＥＡＳＳＱＡＰＦＩＡＳＬＣＬＫＳＰＧＲＦＥＲＩＬＬＲＡＡＮＴＨＳＳＡＫＰＣＧＱＱＳＩＨＬＧＧＶＦＥＬＱＰＧＡＳＶＦＶＮＶＴＤＰＳＱＶＳＨＧＴＧＦＴＳＦＧＬＬＫＬ（配列番号５９）：
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号５９と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントは、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＣＤ７０の細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及びＣＤ７０の細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＣＤ７０の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＣＤ７０、例えば、ヒトＣＤ７０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ｇｏｏｄｗｉｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ａｎｄ ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＣＤ２７ ｄｅｆｉｎｅｓ ａ ｎｅｗ ｆａｍｉｌｙ ｏｆ ｃｙｔｏｋｉｎｅｓ ｗｉｔｈ ｈｏｍｏｌｏｇｙ ｔｏ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ．”Ｃｅｌｌ ７３（３），４４７－４５６（１９９３）、Ｂｏｗｍａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ ｃｌｏｎｉｎｇ ｏｆ ＣＤ７０ ａｎｄ ｉｔｓ ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ａｓ ｔｈｅ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＣＤ２７”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（４），１７５６－１７６１（１９９４）、Ｈｉｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，“ＣＤ７０ ｒｅｐｒｅｓｅｎｔｓ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ｌｉｇａｎｄ ｆｏｒ ＣＤ２７”Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．６（３），４７７－４８０（１９９４）、及びＨｉｎｔｚｅｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｔｈｅ ｈｕｍａｎ ＣＤ２７ ｌｉｇａｎｄ，ａ ｎｏｖｅｌ ｍｅｍｂｅｒ ｏｆ ｔｈｅ ＴＮＦ ｇｅｎｅ ｆａｍｉｌｙ”Ｊ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．１５２（４），１７６２－１７７３（１９９４）などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＣＤ７０の既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＣＤ７０の細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＱＲＦＡＱＡＱＱＱＬＰＬＥＳＬＧＷＤＶＡＥＬＱＬＮＨＴＧＰＱＱＤＰＲＬＹＷＱＧＧＰＡＬＧＲＳＦＬＨＧＰＥＬＤＫＧＱＬＲＩＨＲＤＧＩＹＭＶＨＩＱＶＴＬＡＩＣＳＳＴＴＡＳＲＨＨＰＴＴＬＡＶＧＩＣＳＰＡＳＲＳＩＳＬＬＲＬＳＦＨＱＧＣＴＩＡＳＱＲＬＴＰＬＡＲＧＤＴＬＣＴＮＬＴＧＴＬＬＰＳＲＮＴＤＥＴＦＦＧＶＱＷＶＲＰ（配列番号６０）：
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＣＤ７０の細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６０と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＯＸ４０Ｌ、例えば、ヒトＯＸ４０Ｌと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、ＣＲＯＦＴ，ｅｔ ａｌ．，“Ｔｈｅ Ｓｉｇｎｉｆｉｃａｎｃｅ ｏｆ ＯＸ４０ ａｎｄ ＯＸ４０Ｌ ｔｏ Ｔ ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌｏｇｙ ａｎｄ Ｉｍｍｕｎｅ Ｄｉｓｅａｓｅ”，Ｉｍｍｕｎｏｌ Ｒｅｖ．，２２９（１），ＰＰ．１７３－１９１，２００９、及びＢＡＵＭ，ｅｔ ａｌ．，“Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ｍｕｒｉｎｅ ａｎｄ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０／０Ｘ４０ ｌｉｇａｎｄ ｓｙｓｔｅｍｓ： ｉｄｅｎｔｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｈｕｍａｎ ＯＸ４０ ｌｉｇａｎｄ ａｓ ｔｈｅ ＨＴＬ Ｖ－１－ｒｅｇｕｌａｔｅｄ ｐｒｏｔｅｉｎ ｇｐ３４”，Ｔｈｅ ＥＭＢＯ Ｊｏｕｒｎａｌ，Ｖｏｌ．１３，Ｎｏ．７７，ＰＰ．３９９２－４００１，１９９４などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＯＸ４０Ｌの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＱＶＳＨＲＹＰＲＩＱＳＩＫＶＱＦＴＥＹＫＫＥＫＧＦＩＬＴＳＱＫＥＤＥＩＭＫＶＱＮＮＳＶＩＩＮＣＤＧＦＹＬＩＳＬＫＧＹＦＳＱＥＶＮＩＳＬＨＹＱＫＤＥＥＰＬＦＱＬＫＫＶＲＳＶＮＳＬＭＶＡＳＬＴＹＫＤＫＶＹＬＮＶＴＴＤＮＴＳＬＤＤＦＨＶＮＧＧＥＬＩＬＩＨＱＮＰＧＥＦＣＶＬ（配列番号６１）。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６１と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインのバリアントは、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＧＩＴＲＬ、例えば、ヒトＧＩＴＲＬと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ ｅｔ ａｌ．“Ｅｖｏｌｕｔｉｏｎ ｏｆ ＧＩＴＲＬ ｉｍｍｕｎｅ ｆｕｎｃｔｉｏｎ：Ｍｕｒｉｎｅ ＧＩＴＲＬ ｅｘｈｉｂｉｔｓ ｕｎｉｑｕｅ ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ａｎｄ ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ ｗｉｔｈｉｎ ｔｈｅ ＴＮＦ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ．”ＰＮＡＳ，Ｖｏｌｕｍｅ １０５，Ｉｓｓｕｅ ２，２００８，ｐｐ．６３５－６４０、及びＺｊｏｕ，ｅｔ ａｌ．“Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ＧＩＴＲ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ Ｓｔｒｕｃｔｕｒａｌ ｂａｓｉｓ ｆｏｒ ｌｉｇａｎｄ－ｍｅｄｉａｔｅｄ ｍｏｕｓｅ ＧＩＴＲ ａｃｔｉｖａｔｉｏｎ．”ＰＮＡＳ Ｊａｎｕａｒｙ １５，２００８．１０５（２）６４１－６４５などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＧＩＴＲＬの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＧＩＴＲＬの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＥＴＡＫＥＰＣＭＡＫＦＧＰＬＰＳＫＷＱＭＡＳＳＥＰＰＣＶＮＫＶＳＤＷＫＬＥＩＬＱＮＧＬＹＬＩＹＧＱＶＡＰＮＡＮＹＮＤＶＡＰＦＥＶＲＬＹＫＮＫＤＭＩＱＴＬＴＮＫＳＫＩＱＮＶＧＧＴＹＥＬＨＶＧＤＴＩＤＬＩＦＮＳＥＨＱＶＬＫＮＮＴＹＷＧＩＩＬＬＡＮＰＱＦＩＳ（配列番号６２）。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６２と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、ＧＩＴＲＬの細胞外ドメインのバリアントは、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＴＬ１Ａの細胞外ドメインを含む。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインのバリアント、及びＴＬ１Ａの細胞外ドメインのバリアントを含む。
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＴＬ１Ａの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、ＴＬ１Ａ、例えば、ヒトＴＬ１Ａと少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
当業者は、例えば、Ｔａｎ ｅｔ ａｌ．，“Ｃｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎ ｏｆ ａ ｎｏｖｅｌ ＴＮＦ－ｌｉｋｅ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ｒｅｃｅｎｔｌｙ ｄｅｓｃｒｉｂｅｄ ＴＮＦ ｌｉｇａｎｄ ａｎｄ ＴＮＦ ｒｅｃｅｐｔｏｒ ｓｕｐｅｒｆａｍｉｌｙ ｇｅｎｅｓ ａｎｄ ｔｈｅｉｒ ｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅ ａｎｄ ｉｎｄｕｃｉｂｌｅ ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ ｉｎ ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ａｎｄ ｎｏｎ－ｈｅｍａｔｏｐｏｉｅｔｉｃ ｃｅｌｌｓ”Ｇｅｎｅ ２０４（１－２），３５－４６（１９９７）、及びＺｈａｉ ｅｔ ａｌ．，“ＶＥＧＩ，ａ ｎｏｖｅｌ ｃｙｔｏｋｉｎｅ ｏｆ ｔｈｅ ｔｕｍｏｒ ｎｅｃｒｏｓｉｓ ｆａｃｔｏｒ ｆａｍｉｌｙ，ｉｓ ａｎ ａｎｇｉｏｇｅｎｅｓｉｓ ｉｎｈｉｂｉｔｏｒ ｔｈａｔ ｓｕｐｐｒｅｓｓｅｓ ｔｈｅ ｇｒｏｗｔｈ ｏｆ ｃｏｌｏｎ ｃａｒｃｉｎｏｍａｓ ｉｎ ｖｉｖｏ．”ＦＡＳＥＢ Ｊ．１３（１），１８１－１８９（１９９９）などの文献（その各々は、その全体が参照により組み込まれる）を参照することにより、ＴＬ１Ａの既知のアミノ酸配列のバリアントを選択することができる。
実施形態では、ヒトＴＬ１Ａの細胞外ドメインは、以下のアミノ酸配列を含む：
ＲＡＱＧＥＡＣＶＱＦＱＡＬＫＧＱＥＦＡＰＳＨＱＱＶＹＡＰＬＲＡＤＧＤＫＰＲＡＨＬＴＶＶＲＱＴＰＴＱＨＦＫＮＱＦＰＡＬＨＷＥＨＥＬＧＬＡＦＴＫＮＲＭＮＹＴＮＫＦＬＬＩＰＥＳＧＤＹＦＩＹＳＱＶＴＦＲＧＭＴＳＥＣＳＥＩＲＱＡＧＲＰＮＫＰＤＳＩＴＶＶＩＴＫＶＴＤＳＹＰＥＰＴＱＬＬＭＧＴＫＳＶＣＥＶＧＳＮＷＦＱＰＩＹＬＧＡＭＦＳＬＱＥＧＤＫＬＭＶＮＶＳＤＩＳＬＶＤＹＴＫＥＤＫＴＦＦＧＡＦＬＬ（配列番号６３）：
実施形態では、本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＴＬ１Ａの細胞外ドメインのバリアントを含む。例として、バリアントは、配列番号６３と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
任意の本明細書に開示される態様及び実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に開示されるタンパク質配列のうちのいずれかと比較して１つ以上のアミノ酸変異を有するアミノ酸配列を含み得る。実施形態では、１つ以上のアミノ酸変異は独立して、置換、挿入、欠失、及び短縮から選択され得る。
実施形態では、アミノ酸変異は、アミノ酸置換であり、保存的及び／または非保存的置換を含み得る。「保存的置換」は、例えば、関与するアミノ酸残基の極性、電荷、サイズ、溶解度、疎水性、親水性、及び／または両親媒性の類似性に基づいて行ってもよい。２０個の天然に存在するアミノ酸は、（１）疎水性：Ｍｅｔ、Ａｌａ、Ｖａｌ、Ｌｅｕ、Ｉｌｅ；（２）中性親水性：Ｃｙｓ、Ｓｅｒ、Ｔｈｒ；Ａｓｎ、Ｇｌｎ；（３）酸性：Ａｓｐ、Ｇｌｕ；（４）塩基性：Ｈｉｓ、Ｌｙｓ、Ａｒｇ；（５）鎖配向に影響を与える残基：Ｇｌｙ、Ｐｒｏ；及び（６）芳香族：Ｔｒｐ、Ｔｙｒ、Ｐｈｅの６つの標準的なアミノ酸グループに分類できる。本明細書で使用される場合、「保存的置換」は、上記の６つの標準的なアミノ酸グループの同じグループ内に列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。例えば、ＧｌｕによるＡｓｐの交換は、そのように修飾されたポリペプチド内に１つの負電荷を保持する。さらに、グリシン及びプロリンは、α－ヘリックスを破壊するそれらの能力に基づいて互いに置換され得る。本明細書で使用される場合、「非保存的置換」は、上記の６つの標準的なアミノ酸グループ（１）～（６）の異なるグループに列挙される別のアミノ酸によるアミノ酸の交換として定義される。
実施形態では、置換はまた、非古典的なアミノ酸も含み得る（例えば、セレノシステイン、ピロリシン、Ｎ－ホルミルメチオニンβ－アラニン、ＧＡＢＡ及びδ－アミノレブリン酸、４－アミノ安息香酸（ＰＡＢＡ）、一般的なアミノ酸のＤ－異性体、２，４－ジアミノ酪酸、α－アミノイソ酪酸、４－アミノ酪酸、Ａｂｕ、２－アミノ酪酸、γ－Ａｂｕ、ε－Ａｈｘ、６－アミノヘキサン酸、Ａｉｂ、２－アミノイソ酪酸、３－アミノプロピオン酸、オルニチン、ノルロイシン、ノルバリン、ヒドロキシプロリン、サルコスメ、シトルリン、ホモシトルリン、システイン酸、ｔ－ブチルグリシン、ｔ－ブチルアラニン、フェニルグリシン、シクロヘキシルアラニン、β－アラニン、フルオロアミノ酸、デザイナーアミノ酸、例えば、βメチルアミノ酸、Ｃ α－メチルアミノ酸、Ｎ α－メチルアミノ酸、及び一般的なアミノ酸類似体）。
コドン縮重を考慮に入れることを含めて、遺伝暗号を参照することによって、キメラタンパク質のヌクレオチド配列に変異を作製することもできる。
実施形態では、キメラタンパク質は、ネズミリガンド（複数可）／受容体（複数可）と結合することが可能である。
実施形態では、キメラタンパク質は、ヒトリガンド（複数可）／受容体（複数可）と結合することが可能である。
実施形態では、キメラタンパク質の各細胞外ドメイン（またはそのバリアント）は、約１ｎＭ～約５ｎＭ、例えば、約１ｎＭ、約１．５ｎＭ、約２ｎＭ、約２．５ｎＭ、約３ｎＭ、約３．５ｎＭ、約４ｎＭ、約４．５ｎＭ、または約５ｎＭのＫＤでその同族の受容体またはリガンドと結合する。実施形態では、キメラタンパク質は、約５ｎＭ～約１５ｎＭ、例えば、約５ｎＭ、約５．５ｎＭ、約６ｎＭ、約６．５ｎＭ、約７ｎＭ、約７．５ｎＭ、約８ｎＭ、約８．５ｎＭ、約９ｎＭ、約９．５ｎＭ、約１０ｎＭ、約１０．５ｎＭ、約１１ｎＭ、約１１．５ｎＭ、約１２ｎＭ、約１２．５ｎＭ、約１３ｎＭ、約１３．５ｎＭ、約１４ｎＭ、約１４．５ｎＭ、または約１５ｎＭのＫＤで同族の受容体またはリガンドと結合する。
実施形態では、キメラタンパク質の各細胞外ドメイン（またはそのバリアント）は、約１μＭ、約９００ｎＭ、約８００ｎＭ、約７００ｎＭ、約６００ｎＭ、約５００ｎＭ、約４００ｎＭ、約３００ｎＭ、約２００ｎＭ、約１５０ｎＭ、約１３０ｎＭ、約１００ｎＭ、約９０ｎＭ、約８０ｎＭ、約７０ｎＭ、約６０ｎＭ、約５５ｎＭ、約５０ｎＭ、約４５ｎＭ、約４０ｎＭ、約３５ｎＭ、約３０ｎＭ、約２５ｎＭ、約２０ｎＭ、約１５ｎＭ、約１０ｎＭ、または約５ｎＭ、または約１ｎＭ未満（例えば、表面プラズモン共鳴または生体層干渉法によって測定される）のＫＤでその同族の受容体またはリガンドと結合する。実施形態では、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約９００ｐＭ、約８００ｐＭ、約７００ｐＭ、約６００ｐＭ、約５００ｐＭ、約４００ｐＭ、約３００ｐＭ、約２００ｐＭ、約１００ｐＭ、約９０ｐＭ、約８０ｐＭ、約７０ｐＭ、約６０ｐＭ、約５５ｐＭ、約５０ｐＭ、約４５ｐＭ、約４０ｐＭ、約３５ｐＭ、約３０ｐＭ、約２５ｐＭ、約２０ｐＭ、約１５ｐＭ、または約１０ｐＭ、または約１ｐＭ未満（例えば、表面プラズモン共鳴または生体層干渉法によって測定される）のＫＤでヒトＣＳＦ１と結合する。
本明細書で使用される場合、細胞外ドメインのバリアントは、天然の細胞外ドメインの受容体／リガンドと結合することが可能である。例えば、バリアントは、その受容体／リガンドとのその結合親和性に影響を及ぼさない細胞外ドメインの１つ以上の変異を含み得、代替的に、細胞外ドメインにおける１つ以上の変異は、受容体／リガンドに対する結合親和性を改善し得るか、または細胞外ドメインにおける１つ以上の変異は、受容体／リガンドに対する結合親和性を低下させ得るが、結合を完全に排除しない。実施形態では、１つ以上の変異は、細胞外ドメインがその受容体／リガンドと相互作用する結合ポケットの外側に位置する。実施形態では、１つ以上の変異は、変異が結合を完全に排除しない限り、細胞外ドメインがその受容体／リガンドと相互作用する結合ポケットの内側に位置する。受容体－リガンド結合に関する当業者の知識及び当技術分野の知識に基づいて、どの変異が結合を可能にし、どれが結合を排除するかを理解するであろう。
実施形態では、キメラタンパク質は、単一ドメイン融合タンパク質または抗体対照と比較して、増強された安定性、高アビディティ結合特性、標的結合の延長されたオフ速度、及びタンパク質半減期を示す。
本発明のキメラタンパク質は、２つを超える細胞外ドメインを含み得る。例えば、キメラタンパク質は、３つ、４つ、５つ、６つ、７つ、８つ、９つ、１０つ、またはそれ以上の細胞外ドメインを含み得る。本明細書に開示されるように、第２の細胞外ドメインは、リンカーを介して第３の細胞外ドメインから分離され得る。代替的に、第２の細胞外ドメインは、第３の細胞外ドメインと直接的に連結され得る（例えば、ペプチド結合を介して）。実施形態では、本明細書に開示されるように、キメラタンパク質は、直接的に連結される細胞外ドメイン及びリンカーを介して間接的に連結される細胞外ドメインを含む。
リンカー
実施形態では、キメラタンパク質は、リンカーを含む。
実施形態では、リンカーは、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含む。少なくとも１つのシステイン残基は、キメラタンパク質の１対（またはそれ以上）の間にジスルフィド結合を形成することが可能である。理論に拘束されることを望まないが、かかるジスルフィド結合形成は、キメラタンパク質の有用な多量体状態を維持する原因となる。これは、キメラタンパク質の効率的な生産を可能とし、それは、インビトロ及びインビボで所望される活性を可能とする。
本発明のキメラタンパク質では、リンカーは、柔軟なアミノ酸配列、ＩｇＧヒンジ領域、または抗体配列から選択されるポリペプチドである。
実施形態では、リンカーは、天然に存在するマルチドメインタンパク質に由来するか、または、例えば、Ｃｈｉｃｈｉｌｉ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉ．２２（２）：１５３－１６７、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９に記載されるような経験的なリンカーであり、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。実施形態では、リンカーは、Ｃｈｅｎ ｅｔ ａｌ．，（２０１３），Ａｄｖ Ｄｒｕｇ Ｄｅｌｉｖ Ｒｅｖ．６５（１０）：１３５７－１３６９、及びＣｒａｓｔｏ ｅｔ．ａｌ．，（２０００），Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｅｎｇ．１３（５）：３０９－３１２に記載されるようなものなどのリンカー設計データベース及びコンピュータプログラムを使用して設計することができ、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
実施形態では、リンカーは、ポリペプチドを含む。実施形態では、ポリペプチドは、約５００アミノ酸長、約４５０アミノ酸長、約４００アミノ酸長、約３５０アミノ酸長、約３００アミノ酸長、約２５０アミノ酸長、約２００アミノ酸長、約１５０アミノ酸長、または約１００アミノ酸長未満である。例えば、リンカーは、約１００、約９５、約９０、約８５、約８０、約７５、約７０、約６５、約６０、約５５、約５０、約４５、約４０、約３５、約３０、約２５、約２０、約１９、約１８、約１７、約１６、約１５、約１４、約１３、約１２、約１１、約１０、約９、約８、約７、約６、約５、約４、約３、または約２アミノ酸長未満であり得る。
実施形態では、リンカーは、柔軟性である。
実施形態では、リンカーは、剛性である。
実施形態では、リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基からなる（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。
実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のヒンジ領域を含む。ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥクラス抗体に見られるヒンジ領域は、柔軟なスペーサーとして機能し、Ｆａｂ部分が空間内を自由に移動することを可能とする。定常領域とは対照的に、ヒンジドメインは、構造的に多様であり、免疫グロブリンクラス及びサブクラス間で配列及び長さの両方が異なる。例えば、ヒンジ領域の長さ及び柔軟性は、ＩｇＧサブクラス間で異なる。ＩｇＧ１のヒンジ領域はアミノ酸２１６～２３１を包括し、自由に柔軟であるため、Ｆａｂ断片はその対称軸を中心に回転し、２つの重鎖間ジスルフィド架橋の第１の中心にある球内を移動できる。ＩｇＧ２は、ＩｇＧ１よりも短いヒンジを有し、１２個のアミノ酸残基及び４個のジスルフィド架橋を有する。ＩｇＧ２のヒンジ領域は、グリシン残基を欠いており、比較的短く、余分な重鎖間ジスルフィド架橋によって安定化された剛性のポリプロリン二重らせんを含む。これらの特性は、ＩｇＧ２分子の柔軟性を制限する。ＩｇＧ３は、６２個のアミノ酸（２１個のプロリン及び１１個のシステインを含む）を含み、柔軟性がないポリプロリン二重らせんを形成する、その固有の拡張ヒンジ領域（ＩｇＧ１ヒンジの約４倍の長さ）が他のサブクラスと異なる。ＩｇＧ３では、Ｆａｂ断片は、Ｆｃ断片から比較的離れているため、分子の柔軟性が高まる。ＩｇＧ３における細長いヒンジは、他のサブクラスと比較してその高分子量の原因でもある。ＩｇＧ４のヒンジ領域は、ＩｇＧ１よりも短く、その柔軟性は、ＩｇＧ１及びＩｇＧ２の中間である。ヒンジ領域の柔軟性は、ＩｇＧ３＞ＩｇＧ１＞ＩｇＧ４＞ＩｇＧ２の順に減少すると報告されている。実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来し、二量体形成（Ｓ２２８Ｐを含む）またはＦｃＲｎ結合を増強するための１つ以上の変異を含み得る。
結晶学的研究によると、免疫グロブリンヒンジ領域は、機能的に、上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域の３つの領域にさらに細分することができる。Ｓｈｉｎ ｅｔ ａｌ．，１９９２ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｒｅｖｉｅｗｓ１３０：８７を参照されたい。上部ヒンジ領域には、ＣＨ１のカルボキシル末端から、動きを制限するヒンジにおける第１の残基、通常は２つの重鎖間に鎖間ジスルフィド結合を形成する第１のシステイン残基までのアミノ酸が含まれる。上部ヒンジ領域の長さは、抗体のセグメントの柔軟性と相関する。コアヒンジ領域には、重鎖間ジスルフィド架橋が含まれ、下部ヒンジ領域には、ＣＨ２ドメインのアミノ末端と結合し、ＣＨ２の残基が含まれる。（同上。）野生型ヒトＩｇＧ１のコアヒンジ領域は、配列ＣＰＰＣ（配列番号２４）を含み、これは、ジスルフィド結合形成によって二量体化されると、回転軸として作用すると考えられる環状オクタペプチドをもたらし、したがって柔軟性が与えられる。実施形態では、本発明のリンカーは、任意の抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）の上部ヒンジ領域、コア領域、及び下部ヒンジ領域のうちの１つ、２つ、または３つを含む。ヒンジ領域はまた、１つ以上のグリコシル化部位を含み得、これは、炭水化物付着のためのいくつかの構造的に異なる種類の部位を含む。例えば、ＩｇＡ１は、ヒンジ領域の１７個のアミノ酸セグメント内に５つのグリコシル化部位を含み、分泌型免疫グロブリンにとって有利な特性と考えられる、腸のプロテアーゼに対するヒンジ領域ポリペプチドの抵抗性を付与する。実施形態では、本発明のリンカーは、１つ以上のグリコシル化部位を含む。
実施形態では、リンカーは、抗体（例えば、サブクラス（例えば、ＩｇＧ１、ＩｇＧ２、ＩｇＧ３、及びＩｇＧ４、ならびにＩｇＡ１、及びＩｇＡ２）を含むＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、及びＩｇＥ）のＦｃドメインを含む。
本発明のキメラタンパク質では、リンカーは、ＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、リンカーは、配列番号１～配列番号３のいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも９５％同一である、例えば、配列番号２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む。実施形態では、リンカーは、１つ以上の結合リンカーを含み、かかる結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０（またはそのバリアント）から選択される。実施形態では、リンカーは、２つ以上の結合リンカーを含み、各結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０（またはそのバリアント）から選択され、一方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＮ末端であり、他方の結合リンカーは、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインに対してＣ末端である。
実施形態では、リンカーは、ヒトＩｇＧ１抗体に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む。実施形態では、Ｆｃドメインは、新生児Ｆｃ受容体（ＦｃＲｎ）に対して増加した親和性及び増強した結合を示す。実施形態では、Ｆｃドメインは、ＦｃＲｎに対する親和性を増加させ、ＦｃＲｎとの結合を増強する１つ以上の変異を含む。理論に拘束されることを望まないが、ＦｃＲｎとの増加した親和性及び増強した結合は、本発明のキメラタンパク質のインビボでの半減期を増加させると考えられる。
実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、アミノ酸残基２５０、２５２、２５４、２５６、３０８、３０９、３１１、４１６、４２８、４３３、もしくは４３４（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）、またはそれらの同等物での１つ以上のアミノ酸置換を含む。実施形態では、アミノ酸残基２５０でのアミノ酸置換は、グルタミンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５２でのアミノ酸置換は、チロシン、フェニルアラニン、トリプトファン、またはスレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５４でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基２５６でのアミノ酸置換は、セリン、アルギニン、グルタミン、グルタミン酸、アスパラギン酸、またはスレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３０８でのアミノ酸置換は、スレオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３０９でのアミノ酸置換は、プロリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３１１でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８５でのアミノ酸置換は、アルギニン、アスパラギン酸、セリン、スレオニン、ヒスチジン、リジン、アラニン、またはグリシンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８６でのアミノ酸置換は、スレオニン、プロリン、アスパラギン酸、セリン、リジン、アルギニン、イソロイシン、またはメチオニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８７でのアミノ酸置換は、アルギニン、プロリン、ヒスチジン、セリン、スレオニン、またはアラニンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基３８９でのアミノ酸置換は、プロリン、セリン、またはアスパラギンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４１６でのアミノ酸置換は、セリンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４２８でのアミノ酸置換は、ロイシンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４３３でのアミノ酸置換は、アルギニン、セリン、イソロイシン、プロリン、またはグルタミンによる置換である。実施形態では、アミノ酸残基４３４でのアミノ酸置換は、ヒスチジン、フェニルアラニン、またはチロシンによる置換である。
実施形態では、Ｆｃドメインリンカー（例えば、ＩｇＧ定常領域を含む）は、アミノ酸残基２５２、２５４、２５６、４３３、４３４、または４３６（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での置換などの１つ以上の変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＭ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ変異またはＹＴＥ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、トリプルＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ／Ｙ４３６Ｈ変異またはＫＦＨ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、ＹＴＥ及びＫＦＨ変異の組み合わせを含む。
実施形態では、リンカーは、アミノ酸残基２５０、２５３、３０７、３１０、３８０、４２８、４３３、４３４、及び４３５（参照により本明細書に明示的に組み込まれる、Ｋａｂａｔ，ｅｔ ａｌ．，Ｓｅｑｕｅｎｃｅｓ ｏｆ Ｐｒｏｔｅｉｎｓ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｔｅｒｅｓｔ，５ｔｈ Ｅｄ．Ｐｕｂｌｉｃ Ｈｅａｌｔｈ Ｓｅｒｖｉｃｅ，Ｎａｔｉｏｎａｌ Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅｓ ｏｆ Ｈｅａｌｔｈ，Ｂｅｔｈｅｓｄａ，Ｍｄ．（１９９１）の場合と同様に、Ｋａｂａｔの番号付けに従って）での１つ以上の変異を含むＩｇＧ定常領域を含む。例示的な変異には、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｔ３０７Ａ、Ｅ３８０Ａ、Ｉ２５３Ａ、Ｈ３１０Ａ、Ｍ４２８Ｌ、Ｈ４３３Ｋ、Ｎ４３４Ａ、Ｎ４３４Ｆ、Ｎ４３４Ｓ、及びＨ４３５Ａが含まれる。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ４２８Ｌ／Ｎ４３４Ｓ変異またはＬＳ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ２５０Ｑ／Ｍ４２８Ｌ変異またはＱＬ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｎ４３４Ａ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｔ３０７Ａ／Ｅ３８０Ａ／Ｎ４３４Ａ変異またはＡＡＡ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｉ２５３Ａ／Ｈ３１０Ａ／Ｈ４３５Ａ変異またはＩＨＨ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｈ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異を含む。実施形態では、ＩｇＧ定常領域は、Ｍ２５２Ｙ／Ｓ２５４Ｔ／Ｔ２５６Ｅ及びＨ４３３Ｋ／Ｎ４３４Ｆ変異の組み合わせを含む。
ＩｇＧ定常領域における追加の例示的な変異は、例えば、Ｒｏｂｂｉｅ，ｅｔ ａｌ．，Ａｎｔｉｍｉｃｒｏｂｉａｌ Ａｇｅｎｔｓ ａｎｄ Ｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ（２０１３），５７（１２）：６１４７－６１５３、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，ＪＢＣ（２００６），２８１（３３）：２３５１４－２４、Ｄａｌｌ’Ａｃｑｕａ ｅｔ ａｌ．，Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ（２００２），１６９：５１７１－８０、Ｋｏ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ（２０１４）５１４：６４２－６４５、Ｇｒｅｖｙｓ ｅｔ ａｌ．Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｉｍｍｕｎｏｌｏｇｙ．（２０１５），１９４（１１）：５４９７－５０８、及び米国特許第７，０８３，７８４号に記載されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
例示的なＦｃ安定化変異体は、Ｓ２２８Ｐである。例示的なＦｃ半減期延長変異体は、Ｔ２５０Ｑ、Ｍ４２８Ｌ、Ｖ３０８Ｔ、Ｌ３０９Ｐ、及びＱ３１１Ｓであり、本発明のリンカーは、これらの変異体の１つ、２つ、３つ、４つ、または５つを含み得る。
実施形態では、キメラタンパク質は、高い親和性でＦｃＲｎと結合する。実施形態では、キメラタンパク質は、約１ｎＭ～約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。例えば、キメラタンパク質は、約１ｎＭ、約２ｎＭ、約３ｎＭ、約４ｎＭ、約５ｎＭ、約６ｎＭ、約７ｎＭ、約８ｎＭ、約９ｎＭ、約１０ｎＭ、約１５ｎＭ、約２０ｎＭ、約２５ｎＭ、約３０ｎＭ、約３５ｎＭ、約４０ｎＭ、約４５ｎＭ、約５０ｎＭ、約５５ｎＭ、約６０ｎＭ、約６５ｎＭ、約７０ｎＭ、約７１ｎＭ、約７２ｎＭ、約７３ｎＭ、約７４ｎＭ、約７５ｎＭ、約７６ｎＭ、約７７ｎＭ、約７８ｎＭ、約７９ｎＭ、または約８０ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。実施形態では、キメラタンパク質は、約９ｎＭのＫＤでＦｃＲｎと結合し得る。実施形態では、キメラタンパク質は、エフェクター機能を有する他のＦｃ受容体（すなわち、ＦｃＲｎ以外）と実質的に結合しない。
実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号１（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を有する。実施形態では、変異は、安定性及び／または半減期を増加させるために、配列番号１に対して作製される。例えば、実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号２（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。例えば、実施形態では、リンカーにおけるＦｃドメインは、配列番号３（以下の表１を参照されたい）、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性のアミノ酸配列を含む。
さらに、１つ以上の結合リンカーは、リンカーにおけるＦｃドメイン（例えば、配列番号１、配列番号２、配列番号３、またはそれと少なくとも９０％、または９３％、または９５％、または９７％、または９８％、または９９％同一性であるもののうちの１つ）及び細胞外ドメインを接続するために使用され得る。例えば、配列番号４、配列番号５、配列番号６、配列番号７、配列番号８、配列番号９、またはそのバリアントのうちのいずれか１つが、本明細書に開示される細胞外ドメイン、及び本明細書に開示されるリンカーにおけるＦｃドメインを接続し得る。任意で、配列番号４～配列番号５０、またはそのバリアントのうちのいずれか１つは、本明細書に開示される細胞外ドメインと本明細書に開示されるＦｃドメインとの間に位置する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、以下の表１に開示される結合リンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号４～配列番号５０のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、第１及び第２の結合リンカーは異なっていてもよく、またはそれらは同じであってもよい。
理論に拘束されることを望まないが、キメラタンパク質においてＦｃドメインの少なくとも一部を含むリンカーを含めることは、不溶性であり、非機能性の可能性のあるタンパク質連結オリゴマー及び／または凝集体の形成を回避する助けとなる。これは、キメラタンパク質間にジスルフィド結合を形成することが可能であるＦｃドメイン内にシステインが存在するためである。
実施形態では、キメラタンパク質は、本明細書に開示されるように、１つ以上の結合リンカーを含み得、本明細書に開示されるように、Ｆｃドメインリンカーを欠き得る。
実施形態では、第１及び／または第２の結合リンカーは独立して、配列番号４～配列番号５０のアミノ酸配列から選択され、以下の表１に提供される：
Figure 2022512540000002
Figure 2022512540000003
実施形態では、結合リンカーは、実質的にグリシン及びセリン残基を含む（例えば、約３０％、または約４０％、または約５０％、または約６０％、または約７０％、または約８０％、または約９０％、または約９５％、または約９７％、または約９８％、または約９９％、または約１００％のグリシン及びセリン）。例えば、実施形態では、結合リンカーは、（Ｇｌｙ４Ｓｅｒ）ｎであり、ここで、ｎは、約１～約８、例えば、１、２、３、４、５、６、７、または８（配列番号２５～配列番号３２のそれぞれ）である。実施形態では、結合リンカー配列は、ＧＧＳＧＧＳＧＧＧＧＳＧＧＧＧＳ（配列番号３３）である。追加の例示的な結合リンカーには、これらに限定されないが、配列ＬＥ、（ＥＡＡＡＫ）ｎ（ｎ＝１～３）（配列番号３６～配列番号３８）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）ｎＡ（ｎ＝２～５）（配列番号３９～配列番号４２）、Ａ（ＥＡＡＡＫ）４ＡＬＥＡ（ＥＡＡＡＫ）４Ａ（配列番号４３）、ＰＡＰＡＰ（配列番号４４）、ＫＥＳＧＳＶＳＳＥＱＬＡＱＦＲＳＬＤ（配列番号４５）、ＧＳＡＧＳＡＡＧＳＧＥＦ（配列番号４６）、及びＸが、例えば、Ａｌａ、Ｌｙｓ、またはＧｌｕなどの任意のアミノ酸を示す、（ＸＰ）ｎを有するリンカーが含まれる。実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＳである。実施形態では、結合リンカーは、配列（Ｇｌｙ）ｎを有し、ここで、ｎは、１～１００の任意の数、例えば、（Ｇｌｙ）８（配列番号３４）及び（Ｇｌｙ）６（配列番号３５）である。
実施形態では、結合リンカーは、ＧＧＧＳＥ（配列番号４７）、ＧＳＥＳＧ（配列番号４８）、ＧＳＥＧＳ（配列番号４９）、ＧＥＧＧＳＧＥＧＳＳＧＥＧＳＳＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＧＳＥＧＧＳ（配列番号５０）、ならびに４アミノ酸間隔ごとにランダムに配置されるＧ、Ｓ、及びＥの結合リンカーのうちの１つ以上である。
実施形態では、キメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（ＥＣＤ）、Ｆｃドメインに先行する１つの結合リンカー、Ｆｃドメインに続く第２の結合リンカー、及びＩＩ型膜貫通タンパク質のＥＣＤを含み、キメラタンパク質は、以下の構造を含み得る：
ＦＬＴ３ＬのＥＣＤ－結合リンカー１－Ｆｃドメイン－結合リンカー２－ＩＩ型タンパク質のＥＣＤ。
第１の結合リンカー、Ｆｃドメインリンカー、及び第２の結合リンカーの組み合わせは、本明細書において「モジュラーリンカー」と称される。実施形態では、キメラタンパク質は、表２に示されるようなモジュラーリンカーを含む。
Figure 2022512540000004
Figure 2022512540000005
Figure 2022512540000006
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、上記の表２に開示されるモジュラーリンカーのバリアントを含み得る。例えば、リンカーは、配列番号５１～配列番号５６のうちのいずれか１つのアミノ酸配列と少なくとも約６０％、または少なくとも約６１％、または少なくとも約６２％、または少なくとも約６３％、または少なくとも約６４％、または少なくとも約６５％、または少なくとも約６６％、または少なくとも約６７％、または少なくとも約６８％、または少なくとも約６９％、または少なくとも約７０％、または少なくとも約７１％、または少なくとも約７２％、または少なくとも約７３％、または少なくとも約７４％、または少なくとも約７５％、または少なくとも約７６％、または少なくとも約７７％、または少なくとも約７８％、または少なくとも約７９％、または少なくとも約８０％、または少なくとも約８１％、または少なくとも約８２％、または少なくとも約８３％、または少なくとも約８４％、または少なくとも約８５％、または少なくとも約８６％、または少なくとも約８７％、または少なくとも約８８％、または少なくとも約８９％、または少なくとも約９０％、または少なくとも約９１％、または少なくとも約９２％、または少なくとも約９３％、または少なくとも約９４％、または少なくとも約９５％、または少なくとも約９６％、または少なくとも約９７％、または少なくとも約９８％、または少なくとも約９９％の配列同一性を有し得る。
実施形態では、リンカーは、高い柔軟性であることを含むがこれに限定されない柔軟性であり得る。実施形態では、リンカーは、剛性アルファヘリックスを含むがこれに限定されない剛性であり得る。例示的な結合リンカーの特徴を以下の表３に示す。
Figure 2022512540000007
実施形態では、リンカーは、機能性であり得る。例えば、限定されないが、リンカーは、本発明のキメラタンパク質の折り畳み及び／または安定性を改善し、発現を改善し、薬物動態を改善し、及び／または生物活性を改善するように機能し得る。別の例では、リンカーは、キメラタンパク質を特定の細胞型または位置に標的化するように機能し得る。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、１つの結合リンカーのみを含む。
実施形態では、キメラタンパク質は、結合リンカーを欠く。
実施形態では、リンカーは、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）などの合成リンカーである。
実施形態では、キメラタンパク質は、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第１のドメイン、及び／またはそのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である第２のドメインを有する。したがって、細胞外ドメインのリガンド／受容体結合ドメインがそのリガンド／受容体の結合を立体的に妨げられないように、キメラタンパク質及び／または細胞外ドメイン（またはその一部）と残りのキメラタンパク質との間の物理的距離に十分な全体的な柔軟性がある。この柔軟性及び／または物理的距離（「緩み」と称される）は通常、細胞外ドメイン（複数可）に存在し、通常はリンカーに存在し、及び／または通常はキメラタンパク質に（全体として）存在し得る。代替的にまたは追加的に、アミノ酸配列（例えば）は、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、１つ以上の細胞外ドメイン及び／またはリンカーに追加され得る。緩みを提供する任意のアミノ酸配列が追加され得る。実施形態では、追加されるアミノ酸配列は、配列（Ｇｌｙ）ｎを含み、ここで、ｎは、１～１００の任意の数である。追加可能なアミノ酸配列の追加の例には、表１及び表３に記載される結合リンカーが含まれる。実施形態では、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）リンカーは、立体障害を回避するために必要な緩みを提供するために、細胞外ドメインとリンカーとの間に追加され得る。かかるＰＥＧリンカーは、当技術分野において周知である。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及び４－１ＢＢＬの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及び４－１ＢＢＬの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ」と称される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ」と称される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及びＣＤ７０の細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ７０Ｌ」と称される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及びＧＩＴＲＬの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ」と称される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及びＯＸ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ」と称される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、リンカー、及びＴＬ１Ａの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。実施形態では、リンカーは、例えば、ヒトＩｇＧ１またはＩｇＧ４を含む、ＩｇＧ１から、またはＩｇＧ４からのヒンジＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメイン（またはそのバリアント）を含む。したがって、実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）、ヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含むリンカー（またはそのバリアント）、及びＣＤ４０Ｌの細胞外ドメイン（またはそのバリアント）を含む。かかるキメラタンパク質は、本明細書において「ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＴＬ１Ａ」と称される。
疾患、治療法、及び作用機序
本明細書に開示されるキメラタンパク質は、がんの治療及び／または例えば、ウイルス感染に起因する、炎症性疾患の治療に使用され得る。
本発明の態様は、がんを治療する方法を提供する。本方法は、有効量の本明細書に開示されるようなキメラタンパク質を含む薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与するステップを含む。
免疫応答を強化するため、例えば、患者の抗腫瘍免疫応答を増強するために免疫刺激シグナル伝達を増強することが多くに場合に所望される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及びＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインを含み、その各々が免疫刺激特性を有する。したがって、ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインとそのリガンド／受容体（例えば、ＦＬＴ３）との結合は、免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／または刺激する。本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、免疫刺激シグナルを提供するＩＩ型膜タンパク質の細胞外ドメインをさらに含み、ＩＩ型膜タンパク質は、限定されないが、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＬＥＣ）ファミリーメンバー、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴａ、ＬＴａ１ｂ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦａ、及びＴＲＡＩＬのうちの１つ以上である。したがって、キメラタンパク質は、非限定的な例として、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ４０Ｌ、ＣＤ７０、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＬＥＣ）ファミリーメンバー、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴａ、ＬＴａ１ｂ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦａ、及びＴＲＡＩＬのうちの１つと、そのリガンド／受容体との結合が免疫刺激シグナルの伝達を増強、増加、及び／または刺激するように操作される。したがって、実施形態では、キメラタンパク質は、その第１のドメイン及びその第２のドメインのそれぞれから「二重共刺激」能力を有する。
実施形態では、キメラタンパク質は、免疫刺激シグナルのリガンドの細胞外ドメインである免疫刺激シグナルを含み、これが免疫刺激シグナルの同族受容体を有するＴ細胞に作用する。
実施形態では、細胞外ドメインは、人工シグナル伝達を提供するために使用され得る。
実施形態では、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインは、免疫刺激シグナルである。
実施形態では、本発明は、がん及び／または腫瘍に関する、例えば、がん及び／または腫瘍の治療または予防に関する。本明細書の他の箇所に開示されるように、がんの治療は、実施形態では、免疫刺激シグナルを増加または活性化することに有利になるように、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫系を調節することを伴う。実施形態では、方法は、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、ＩＩ型タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量または活性を減少させる。実施形態では、方法は、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、ＩＩ型タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、対象の流入領域リンパ節におけるエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる。実施形態では、方法は、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、ＩＩ型タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、免疫抑制細胞の全体的な低減、及びより炎症性の腫瘍環境への移行をもたらす。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫応答の振幅を調節すること、例えば、エフェクター出力のレベルを調節することが可能であるか、またはそれを含む方法で使用することができる。実施形態では、例えば、がんの治療に使用される場合、本発明のキメラタンパク質は、免疫阻害と比較して免疫刺激の程度を改変し、サイトカイン産生、増殖、または標的を殺傷する潜在性のレベルの増加を刺激することを含むが、これらに限定されないＴ細胞応答の振幅を増加させる。実施形態では、患者のＴ細胞は、キメラタンパク質によって、活性化及び／または刺激され、活性化Ｔ細胞がサイトカインを分離及び／または分泌することを可能とする。
がんまたは腫瘍は、細胞の非制御な成長及び／または細胞生存の異常な増加及び／または身体の器官及びシステムの正常な機能を妨げるアポトーシスの阻害を指す。良性及び悪性がん、ポリープ、過形成、ならびに休止状態の腫瘍または微小転移巣が含まれる。また、免疫系によって妨げられない異常な増殖を有する細胞（例えば、ウイルス感染細胞）も含まれる。がんは、原発性癌または転移性癌であり得る。原発性癌は、臨床的に検出可能となる発生部位での領域のがん細胞であり得、原発性腫瘍であり得る。対照的に、転移性癌は、ある器官または部分から別の隣接していない器官または部分への疾患の拡散であり得る。転移性癌は、局所領域の周囲の正常組織に浸透して浸潤する能力を獲得し、局所転移であり得る新しい腫瘍を形成するがん細胞によって引き起こされ得る。がんはまた、リンパ管及び／または血管の壁を貫通する能力を獲得するがん細胞によって引き起こされ得、その後、がん細胞は血流を通して循環し（それによって循環腫瘍細胞となる）、体内の他の部位及び組織に循環することが可能である。がんは、リンパ系または血行性拡散などのプロセスが原因となり得る。がんはまた、別の部位で静止し、管または壁を通って再浸透し、増殖し続け、別の臨床的に検出可能な腫瘍を最終的に形成する腫瘍細胞によって引き起こされ得る。がんは、この新しい腫瘍であり得、転移性（または続発性）腫瘍であり得る。
がんは、転移した腫瘍細胞によって引き起こされ得、これは続発性または転移性腫瘍であり得る。腫瘍の細胞は、元の腫瘍のものの様であり得る。例として、乳癌または結癌が肝臓に転移した場合、二次腫瘍は肝臓に存在するが、異常な肝臓細胞ではなく、異常な乳癌または結腸細胞で構成される。したがって、肝臓における腫瘍は、肝臓癌ではなく、転移性乳癌または転移性結腸癌であり得る。
がんは、任意の組織が起源であり得る。がんは、黒色腫、結腸、乳房、または前立腺起源であり得、したがって、元々皮膚、結腸、乳房、または前立腺であった細胞からそれぞれ構成され得る。がんはまた、白血病またはリンパ腫であり得る、血液学的悪性腫瘍であり得る。がんは、肝臓、肺、膀胱、腸などの組織に浸潤し得る。
本発明の代表的ながん及び／または腫瘍には、これらに限定されないが、基底細胞癌、胆道癌、膀胱癌、骨癌、脳及び中枢神経系癌、乳癌、腹膜の癌、子宮頸癌、絨毛癌、大腸癌、結合組織癌、消化器系の癌、子宮内膜癌、食道癌、眼癌、頭頸部癌、胃癌（ｇａｓｔｒｉｃ ｃａｎｃｅｒ）（胃腸癌を含む）、神経膠芽腫、肝癌、肝細胞腫、上皮内腫瘍、腎臓もしくは腎癌、喉頭癌、白血病、肝臓癌、肺癌（例えば、小細胞肺癌、非小細胞肺癌、肺腺癌、肺扁平上皮癌）、黒色腫、骨髄腫、神経芽細胞腫、口腔癌（唇、舌、口、及び咽頭）、卵巣癌、膵癌、前立腺癌、網膜芽細胞腫、横紋筋肉腫、直腸癌、呼吸器系の癌、唾液腺癌、肉腫、皮膚癌、扁平上皮癌、胃癌（ｓｔｏｍａｃｈ ｃａｎｃｅｒ）、精巣癌、甲状腺癌、子宮もしくは子宮内膜癌、泌尿器系の癌、外陰癌、ホジキン及び非ホジキンリンパ腫、ならびにＢ細胞リンパ腫を含むリンパ腫（低悪性度／濾胞性非ホジキンリンパ腫（ＮＨＬ）、小リンパ球性（ＳＬ）ＮＨＬ、中悪性度／濾胞性ＮＨＬ、中悪性度びまん性ＮＨＬ、高悪性度免疫芽球性ＮＨＬ、高悪性度リンパ芽球性ＮＨＬ、高悪性度小型非分割細胞ＮＨＬ、巨大腫瘤病変性ＮＨＬ、マントル細胞リンパ腫、エイズ関連リンパ腫、及びワルデンストレーム高ガンマグロブリン血症、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）、急性リンパ性白血病（ＡＬＬ）、ヘアリーセル白血病、慢性骨髄芽球性白血病を含む）、ならびに他の癌腫及び肉腫、及び移植後リンパ増殖性障害（ＰＴＬＤ）、ならびに母斑症、浮腫に関連する異常な血管増殖（脳腫瘍に関連するものなど）、及びメグズ症候群が含まれる。
実施形態では、キメラタンパク質は、治療抵抗性癌を有する対象を治療するために使用される。実施形態では、キメラタンパク質は、１つ以上の免疫調節剤に対して抵抗性である対象を治療するために使用される。例えば、実施形態では、キメラタンパク質を使用して、約１２週間の治療後、治療に応答しない、または進展しない対象を治療する。例えば、実施形態では、対象は、ＰＤ－１及び／またはＰＤ－Ｌ１及び／またはＰＤ－Ｌ２剤に抵抗性であり得、例えば、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペンブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＭＥＲＣＫ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、イブルチニブ（ＰＨＡＲＭＡＣＹＣＬＩＣＳ／ＡＢＢＶＩＥ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ、ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、及び／またはＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）－抵抗性患者が含まれる。例えば、実施形態では、対象は、抗ＣＴＬＡ－４剤に抵抗性であり、例えば、イピリムマブ（ＹＥＲＶＯＹ）抵抗性患者（例えば、黒色腫患者）である。したがって、実施形態では、本発明は、１つ以上の免疫調節剤の単剤療法を含む、様々な療法に非応答性である患者を救済するがん治療の方法を提供する。
実施形態では、本発明は、腫瘍微小環境内の細胞または組織を標的とするキメラタンパク質を提供する。実施形態では、腫瘍微小環境内の細胞または組織は、キメラタンパク質の１つ以上の標的または結合パートナーを発現する。腫瘍微小環境は、腫瘍が存在する細胞、分泌タンパク質、生理学的小分子、及び血管を含む細胞環境を指す。実施形態では、腫瘍微小環境内の細胞または組織は、腫瘍血管系、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、がん関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、及び腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞のうちの１つ以上である。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、がん細胞を標的とする。実施形態では、がん細胞は、キメラタンパク質の１つ以上の標的または結合パートナーを発現する。
実施形態では、本発明の方法は、追加の薬剤に抵抗性である患者において、キメラタンパク質による治療を提供し、本明細書の他の場所に開示されているかかる「追加の薬剤」は、本明細書に開示される様々な化学療法剤を含むがこれに限定されない。
制御性Ｔ細胞の活性化は、共刺激及び共抑制性シグナルによって決定的に影響を受ける。共刺激分子の２つの主要なファミリーには、Ｂ７及び腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーが含まれる。これらの分子は、それぞれＣＤ２８またはＴＮＦ受容体ファミリーに属するＴ細胞上の受容体と結合する。多くの明確に定義された共阻害剤及びその受容体は、Ｂ７及びＣＤ２８ファミリーに属する。
実施形態では、免疫刺激シグナルは、免疫応答を増強するシグナルを指す。例えば、腫瘍学の脈絡では、かかるシグナルは、抗腫瘍免疫を強化し得る。例えば、これらに限定されないが、免疫刺激シグナルは、白血球の増殖、サイトカイン産生、殺傷活性、または食作用活性を直接的に刺激することによって特定され得る。詳細な例には、受容体アゴニスト抗体またはかかる受容体（ＯＸ４０Ｌ、ＬＩＧＨＴ、ＣＤ７０、ＣＤ３０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＴＬ１Ａのそれぞれ）のリガンドを含むキメラタンパク質のいずれかを使用する、ＯＸ４０、ＬＴｂＲ、ＣＤ２７、ＣＤ３０、４－１ＢＢ、またはＴＮＦＲＳＦ２５などのＴＮＦスーパーファミリー受容体の直接的な刺激が含まれる。これらの受容体のうちのいずれか１つからの刺激は、個々のＴ細胞サブセットの増殖及びサイトカイン産生を直接的に刺激し得る。別の例には、かかる免疫抑制細胞の活性を阻害する受容体を介した免疫阻害細胞の直接的な刺激が含まれる。これには、例えば、ＧＩＴＲアゴニスト抗体またはキメラタンパク質を含むＧＩＴＲＬによるＣＤ４＋ＦｏｘＰ３＋制御性Ｔ細胞の刺激が含まれ、これは、制御性Ｔ細胞が、従来のＣＤ４＋またはＣＤ８＋Ｔ細胞の増殖を抑制する能力を減少させる。別の例では、これには、ＣＤ４０アゴニスト抗体またはＣＤ４０Ｌを含むキメラタンパク質を使用する抗原提示細胞の表面上でのＣＤ４０の刺激が含まれ、Ｂ７またはＴＮＦスーパーファミリーにおけるものを含む適切な天然共刺激分子との関連で抗原を提示するそれらの細胞の増強された能力を含む抗原提示細胞の活性化を引き起こす。別の例では、これには、キメラタンパク質を含むＬＩＧＨＴを使用するリンパ球または間質細胞の表面上でのＬＴＢＲの刺激が含まれ、リンパ系細胞の活性化及び／または炎症誘発性サイトカインもしくはケモカインの産生を引き起こし、任意に腫瘍内で免疫応答をさらに刺激する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、免疫調節を増強、回復、促進、及び／または刺激することが可能であるか、またはそれらを含む方法での使用を見出す。実施形態では、本明細書に記載される本発明のキメラタンパク質は、Ｔ細胞、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、抗腫瘍マクロファージ（例えば、Ｍ１マクロファージ）、Ｂ細胞、及び樹状細胞を含むがこれらに限定されない腫瘍細胞に指向する１つ以上の免疫細胞の活性または活性化を回復、促進、及び／または刺激する。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、非限定的な例として、生存促進シグナル、オートクリンもしくはパラクリン成長シグナル、ｐ３８ ＭＡＰＫ、ＥＲＫ、ＳＴＡＴ、ＪＡＫ、ＡＫＴ、もしくはＰＩ３Ｋを媒介したシグナル、抗アポトーシスシグナル、及び／または炎症誘発性サイトカイン産生もしくはＴ細胞遊走もしくはＴ細胞腫瘍浸潤のうちの１つ以上を促進する及び／またはそれに必要とするシグナルを含む、１つ以上のＴ細胞固有シグナルを活性化及び／または刺激することを含む、Ｔ細胞の活性及び／または活性化を増強、回復、促進、及び／または刺激する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、腫瘍または腫瘍微小環境へのＴ細胞（これらに限定されないが、細胞傷害性Ｔリンパ球、Ｔヘルパー細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞を含む）、Ｂ細胞、ナチュラルキラー（ＮＫ）細胞、ナチュラルキラーＴ（ＮＫＴ）細胞、樹状細胞、単球、及びマクロファージ（例えば、Ｍ１及びＭ２のうちの１つ以上）のうちの１つ以上の増加を引き起こすことが可能であるか、またはそれらを含む方法での使用を見出す。実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＤ８＋Ｔ細胞、特に腫瘍微小環境に浸潤しているＴ細胞による腫瘍抗原の認識を増強する。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＣＤ１９発現を誘導する、及び／またはＣＤ１９陽性細胞（例えば、ＣＤ１９陽性Ｂ細胞）の数を増加させる。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＩＬ－１５Ｒα発現を誘導する、及び／またはＩＬ－１５Ｒα陽性細胞（例えば、ＩＬ－１５Ｒα陽性樹状細胞）の数を増加させる。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、特に腫瘍及び／または腫瘍微小環境（ＴＭＥ）内で、免疫抑制細胞（例えば、骨髄由来サプレッサー細胞（ＭＤＳＣ）、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）、腫瘍関連好中球（ＴＡＮ）、Ｍ２マクロファージ、及び腫瘍関連マクロファージ（ＴＡＭ））の低減を阻害及び／または引き起こすことが可能であるか、またはそれらを含む方法での使用を見出す。実施形態では、本療法は、腫瘍部位及び／またはＴＭＥにおけるＭ１対Ｍ２マクロファージの比率を改変し、Ｍ１マクロファージを支持することができる。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ＩＦＮγ、ＴＮＦα、ＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－６、ＩＬ－７、ＩＬ－９、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１５、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－１７Ｆ、ＩＬ－２２、ＣＣＬ２、ＣＣＬ３、ＣＣＬ４、ＣＸＣＬ８、ＣＸＣＬ９、ＣＸＣＬ１０、ＣＸＣＬ１１、及びＣＸＣＬ１２のうちの１つ以上を含むがこれらに限定されない様々なサイトカインまたはケモカインの血清レベルを増加させることが可能である。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、治療対象の血清中のＩＬ－２、ＩＬ－４、ＩＬ－５、ＩＬ－１０、ＩＬ－１３、ＩＬ－１７Ａ、ＩＬ－２２、ＴＮＦα、またはＩＦＮγを増強することが可能である。実施形態では、本発明のキメラタンパク質を投与することは、ＴＮＦα分泌を増強することが可能である。特定の実施形態では、本発明のキメラタンパク質を投与することは、白血球によるスーパー抗原を媒介したＴＮＦα分泌を増強することが可能である。かかるサイトカイン応答の検出は、示されるキメラタンパク質のための最適な投与レジメンを決定するための方法を提供し得る。
本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質では、キメラタンパク質は、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の低減を増加または防止することが可能である。
本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質では、キメラタンパク質は、Ｔ細胞による腫瘍殺傷活性を増強することが可能である。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞の細胞死を阻害、遮断、及び／または減少させる、あるいは腫瘍誘導性Ｔ細胞の細胞死を刺激、誘導、及び／または増加させる。Ｔ細胞枯渇は、増殖及びエフェクター機能の進行性の喪失を特徴とするＴ細胞機能不全の状態であり、クローン欠失に至る。したがって、腫瘍誘導性Ｔ細胞は、多くの慢性感染症、炎症性疾患、及びがんの間に生じるＴ細胞機能不全の状態を指す。この機能不全は、機能的エフェクターまたはメモリーＴ細胞とは異なる不十分な増殖、及び／またはエフェクター機能、阻害性受容体の持続的発現、及び転写状態によって定義される。消耗は、感染及び腫瘍の最適な制御を妨げる。例示的な腫瘍誘導性Ｔ細胞には、これらに限定されないが、Ｔｒｅｇ、１つ以上のチェックポイント阻害性受容体を発現するＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞、Ｔｈ２細胞、ならびにＴｈ１７細胞が含まれる。チェックポイント阻害性受容体は、非制御な免疫応答を防止または阻害する免疫細胞に発現する受容体を指す。対照的に、抗腫瘍ＣＤ８＋及び／またはＣＤ４＋Ｔ細胞は、腫瘍に対する免疫応答を開始できるＴ細胞を指す。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞と制御性Ｔ細胞との比率を増加させることが可能であり、それを含む方法で使用することができる。例示的なエフェクターＴ細胞には、ＩＣＯＳ＋エフェクターＴ細胞、細胞傷害性Ｔ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＤ４５ＲＯ＋）、ＣＤ４＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ高、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋）、ＣＤ８＋エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ８＋、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ高、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋）、エフェクターメモリーＴ細胞（例えば、ＣＤ６２Ｌ低、ＣＤ４４＋、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ－１５Ｒ＋、ＣＣＲ７低）、セントラルメモリーＴ細胞（例えば、ＣＣＲ７＋、ＣＤ６２Ｌ＋、ＣＤ２７＋、またはＣＣＲ７高、ＣＤ４４＋、ＣＤ６２Ｌ高、ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＩＬ－７Ｒ／ＣＤ１２７＋、ＩＬ－１５Ｒ＋）、ＣＤ６２Ｌ＋エフェクターＴ細胞、初期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７＋ ＣＤ６２Ｌ－）及び後期エフェクターメモリーＴ細胞（ＣＤ２７－ ＣＤ６２Ｌ－）（それぞれＴｅｍＥ及びＴｅｍＬ）を含むＣＤ８＋エフェクターメモリーＴ細胞（ＴＥＭ）、ＣＤ１２７（＋）ＣＤ２５（低／－）エフェクターＴ細胞、ＣＤ１２７（－）ＣＤ２５（－）エフェクターＴ細胞、ＣＤ８＋幹細胞メモリーエフェクター細胞（ＴＳＣＭ）（例えば、ＣＤ４４（低）ＣＤ６２Ｌ（高）ＣＤ１２２（高）ｓｃａ（＋））、ＴＨ１エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＸＣＲ３＋、ＣＸＣＲ６＋、及びＣＣＲ５＋、またはαβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－１２Ｒ＋、ＩＦＮγＲ＋、ＣＸＣＲ３＋）、ＴＨ２エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＣＲ３＋、ＣＣＲ４＋、及びＣＣＲ８＋、またはαβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－４Ｒ＋、ＩＬ－３３Ｒ＋、ＣＣＲ４＋、ＩＬ－１７ＲＢ＋、ＣＲＴＨ２＋）、ＴＨ９エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋）、ＴＨ１７エフェクターＴ細胞（例えば、αβ ＴＣＲ、ＣＤ３＋、ＣＤ４＋、ＩＬ－２３Ｒ＋、ＣＣＲ６＋、ＩＬ－１Ｒ＋）、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７＋エフェクターＴ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ４５ＲＯ＋ＣＣＲ７（－）エフェクターＴ細胞、ならびにＩＬ－２、ＩＬ－４、及び／またはＩＦＮ－γを分泌するエフェクターＴ細胞が含まれる。例示的な制御性Ｔ細胞には、ＩＣＯＳ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋ＦＯＸＰ３＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５－制御性Ｔ細胞、ＣＤ４＋ＣＤ２５高制御性Ｔ細胞、ＴＩＭ－３＋ＰＤ－１＋制御性Ｔ細胞、リンパ球活性化遺伝子－３（ＬＡＧ－３）＋制御性Ｔ細胞、ＣＴＬＡ－４／ＣＤ１５２＋制御性Ｔ細胞、ニューロピリン－１（Ｎｒｐ－１）＋制御性Ｔ細胞、ＣＣＲ４＋ＣＣＲ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ６２Ｌ（Ｌ－セレクチン）＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ４５ＲＢ低制御性Ｔ細胞、ＣＤ１２７低制御性Ｔ細胞、ＬＲＲＣ３２／ＧＡＲＰ＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ３９＋制御性Ｔ細胞、ＧＩＴＲ＋制御性Ｔ細胞、ＬＡＰ＋制御性Ｔ細胞、１Ｂ１１＋制御性Ｔ細胞、ＢＴＬＡ＋制御性Ｔ細胞、１型制御性Ｔ細胞（Ｔｒ１細胞）、Ｔヘルパー３型（Ｔｈ３）細胞、ナチュラルキラーＴ細胞表現型（ＮＫＴｒｅｇ）の制御性細胞、ＣＤ８＋制御性Ｔ細胞、ＣＤ８＋ＣＤ２８－制御性Ｔ細胞、及び／またはＩＬ－１０、ＩＬ－３５、ＴＧＦ－β、ＴＮＦ－α、ガレクチン－１、ＩＦＮ－γ、及び／またはＭＣＰ１を分泌する制御性Ｔ細胞が含まれる。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５－Ｔ細胞）の増加を引き起こす。
実施形態では、キメラタンパク質は、制御性Ｔ細胞（例えば、ＣＤ４＋ＣＤ２５＋Ｔ細胞）の低減を引き起こす。
実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＤ１０３＋抗原提示細胞（例えば、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞）の増加を引き起こす。
実施形態では、キメラタンパク質は、例えば、再発を防止するか、もしくは動物を再発から保護すること、及び／または転移を防止するか、もしくは転移の可能性を減少させることができる記憶応答を生成する。したがって、キメラタンパク質により治療した動物は、キメラタンパク質による初期の治療後に再負荷した場合、後に腫瘍細胞を攻撃する、及び／または腫瘍発生を防ぐことが可能である。したがって、本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質は、活性な腫瘍破壊、及びさらに腫瘍抗原の免疫認識の両方を刺激し、これらは、再発を防ぐことが可能である記憶応答をプログラミングするのに不可欠である。
実施形態では、キメラタンパク質は、抗原提示細胞の活性化を引き起こすことが可能である。実施形態では、キメラタンパク質は、抗原提示細胞が抗原を提示する能力を増強することが可能である。
実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＤ１０３＋抗原提示細胞（例えば、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞）の頻度及び／または絶対数の増加をもたらす。
実施形態では、キメラタンパク質は、ＣＤ１０３＋抗原提示細胞（例えば、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞）の頻度及び／または絶対数の増加、ならびにその同じ細胞の活性化状態を同時にもたらす（例えば、ＣＤ８０、及び／またはＣＤ８６、及び／またはＣＤ４０、及び／またはＩＬ－１２、及び／またはＩＦＮｇ、及び／またはＣＤ８の発現を増加させることによる）。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、エフェクターＴ細胞を約１２時間、約２４時間、約４８時間、約７２時間、または約９６時間、または約１週間、または約２週間より長く一過性に刺激することが可能であり、それを含む方法で使用することができる。実施形態では、エフェクターＴ細胞の一過性の刺激は実質的に、患者の血流、または例えば、骨髄、リンパ節、脾臓、胸腺、粘膜関連リンパ組織（ＭＡＬＴ）などのリンパ組織、非リンパ組織、もしくは腫瘍微小環境を含む特定の組織／位置で生じる。
本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質では、本発明のキメラタンパク質は予想外に、細胞外ドメイン成分のそのそれぞれの結合パートナーとの結合を遅いオフ速度（ＫｄまたはＫオフ）で提供する。実施形態では、これは、受容体とリガンド、及びその逆の予想外に長い相互作用を提供する。かかる効果は、より長い正のシグナル効果、例えば、免疫刺激シグナルの増加または活性化を可能にする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、例えば、長いオフ速度結合を介して、免疫細胞増殖を提供するのに十分なシグナル伝達を可能とし、抗腫瘍攻撃を可能とし、刺激シグナル、例えばサイトカインの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能とする。
本発明のキメラタンパク質、及び／または本発明の方法で使用されるキメラタンパク質では、キメラタンパク質は、細胞間で安定性シナプスを形成することが可能である。キメラタンパク質によって促進される細胞の安定性シナプスは、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を配置するなど、腫瘍の縮小に有利な空間的配向を提供する。実施形態では、これは、キメラタンパク質の血清半減期（ｔ１／２）と比較して、より長い標的上の（例えば、腫瘍内）ｔ１／２を提供する。かかる特性は、キメラタンパク質の全身的な分布に関連する標的外毒性を減少させるという複合的な利点を有する可能性がある。
加えて、キメラタンパク質は、単一の免疫系細胞の表面上の２つの受容体／リガンド（例えば、ＦＬＴ３及びＩＩ型膜貫通タンパク質の受容体／リガンド）と独立して結合し、活性化し得る。
実施形態では、キメラタンパク質は、持続的な免疫調節効果を提供することが可能である。
本発明のキメラタンパク質は、２つの免疫療法剤の部位特異的相互作用を改善できるため、相乗的な治療効果（例えば、抗腫瘍効果）を提供する。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、オフサイト及び／または全身的な毒性を減少させる可能性を提供する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、増強された安全性プロファイルを示す。一実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、減少した毒性プロファイルを示す。例えば、本発明のキメラタンパク質の投与は、下痢、炎症（例えば、腸の）、体重低下のうちの１つ以上などの副作用の減少をもたらし得、これらは、本発明のキメラタンパク質の細胞外ドメインによって標的化されるリガンド（複数可）／受容体（複数可）に指向する抗体の投与後に生じる。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、有効性を犠牲にすることなく、本発明のキメラタンパク質の細胞外ドメインによって標的化されるリガンド（複数可）／受容体（複数可）に指向する抗体と比較して、改善した安全性を提供する。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、現在の免疫療法、例えば、本発明のキメラタンパク質の細胞外ドメインによって標的化されるリガンド（複数可）／受容体（複数可）に指向する抗体と比較して、減少した副作用、例えば、ＧＩ合併症を提供する。例示的なＧＩ合併症には、腹痛、食欲不振、自己免疫効果、便秘、痙攣、脱水症、下痢、食事の問題、倦怠感、鼓腸、腹部における流体すなわち腹水、胃腸（ＧＩ）腸内毒素症、ＧＩ粘膜炎、炎症性腸疾患、過敏性腸症候群（ＩＢＳ－Ｄ及びＩＢＳ－Ｃ）、悪心、疼痛、便もしくは尿の変化、潰瘍性大腸炎、嘔吐、流体保持による体重増加、及び／または脱力感が含まれる。
いくつかの態様では、本発明のキメラ薬剤は、１つ以上の感染症を治療するために使用される。実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、ウイルス感染症（例えば、ＨＩＶ及びＨＣＶを含む）を治療する方法で使用される。実施形態では、感染症は、免疫抑制を誘導する。例えば、ＨＩＶ感染は、多くの場合、感染した対象において免疫抑制をもたらす。したがって、本明細書の他の場所に開示されるように、かかる感染症の治療は、実施形態では、免疫阻害を遮断または妨げるよりも免疫刺激に有利になるように、本発明のキメラタンパク質を用いて免疫系を調節することを伴う。
実施形態では、本発明は、限定されないが、急性または慢性のウイルス感染、例えば、呼吸器、乳頭腫ウイルス感染、単純ヘルペスウイルス（ＨＳＶ）感染、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ）感染、及び肝炎ウイルス感染などの内臓のウイルス感染を含む、ウイルス感染を治療する方法を提供する。実施形態では、ウイルス感染は、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスによって引き起こされる。実施形態では、Ｆｌａｖｉｖｉｒｉｄａｅ科のウイルスは、黄熱病ウイルス、ウエストナイルウイルス、デングウイルス、日本脳炎ウイルス、セントルイス脳炎ウイルス、及びＣ型肝炎ウイルスから選択される。実施形態では、ウイルス感染症は、Ｐｉｃｏｒｎａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ポリオウイルス、ライノウイルス、コクサッキーウイルスのウイルスによって引き起こされる。実施形態では、ウイルス感染は、Ｏｒｔｈｏｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、インフルエンザウイルスによって引き起こされる。実施形態では、ウイルス感染は、Ｒｅｔｒｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、レンチウイルスによって引き起こされる。実施形態では、ウイルス感染は、Ｐａｒａｍｙｘｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、呼吸器合胞体ウイルス、ヒトパラインフルエンザウイルス、ルブラウイルス（例えば、ムンプスウイルス）、麻疹ウイルス、及びヒトメタニューモウイルスによって引き起こされる。実施形態では、ウイルス感染は、Ｂｕｎｙａｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ハンタウイルスによって引き起こされる。実施形態では、ウイルス感染は、Ｒｅｏｖｉｒｉｄａｅ科、例えば、ロタウイルスによって引き起こされる。
併用療法及び複合
実施形態では、本発明は、対象に追加の薬剤を投与することをさらに含む、キメラタンパク質及び方法を提供する。実施形態では、本発明は、共投与及び／または共製剤に関する。本明細書に開示される組成物のいずれも、共製剤化及び／または共投与することができる。
実施形態では、本明細書に開示される任意のキメラタンパク質は、別の薬剤と共投与された場合に相乗的に作用し、かかる薬剤が単剤療法として使用される場合に、一般的に利用される用量よりも低い用量で投与される。実施形態では、本明細書で参照される任意の薬剤は、本明細書に開示されるキメラタンパク質のうちのいずれかと組み合わせて使用され得る。
実施形態では、がんへの適用を含むがこれに限定されず、本発明は、追加の薬剤としての化学療法剤に関する。化学療法剤の例としては、限定されないが、チオテパ及びＣＹＴＯＸＡＮシクロスホスファミドなどのアルキル化薬剤；ブスルファン、インプロスルファン、及びピポスルファンなどのアルキルスルホネート；ベンゾドパ、カルボコン、メツレドパ、及びウレドパなどのアジリジン；アルトレタミン、トリエチレンメラミン、トリエチレンホスホルアミド、トリエチレンチオホスホルアミド、及びトリメチローロメラミンを含むエチレンイミン及びメチルアメラミン；アセトゲニン（例えば、ブラタシン及びブラタシノン）；カンプトテシン（合成類似体トポテカンを含む）；ブリオスタチン；カリスタチン；ＣＣ－１０６５（そのアドゼレシン、カルゼレシン、及びビゼレシン合成類似体を含む）；クリプトフィシン（例えばクリプトフィシン１及びクリプトフィシン８）；ドラスタチン；デュオカルマイシン（合成類似体、ＫＷ－２１８９及びＣＢ １－ＴＭ１を含む）；エリュテロビン；パンクラチスタチン；サルコディクチン；スポンジスタチン；クロラムブシル、クロルナファジン、クロロホスファミド、エストラムスチン、イホスファミド、メクロレタミン、塩酸メクロレタミンオキシド、メルファラン、ノベンビチン、フェネステリン、プレドニムスチン、トロホスファミド、ウラシルマスタードなどのナイトロジェンマスタード；カルムスチン、クロロゾトシン、フォテムスチン、ロムスチン、ニムスチン、ラニムスチンなどのニトロソウレア；エンジイン抗生物質などの抗生物質（例えば、カリケアマイシン、特にカリケアマイシンガンマル及びカリケアマイシンオメガル（例えばＡｇｎｅｗ，Ｃｈｅｍ．Ｉｎｔｌ．Ｅｄ．Ｅｎｇｌ．，３３：１８３－１８６（１９９４）を参照されたい）；ダイネミシンＡを含むダイネミシン；クロドロネートなどのビスホスホネート；エスペラミシン；ならびにネオカルジノスタチン発色団及び関連する色素タンパク質エンジイン抗生物質発色団）、アクラシノマイシン、アクチノマイシン、オートラマイシン、アザセリン、ブレオマイシン、カクチノマイシン、カラビシン、カミノマイシン、カルジノフィリン、クロモマイシン、ダクチノマイシン、ダウノルビシン、デトルビシン、６－ジアゾ－５－オキソ－Ｌ－ノルロイシン、ＡＤＲＩＡＭＹＣＩＮドキソルビシン（モルホリノ－ドキソルビシン、シアノモルホリノ－ドキソルビシン、２－ピロリノ－ドキソルビシン及びデオキシドキソルビシンを含む）、エピルビシン、エソルビシン、イダルビシン、マルセロマイシン、マイトマイシンＣなどのマイトマイシン、ミコフェノール酸、ノガラマイシン、オリボマイシン、ペプロマイシン、ポトフィロマイシン、ピューロマイシン、ケラマイシン、ロドルビシン、ストレプトニグリン、ストレプトゾシン、ツベルシジン、ウベニメクス、ジノスタチン、ゾルビシン；メトトレキサート及び５－フルオロウラシル（５－ＦＵ）などの代謝拮抗剤；デノプテリン、メトトレキサート、プテロプテリン、トリメトレキサートなどの葉酸類似体；フルダラビン、６－メルカプトプリン、チアミプリン、チオグアニンなどのプリン類似体；アンシタビン、アザシチジン、６－アザウリジン、カルモフル、シタラビン、ジデオキシウリジン、ドキシフルリジン、エノシタビン、フロクスウリジンなどのピリミジン類似体；カルステロン、プロピオン酸ドロスタノロン、エピチオスタノール、メピチオスタン、テストトラクトンなどのアンドロゲン；ミノグルテチミド、ミトタン、トリロスタンなどの抗副腎剤；フロリン酸などの葉酸補充剤；アセグラトン；アルドホスファミド配糖体；アミノレブリン酸；エニルラシル；アムサクリン；ベストラブシル；ビサントレン；エダトレキサート；デメコルシン；ジアジクオン；エルフォルミチン；酢酸エリプチニウム；エポチロン；エトグルシド；硝酸ガリウム；ヒドロキシ尿素；レンチナン；ロニダイニン；メイタンシン及びアンサミトシンなどのメイタンシノイド；ミトグアゾン；ミトキサントロン；モピダンモール；ニトラエリン；ペントスタチン；フェナメット；ピラルビシン；ロソキサントロン；ポドフィリン酸；２－エチルヒドラジド；プロカルバジン；ＰＳＫ多糖類複合体（ＪＨＳ Ｎａｔｕｒａｌ Ｐｒｏｄｕｃｔｓ，Ｅｕｇｅｎｅ，Ｏｒｅｇ．）；ラゾキサン；リゾキシン；シゾフラン；スピロゲルマニウム；テヌアゾン酸；トリアジクオン；２，２’，２’’－トリクロロトリエチルアミン；トリコテセン（例えば、Ｔ－２トキシン、ベラクリンＡ、ロリジンＡ、及びアンギジン）；ウレタン；ビンデシン；ダカルバジン；マンノムスチン；ミトブロニトール；ミトラクトール；ピポブロマン；ガシトシン；アラビノシド（「Ａｒａ－Ｃ」）；シクロホスファミド；チオテパ；タクソイド、例えば、ＴＡＸＯＬパクリタキセル（Ｂｒｉｓｔｏｌ－Ｍｙｅｒｓ Ｓｑｕｉｂｂ Ｏｎｃｏｌｏｇｙ，Ｐｒｉｎｃｅｔｏｎ，Ｎ．Ｊ．）、ＡＢＲＡＸＡＮＥクレモフォアフリー、パクリタキセルのアルブミン操作ナノ粒子製剤（Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｐａｒｔｎｅｒｓ，Ｓｃｈａｕｍｂｅｒｇ，１１１．）、及びＴＡＸＯＴＥＲＥドセタキセル（Ｒｈｏｎｅ－Ｐｏｕｌｅｎｃ Ｒｏｒｅｒ，Ａｎｔｏｎｙ，Ｆｒａｎｃｅ）；クロランブシル；ＧＥＭＺＡＲゲムシタビン；６－チオグアニン；メルカプトプリン；メトトレキサート；シスプラチン、オキサリプラチン、カルボプラチンなどの白金類似体；ビンブラスチン；白金；エトポシド（ＶＰ－１６）；イホスファミド；ミトキサントロン；ビンクリスチン；ＮＡＶＥＬＢＩＮＥ．ビノレルビン；ノバントロン；テニポシド；エダトレキサート；ダウノマイシン；アミノプテリン；ゼローダ；イバンドロネート；イリノテカン（Ｃａｍｐｔｏｓａｒ、ＣＰＴ－１１）（５－ＦＵ及びロイコボリンによるイリノテカンの治療レジメンを含む）；トポイソメラーゼ阻害剤ＲＦＳ２０００；ジフルオロメチルオルニチン（ＤＭＦＯ）；レチノイン酸などのレチノイド；カペシタビン；コンブレタスタチン；ロイコボリン（ＬＶ）；オキサリプラチン治療レジメン（ＦＯＬＦＯＸ）を含むオキサリプラチン；ラパチニブ（ＴＹＫＥＲＢ）；細胞増殖を低下させるＰＫＣ－αの阻害剤、Ｒａｆの阻害剤、Ｈ－Ｒａｓの阻害剤、ＥＧＦＲの阻害剤（例えば、エルロチニブ（タルセバ））、及びＶＥＧＦ－Ａの阻害剤、ならびに上記の任意の薬学的に許容される塩、酸、または誘導体が含まれる。さらに、治療方法は、放射線の使用をさらに含むことができる。さらに、治療方法は、光力学療法の使用をさらに含むことができる。
実施形態では、がんへの適用を含むがこれらに限定されず、本発明の追加の薬剤は、ＰＤ－１及びＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２、及び／またはＰＤ－１とＰＤ－Ｌ１またはＰＤ－Ｌ２との結合を遮断、減少、及び／または阻害する薬剤（非限定的な例として、ニボルマブ（ＯＮＯ－４５３８／ＢＭＳ－９３６５５８、ＭＤＸ１１０６、ＯＰＤＩＶＯ、ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、ペムブロリズマブ（ＫＥＹＴＲＵＤＡ，Ｍｅｒｃｋ）、ＭＫ－３４７５（ＭＥＲＣＫ）、ＢＭＳ ９３６５５９（ＢＲＩＳＴＯＬ ＭＹＥＲＳ ＳＱＵＩＢＢ）、アテゾリズマブ（ＴＥＣＥＮＴＲＩＱ，ＧＥＮＥＮＴＥＣＨ）、ＭＰＤＬ３２８ＯＡ（ＲＯＣＨＥ）のうちの１つ以上）、ＣＤ１３７（４－１ＢＢ）及び／またはＣＤ１３７（４－１ＢＢ）と４－１ＢＢリガンドの１つ以上との結合を増加及び／または刺激する薬剤（非限定的な例として、ウレルマブ（ＢＭＳ－６６３５１３及び抗４－１ＢＢ抗体）、及びＣＴＬＡ－４の活性及び／またはＣＴＬＡ－４とＡＰ２Ｍ１、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＳＨＰ－２、及びＰＰＰ２Ｒ５Ａの１つ以上との結合、及び／またはＯＸ４０とＯＸ４０Ｌとの結合を遮断、減少、及び／または阻害する薬剤（非限定的な例として、ＧＢＲ ８３０（ＧＬＥＮＭＡＲＫ）、ＭＥＤＩ６４６９（ＭＥＤＩＭＭＵＮＥ）から選択される１つ以上の免疫調節剤である。
実施形態では、感染症への適用を含むがこれに限定されず、本発明は、追加の薬剤としての抗感染症剤に関する。実施形態では、抗感染症剤は、アバカビル、アシクロビル、アデフォビル、アンプレナビル、アタザナビル、シドホビル、ダルナビル、デラビルジン、ジダノシン、ドコサノール、エファビレンツ、エルビテグラビル、エムトリシタビン、エンフビルチド、エトラビリン、ファムシクロビル、及びフォスカルネットを含むがこれらに限定されない抗ウイルス剤である。実施形態では、抗感染症剤は、セファロスポリン抗生物質（セファレキシン、セフロキシム、セファドロキシル、セファゾリン、セファロシン、セファクロール、セファマンドール、セフォキシチン、セフプロジル、及びセフトビプロール）；フルオロキノロン抗生物質（シプロ、レバクイン、フロキシン、テキン、アベロックス、及びノルフロックス）；テトラサイクリン抗生物質（テトラサイクリン、ミノサイクリン、オキシテトラサイクリン、及びドキシサイクリン）；ペニシリン抗生物質（アモキシシリン、アンピシリン、ペニシリンＶ、ジクロキサシリン、カルベニシリン、バンコマイシン、及びメチシリン）；モノバクタム抗生物質（アズトレオナム）；ならびにカルバペネム抗生物質（エルタペネム、ドリペネム、イミペネム／シリスタチン、及びメロペネム）を含むがこれらに限定されない抗細菌剤である。実施形態では、抗感染症剤としては、抗マラリア剤（例えば、クロロキン、キニン、メフロキン、プリマキン、ドキシサイクリン、アルテメテル／ルメファントリン、アトバクオン／プログアニル、及びスルファドキシン／ピリメタミン）、メトロニダゾール、チニダゾール、イベルメクチン、パモ酸ピランテル、及びアルベンダゾールが含まれる。
実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、共有結合が組成物の活性を妨げないように、すなわち、組成物への任意の種類の分子の共有結合によって修飾した誘導体を含む。例えば、限定されないが、誘導体には、とりわけ、グリコシル化、脂質化、アセチル化、ペグ化、リン酸化、アミド化、既知の保護／遮断基による誘導体化、タンパク質分解切断、細胞性リガンドまたは他のタンパク質との結合などによって修飾されている組成物が含まれる。特定の化学的切断、アセチル化、ホルミル化、ツニカマイシンの代謝合成などを含むがこれらに限定されない既知の技術によって、多数の化学修飾のいずれかを実施することができる。さらに、誘導体は、１つ以上の非古典的アミノ酸を含むことができる。さらに他の実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、例示的な実施形態において、毒素、化学療法剤、放射性同位元素、及びアポトーシスまたは細胞死を引き起こす薬剤を含む、細胞傷害性薬剤をさらに含む。かかる薬剤は、本明細書に開示される組成物に複合化され得る。
したがって、本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、翻訳後に修飾して、化学リンカーなどのエフェクター部分、例えば、蛍光色素、酵素、基質、生物発光物質、放射性物質、及び化学発光部分などの検出可能な部分、または例えば、ストレプトアビジン、アビジン、ビオチン、細胞毒素、細胞傷害性薬剤、及び放射性物質などの機能的部分を追加することができる。
薬学的組成物
本発明の態様は、治療有効量の本明細書に開示されるキメラタンパク質を含む薬学的組成物を含む。
本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、十分に塩基性の官能基を保有することができ、それは、無機、有機、またはカルボキシル基と反応することができ、無機または有機塩基と反応して、薬学的に許容される塩を形成することができる。薬学的に許容される酸付加塩は、当該技術分野で周知であるように、薬学的に許容される酸から形成される。かかる塩には、例えば、Ｊｏｕｒｎａｌ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅ，６６，２－１９（１９７７）、及びＴｈｅ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓａｌｔｓ；Ｐｒｏｐｅｒｔｉｅｓ，Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ，ａｎｄ Ｕｓｅ Ｐ．Ｈ．Ｓｔａｈｌ ａｎｄ Ｃ．Ｇ．Ｗｅｒｍｕｔｈ（ｅｄｓ．），Ｖｅｒｌａｇ，Ｚｕｒｉｃｈ（Ｓｗｉｔｚｅｒｌａｎｄ）２００２に列挙される薬学的に許容される塩が含まれ、これらは、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
実施形態では、本明細書に開示される組成物は、薬学的に許容される塩の形態である。
さらに、本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、組成物、例えば、薬学的に許容される担体またはビヒクルを含む薬学的組成物の成分として対象に投与することができる。かかる薬学的組成物は、適切な投与のための形態を提供するために、任意で、好適な量の薬学的に許容される賦形剤を含むことができる。薬学的賦形剤は、水、及び例えばピーナッツ油、ダイズ油、鉱物油、ゴマ油といった石油、動物、植物、もしくは合成起源のものを含む油などの液体であり得る。薬学的賦形剤は、例えば、食塩水、アカシアゴム、ゼラチン、デンプンのり、タルク、ケラチン、コロイダルシリカ、尿素、及び類似物であり得る。加えて、助剤、安定剤、増粘剤、滑沢剤、及び着色剤を使用することができる。一実施形態では、薬学的に許容される賦形剤は、対象に投与される場合に無菌である。水は、本明細書に開示される任意の薬剤が静脈内投与される場合に有用な賦形剤である。食塩水溶液ならびにデキストロース及びグリセロールの水溶液はまた、特に注入溶液のために液体賦形剤として用いられ得る。好適な薬学的賦形剤には、デンプン、グルコース、ラクトース、スクロース、ゼラチン、麦芽、コメ、小麦粉、チョーク、シリカゲル、ステアリン酸ナトリウム、モノステアリン酸グリセロール、タルク、塩化ナトリウム、乾燥脱脂乳、グリセロール、プロピレングリコール、水、エタノールなども含まれる。本明細書に開示される任意の薬剤は、必要に応じて、少量の湿潤もしくは乳化剤、またはｐＨ緩衝剤を含むこともできる。
実施形態では、本明細書に開示される組成物、例えば、薬学的組成物は、生理食塩水緩衝液（ＴＢＳ、ＰＢＳなどを含むがこれらに限定されない）に再懸濁される。
実施形態では、キメラタンパク質は、半減期を延長するか、さもなければ薬力学的及び薬物動態学的特性を改善するために、別の薬剤と複合化及び／または融合することができる。実施形態では、キメラタンパク質は、ＰＥＧ、ＸＴＥＮ（例えば、ｒＰＥＧとして）、ポリシアル酸（ＰＯＬＹＸＥＮ）、アルブミン（例えば、ヒト血清アルブミンまたはＨＡＳ）、エラスチン様タンパク質（ＥＬＰ）、ＰＡＳ、ＨＡＰ、ＧＬＫ、ＣＴＰ、トランスフェリンなどのうちの１つ以上と融合または複合化され得る。実施形態では、個々のキメラタンパク質の各々は、ＢｉｏＤｒｕｇｓ（２０１５）２９：２１５－２３９に記載される薬剤のうちの１つ以上と融合されており、その全内容は、参照により本明細書に組み込まれる。
本発明は、薬学的組成物の様々な製剤において開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）を含む。本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、溶液、懸濁液、乳剤、液滴、錠剤、丸薬、ペレット、カプセル、液体を含むカプセル、粉末、徐放性製剤、坐剤、乳濁液、エアロゾル、スプレー、懸濁液、または使用に好適な他の任意の形態をとることができる。タンパク質配列をコードするＤＮＡまたはＲＮＡ構築物も使用することができる。実施形態では、組成物は、カプセルの形態である（例えば、米国特許第５，６９８，１５５号を参照されたい）。好適な薬学的添加剤の他の例は、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓ Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｓｃｉｅｎｃｅｓ１４４７－１６７６（Ａｌｆｏｎｓｏ Ｒ．Ｇｅｎｎａｒｏ ｅｄｓ．，１９ｔｈ ｅｄ．１９９５）に記載されており、参照により本明細書に組み込まれる。
必要に応じて、キメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）を含む薬学的組成物は、可溶化剤を含むこともできる。また、薬剤は、当技術分野で既知である好適なビヒクルまたは送達デバイスを用いて送達することができる。本明細書に概説される併用療法は、単一の送達ビヒクルまたは送達デバイスで共送達することができる。投与用の組成物は、任意で、注入の部位における疼痛を緩和するために、例えば、リグノカインなどの局所麻酔薬を含むことができる。
本発明のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）を含む薬学的組成物は、単位剤形で好都合に提示することができ、薬学の分野で周知である方法のいずれかによって調製することができる。かかる方法は一般に、治療剤を１つ以上の副成分を構成する担体と会合させるステップを含む。典型的には、薬学的組成物は、治療剤を液体担体、細かく分割した固体担体、またはその両方と会合させることによって均一かつ密接に調製され、次に必要に応じて、生成物を所望の製剤の剤形に成形する（例えば、湿式または乾式造粒、粉末ブレンドなど、その後、当技術分野で既知である従来の方法を使用して錠剤化する）。
実施形態では、本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、本明細書に開示される投与様式に適合した薬学的組成物として、慣例の手順に従って製剤化される。
投与、用量、及び治療レジメン
投与経路には、例えば、皮内、腫瘍内、筋肉内、腹腔内、静脈内、皮下、鼻腔内、硬膜外、経口、舌下、鼻腔内、脳内、膣内、経皮、直腸、吸入、または局所的、特に耳、鼻、目、もしくは皮膚に対するものを含む。
例として、投与は血流中に本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の放出をもたらすか（経腸または非経口投与を介して）、または代替的にキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、活性疾患の部位に直接的に投与される。
本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、経口的に投与され得る。かかるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）はまた、他の簡便な経路、例えば、静脈内注入またはボーラス注射、上皮または粘膜皮膚内層を介した吸収（例えば、口腔粘膜、直腸、及び腸粘膜など）によって投与することもでき、別の生物学的に活性な薬剤と一緒に投与することもできる。投与は、全身性または局所性であり得る。様々な送達系、例えば、リポソーム、微粒子、マイクロカプセル、カプセルなどへの封入化が既知であり、投与するために使用することができる。
特定の実施形態では、それは、治療が必要な領域に局所的に投与することが望ましい場合がある。実施形態では、例えば、がんの治療において、キメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、腫瘍微小環境（例えば、腫瘍血管系を含む、腫瘍細胞を取り囲み及び／または供給する細胞、分子、細胞外マトリックス及び／または血管、腫瘍浸潤リンパ球、線維芽細網細胞、内皮前駆細胞（ＥＰＣ）、がん関連線維芽細胞、周皮細胞、他の間質細胞、細胞外マトリックス（ＥＣＭ）の成分、樹状細胞、抗原提示細胞、Ｔ細胞、制御性Ｔ細胞、マクロファージ、好中球、ならびに腫瘍の近位に位置する他の免疫細胞）またはリンパ節に投与される、及び／または腫瘍微小環境またはリンパ節を標的とする。実施形態では、例えば、がんの治療において、キメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、腫瘍内に投与される。
実施形態では、本発明のキメラタンパク質は、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１つ以上による治療）で見られるよりも少ない副作用を提供する二重効果を可能とする。例えば、本発明のキメラタンパク質は、皮膚、胃腸管、腎臓、末梢及び中枢神経系、肝臓、リンパ節、目、膵臓、ならびに内分泌系を含む様々な組織及び器官に影響を与え、例えば、下垂体炎、大腸炎、肝炎、間質性肺炎、発疹、リウマチ性疾患など一般的に観察される免疫関連の有害事象を減少または予防する。さらに、現在の局所性投与、例えば腫瘍内投与は、従来の免疫療法（例えば、ＯＰＤＩＶＯ、ＫＥＹＴＲＵＤＡ、ＹＥＲＶＯＹ、及びＴＥＣＥＮＴＲＩＱのうちの１つ以上による治療）で使用されるような標準的な全身投与、例えば、ＩＶ注入で見られる有害事象を未然に防ぐ。
非経口投与（例えば、静脈内、筋肉内、腹腔内、皮下、及び関節内注射ならびに注入）に好適な剤形には、例えば、溶液、懸濁液、分散液、乳濁液などが含まれる。それらはまた、使用直前に無菌の注入可能な培地に溶解または懸濁することができる、無菌の固体組成物（例えば、凍結乾燥組成物）の形態で製造され得る。それらは、例えば、当技術分野で既知である懸濁剤または分散剤を含み得る。
本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の投与量、ならびに投薬スケジュールは、治療される疾患、対象の一般的な健康状態、及び投与する医師の裁量を含むがこれらに限定されない様々なパラメータに依存し得る。本明細書に開示される任意のキメラタンパク質は、追加の薬剤の投与の前（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間前）、それと同時、またはそれに続いて（例えば、５分、１５分、３０分、４５分、１時間、２時間、４時間、６時間、１２時間、２４時間、４８時間、７２時間、９６時間、１週間、２週間、３週間、４週間、５週間、６週間、８週間、または１２週間後）、それを必要とする対象に投与することができる。
実施形態では、キメラタンパク質及び追加の薬剤（複数可）は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満間隔、１時間間隔、１時間～２時間間隔、２時間～３時間間隔、３時間～４時間間隔、４時間～５時間間隔、５時間～６時間間隔、６時間～７時間間隔、７時間～８時間間隔、８時間～９時間間隔、９時間～１０時間間隔、１０時間～１１時間間隔、１１時間～１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、または４週間間隔で投与される。
実施形態では、本発明は、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質、及び適応免疫応答を誘導する別のキメラタンパク質の共投与に関する。かかる実施形態では、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与の前、それと同時、またはそれに続いて投与され得る。例えば、キメラタンパク質は、１分間隔、１０分間隔、３０分間隔、１時間未満間隔、１時間間隔、１時間～２時間間隔、２時間～３時間間隔、３時間～４時間間隔、４時間～５時間間隔、５時間～６時間間隔、６時間～７時間間隔、７時間～８時間間隔、８時間～９時間間隔、９時間～１０時間間隔、１０時間～１１時間間隔、１１時間～１２時間間隔、１日間隔、２日間隔、３日間隔、４日間隔、５日間隔、６日間隔、１週間間隔、２週間間隔、３週間間隔、または４週間間隔で投与され得る。例示的な実施形態では、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質及び適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質は、１週間間隔で投与されるか、または隔週で投与される（すなわち、自然免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与は、適応免疫応答を誘導するキメラタンパク質の投与が１週間後に続くなどである）。
本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の投与量は、状態の重症度、状態を治療するのかまたは予防するのか、治療する対象の年齢、体重、健康状態など、いくつかの要因に依存し得る。さらに、特定の対象に関する薬理ゲノミクス（治療上の薬物動態、薬力学、または有効性プロファイルに対する遺伝子型の影響）情報は、使用される投与量に影響し得る。さらに、正確な個々の投与量は、投与される薬剤の特定の組み合わせ、投与の期間、投与の経路、製剤の性質、排泄率、治療される特定の疾患、障害の重症度、及び障害の解剖学的位置を含む、様々な要因に応じて若干調整することができる。投与量のいくつかの変動が予想され得る。
非経口注入による本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の投与について、投与量は、１日あたり約０．１ｍｇ～約２５０ｍｇ、１日あたり約１ｍｇ～約２０ｍｇ、または１日あたり約３ｍｇ～約５ｍｇであり得る。一般に、経口的または非経口的に投与される場合、本明細書に開示される任意の薬剤の投与量は、１日あたり約０．１ｍｇ～約１５００ｍｇ、または１日あたり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇ、または１日あたり約０．５ｍｇ～約５ｍｇ、または１日あたり約２００～約１，２００ｍｇ（例えば、１日あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）であり得る。
実施形態では、本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の投与は、治療あたり約０．１ｍｇ～約１５００ｍｇ、または治療あたり約０．５ｍｇ～約１０ｍｇ、または治療あたり約０．５ｍｇ～約５ｍｇ、または治療あたり約２００～約１，２００ｍｇ（例えば、治療あたり約２００ｍｇ、約３００ｍｇ、約４００ｍｇ、約５００ｍｇ、約６００ｍｇ、約７００ｍｇ、約８００ｍｇ、約９００ｍｇ、約１，０００ｍｇ、約１，１００ｍｇ、約１，２００ｍｇ）の投与量での非経口注入によるものである。
実施形態では、キメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の好適な投与量は、対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１００ｍｇ／ｋｇまたは対象の体重の約０．０１ｍｇ／ｋｇ～約１０ｍｇ／ｋｇ、例えば、約０．０１ｍｇ／ｋｇ、約０．０２ｍｇ／ｋｇ、約０．０３ｍｇ／ｋｇ、約０．０４ｍｇ／ｋｇ、約０．０５ｍｇ／ｋｇ、約０．０６ｍｇ／ｋｇ、約０．０７ｍｇ／ｋｇ、約０．０８ｍｇ／ｋｇ、約０．０９ｍｇ／ｋｇ、約０．１ｍｇ／ｋｇ、約０．２ｍｇ／ｋｇ、約０．３ｍｇ／ｋｇ、約０．４ｍｇ／ｋｇ、約０．５ｍｇ／ｋｇ、約０．６ｍｇ／ｋｇ、約０．７ｍｇ／ｋｇ、約０．８ｍｇ／ｋｇ、約０．９ｍｇ／ｋｇ、約１ｍｇ／ｋｇ、約１．１ｍｇ／ｋｇ、約１．２ｍｇ／ｋｇ、約１．３ｍｇ／ｋｇ、約１．４ｍｇ／ｋｇ、約１．５ｍｇ／ｋｇ、約１．６ｍｇ／ｋｇ、約１．７ｍｇ／ｋｇ、約１．８ｍｇ／ｋｇ、１．９ｍｇ／ｋｇ、約２ｍｇ／ｋｇ、約３ｍｇ／ｋｇ、約４ｍｇ／ｋｇ、約５ｍｇ／ｋｇ、約６ｍｇ／ｋｇ、約７ｍｇ／ｋｇ、約８ｍｇ／ｋｇ、約９ｍｇ／ｋｇ、約１０ｍｇ／ｋｇ体重の範囲であり、これらの間のすべての値及び範囲を含む。
別の実施形態では、送達は、小胞、特にリポソームであり得る（Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３、Ｔｒｅａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｌｉｐｏｓｏｍｅｓ ｉｎ Ｔｈｅｒａｐｙ ｏｆ Ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ Ｄｉｓｅａｓｅ ａｎｄ Ｃａｎｃｅｒ，Ｌｏｐｅｚ－Ｂｅｒｅｓｔｅｉｎ ａｎｄ Ｆｉｄｌｅｒ（ｅｄｓ．），Ｌｉｓｓ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，ｐｐ．３５３－３６５（１９８９）を参照されたい。
本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、制御放出または持続放出手段によって、または当業者に周知である送達デバイスによって投与することができる。例には、これらに限定されないが、米国特許第３，８４５，７７０号、同第３，９１６，８９９号、同第３，５３６，８０９号、同第３，５９８，１２３号、同第４，００８，７１９号、同第５，６７４，５３３号、同第５，０５９，５９５号、同第５，５９１，７６７号、同第５，１２０，５４８号、同第５，０７３，５４３号、同第５，６３９，４７６号、同第５，３５４，５５６号、及び同第５，７３３，５５６号に記載されているものが含まれ、これらの各々は、その全体が参照により本明細書に組み込まれる。かかる剤形は、様々な割合で所望の放出プロファイルを提供するために、例えば、ヒドロプロピルメチルセルロース、他のポリマーマトリックス、ゲル、透過性膜、浸透圧システム、多層コーティング、微小粒子、リポソーム、ミクロスフェア、またはこれらの組み合わせを使用して、１つ以上の活性成分を制御放出または持続放出を提供するために有用であり得る。活性成分の制御または持続放出は、ｐＨの変化、温度の変化、適切な波長の光による刺激、酵素の濃度もしくは利用能、水の濃度もしくは利用能、または他の生理学的条件もしくは化合物を含むがこれらに限定されない様々な条件によって刺激することができる。
別の実施形態では、高分子材料を使用することができる（Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，Ｌａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｗｉｓｅ（ｅｄｓ．），ＣＲＣ Ｐｒｅｓ．，Ｂｏｃａ Ｒａｔｏｎ，Ｆｌｏｒｉｄａ（１９７４）、Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ Ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ，Ｓｍｏｌｅｎ ａｎｄ Ｂａｌｌ（ｅｄｓ．），Ｗｉｌｅｙ，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ（１９８４）、Ｒａｎｇｅｒ ａｎｄ Ｐｅｐｐａｓ，１９８３，Ｊ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｓｃｉ．Ｒｅｖ．Ｍａｃｒｏｍｏｌ．Ｃｈｅｍ．２３：６１を参照されたく、さらにＬｅｖｙ ｅｔ ａｌ．，１９８５，Ｓｃｉｅｎｃｅ２２８：１９０、Ｄｕｒｉｎｇ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ａｎｎ．Ｎｅｕｒｏｌ．２５：３５１、Ｈｏｗａｒｄ ｅｔ ａｌ．，１９８９，Ｊ．Ｎｅｕｒｏｓｕｒｇ．７１：１０５も参照されたい）。
別の実施形態では、制御放出系は、治療される標的領域の近くに配置され得、したがって全身用量のほんの一画分を必要とし得る（例えば、Ｇｏｏｄｓｏｎ，Ｍｅｄｉｃａｌ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ ｏｆ Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｒｅｌｅａｓｅ，前述，ｖｏｌ．２，ｐｐ．１１５－１３８（１９８４）を参照されたい）。Ｌａｎｇｅｒ，１９９０，Ｓｃｉｅｎｃｅ２４９：１５２７－１５３３）による総説で議論されている他の制御放出系を使用することができる。
本明細書に開示されるキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の投与は独立して、１日１～４回、または１ヶ月に１～４回、または１年に１～６回、または２、３、４、もしくは５年に１回であり得る。投与は、１日または１ヶ月、２ヶ月、３ヶ月、６ヶ月、１年、２年、３年の期間であり得、対象の生涯にわたる可能性もある。
本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）を利用する投与レジメンは、対象の型、種、年齢、体重、性別、医学的状態、治療される状態の重症度、投与の経路、対象の腎機能または肝機能、個人の薬理ゲノミクス構成、及び利用される本発明の特定の化合物など、様々な要因に応じて選択され得る。本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、１日１回用量で投与され得るか、または総１日用量が、１日２回、３回、４回の分割用量で投与され得る。さらに、本明細書に開示される任意のキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）は、投与レジメン全体を通して断続的ではなく継続的に投与され得る。
細胞及び核酸
本発明の態様は、本明細書に開示されるようなキメラタンパク質をコードする核酸を含む発現ベクターを提供する。発現ベクターは、本明細書に開示されるキメラタンパク質をコードする核酸を含む。実施形態では、発現ベクターは、ＤＮＡまたはＲＮＡを含む。実施形態では、発現ベクターは、哺乳動物発現ベクターである。
原核生物及び真核生物の両方のベクターは、キメラタンパク質の発現に使用することができる。原核生物ベクターには、Ｅ．ｃｏｌｉ配列に基づく構築物が含まれる（例えば、Ｍａｋｒｉｄｅｓ，Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ Ｒｅｖ １９９６，６０：５１２－５３８を参照されたい）。Ｅ．ｃｏｌｉでの発現のために使用することができる制御性領域の非限定的な例には、ｌａｃ、ｔｒｐ、ｌｐｐ、ｐｈｏＡ、ｒｅｃＡ、ｔａｃ、Ｔ３、Ｔ７、及びλＰＬが含まれる。原核生物発現ベクターの非限定的な例には、λｇｔ１１などのλｇｔベクターシリーズ（Ｈｕｙｎｈ ｅｔ ａｌ．，“ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ Ｔｅｃｈｎｉｑｕｅｓ，Ｖｏｌ．Ｉ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ，”１９８４，（Ｄ．Ｇｌｏｖｅｒ，ｅｄ．），ｐｐ．４９－７８，ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ，Ｏｘｆｏｒｄ）、及びｐＥＴベクターシリーズ（Ｓｔｕｄｉｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ １９９０，１８５：６０－８９）が含まれる。しかしながら、原核生物宿主－ベクター系は、哺乳類細胞の翻訳後プロセシングの多くを実行できない。したがって、真核生物宿主－ベクター系は、特に有用であり得る。様々な制御性領域は、哺乳動物宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現に使用することができる。例えば、ＳＶ４０初期及び後期プロモーター、サイトメガロウイルス（ＣＭＶ）前初期プロモーター、及びラウス肉腫ウイルス末端反復配列（ＲＳＶ－ＬＴＲ）プロモーターを使用できる。哺乳動物細胞において有用であり得る誘導性プロモーターには、限定されないが、メタロチオネインＩＩ遺伝子、マウス乳癌ウイルス糖質コルチコイド応答性末端反復配列（ＭＭＴＶ－ＬＴＲ）、β－インターフェロン遺伝子、及びｈｓｐ７０遺伝子に関連するプロモーターが含まれる（例えば、Ｗｉｌｌｉａｍｓ ｅｔ ａｌ．，Ｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓ １９８９，４９：２７３５－４２、及びＴａｙｌｏｒ ｅｔ ａｌ．，Ｍｏｌ Ｃｅｌｌ Ｂｉｏｌ １９９０，１０：１６５－７５を参照されたい）。熱ショックプロモーターまたはストレスプロモーターもまた、組換え宿主細胞におけるキメラタンパク質の発現を駆動するために有利であり得る。
実施形態では、本発明の発現ベクターは、哺乳動物細胞において機能的である、発現制御領域またはその補体に作動可能に連結された、キメラタンパク質またはその補体をコードする核酸を含む。発現制御領域は、発現ベクターを用いて形質転換されたヒト細胞において遮断及び／または刺激媒介物が生成されるように、作動可能に連結された遮断及び／または刺激媒介物をコードする核酸の発現を駆動することができる。
発現制御領域は、プロモーター及びエンハンサーなどの制御性ポリヌクレオチド（本明細書ではエレメントと称されることもある）であり、作動可能に連結された核酸の発現に影響を与える。本発明の発現ベクターの制御制御領域は、ヒト細胞において作動可能に連結されたコード化核酸を発現することができる。実施形態では、細胞は、腫瘍細胞である。別の実施形態では、細胞は、非腫瘍細胞である。実施形態では、発現制御領域は、作動可能に連結された核酸に制御可能な発現を付与する。シグナル（刺激と称されることもある）は、かかる発現制御領域に作動可能に連結された核酸の発現を増加または低減させることができる。シグナルに応答して発現を増加させるかかる発現制御領域は、誘導可能と称されることが多い。シグナルに応答して発現を低減させるかかる発現制御領域は、抑制可能と称されることが多い。通常、かかるエレメントによって付与される増加または低減の量は、存在するシグナルの量に比例し、シグナルの量が多いほど、発現の増加または低減が大きくなる。
実施形態では、本発明は、合図に応答して一過性で高レベルの発現をもたらすことが可能である誘導性プロモーターの使用を企図する。例えば、腫瘍細胞の近くにある場合、かかる発現制御配列を含むキメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の発現ベクターで形質転換された細胞は、形質転換された細胞を適切な合図に曝露することによって、高レベルの薬剤を一過性に生成するように誘導される。例示的な誘導性発現制御領域には、低分子化学化合物などの合図で刺激される誘導性プロモーターを含む領域が含まれる。他の例では、キメラタンパク質は、細胞による抗原認識に感受性のあるプロモーターの制御下で、キメラ抗原受容体含有細胞またはインビトロで増殖した腫瘍浸潤リンパ球で発現され、腫瘍抗原認識に応答して、キメラタンパク質の局所分泌を引き起こす。特定の例は、例えば、米国特許第５，９８９，９１０号、同第５，９３５，９３４号、同第６，０１５，７０９号、及び同第６，００４，９４１号に見出すことができ、これらの各々は、参照によりその全体が本明細書に組み込まれる。
発現制御領域及び遺伝子座制御領域には、天然のプロモーター及びエンハンサーエレメントなどの全長プロモーター配列、ならびに全長または非バリアント機能の全部もしくは一部を保持する、部分配列またはポリヌクレオチドバリアントが含まれる。本明細書で使用される場合、「機能的」及びその適格なバリアントという用語は、核酸配列、部分配列、または断片に関して使用される場合、その配列が天然核酸配列（例えば、非バリアントまたは非修飾配列）の１つ以上の機能を有することを意味する。
本明細書で使用される場合、「作動可能に連結する」とは、それらが意図した様式で機能することを可能にするように記載された構成要素の物理的並置を指す。核酸と作動可能に連結する発現制御エレメントの例では、制御エレメントが核酸の発現を調節するような関係である。典型的には、転写を調節する発現制御領域は、転写される核酸の５’末端近く（すなわち、「上流」）に並置する。発現制御領域はまた、転写される配列の３’末端（すなわち、「下流」）または転写物内（例えば、イントロン内）に位置し得る。発現制御エレメントは、転写される配列から離れた距離に位置し得る（例えば、核酸から１００～５００、５００～１０００、２０００～５０００、またはそれ以上のヌクレオチド）。発現制御エレメントの特定の例はプロモーターであり、これは通常、転写される配列の５’に位置する。発現制御エレメントの別の例は、転写される配列の５’もしくは３’、または転写される配列内に位置し得るエンハンサーである。
ヒト細胞で機能する発現系は当技術分野で周知であり、ウイルス系が含まれる。一般に、ヒト細胞で機能するプロモーターは、哺乳動物ＲＮＡポリメラーゼと結合し、コード配列のｍＲＮＡへの下流（３’）転写を開始することが可能である任意のＤＮＡ配列である。プロモーターは、通常、コード配列の５’末端の近位に配置される転写開始領域と、典型的に、転写開始部位の２５～３０塩基対上流に位置するＴＡＴＡボックスを有する。ＴＡＴＡボックスは、ＲＮＡポリメラーゼＩＩに正確な部位でＲＮＡ合成を開始するように指示すると考えられている。プロモーターはまた、典型的に、ＴＡＴＡボックスの上流の１００～２００塩基対内に典型的に位置する上流プロモーターエレメント（エンハンサーエレメント）も含むであろう。上流のプロモーターエレメントは、転写が開始される比率を決定し、どちらの配向にも作用することができる。プロモーターとして特に使用されるのは、ウイルス遺伝子が多くの場合高度に発現され、広い宿主範囲を有するため、哺乳動物ウイルス遺伝子からのプロモーターである。例には、ＳＶ４０初期プロモーター、マウス乳癌ウイルスＬＴＲプロモーター、アデノウイルス主要後期プロモーター、単純ヘルペスウイルスプロモーター、ＣＭＶプロモーターなどが含まれる。
典型的には、哺乳動物細胞によって認識される転写終結及びポリアデニル化配列は、翻訳終止コドンの３’に位置する制御性領域であり、したがって、プロモーターエレメントと一緒に、コード配列に隣接する。成熟ｍＲＮＡの３’末端は、部位特異的な翻訳後切断及びポリアデニル化によって形成される。転写ターミネーター及びポリアデニル化シグナルの例には、ＳＶ４０に由来するものが含まれる。イントロンはまた、発現構築物に含まれ得る。
核酸を生細胞に導入するために使用可能な様々な技術が存在する。インビトロでの哺乳動物細胞への核酸の移入に好適な技術には、リポソームの使用、電気穿孔、微量注入、細胞融合、ポリマー系システム、ＤＥＡＥ－デキストラン、ウイルス形質導入、リン酸カルシウム沈降法などが含まれる。インビボでの遺伝子導入のために、リポソーム、キトサン及びゼラチンなどの天然ポリマー系送達ビヒクル、インビボでの形質導入にさらに好適であるウイルスベクターを含む多くの技術及び試薬も使用され得る。いくつかの状況では、腫瘍細胞表面膜タンパク質に特異的な抗体またはリガンドなどの標的化剤を提供することが望ましい。リポソームが用いられる場合、エンドサイトーシスと関連付けられた細胞表面膜タンパク質に結合するタンパク質は、例えば、特定の細胞型に向性のカプシドタンパク質またはその断片、循環中の内部化を受けるタンパク質の抗体、細胞内限局化を標的とし、細胞内半減期を強化するタンパク質を標的とするため、及び／またはそれらの取り込みを促進するために使用され得る。受容体を媒介したエンドサイトーシスの技術は、例えば、Ｗｕ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２，４４２９－４４３２（１９８７）、及びＷａｇｎｅｒ ｅｔ ａｌ．，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ８７，３４１０－３４１４（１９９０）に記載される。
必要に応じて、例えば、組み込み配列などの遺伝子送達剤を利用することもできる。多数の組み込み配列が当技術分野で既知である（例えば、Ｎｕｎｅｓ－Ｄｕｂｙ ｅｔ ａｌ．，Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．２６：３９１－４０６，１９９８、Ｓａｄｗｏｓｋｉ，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ．，１６５：３４１－３５７，１９８６、Ｂｅｓｔｏｒ，Ｃｅｌｌ，１２２（３）：３２２－３２５，２００５、Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，ＴＩＧ １５：３２６－３３２，１９９９、Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３を参照されたい）。これらには、リコンビナーゼ及びトランスポザーゼが含まれる。例には、Ｃｒｅ（Ｓｔｅｒｎｂｅｒｇ ａｎｄ Ｈａｍｉｌｔｏｎ，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，１５０：４６７－４８６，１９８１）、ラムダ（Ｎａｓｈ，Ｎａｔｕｒｅ，２４７，５４３－５４５，１９７４）、ＦＩｐ（Ｂｒｏａｃｈ，ｅｔ ａｌ．，Ｃｅｌｌ，２９：２２７－２３４，１９８２）、Ｒ（Ｍａｔｓｕｚａｋｉ，ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂａｃｔｅｒｉｏｌｏｇｙ，１７２：６１０－６１８，１９９０）、ｃｐＣ３１（例えば、Ｇｒｏｔｈ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．３３５：６６７－６７８，２００４を参照されたい）、スリーピングビューティ、マリナーファミリーのトランスポザーゼ（Ｐｌａｓｔｅｒｋ ｅｔ ａｌ．，前述）、ならびにレトロウイルスまたはレンチウイルスのＬＴＲ配列及びＡＡＶのＩＴＲ配列など、ウイルス組み込みを提供する成分を有するＡＡＶ、レトロウイルス、及びアンチウイルスなどのウイルスを組み込むための成分（Ｋｏｏｔｓｔｒａ ｅｔ ａｌ．，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｐｈａｒｍ．Ｔｏｘｉｃｏｌ．，４３：４１３－４３９，２００３）が含まれる。さらに、直接的及び標的遺伝子組み込み戦略を使用して、ＣＲＩＳＰＲ／ＣＡＳ９、ジンクフィンガー、ＴＡＬＥＮ、及びメガヌクレアーゼ遺伝子編集技術を含むキメラ融合タンパク質をコードする核酸配列を挿入することができる。
実施形態では、キメラタンパク質（及び／または追加の薬剤）の発現のための発現ベクターは、ウイルスベクターである。遺伝子治療に有用な多くのウイルスベクターが既知である（例えば、Ｌｕｎｄｓｔｒｏｍ，Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．，２１：１ １７，１２２，２００３を参照されたい。例示的なウイルスベクターには、アンチウイルス（ＬＶ）、レトロウイルス（ＲＶ）、アデノウイルス（ＡＶ）、アデノ随伴ウイルス（ＡＡＶ）、及びαウイルスから選択されるものが含まれるが、他のウイルスベクターも使用され得る。インビボでの使用について、αウイルス及びアデノウイルスなど、宿主ゲノムに組み込まれないウイルスベクターが使用に好適である。αウイルスの例示的な種類には、シンドビスウイルス、ベネズエラ馬脳炎（ＶＥＥ）ウイルス、及びセムリキ森林ウイルス（ＳＦＶ）が含まれる。インビトロでの使用について、レトロウイルス、ＡＡＶ、アンチウイルスなど、宿主ゲノムに組み込まれるウイルスベクターが好適である。実施形態では、本発明は、インビボで固形腫瘍を本発明のウイルスベクターと接触させることを含む、インビボでのヒト細胞を形質導入する方法を提供する。
本発明の態様は、本明細書に開示されるキメラタンパク質を含む発現ベクターを含む宿主細胞を含む。
発現ベクターは、本発明のキメラタンパク質を生成するために宿主細胞に導入され得る。細胞は、例えば、インビトロで培養され得るか、または遺伝子操作され得る。有用な哺乳動物宿主細胞には、ヒト、サル、及びげっ歯類に由来する細胞が含まれるが、これらに限定されない（例えば、Ｋｒｉｅｇｌｅｒ，“Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ ａｎｄ Ｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ：Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ，”１９９０，Ｎｅｗ Ｙｏｒｋ，Ｆｒｅｅｍａｎ ＆ Ｃｏ．を参照されたい）。これらには、ＳＶ４０によって形質転換されたサル腎臓細胞株（例えば、ＣＯＳ－７、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １６５１）、ヒト胎児腎臓株（例えば、２９３、２９３－ＥＢＮＡ、または浮遊培養での増殖のためにサブクローン化された２９３細胞、Ｇｒａｈａｍ ｅｔ ａｌ．，Ｊ Ｇｅｎ Ｖｉｒｏｌ１９７７，３６：５９）、仔ハムスター腎臓細胞（例えば、ＢＨＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ １０）、チャイニーズハムスター卵巣細胞－ＤＨＦＲ（例えば、ＣＨＯ、Ｕｒｌａｕｂ ａｎｄ Ｃｈａｓｉｎ，Ｐｒｏｃ Ｎａｔｌ Ａｃａｄ Ｓｃｉ ＵＳＡ １９８０，７７：４２１６）、ＤＧ４４ ＣＨＯ細胞、ＣＨＯ－Ｋ１細胞、マウスセルトリ細胞（Ｍａｔｈｅｒ，Ｂｉｏｌ Ｒｅｐｒｏｄ１９８０，２３：２４３－２５１）、マウス線維芽細胞（例えば、ＮＩＨ－３Ｔ３）、サル腎臓細胞（例えば、ＣＶ１ ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７０）、アフリカミドリザル腎臓細胞（例えば、ＶＥＲＯ－７６、ＡＴＣＣ ＣＲＬ－１５８７）、ヒト子宮頸癌細胞（例えば、ＨＥＬＡ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ２）、イヌ腎臓細胞（例えば、ＭＤＣＫ、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ３４）、バッファローラット肝臓細胞（例えば、ＢＲＬ ３Ａ、ＡＴＣＣ ＣＲＬ １４４２）、ヒト肺細胞（例えば、Ｗ１３８、ＡＴＣＣ ＣＣＬ ７５）、ヒト肝臓細胞（例えば、Ｈｅｐ Ｇ２、ＨＢ ８０６５）、及びマウス乳腺腫瘍細胞（例えば、ＭＭＴ ０６０５６２、ＡＴＣＣ ＣＣＬ５１）が含まれる。本明細書に開示されるキメラタンパク質を発現するための例示的ながん細胞型には、マウス線維芽細胞株、ＮＩＨ３Ｔ３、マウスルイス肺癌細胞株、ＬＬＣ、マウス肥満細胞腫細胞株、Ｐ８１５、マウスリンパ腫細胞株、ＥＬ４及びその卵白アルブミン形質移入体、Ｅ．Ｇ７、マウスメラノーマ細胞株、Ｂ１６Ｆ１０、マウス線維肉腫細胞株、ＭＣ５７、ならびにヒト小細胞肺癌細胞株、ＳＣＬＣ＃２及びＳＣＬＣ＃７が含まれる。
宿主細胞は、健康なヒト、がん患者、及び感染性疾患を有する患者を含む正常または罹患した対象から、民間研究所の寄託、Ａｍｅｒｉｃａｎ Ｔｙｐｅ Ｃｕｌｔｕｒｅ Ｃｏｌｌｅｃｔｉｏｎ（ＡＴＣＣ）などの公的な培養物収集、または商業的供給業元から得ることができる。
インビトロ、エクスビボ、及び／またはインビボで、本発明のキメラタンパク質の生成に使用することができる細胞には、これらに限定されないが、上皮細胞、内皮細胞、ケラチノサイト、線維芽細胞、筋肉細胞、肝細胞、Ｔリンパ球、キメラ抗原受容体発現Ｔ細胞、腫瘍浸潤リンパ球、Ｂリンパ球、単球、マクロファージ、好中球、好酸球、巨核球、顆粒球などの血液細胞、様々な幹または前駆細胞、特に造血幹または前駆細胞（例えば、骨髄から得られるもの）、臍帯血、末梢血、及び胎児肝臓が含まれる。細胞型の選択は、治療もしくは予防されている腫瘍または感染症の種類に依存し、当業者によって決定することができる。
Ｆｃを含む巨大分子（モノクローナル抗体など）の生成及び精製は、生成物間でわずかな修飾を伴い、標準化されたプロセスとなった。例えば、多くのＦｃを含む巨大分子は、ヒト胎児腎臓（ＨＥＫ）細胞（またはそのバリアント）もしくはチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞（またはそのバリアント）によって、またはいくつかの事例では細菌または合成法によって生成される。生成後、ＨＥＫまたはＣＨＯ細胞によって分泌されるＦｃを含む巨大分子は、プロテインＡカラムと結合することを介してで精製され、それに続く様々な方法を使用して「洗練」される。一般的に言えば、精製されたＦｃを含む巨大分子は、液体の形態で一定期間保存され、長期間凍結されるか、またいくつかの事例では凍結乾燥される。実施形態では、本明細書で企図されるキメラタンパク質の生成は、従来のＦｃを含む巨大分子と比較して、固有の特徴を有し得る。特定の例では、キメラタンパク質は、特定のクロマトグラフィ樹脂を使用するか、またはプロテインＡの捕捉に依存しないクロマトグラフィ法を使用して精製することができる。実施形態では、キメラタンパク質は、オリゴマー状態または複数のオリゴマー状態で精製され得、特定の方法を使用して特定のオリゴマー状態について濃縮され得る。理論に拘束されることなく、これらの方法には、特定の塩濃度、ｐＨ、及び添加剤組成を含む特定の緩衝液による処理が含まれ得る。他の例では、かかる方法は、あるオリゴマー状態を別のものよりも有利に処理することを含み得る。本明細書で得られたキメラタンパク質は、当技術分野で指定されている方法を使用してさらに「洗練」することができる。実施形態では、キメラタンパク質は、非常に安定性であり、広範囲のｐＨ曝露（ｐＨ３～１２）に耐えることが可能であり、多数の凍結／解凍ストレス（３回を超える凍結／解凍サイクル）に耐えることが可能であり、高温での長時間の培養（４０℃で２週間を超える）に耐えることが可能である。実施形態では、キメラタンパク質は、かかるストレス条件下で、分解、脱アミド化などの証拠を伴わず、無傷のままであることが示されている。
対象及び／または動物
実施形態では、対象及び／または動物は、哺乳動物、例えば、ヒト、マウス、ラット、モルモット、イヌ、ネコ、ウマ、ウシ、ブタ、ウサギ、ヒツジ、またはサル、チンパンジー、もしくはヒヒなどの非ヒト霊長類である。実施形態では、対象及び／または動物は、例えば、ゼブラフィッシュなどの非哺乳動物である。実施形態では、対象及び／または動物は、蛍光標識された細胞（例えば、ＧＦＰを有する）を含み得る。実施形態では、対象及び／または動物は、蛍光細胞を含むトランスジェニック動物である。
実施形態では、対象及び／または動物は、ヒトである。実施形態では、ヒトは、小児のヒトである。実施形態では、ヒトは、成人のヒトである。実施形態では、ヒトは、老齢期のヒトである。実施形態では、ヒトは、患者と称され得る。
特定の実施形態では、ヒトは、約０ヶ月～約６ヶ月、約６～約１２ヶ月、生後約６～約１８ヶ月、生後約１８～約３６ヶ月、生後約１～約５歳、生後約５～約１０歳、約１０～約１５歳、約１５～２０歳、約２０～約２５歳、約２５～約３０歳、約３０～約３５歳、約３５～約４０歳、約４０～約４５歳、約４５～約５０歳、約５０～約５５歳、約５５～約６０歳、約６０～約６５歳、約６５～約７０歳、約７０～約７５歳、約７５～約８０歳、約８０～約８５歳、約８５～約９０歳、約９０～約９５歳、または約９５～約１００歳の範囲の年齢を有する。
実施形態では、対象は、非ヒト動物であり、したがって、本発明は獣医学的使用に対する。特定の実施形態では、非ヒト動物は、家庭用ペットである。別の特定の実施形態では、非ヒト動物は、家畜である。
キット及び医薬品
本発明の態様は、本明細書に開示される任意の薬剤の投与を単純化することができるキットを提供する。
本発明の例示的なキットは、単位剤形で本明細書に開示される任意のキメラタンパク質及び／または薬学的組成物を含む。実施形態では、単位剤形は、本明細書に開示される任意の薬剤、及び薬学的に許容される担体、希釈剤、賦形剤、またはビヒクルを含む、無菌であり得る予め充填されたシリンジなどの容器である。キットは、本明細書に開示される任意の薬剤の使用を指示するラベルまたは印刷された説明書をさらに含むことができる。キットは、開瞼器、局所麻酔剤、及び投与位置に対する洗浄剤をさらに含み得る。キットは、本明細書に開示される１つ以上の追加の薬剤をさらに含み得る。実施形態では、キットは、有効量の本発明の組成物及び有効量の別の組成物、例えば、本明細書に開示されるものなどを含む容器を含む。
本発明の態様は、医薬品、がんの治療及び／または例えば、ウイルス感染に起因する炎症性疾患の治療のための医薬品の製造における、本明細書に開示されるようなキメラタンパク質の使用を含む。
本明細書に開示される任意の態様または実施形態は、本明細書に開示される任意の他の態様または実施形態と組み合わせることができる。
本発明は、以下の実施例でさらに記載されるが、これらは、特許請求の範囲に記載される本発明の範囲を限定するものではない。
実施例１．例示的なＦＬＴ３Ｌ及び４－１ＢＢＬ系キメラタンパク質の構築及び特徴付け
ネズミＦＬＴ３Ｌ及び４－１ＢＢＬ系キメラタンパク質をコードする構築物を生成した。「ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ」構築物は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介して４－１ＢＢＬのネズミＥＣＤに融合されたＦＬＴ３Ｌのネズミ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んだ。図１Ｄを参照されたい。
ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ構築物を２９３細胞で一過性に発現し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して精製した。ウエスタンブロット分析を実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬの３つの構成成分のすべてとそれらのそれぞれの結合パートナーとの検出及び結合を検証した（図３Ａ）。ウエスタンブロットは、非還元レーンにおける優性多量体バンドの存在を示し（図３Ａ、各ブロットにおけるレーン２）、これは還元剤β－メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図３Ａ、各ブロットにおけるレーン３）。図３Ａ（各ブロットにおけるレーン４）に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）及び脱グリコシル化剤の両方の存在下で、約７０ｋＤａの予測分子量でモノマーとして機能した。
機能的ＥＬＩＳＡ（酵素結合免疫吸着アッセイ）を実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質の異なるドメインのそのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を実証した。図３Ｂに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＦＬＴ３タンパク質に捕捉し、抗ｍＦＬＴ３Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＦＬＴ３Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図３Ｂに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。図３Ｃに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質のｍＦｃ部分の結合は、キメラタンパク質をプレートに結合したマウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体に捕捉し、ＨＲＰ複合抗マウスＦｃ抗体を介して検出することによって特徴付けした。マウス総ＩｇＧを使用して標準曲線を生成した。図３Ｄに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質のｍ４－１ＢＢＬドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍ４－１ＢＢタンパク質に捕捉し、抗ｍ４－１ＢＢＬ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍ４－１ＢＢタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図３Ｄに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質のｍ４－１ＢＢＬドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。
実施例２．例示的なＦＬＴ３Ｌ及びＣＤ４０Ｌ系キメラタンパク質の構築及び特徴付け
ネズミＦＬＴ３Ｌ及びＣＤ４０Ｌ系キメラタンパク質をコードする構築物を生成した。「ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ」構築物は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＣＤ４０ＬのネズミＥＣＤに融合されたＦＬＴ３Ｌのネズミ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んだ。図１Ｄを参照されたい。
ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌ構築物を２９３細胞で一過性に発現し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して精製した。ウエスタンブロット分析を実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌの３つの構成成分のすべてとそれらのそれぞれの結合パートナーとの検出及び結合を検証した（図４Ａ）。ウエスタンブロットは、非還元レーンにおける優性多量体バンドの存在を示し（図４Ａ、各ブロットにおけるレーン２）、これは還元剤β－メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図４Ａ、各ブロットにおけるレーン３）。図４Ａ（各ブロットにおけるレーン４）に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）及び脱グリコシル化剤の両方の存在下で、約７５ｋＤａの予測分子量でモノマーとして機能した。
機能的ＥＬＩＳＡを実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインのそのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を実証した。図４Ｂに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＦＬＴ３タンパク質に捕捉し、抗ｍＦＬＴ３Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＦＬＴ３Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図４Ｂに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。図４Ｃに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦｃ部分の結合は、キメラタンパク質をプレートに結合したマウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体に捕捉し、ＨＲＰ複合抗マウスＦｃ抗体を介して検出することによって特徴付けした。マウス総ＩｇＧを使用して標準曲線を生成した。図４Ｄに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のｍＣＤ４０Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＣＤ４０タンパク質に捕捉し、抗ｍＣＤ４０Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＣＤ４０Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図４Ｄに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のｍＣＤ４０Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。
実施例３．例示的なＦＬＴ３Ｌ及びＯＸ４０Ｌ系キメラタンパク質の構築及び特徴付け
ネズミＦＬＴ３Ｌ及びＯＸ４０Ｌ系キメラタンパク質をコードする構築物を生成した。「ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ」構築物は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＯＸ４０ＬのネズミＥＣＤに融合されたＦＬＴ３Ｌのネズミ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んだ。図１Ｄを参照されたい。
ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ構築物を２９３細胞で一過性に発現し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して精製した。ウエスタンブロット分析を実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌの３つの構成成分のすべてとそれらのそれぞれの結合パートナーとの検出及び結合を検証した（図５Ａ）。ウエスタンブロットは、非還元レーンにおける優性多量体バンドの存在を示し（図５Ａ、各ブロットにおけるレーン２）、これは還元剤β－メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図５Ａ、各ブロットにおけるレーン３）。図５Ａ（各ブロットにおけるレーン４）に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）及び脱グリコシル化剤の両方の存在下で、約７０ｋＤａの予測分子量でモノマーとして機能した。
機能的ＥＬＩＳＡを実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質の異なるドメインのそのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を実証した。図５Ｂに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＦＬＴ３タンパク質に捕捉し、抗ｍＦＬＴ３Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＦＬＴ３Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図５Ｂに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。図５Ｃに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＦｃ部分の結合は、キメラタンパク質をプレートに結合したマウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体に捕捉し、ＨＲＰ複合抗マウスＦｃ抗体を介して検出することによって特徴付けした。マウス総ＩｇＧを使用して標準曲線を生成した。図５Ｄに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＯＸ４０Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＯＸ４０タンパク質に捕捉し、抗ｍＯＸ４０Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＯＸ４０Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図５Ｄに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌキメラタンパク質のｍＯＸ４０Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。
実施例４．例示的なＦＬＴ３Ｌ及びＧＩＴＲＬ系キメラタンパク質の構築及び特徴付け
ネズミＦＬＴ３Ｌ及びＧＩＴＲＬ系キメラタンパク質をコードする構築物を生成した。「ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ」構築物は、ＩｇＧ１に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを介してＧＩＴＲＬのネズミＥＣＤに融合されたＦＬＴ３Ｌのネズミ細胞外ドメイン（ＥＣＤ）を含んだ。図１Ｄを参照されたい。
ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ構築物を２９３細胞で一過性に発現し、プロテインＡアフィニティクロマトグラフィを使用して精製した。ウエスタンブロット分析を実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬの３つの構成成分のすべてとそれらのそれぞれの結合パートナーとの検出及び結合を検証した（図６Ａ）。ウエスタンブロットは、非還元レーンにおける優性多量体バンドの存在を示し（図６Ａ、各ブロットにおけるレーン２）、これは還元剤β－メルカプトエタノールの存在下でグリコシル化単量体バンドに還元された（図６Ａ、各ブロットにおけるレーン３）。図６Ａ（各ブロットにおけるレーン４）に示すように、キメラタンパク質は、還元剤（β－メルカプトエタノール）及び脱グリコシル化剤の両方の存在下で、約７０ｋＤａの予測分子量でモノマーとして機能した。
機能的ＥＬＩＳＡを実施して、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質の異なるドメインのそのそれぞれの結合パートナーとの結合親和性を実証した。図６Ｂに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＦＬＴ３タンパク質に捕捉し、抗ｍＦＬＴ３Ｌ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＦＬＴ３Ｌタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図６Ｂに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質のｍＦＬＴ３Ｌドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。図６Ｃに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質のｍＦｃ部分の結合は、キメラタンパク質をプレートに結合したマウスＩｇＧ Ｆｃγ抗体に捕捉し、ＨＲＰ複合抗マウスＦｃ抗体を介して検出することによって特徴付けした。マウス総ＩｇＧを使用して標準曲線を生成した。図６Ｄに示すように、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質のｍＧＩＴＲＬドメインの結合は、プレートに結合した組換えマウスｍＧＩＴＲタンパク質に捕捉し、抗ｍＧＩＴＲＬ抗体及びＨＲＰ染色を介して検出することによって特徴付けした。組換えｍＧＩＴＲＬタンパク質を使用して標準曲線を生成した。図６Ｄに示すデータは、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質のｍＧＩＴＲＬドメインが、その結合パートナーと濃度依存的にかつ高い親和性で効果的に相互作用したことを示す。
実施例５：二重ＥＬＩＳＡ特徴付け
図８は、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ、ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬ、及びＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の二重ＥＬＩＳＡアッセイを示す。捕捉を抗ＦＬＴ３Ｌ抗体で実施し、続いて共刺激ドメインをｈｉｓタグ付き組換えタンパク質で検出し、抗ｈｉｓ／ＨＲＰ抗体を使用して視覚化した。
実施例６：ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の特徴付け
ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質をさらに特徴付けした。
図９Ａは、ｍＣＤ４０－ｈｉｓ捕捉によるＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の親和性を測定するためのＯｃｔｅｔ系からの結果を示す。図９Ｂは、ｍＦＬＴ３－ｈｉｓ捕捉によるＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質の親和性を測定するためのＯｃｔｅｔ系からの結果を示す。Ｏｃｔｅｔを使用して、標的受容体へのオン／オフ速度及び結合親和性を決定した。図９Ｃは、図９Ａ及び図９Ｂのデータの要約を示す。
図９Ｄは、ＮＦｋＢ－ｍＣＤ４０ルシフェラーゼレポーターアッセイの結果を示す。ＮＦｋＢ－ｍＣＤ４０レポーター細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にマウスＣＤ４０発現ベクター及びＮＦｋＢ－ルシフェラーゼレポーターベクター（Ｐｒｏｍｅｇａ）の両方を安定的にトランスフェクトすることにより生成した。細胞を、市販のｍＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍＦＬＴ３－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質、または陰性対照としての非ＣＤ４０Ｌ含有キメラタンパク質（「ｍＸＸＸＸ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ」）の用量漸増を使用して培養した。６時間後、発光をルミノメーターで定量した。
図９Ｅは、ＣＤ４０Ｌシグナル伝達についてのＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｕ２ＯＳ細胞系アッセイを示す（ＮＦｋＢ活性、非標準）。ＰａｔｈＨｕｎｔｅｒ Ｕ２ＯＳ細胞（ＤｉｓｃｏｖｅｒＸ）は、ＣＤ４０を介したマウスシグナル伝達及びヒトシグナル伝達の両方に応答し、ＮＦｋＢ活性（非標準）を通知する別の手段である。細胞を、市販のｍＣＤ４０Ｌ－Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）またはｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＣＤ４０Ｌキメラタンパク質のいずれかで培養した。６時間後、ルシフェラーゼ活性をルミノメーターで測定した。
図９Ｄ及び図９Ｅは、驚くべきことに、キメラタンパク質の作製が、ＣＤ４０Ｌ側の活性を失うことなく、実際に、片側ＣＤ４０Ｌ分子と比較して活性のわずかな増加を伴って達成されることを実証する。
図９Ｆは、Ｆｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。点線は、未処理細胞の最大増殖を示す。有意性は、独立Ｔ検定を使用して決定した。ＩＬ－３依存性ｐｒｏＢ細胞株であるＢａ／Ｆ３は、ＦＬＴ３受容体を過剰発現すると、ＦＬＴ３Ｌシグナル伝達に応答する。ｍＦＬＴ３を過剰発現するＢａ／Ｆ３細胞を、市販のＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）または４つの異なるＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質の用量漸増を使用して培養した。増殖を、Ｉｎｃｕｃｙｔｅ生細胞イメージングプラットフォームを使用して評価し、時間の経過と共に集密度を測定した。
図９Ｆは、驚くべきことに、キメラタンパク質の作製が、ＦＬＴ３側の活性を失うことなく、実際に、片側ＦＬＴ３分子と比較して活性のわずかな増加を伴って達成されることを実証する。
実施例７：ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ、及びＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬキメラタンパク質の特徴付け
図１０Ａは、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にマウスＧＩＴＲ発現ベクター及びＮＦｋＢ－ルシフェラーゼレポーターベクターの両方を安定的にトランスフェクトすることによって生成したＮＦｋＢ－ｍＧＩＴＲレポーター細胞株によるＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬ活性の特徴付けを示す。ＮＦｋＢ－ｍＧＩＴＲレポーター細胞株は、ＣＨＯ－Ｋ１細胞にマウスＧＩＴＲ発現ベクター及びＰｒｏｍｅｇａのＮＦｋＢ－ルシフェラーゼレポーターベクターの両方を安定的にトランスフェクトすることにより生成した。細胞を、市販のｍＧＩＴＲＬ－Ｆｃ（Ａｃｒｏ Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）、ｍＦＬＴ３－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬキメラタンパク質、または陰性対照としての非ＧＩＴＲＬ含有キメラタンパク質（ｍＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌ）の用量漸増を使用して培養した。６時間後、発光をルミノメーターで定量した。
図１０Ａは、驚くべきことに、キメラタンパク質の作製が、ＧＩＴＲＬ側での活性を失うことなく達成されることを実証する。
上記のＢａ／Ｆ３アッセイを利用して、他のキメラタンパク質の増殖を測定した。図１０Ｂは、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＧＩＴＲＬを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。図１０Ｃは、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－ＯＸ４０Ｌを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。図１０Ｄは、ＦＬＴ３Ｌ－Ｆｃ－４－１ＢＢＬを介したＦｌｔ３シグナル伝達に応答したモデル細胞系（ｍＦＬＴ３過剰発現Ｂａ／Ｆ３細胞）の増殖を示す。図１０Ｂ～Ｄのすべてについて、点線は、未処理の細胞の最大増殖を示し、有意性は、一方向独立Ｔ検定を使用して決定した。
図１０Ｂ～図１０Ｄは、驚くべきことに、キメラタンパク質の作製が、ＦＬＴ３側の活性を失うことなく、実際に、片側ＦＬＴ３分子と比較して活性の増加を伴って達成されることを実証する。
実施例８：キメラタンパク質シグナル伝達のインビボでの特徴付け
マウスに、０．０１％マウス血清アルブミン（ＭＳＡ、ビヒクル対照としても使用）で希釈したネズミＦＬＴ３Ｌキメラタンパク質を９回または１１回連続して注入（ＩＰ）した。マウスを、１０日目または１２日目に安楽死させた。サイトカイン分析のために血清を採取し、脾臓及び腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を単離した。脾臓重量及び総リンパ節細胞数を記録した。樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋）及び活性化樹状細胞（ＣＤ１１ｃ＋／ＣＤ１０３＋及びＣＤ１１ｃ＋／ＭＨＣＩＩ＋（ＩＡ／ＩＥ））の細胞集団をフローサイトメトリで分析した。血清サイトカインを、Ｐｒｏｃａｒｔａマルチプレックスキットを使用して評価し、これをＬｕｍｉｎｅｘプラットフォームで分析した。
図１１は、様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの樹状細胞活性化を示す。
図１２Ａは、様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの血清サイトカインを示す。マウスに９日または１１日間連続して注入し、次いで１０日目または１２日目にＭＬＮ／脾臓を単離し、フローサイトメトリで分析した。
図１２Ｂは、様々なＦＬＴ３Ｌ系キメラタンパク質によるインビボでの血清サイトカインを示す。マウスに９日または１１日間連続して注入し、次いで１０日目または１２日目にＭＬＮ／脾臓を単離し、フローサイトメトリで分析した。
参照による組み込み
本明細書で参照されるすべての特許及び刊行物は、それらの全体が参照により本明細書に組み込まれる。
本明細書で考察される刊行物は、本出願の出願日前のそれらの開示に対してのみ提供される。本明細書におけるいずれの内容も、本発明が先行発明によりそのような刊行物に先行する資格がないことを認めるものと解釈されるべきではない。
本書で使用されるように、すべての表題は単純に組織化するのためのものであり、いかなる様式においても開示を制限することを意図したものではない。あらゆる個々のセクションの内容は、すべてのセクションに等しく適用可能であり得る。
均等物
本発明は、その特定の実施形態に関連して開示したが、さらなる修正が可能であること、本出願は、一般に、本発明の原理に従って、本発明の任意の変型、使用、または適応を網羅するものであり、本発明が属する技術分野において知られているか、または慣行に含まれるような本開示からの逸脱、及び前述される本質的な特徴に適用され得るもの、ならびに添付の請求項の範囲に含まれるような本開示からの逸脱を含むことを理解されたい。
当業者であれば、単なる日常的な実験を使用して、本明細書に詳細に記載される特定の実施形態の多数の均等物を認識するか、または確認することができるであろう。かかる均等物は、以下の特許請求の範囲内に包含されることが企図される。

Claims (49)

  1. 以下の一般的な構造のキメラタンパク質であって、
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端
    式中、
    （ａ）が、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１及び第２のドメインに隣接するリンカーであり、
    （ｃ）が、ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインを含む、第２のドメインである、前記キメラタンパク質。
  2. 前記第１のドメインが、実質的にＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン全体を含む、請求項１に記載のキメラタンパク質。
  3. 前記第２のドメインが、実質的に前記ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメイン全体を含む、請求項１または請求項２に記載のキメラタンパク質。
  4. 前記ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメイン、及び／または前記ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインが、免疫刺激シグナルを活性化することが可能である、請求項１～３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  5. 前記ＩＩ型膜貫通タンパク質が、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＡＰＲＩＬ、ＢＡＦＦ、ＢＴＮＬ２、ＣＤ２７、ＣＤ２８、ＣＤ３０Ｌ、ＣＤ７０、Ｃ型レクチンドメイン（ＣＬＥＣ）ファミリーメンバー、ＦａｓＬ、ＧＩＴＲＬ、ＬＩＧＨＴ、ＬＴａ、ＬＴａ１ｂ２、ＮＫＧ２Ａ、ＮＫＧ２Ｃ、ＮＫＧ２Ｄ、ＯＸ４０Ｌ、ＲＡＮＫＬ、ＴＬ１Ａ、ＴＮＦａ、及びＴＲＡＩＬからなる群から選択される、請求項１～４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  6. 前記ＩＩ型膜貫通タンパク質が、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＯＸ４０Ｌからなる群から選択される、請求項５に記載のキメラタンパク質。
  7. 前記キメラタンパク質が、細胞間の安定性シナプスを形成することが可能である、請求項１～６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  8. 前記細胞間の安定性シナプスが、腫瘍の縮小に有利な空間的配向を提供する、請求項７に記載のキメラタンパク質。
  9. 前記空間的配向が、腫瘍細胞を攻撃するようにＴ細胞を配置する、請求項７または請求項８に記載のキメラタンパク質。
  10. 前記細胞外ドメインのいずれかまたは両方のそのそれぞれの結合パートナーとの結合が、受容体とそのリガンドとの長い相互作用を提供する、遅いオフ速度（Ｋオフ）で生じる、請求項１～９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  11. 前記長い相互作用が、より長い正のシグナル効果を送達する、請求項１０に記載のキメラタンパク質。
  12. 前記長い相互作用が、免疫細胞増殖を提供し、抗腫瘍攻撃を可能にする、請求項１０または請求項１１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  13. 前記長い相互作用が、刺激シグナルの放出を提供するのに十分なシグナル伝達を可能とする、請求項１０～１２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  14. 前記刺激シグナルが、サイトカインである、請求項１３に記載のキメラタンパク質。
  15. 前記キメラタンパク質が、ＣＤ４＋及び／またはＣＤ８＋Ｔ細胞の亜集団の低減を増加または防止することが可能である、請求項１～１４のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  16. 前記キメラタンパク質が、Ｔ細胞による腫瘍殺傷活性を増強することが可能である、請求項１～１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  17. 前記キメラタンパク質が、キメラ抗原受容体を発現するリンパ球によって分泌されるか、または前記キメラタンパク質が、インビトロで増殖させた腫瘍浸潤リンパ球によって分泌される、請求項１～１５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  18. 前記キメラタンパク質が、抗原提示細胞の活性化を引き起こすことが可能である、及び／または抗原提示細胞が抗原を提示する能力を増強することが可能である、請求項１～１７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  19. 前記抗原提示細胞が、ＣＤ１０３＋抗原提示細胞、任意選択でＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞である、請求項１８に記載のキメラタンパク質。
  20. 前記キメラタンパク質が、ＣＤ１０３＋抗原提示細胞の頻度及び／または絶対数の増加をもたらすことが可能である、請求項１７～１９のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  21. 前記ＣＤ１０３＋抗原提示細胞が、ＣＤ１１ｃ＋ＣＤ１０３＋細胞である、請求項２０に記載のキメラタンパク質。
  22. 抗原提示細胞の活性化が、ＣＤ８０、ＣＤ８６、ＣＤ４０、ＩＬ－１２、ＩＦＮｇ、及び／またはＣＤ８の増加した発現をもたらす、請求項１７～２１のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  23. 前記キメラタンパク質が、持続的な免疫調節効果を提供することが可能である、請求項１～２２のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  24. 前記リンカーが、ジスルフィド結合を形成することが可能である少なくとも１つのシステイン残基を含み、及び／またはヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項１～２３のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  25. 前記リンカーが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項２４に記載のキメラタンパク質。
  26. 前記リンカーが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項２４または請求項２５のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  27. 前記ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインが、その受容体と立体的に結合することが可能である、及び／または前記ＩＩ型膜貫通タンパク質の細胞外ドメインが、そのリガンド／受容体と立体的に結合することが可能である、請求項１～２６のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  28. 前記キメラタンパク質が、組換え融合タンパク質である、請求項１～２７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  29. 請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質をコードする核酸を含む、発現ベクター。
  30. 請求項２９に記載の発現ベクターを含む、宿主細胞。
  31. 治療有効量の請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質を含む、薬学的組成物。
  32. がんを治療する、またはウイルス感染に起因する炎症性疾患を治療する方法であって、有効量の請求項３１に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  33. 患者の免疫応答を調節する方法であって、有効量の請求項３１に記載の薬学的組成物を、それを必要とする対象に投与することを含む、前記方法。
  34. 前記患者のＴ細胞が、活性化される、請求項３２または請求項３３に記載の方法。
  35. 前記活性化Ｔ細胞が、サイトカイン産生、増殖、及び／または標的を殺傷する潜在性のレベルを増加させる、請求項３４に記載の方法。
  36. 前記方法が、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、ＩＩ型タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、制御性Ｔ細胞（Ｔｒｅｇ）の量または活性を減少させる、請求項３２～３５のいずれかに記載の方法。
  37. 前記方法が、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、前記ＩＩ型膜貫通タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、前記対象の流入領域リンパ節におけるエフェクターＴ細胞のプライミングを増加させる、請求項３２～３６のいずれかに記載の方法。
  38. 前記方法が、未治療の対象、またはＦＬＴ３Ｌ、前記ＩＩ型膜貫通タンパク質、及び／またはそれらのそれぞれのリガンドもしくは受容体に指向する抗体により治療された対象と比較して、免疫抑制細胞の全体的な低減、及びより炎症性の腫瘍環境への移行をもたらす、請求項３２～３８のいずれかに記載の方法。
  39. 薬剤として使用するための、請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  40. がんまたはウイルス感染に起因する炎症性疾患の治療に使用するための、請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  41. 薬剤の製造における、請求項１～２８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質の使用。
  42. 以下の一般的な構造のキメラタンパク質であって、
    Ｎ末端－（ａ）－（ｂ）－（ｃ）－Ｃ末端
    式中、
    （ａ）が、ＦＭＳ様チロシンキナーゼ３リガンド（ＦＬＴ３Ｌ）の細胞外ドメインを含む、第１のドメインであり、
    （ｂ）が、前記第１及び第２のドメインに隣接するリンカーであり、
    （ｃ）が、ＣＤ４０Ｌ、４－１ＢＢＬ、ＧＩＴＲＬ、及びＯＸ４０Ｌのうちの１つの細胞外ドメインを含む、第２のドメインである、前記キメラタンパク質。
  43. 前記ＦＬＴ３Ｌの細胞外ドメインが、配列番号５７のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２に記載のキメラタンパク質。
  44. 前記ＣＤ４０Ｌの細胞外ドメインが、配列番号５９のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラタンパク質。
  45. 前記４－１ＢＢＬの細胞外ドメインが、配列番号５８のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラタンパク質。
  46. 前記ＧＩＴＲＬの細胞外ドメインが、配列番号６２のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラタンパク質。
  47. 前記ＯＸ４０Ｌの細胞外ドメインが、配列番号６１のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２または４３に記載のキメラタンパク質。
  48. 前記リンカーが、ＩｇＧ１またはＩｇＧ４、例えば、ヒトＩｇＧ１またはヒトＩｇＧ４に由来するヒンジ－ＣＨ２－ＣＨ３ Ｆｃドメインを含む、請求項４２～４７のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
  49. 前記リンカーが、配列番号１、配列番号２、または配列番号３のアミノ酸配列と少なくとも９５％同一であるアミノ酸配列を含む、請求項４２～４８のいずれか１項に記載のキメラタンパク質。
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