DE69835828T2

DE69835828T2 - Muc-1 derivate und deren verwendung zur behandlung von krebsassoziierter muc-1 mucin induzierter immunosuppression

Info

Publication number: DE69835828T2
Application number: DE69835828T
Authority: DE
Inventors: Babita Edmonton AGRAWAL; Austin Mark Edmonton REDDISH; Michael Bryan Edmonton LONGENECKER
Original assignee: Biomira Inc
Current assignee: Oncothyreon Canada Inc
Priority date: 1997-10-31
Filing date: 1998-10-30
Publication date: 2007-04-12
Anticipated expiration: 2018-10-31
Also published as: EP1027373B1; ATE338768T1; AU749152B2; US20020159969A1; EP1027373A1; JP2002526380A; WO1999023114A1; DE69835828D1; AU1278299A; CA2307622A1

Description

Hintergrund der Erfindung
MUC-1-Mucin ist ein Glycoprotein mit hohem Molekulargewicht mit einem Proteinkern, bestehend aus Tandemwiederholungen einer 20 Aminosäuren langen Sequenz und hochgradig verzweigten Kohlenhydrat-Seitenketten. Viele menschliche Adenokarzinome, wie Brust-, Darm-, Lungen-, Eierstock- und Bauchspeicheldrüsenkrebs, überexprimieren unterglycosyliertes MUC-1-Protein und sondern große Mengen davon ab. Es ist von Bedeutung, daß ein hohes Niveau der MUC-1-Mucin-Expression mit einem hohen metastatischen Potential und schlechten Prognosen verknüpft ist. MUC-1 ist daher ein klinisch signifikanter Marker für diese Krebsarten.
Große Mengen von MUC-1 im Serum von Krebspatienten wurden auch mit der Immunsuppression in Patienten mit metastatischem Adenokarzinom, die eine aktive spezifische Immuntherapie erhielten, in Verbindung gebracht. Die hier angegebenen Daten zeigen, daß MUC-1 wenigstens teilweise direkt für diese Immunsuppression verantwortlich ist.
Zytokine, wie IL-2, wurden klinisch verwendet, um die Immuntherapie verschiedener Krebsarten zu unterstützen. Die Verwendung von Zytokinen führt, obwohl diese die MUC-1-induzierte Immunsuppression umkehren können, zu einer relativ unspezifischen Aktivierung einer großen Vielzahl von Immunzellen.
Es besteht daher ein Bedarf nach verbesserten immuntherapeutischen Medikamenten sowie Vorschriften zu deren Verwendung, die die MUC-1-induzierte Suppression und/oder die Anergie von Immunantworten reduzieren oder eliminieren.
Zusammenfassung der Erfindung
Ein Ziel der vorliegenden Erfindung besteht somit darin, verbesserte immuntherapeutische Medikamente bereitzustellen, die zur Linderung von Anergie und/oder Suppression des Immunsystems geeignet sind. Gemäß diesem Ziel werden neue Medikamente bereitgestellt, die beim Lindern von Immunzellanergie und/oder Immunsuppression aktiv sind. Eine Klasse solcher Medikamente umfaßt MUC-1-Derivate, die die durch MUC-1 vermittelte Immunsuppression umkehren. In einer Ausführungsform werden MUC-1-Derivate, umfassend ein von der MUC-1-Kernsequenz PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA abgeleitetes Peptid, und Permutationen davon bereitgestellt. In einer weiteren Ausführungsform werden MUC-1-Derivate bereitgestellt, die ein MUC-1-Kernpeptidderivat umfassen, welches mit einem stimulierenden Antigen fusioniert ist. In noch einer weiteren Ausführungsform werden MUC-1-Derivate bereitgestellt, die ein mit einem Zytokin fusioniertes MUC-1-Kernpeptidderivatumfassen.
Es ist ein weiteres Ziel der Erfindung, pharmazeutische Zusammensetzungen bereitzustellen, die für therapeutische Anwendungen geeignet sind, welche die Umkehrung von Immunzellanergie und/oder Immunsuppression erfordern. Gemäß diesem Ziel werden pharmazeutische Zusammensetzungen bereitgestellt, die MUC-1-Derivate im Gemisch mit einem pharmazeutisch verträglichen Hilfsstoff umfassen.
Es ist noch ein weiteres Ziel der Erfindung, Behandlungsverfahren bereitzustellen, die die antigeninduzierte Immunsuppression und/oder Immunzellanergie lindern. Gemäß diesem Ziel werden Verfahren bereitgestellt, die die Verabreichung eines MUC-1-Derivats an einen Patienten, der eine Behandlung benötigt, umfassen.
Kurze Beschreibung der Zeichnungen
1 zeigt die Fähigkeit von MUC-1 zur Suppression der Immunantwort auf die verschiedenen gezeigten Stimuli.
2, Feld (a) zeigt eine ähnliche Suppression durch größere Tandemwiederholungen der MUC-1-Kernsequenz, jedoch nicht durch das 16-mere mit einer einzelnen Wiederholungseinheit. Die Felder (b) und (c) zeigen die Umkehrung der MUC-1-Suppression durch Anti-CD28 und IL-2.
3 zeigt die Linderung der MUC-1-induzierten Anergie/Suppression durch das 16-mere Peptid BP₁₆, abgeleitet von der MUC-1-Kernsequenz. Das linke Feld zeigt das Kontrollmedium und das rechte Feld zeigt das Experiment, welches eine spezifische Linderung der Anergie/Suppression zeigt.
Ausführliche Beschreibung
Die Mucine sind eine Familie großer Glycoproteine mit einem Molekulargewicht von mehr als 200 kDa. Einige Mucine, wie MUC-1, sind membrangebundene Moleküle mit einer erweiterten extrazellulären Domäne, bestehend aus Tandemwiederholungen von Aminosäure- (aa-) Sequenzen, die zahlreiche potentielle O-Glycosylierungsstellen enthalten. Devine et al., BioEssays 14:619 (1992).
Zahlreiche klinische Studien haben angedeutet, daß mucinartige Tumorantigene, und zwar sowohl diejenigen, die auf der Zelloberfläche von Tumorzellen exprimiert werden, als auch diejenigen, die von der Oberfläche von Tumorzellen abgegeben werden, bei einer Vielzahl von Krebsarten mit einer schlechten Prognose verknüpft sind. Siehe beispielsweise Kobayashi et al., J. Clinical. Oncol. 10:95–101 (1992).
In einer kürzlich durchgeführten Studie zeigten wir, daß von Krebspatienten abgeleitetes MUC-1-Mucin die Inhibition spezifischer humaner T-Zell-Antworten bewirkt. Agrawal et al., Nature Medicine, 4:43–49 (1998). Zusätzlich erzeugen von MUC-1-Mucin abgeleitete lange synthetische Peptide, nicht jedoch kleine Peptide, die gleiche T-Zell-Suppression. Diese von MUC-1 abgeleiteten Peptide umfassen mehrere Tandemwiederholungen der spezifischen 20 Aminosäuren langen Kernwiederholung von MUC-1, was auf die Bedeutung der Wiederholungen bei dieser physiologischen Wirkung hinweist. Überraschenderweise fanden die Erfinder jedoch heraus, daß ein Peptid, welches kleiner als drei Vielfache der 20 Aminosäuren langen Kernwiederholung war, keine Anergie induzierte, wenn es getestet wurde.
Der Teil von MUC-1, von dem angenommen wird, daß er für dessen spezifische immunsuppressive Eigenschaften verantwortlich ist, besteht aus mehreren Tandemwiederholungen der zwanzig Aminosäuren langen Sequenz. Die Erfinder nehmen hypothetisch an, daß mehrere Wiederholungen notwendig sind, um eine Immunsuppression zu induzieren, da eine gleichzeitige Wechselwirkung mit mehreren Zelloberflächenrezeptoren erforderlich ist. Somit kann eine Vernetzung mehrerer Rezeptoren und möglicherweise das Abdecken der vernetzten Rezeptoren für eine Immunsuppression erforderlich sein. Dementsprechend ist ein Medikament, welches diesen Prozeß spezifisch stören kann, möglicherweise beim Umkehren oder sogar Verhindern einer MUC-1-induzierten Immunsuppression von Nutzen.
Die vorliegende Erfindung betrachtet MUC-1-Derivate, einschließlich bestimmter Peptide und Peptidmimetika, die, wie durch Tests, wie z.B. die unten beschriebenen, gezeigt wird, die Fähigkeit besitzen, eine MUC-1-induzierte Anergie/Immunsuppression umzukehren oder zu verhindern. Solche Verbindungen können insbesondere die nachteiligen, pathologischen Wirkungen von MUC-1 stören. Wie sie hierin verwendet werden, sind die Begriffe "Anergie" und "Immunsuppression" austauschbar und umfassen insbesondere alle Attribute, die diesen Begriffen auf dem Gebiet der Immunologie einzeln oder gemeinsam zugeschrieben werden.
Im Hinblick auf das Vorstehende besteht eine Klasse geeigneter Verbindungen aus denjenigen Verbindungen, die die Bindung von MUC-1 an einen Zelloberflächenrezeptor stören. Diese Störung kann dadurch erfolgen, daß die Bindung von MUC-1 kompetitiv gehemmt wird. Bei einer prophylaktischen Anwendung besetzt somit die Verbindung die Stelle, durch die MUC-1 seine immunsuppressive Wirkung vermittelt, wodurch eine Bindung von MUC-1 insgesamt verhindert wird. Bei einer anderen Anwendung können die erfindungsgemäßen Verbindungen verwendet werden, um die Bindung von MUC-1 umzukehren, indem es vom Rezeptor verschoben wird.
Verbindungen der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Verbindungen werden hier allgemein als "MUC-1-Derivate" bezeichnet. Die Verbindungen sind jedoch nicht auf diejenigen Verbindungen beschränkt, die spezifisch von MUC-1 abgeleitet sind, sondern umfassen die gesamte Klasse von Verbindungen, die eine Wirkung beim Lindern von MUC-1-induzierter Immunsuppression zeigen.
Eine wichtige Klasse der MUC-1-Derivate umfaßt Peptidderivate. Spezifische peptidbasierte Derivate umfassen diejenigen, die von der Sequenz der Kernwiederholung von nativem MUC-1 abgeleitet sind. In einer Ausführungsform umfaßt das Peptid die extrazelluläre Tandemwiederholungsregion von MUC-1, die Wiederholungen der Aminosäuresequenz DTRP (Asp-Thr-Arg-Pro) umfaßt. Vorzugsweise umfassen diese Tandemwiederholungen die Sequenz SAPDTRP (Ser-Ala-Pro-Asp-Thr-Arg-Pro).
Eine MUC-1-"Kernwiederholung", eine MUC-1-"Kernsequenz" oder ein MUC-1 "Kern", wie sie hierin verwendet werden, betreffen im allgemeinen diejenigen, die in dem nativen MUC-1- Molekül vorliegen, dessen Sequenz dem Fachmann auf dem Gebiet gut bekannt ist und welches die 20 Aminosäuren lange Sequenz PDTRPAPGSTAPPAHGVTSA (Pro-Asp-Arg-Thr-Pro-Ala-Pro-Gly-Ser-Thr-Ala-Pro-Pro-Ala-His-Gly-Val-Thr-Ser-Ala) umfaßt.
Deletionsderivate, einschließlich Trunkierungen und interner Deletionen, sind von besonderem Nutzen. Ein besonders geeignetes MUC-1-Derivat dieser Klasse ist ein 16 Aminosäuren langes Peptid mit der Sequenz GVTSAPDTRPAPGSTA.
Einige bevorzugte peptidbasierte MUC-1-Derivate umfassen eine oder wenigstens eine Peptidkernwiederholung des MUC-1-Mucins. Natürlich ist eine Mindestgröße von wenigstens einem Dipeptid in solchen Derivaten inhärent, da sie Peptidbindungen enthalten. Somit zieht die Bezeichnung "höchstens eine MUC-1-Kernwiederholung" mindestens ein Dipeptid in Betracht. Dies ist natürlich abhängig davon, ob ein solches Molekül die erforderlichen Eigenschaften zur Linderung von Anergie/Immunsuppression besitzt. Somit haben typische MUC-1-Kernwiederholungen eine Mindestgröße von wenigstens etwa 5 Aminosäuren, beispielsweise SAPDTRP, wobei eine Klasse besonders geeigneter Wiederholungen eine Mindestgröße von etwa 10 Aminosäuren hat. Die maximale Größe von "höchstens einer MUC-1-Kernwiederholung" beträgt 20 Aminosäuren, wie es durch die native Länge vorgegeben ist.
Weitere geeignete MUC-1-Derivate umfassen glycosylierte oder unglycoslierte Peptide. Glycosylierung kann die Halbwertszeit im Kreislauf verbessern und eine Modulation der die Immunsuppression umkehrenden Eigenschaften von MUC-1-Derivaten erlauben. Die Glycosylierung kann biologisch oder nicht-biologisch sein. Beispielsweise werden biologisch relevante N- oder O-verknüpfte Kohlenhydrate in Betracht gezogen. Alternativ können auch andere Derivate, wie ein Succinat, verwendet werden. Weitere chemische Modifikationen, wie z.B. mit Polyethylenglycolen, werden ebenfalls in Erwägung gezogen.
Obgleich sowohl aus wirtschaftlichen als auch aus bestimmten technischen Gesichtspunkten kleine Peptide bevorzugt sein können, werden auch größere Moleküle in Erwägung gezogen. So können peptidbasierte MUC-1-Derivate mit anderen geeigneten therapeutischen Mitteln kombiniert werden, was verbesserte Eigenschaften liefert. Sie können beispielsweise kovalent oder elektrostatisch kombiniert werden. In idealer Weise handelt es sich bei den anderen therapeutischen Mitteln um Immunmodulatoren, und sie besitzen vorzugsweise immunstimulatorische Eigenschaften. Obwohl auch Mittel in Betracht gezogen werden, die keine Proteine sind, sind die zusätzlichen therapeutischen Mittel vorzugsweise Proteine, die im allgemeinen Peptide umfassen. Einige besonders geeignete Proteintherapeutika umfassen Zytokine.
In einem Beispiel umfassen Fusionsproteine ein erfindungsgemäßes Peptid, welches mit einem Zytokin fusioniert ist. Es wird erwartet, daß solche Fusionen Hybrideigenschaften zum Umkehren von MUC-1-induzierter Immunsuppression besitzen und die Immunantwort in breiterem Maße induzieren. Darüber hinaus liegt aufgrund der Wechselwirkung der MUC-1-basierten Peptidkomponente mit unterdrückten T-Zellen das Zytokin physikalisch sehr nahe bei der Zielzelle, was eine spezifische zytokinvermittelte Induktion genau der Zellen, die durch den Peptidteil des MUC-1- Derivats dereprimiert werden, ermöglichen kann. So wird nicht nur die Immunsuppression gelindert, sondern es wird auch eine spezifische Immunstimulation der gleichen T-Zell-Population erzielt.
Besonders geeignete Zytokine umfassen diejenigen mit immunstimulatorischer Aktivität. Einige bevorzugte Zytokine umfassen die Interleukine (ILs) und insbesondere IL-2. Weitere geeignete Zytokine umfassen beispielsweise IL-1, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 und γ-Interferon. MUC-1 kann unter Verwendung rekombinanter DNA-Techniken mit diesen Molekülen verknüpft werden. Alternativ können die Proteine unter Verwendung multivalenter Vernetzungsmittel aneinander angehängt sein. Diese beiden Techniken sind Fachleuten auf dem Gebiet gut bekannt und in allen Standardwerken zu Laborverfahren, wie den aktuellen Ausgaben von Sambrook et al., 1989, MOLECULAR CLONING, A LABORATORY MANUAL, Cold Spring Harbor Press, NY, und Ausubel et al., 1989, CURRENT PROTO-COLS IN MOLECULAR BIOLOGY, Green Publishing Associates and Wiley Interscience, NY, zu finden.
Besonders geeignete MUC-1-Derivate können unter Verwendung von Verfahren, die den Verdau mit Enzymen, wie Pepsin oder Papain umfassen, von gereinigtem MUC-1 oder Teilen davon, die durch native Quellen oder rekombinante DNA-Verfahren hergestellt wurden, abgeleitet werden. Alternativ können von der vorliegenden Erfindung umfaßte Peptide unter Verwendung automatischer Peptidsynthetisierer, wie z.B. denjenigen, die von Applied Biosystems, Multiple Peptide Systems und anderen kommerziell erhältlich sind, synthetisiert werden, oder sie können unter Verwendung auf dem Gebiet gut bekannter Techniken manuell hergestellt werden. Siehe Geysen et al., J. Immunol. Methods 102:259 (1978). Glycosylierte und andere Formen von Peptid- oder Protein-MUC-1-Derivaten können unter Verwendung von auf dem Gebiet gut bekannten Verfahren hergestellt werden.
Obwohl die am meisten bevorzugten MUC-1-Derivate auf Proteinen (oder Peptiden) basieren, werden auch andere Derivate in Betracht gezogen. Beispielsweise können kleine Moleküle, die Aminosäure- oder Peptidmimetika sind, geeignet sein. Eine rationale Ausgestaltung solcher Moleküle ist unter Verwendung von auf dem Gebiet bekannten Verfahren möglich. Beispielsweise unter Verwendung von Kalottenmodellen können ansonsten strukturell nicht verwandte Verbindungen dazu gebracht werden, proteinbasierende MUC-1-Derivate nachzuahmen. Die Nützlichkeit dieser MUC-1-Derivate kann unter Verwendung von Routinetests, wie den in den Beispielen gezeigten, bestätigt werden.
Pharmazeutische Zusammensetzungen der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen können für die Verabreichung auf einer Vielzahl von Wegen formuliert werden. Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung enthalten im allgemeinen eine pharmazeutisch wirksame Menge einer erfindungsgemäßen Verbindung. Vorzugsweise ist die Verbindung mit einem pharmazeutisch wirksamen Vehikel (Hilfsstoff) gemischt.
Eine geeignete Formulierung ist abhängig von der Beschaffenheit des bestimmten gewählten Medikaments, davon, ob die Behandlung in vivo oder ex vivo durchgeführt wird, vom gewünschten Verabreichungsweg und von der Beurteilung durch den behandelnden Arzt. Geeignete Formulierungen und pharmazeutisch wirksame Vehikel sind beispielsweise zu finden in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Kapitel 83–92, Seiten 1519–1714 (Mack Publishing Company 1990) (Remington's).
Bevorzugte Vehikel umfassen Liposome. Siehe beispielsweise Remington's auf S. 1691–92. So können die erfindungsgemäßen Zusammensetzungen auch in Kombination mit anderen bekannten Medikamenten, die eine komplementäre, die Anergie/Immunsuppression lindernde Aktivität bereitstellen können, in liposomalen Formulierungen formuliert und verabreicht werden. Bevorzugte andere Medikamente umfassen Immunmodulatoren, wie die oben diskutierten Zytokine.
Die pharmazeutischen Zusammensetzungen der Erfindung können auch mit stimulierenden Antigenen, wie Adjuvanzien, formuliert werden. Solche Adjuvanzien sind auf dem Gebiet der Impfstoffe gut bekannt und funktionieren typischerweise so, daß sie die Immunantwort verstärken. Bevorzugte Adjuvanzien, die in der Erfindung von Nutzen sind, sind somit dadurch gekennzeichnet, daß sie die Wirkung der hier beschriebenen erfindungsgemäßen Medikamente so verstärken, daß sie die antigeninduzierte Immunsuppression/Anergie lindern. Einige Beispiele gut bekannter und nützlicher Adjuvanzien umfassen diejenigen, die von bakteriellen Lipopolysacchariden abgeleitet sind, wie Lipid A oder Monophosphoryl-Lipid A.
Verfahren der Erfindung
Die erfindungsgemäßen Verfahren umfassen typischerweise das Verabreichen einer wirksamen Menge wenigstens eines MUC-1-Derivats, wie oben beschrieben, an einen Patienten, der eine Behandlung benötigt. Natürlich ist in allen erfindungsgemäßen Verfahren die Verabreichung der obigen pharmazeutischen Zusammensetzungen austauschbar mit der Verabreichung eines MUC-1-Derivats. Weitere Verfahren ziehen eine Kombinationstherapie mit wenigstens einem MUC-1-Derivat zusammen mit wenigstens einem anderen Medikament in Betracht. Der Patient kann ein menschliches oder nicht-menschliches Tier sein. Ein Patient bedarf typischerweise einer Behandlung, wenn er an einer Anergie/Immunsuppression leidet, die möglicherweise durch MUC-1 induziert ist.
Obwohl die erfindungsgemäßen Verfahren primär auf MUC-1-induzierte Störungen anwendbar sind, wird in Betracht gezogen, daß sie sich womöglich auch allgemeiner anwenden lassen. Die hier beobachtete biologische Aktivität kann daher auch Aspekte haben, die nicht nur antigenspezifisch sind, sondern die auch für das Umkehren von Anergie/Immunsuppression im allgemeinen relevant sind. Eine solche Situation entsteht typischerweise aufgrund von antigener Kreuzreaktivität. Somit können andere die Anergie oder Immunsuppression induzierende Antigene die gleichen Epitope wie MUC-1 oder überlappende Epitope enthalten. Dementsprechend sind die hier offenbarten Verbindungen bei der Behandlung solcher Störungen anwendbar.
Die erfindungsgemäßen Verfahren können in vivo oder ex vivo eingesetzt werden. Bei einem typischen Verfahren ex vivo können beispielsweise periphere T-Zellen aus Patienten isoliert, mit wenigstens einem MUC-1-Derivat allein oder in Kombination behandelt und wieder in den Patienten infundiert werden.
Die Verabreichung bei der Behandlung in vivo kann über eine Anzahl von Wegen, einschließlich parenteral und oral, erfolgen. Bestimmte bevorzugte Verabreichungswege umfassen die direkte Injektion in den Tumor oder in die ableitenden Lymphknoten. So werden beispielsweise die den Tumor infiltrierenden Lymphozyten in dem Tumor, von denen bekannt ist, daß sie immunsupprimiert sind, spezifisch angezielt und von der Unterdrückung befreit.
MUC-1-Derivate können alleine, in Kombination miteinander oder in Kombination mit anderen Medikamenten verabreicht werden. Idealerweise sind diese anderen Medikamente Immunmodulatoren und besitzen vorzugsweise immunstimulatorische Eigenschaften. Es werden sowohl Mittel, die Proteine sind, als auch Mittel, die keine Proteine sind, in Betracht gezogen. Einige besonders geeignete proteinbasierte Mittel umfassen stimulierende Antigene und Zytokine, wie sie oben beschrieben wurden. Beispielsweise können Zytokine entweder gleichzeitig oder nacheinander zusammen mit MUC-1-Derivaten verabreicht werden. Natürlich können auch MUC-1-Derivate in Kombination mit anderen antineoplastischen Regimes verwendet werden.
Der Begriff "Behandeln" in seinen zahlreichen grammatikalischen Formen in Bezug auf die vorliegende Erfindung bezieht sich auf das Verhindern, Heilen, Umkehren, Abschwächen, Lindern, Minimieren, Unterdrücken oder Stoppen der schädlichen Auswirkungen eines Erkrankungszustands, eines Fortschreitens der Erkrankung, eines die Erkrankung verursachenden Mittels oder eines anderen abnormalen Zustands. Insbesondere Verfahren zur Prophylaxe sind von dem Begriff "Behandlung" umfaßt.
Die Bestimmung einer pharmazeutisch wirksamen Menge von MUC-1-Derivat liegt im Bereich des Fachwissens eines erfahrenen Klinikarztes und hängt zum großen Teil von der genauen Identität der erfindungsgemäßen Verbindung, den Charakteristika des bestimmten Patienten, dem Verabreichungsweg und der Art der behandelten Störung ab. Allgemeine Anleitungen sind beispielsweise in den Veröffentlichungen der International Conference on Harmonisation und in REMINGTON'S PHARMACEUTICAL SCIENCES, Kapitel 27 und 28, S. 484–528 (Mack Publishing Company 1990) zu finden.
Die Bestimmung einer pharmazeutisch wirksamen Menge hängt insbesondere von solchen Faktoren wie der Toxizität und der Wirksamkeit des Medikaments ab. Die Toxizität kann unter Verwendung von Verfahren, die auf dem Gebiet gut bekannt und in den vorgenannten Literaturstellen zu finden sind, bestimmt werden. Die Wirksamkeit kann unter Verwendung der gleichen Anleitung zusammen mit den unten in den Beispielen beschriebenen Verfahren bestimmt werden. Eine pharmazeutisch wirksame Menge ist daher eine Menge, von der der Klinikarzt annimmt, daß sie toxikologisch verträglich und doch wirksam ist.
Die Wirksamkeit wird entsprechend der oben diskutierten Definition von "Behandeln" beispielsweise anhand der Linderung oder wesentlichen Linderung der Anergie oder Immunsuppression gemessen. Quantitativ bedeutet eine "wesentliche Linderung" für gewöhnlich eine Wirkung von wenigstens 50% im Vergleich zu einer normalen Kontrolle, gemessen mittels konventioneller Immuntests. Da es für gewöhnlich wünschenswert ist, ein höheres Maß an Linderung der Immunsuppression/Anergie zu erzielen, liefert eine bevorzugte wirksame Menge eine Umkehrung der Immunsuppression/Anergie zu 75%. Am meisten bevorzugt wird jedoch wenigstens eine Wirkung von 90% erhalten, was als im wesentlichen vollständige "Linderung" betrachtet wird.
Die vorstehende Diskussion und die nachfolgenden Beispiele werden lediglich zu Veranschaulichungszwecken angegeben und sollen nicht beschränkend sein. Ein Fachmann auf dem Gebiet erkennt leicht zusätzliche Ausführungsformen, die innerhalb des Schutzbereichs der Erfindung liegen und nicht spezifisch beispielhaft veranschaulicht sind.
BEISPIELE
Beispiel 1:
Dieses Beispiel zeigt, daß die Zugabe von gereinigtem menschlichem MUC-1-Mucin zu Kulturen von menschlichen T-Zellen die T-Zell-Proliferation gegen einen starken alloantigenen Stimulus (oder mitogenen Stimulus) in vitro stark hemmt.
Die Reaktion mit gemischten Lymphozyten wird durchgeführt, indem die Lymphozyten von hinsichtlich HLA ungleichen Individuen in Gewebekulturen in vitro gemischt werden. Die "Responder-Population" in diesem Experiment bilden gereinigte T-Zellen aus einer Population, während die "Stimulator"-Population in diesem Experiment die Peripherblutlymphozyten bilden, die aus einem hinsichtlich HLA nicht passenden Individuum als Donor erhalten wurden. Die beiden Zellpopulationen werden gemischt und entweder in Gegenwart oder in Abwesenheit verschiedener Dosen von affinitätsgereinigtem MUC-1-Mucin B27.29, welches aus dem Fluid eines Pleuraergusses gereinigt wurde, kultiviert. Die Ergebnisse dieses Experiments sind in 1 gezeigt.
In dem in 1 gezeigten Experiment wurden 10⁶ T-Zellen in AIM V-Medium in Gegenwart von 10⁶ Allo-PBLs (mit Mitomycin C behandelt) mit der angegebenen Konzentration oder ohne die angegebene Konzentration von affinitätsgereinigtem MUC-1 oder OSM für 6–7 Tage kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die T-Zellen geerntet und in einer Menge von 10⁵/Well in 96-Well-Platten mit flachem Boden und mit den polyklonalen Stimuli Allo-PBLs (10⁵/(Well) oder Anti-CD3 (1 μg/ml) oder PHA (02 μg/ml) in Gegenwart oder in Abwesenheit von MUC-1 oder OSM für 4 Tage ausplattiert. Jede Gruppe wurde in einem Replikat von fünf Wells gebildet. ³H-Thymidin (1 μCi/Well) wurde zugegeben, und die Kulturplatten wurden vor dem Ernten für 18–24 h weiter inkubiert. Die Aufnahme von ³H-Thymidin in die DNA proliferierender T-Zellen wurde mittels Flüssigszintillationszählung gemessen. Die Daten sind als mittlere CPM für die Replikatwells ± Standardabweichungen gezeigt. Jedes Experiment wurde viermal wiederholt, und die Daten eines repräsentativen Experiments sind gezeigt.
Beispiel 2
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit synthetischer Peptide mit mehreren Tandemwiederholungen des MUC-1-Kerns zur Inhibition der Proliferation von T-Zellen und das Unvermögen eines enthaltenen MUC-1-Derivats zu einer solchen Inhibition.
Mucine:
MUC-1 wurde aus Aszitesflüssigkeit, die von Eierstockkrebspatienten erhalten wurde, gereinigt. 2 M Natriumacetat mit einem pH-Wert von 5 wurden zu der Aszitesflüssigkeit zugegeben und für 30 Minuten bei 20.000 U.p.M. zentrifugiert. Nach Filtration durch einen 0,45 Mikrometer-Zelluloseacetatfilter wurde die Lösung mit B27.29 Mab (Reddish et al., J. Tumor Marker Oncol., 7:19–27 (1992)) gemischt, mit CNBr über Nacht an Sepharose 4B gekoppelt, gefolgt von Waschen mit 1 M NaCl/PBS. Das affinitätsgebundene MUC-1-Mucin wurde mit 50 mM Diethanolamin (gereinigt nach Fisher) in 150 mM NaCl bei einem pH-Wert von 11 eluiert. Das Elutionsmittel wurde mit 2 M Natriumacetat bei einem pH-Wert von 5 neutralisiert. Das affinitätsgereinigte Material wurde gegen PBS dialysiert und dann mit einem Nalgene 0,2 Mikrometer-Zelluloseacetat-Spritzenfilter sterilfiltriert. Das affinitätsgereinigte MUC-1-Mucin wurde unter Verwendung des Truquant BR R1A-Tests (Biomira Diagnostics Inc., Roxdale, ON, Kanada) quantifiziert. Zur Berechnung der Menge von MUC-1-Mucin wurde die Umwandlungsformel verwendet, wonach 1 BR-Einheit ungefähr 50 ng MUC-1-Mucin entspricht.
Synthetische MUC-1-Derivate enthielten 1, 3, 4, 5 oder 6 Tandemwiederholungen des MUC-1-Kerns und waren ungefähr 16, 60, 80, 100 und 120 Aminosäuren lang. Das 16-mer (BP₁₆) enthielt die Sequenz GVTSAPDTRPAPGSTA. Die anderen Derivate enthielten Tandemwiederholungen der Sequenz TAPPAHGVTSAPDTRPAPGS:
Schaf-Submaxillar-Mucin (OSM) wurde als Kontrolle verwendet.
T-Zell-Kulturen:
Angereicherte T-Zell-Populationen wurden mittels zuvor berichteter Verfahren unter Verwendung von Nylon-Wattesäulen aus Leukozyten- und Thrombozytenschichten normaler Blutspender gereinigt. Siehe z.B. Agrawal et al., J. Immunol. 157:2089–95 (1996) und Agrawal et al., J. Immunol. 157:3229–34 (1996). Für Allo-MLR wurden mit Mitomycin C behandelte allogene PBLs zusammen mit gereinigten T-Zellen in Gegenwart oder in Abwesenheit von affinitätsgereinigtem MUC-1-Mucin oder Kontroll-OSM kultiviert. In den meisten Experimenten wurden die T-Zellen 6–7 Tage in AIM V-Medium in Abwesenheit oder in Gegenwart von MUC-1, MUC-1-Derivat oder OSM in der angegebenen Konzentration kultiviert. Danach wurden die T-Zellen geerntet, gewaschen und wie angegeben kultiviert.
Proliferationstest:
Für das in 2 dargestellte Experiment wurden gereinigte T-Zellen (10⁶/ml) in AIM V-Medium mit Allo-PBLs in Abwesenheit oder in Gegenwart von MUC-1, MUC-1-Derivat oder OSM, 10 μg/ml, für 6–7 Tage kultiviert. Die T-Zellen wurden geerntet und in einer Menge von 10⁵/Well in 96–Well-Platten mit flachem Boden mit Allo-PBLs (10⁵/Well) ausplattiert, und zwar in Gegenwart oder in Abwesenheit von affinitätsgereinigtem MUC-1, MUC-1-Derivat oder OSM. Die Kontrollkulturen wurden entweder mit 50 U/ml IL-2 oder mit 1 μg/ml Anti-CD28-Mab behandelt. Nach 4 Tagen der Kultur wurde ³H-Thymidin (1 μCi/Well) zugegeben. Die Zellen wurden am fünften Tag geerntet, und die Aufnahme von ³H-Thymidin wurde mittels Flüssigszintillation gemessen.
Ergebnisse:
Wie es in den 2 und 3 zu erkennen ist, reduzierten synthetische Peptide, die 3–6 Tandemwiederholungen des MUC-1-Kerns enthielten, das Niveau der Proliferation von T-Zellen im Vergleich zur Kontrolle signifikant. Diese Wirkung wurde bei einem Peptid, welches eine einzige Wiederholung enthielt, nicht beobachtet. Darüber hinaus wurde diese Wirkung durch Behandlung mit IL-2 oder CD28-Mab umgekehrt. Tabelle 1 zeigt die statistische Bedeutung dieser Daten im Vergleich zum Kontrollmedium. Tabelle 1
Tabelle 2 zeigt die statistische Bedeutung dieser Daten im Vergleich zur OSM-Kontrolle. Tabelle 2
Beispiel 3
Dieses Beispiel zeigt die Fähigkeit eines repräsentativen MUC-1-Derivats zur Linderung von MUC-1-induzierter Immunsuppression. Wie es in 3 gezeigt ist, kehrt die Behandlung mit dem MUC-1-Derivat BP₁₆ die durch ein 100-meres MUC-1-Peptid induzierte Suppression/Anergie um.
In dem Experiment von 3 wurden gereinigte T-Zellen (10⁶/ml) in AIM V-Medium mit Allo-PBLs in Gegenwart (100-mere MUC-1-Peptidgruppe, rechtes Feld) oder in Abwesenheit (Mediengruppe, linkes Feld) von 100-merem synthetischem MUC-1-Peptid (25 μg/ml) für 6–7 Tage kultiviert. Zu diesem Zeitpunkt wurden die T-Zellen geerntet und in einer Menge von 10⁵/Well auf 96–Well-Platten mit flachem Boden mit Allo-PBLs (10⁵/Well) in Gegenwart oder in Abwesenheit von 100-merem MUC-1-Peptid (25 μg/ml) und dem 16-meren MUC-1-Peptid (weniger als eine Tandemwiederholung) in variierenden Mengen ausplattiert. Die Wells wurden am vierten Tag der Kultur mit ³H-Thymidin (1 μCi/Well) gepulst, gefolgt vom Ernten am fünften Tag. Die Aufnahme von ³H- Thymidin in die DNA proliferierender T-Zellen wurde mittels eines Flüssigszintillationszählers ge messen. Die Daten sind als mittlere CPM ± Standardabweichungen gezeigt. Jede Gruppe wurde in Replikaten von 3 Wells gebildet.
Die vorstehende Beschreibung und die darauffolgenden Beispiele werden lediglich zu Ver anschaulichungszwecken angegeben und sollen nicht beschränkend sein. Somit sind für einen Fachmann auf dem Gebiet leicht zusätzliche Ausführungsformen offensichtlich, die im Schutzbereich der Erfindung liegen und hier nicht speziell beispielhaft ausgeführt sind.

Claims

Verwendung eines MUC-1-Peptids bei der Herstellung eines Medikaments zum Lindern von MUC-1-induzierter Immunsuppression oder Anergie, wobei das MUC-1-Peptid aus der Aminosäuresequenz GVTSAPDTRPAPGSTA besteht.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das MUC-1-Peptid mit einem Zytokin verbunden ist.
Verwendung nach Anspruch 2, wobei das Zytokin aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus IL-1, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 und γ-Interferon.
Verwendung nach Anspruch 3, wobei das Zytokin IL-2 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament weiterhin ein Zytokin umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 5, wobei das Zytokin aus der Gruppe ausgewählt ist, bestehend aus IL-1, IL-4, IL-7, IL-10, IL-12 und γ-Interferon.
Verwendung nach Anspruch 6, wobei das Zytokin IL-2 ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament weiterhin ein stimulatorisches Antigen umfaßt.
Verwendung nach Anspruch 8, wobei das stimulatorische Antigen ein Adjuvans ist.
Verwendung nach Anspruch 9, wobei das Adjuvans von einem bakteriellen Lipopolysaccharid abgeleitet ist.
Verwendung nach Anspruch 10, wobei das bakterielle Lipopolysaccharid Lipid A oder Monophosphoryl-Lipid A ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei das MUC-1-Peptid glycosyliert ist.
Verwendung nach einem der vorangegangenen Ansprüche, wobei eine L-Aminosäure in dem Peptid durch eine D-Aminosäure ersetzt ist.
Verwendung nach Anspruch 1, wobei das Medikament mit einem pharmazeutisch wirksamen Vehikel vermischt ist.
Verwendung nach Anspruch 14, wobei das pharmazeutisch wirksame Vehikel ein Liposom ist.