DE69909781T2

DE69909781T2 - Zusammensetzung enthaltend il-18 und topotecan zur behandulung und/oder vorbeugung von krebs

Info

Publication number: DE69909781T2
Application number: DE69909781T
Authority: DE
Inventors: K. Randall JOHNSON
Original assignee: SmithKline Beecham Corp
Current assignee: SmithKline Beecham Corp
Priority date: 1998-05-21
Filing date: 1999-05-20
Publication date: 2004-05-27
Anticipated expiration: 2019-05-21
Also published as: KR20010052369A; TR200003453T2; CZ300496B6; IL139733A0; EP1079818B1; ES2204164T3; AR019844A1; TWI227136B; IL139733A; NZ508115A; DK1079818T3; CZ20004321A3; AU750918B2; MY123434A; CN1367686A; NO329195B1; DE69909781D1; US6582689B1; ZA200006675B; JP4283998B2

Description

GEBIET DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen, die den Potentiator IL-18, ebenfalls bekannt als Interferon-γ-induzierender Faktor (IGIF), und Topotecan umfassen. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung solcher Zusammensetzungen, die Verwendung solcher Zusammensetzungen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebs und die Verwendung solcher Zusammensetzungen zur Hemmung des Wachstums von Tumoren oder krebsartigen Zellen in Säugetieren.
HINTERGRUND DER ERFINDUNG:
Es hat signifikant Fortschritte im Verständnis der genetischen und zellulären Veränderungen gegeben, die zu Krebs führen und die im Fortchreiten in einer stärker bösartigen und metastatischen Erkrankung resulieren. Es hat weniger beeindruckende Fortschritte in der Therapie von meastatischem Krebs gegeben, da viele der häufig auftretenden Tumore, wie Kolon-, Lungen-, Prostata- und Brustkrebs, selbst auf die neuesten Schemata chemotherapeutischer Mittel entweder kurz ansprechen oder darin versagen, überhaupt anzusprechen. Die molekularen biologischen Untersuchungen von Krebs haben ein Verständnis für die Gründe bereitgestellt, warum Tumoren darin versagen, auf Chemotherapie anzusprechen. In normalen Zellen schaltet die Induktion von DNA-Schädigung oder ein anderer metabolischer Anfall durch Chemotherapeutika einen Reaktionsweg des programmierten Zelltodes ein (Apoptose). Als Teil der genetischen Evolution von Tumoren gibt es eine Aufregulierung der Reaktionswege, die Apoptose verhindern. Dies erfolgt als Ergebnis der Selektion für Mutationen, wie den Verlust der p53-Funktion oder Überexpression von bcl-2, die das Überleben fördern, da die fehlerhafte DNA-Replikation, die in Krebszellen auftritt, normalerweise die Apoptose auslösen würde. Die Tatsache, dass antiapoptotische Reaktionswege in Tumorzellen aktiviert werden, lässt vermuten, dass diese Zellen hartnäckig gegenüber vielen unterschiedlichen Chemotherapeutika sind, unabhängig vom Mechanismus. Daher wird es wichtig sein, neue therapeutische Modalitäten einzuführen, wie die Hemmung von Tumor-induzierter Angiogenese oder Stimu- lation der Immunreaktion gegen Tumoren, um Reaktionen in chemorefraktären Krebstypen zu erzeugen.
IL-18, ebenfalls bekannt als Interferon-γ-induzierender Faktor (IGIF), ist ein kürzlich entdecktes neues Cytokin. Aktives IL-18 enthält 157 Aminosäurereste. Es besitzt wirksame biologische Aktivitäten, einschliesslich der Induktion von Interferon-γ-Produktion durch T-Zellen und Splenozyten, Steigerung der Abtötungsaktivität von NK-Zellen und Förderung der Differenzierung von naiven CD4⁺T-Zellen zu Thl-Zellen. Zusätzlich steigert menschliches IL-18 die Produktion von GM-CSF und verringern die Produktion von IL-10. Es wurde gezeigt, dass IL-18 grössere Interferon-γ-induzierende Fähigkeiten als IL-12 hat, und es scheint unterschiedliche Rezeptoren aufzuweisen und einen besonderen Signalübertragungsweg zu verwenden.
Die therapeutischen Potentiale für IL-18 in der Behandlung von Krebs und für seinen Antikörper in der Behandlung von durch endotoxischem Schock induzierter Leberschädigung (die ähnlich dem menschlichen Leberversagen ist) wurden in Tiermodellen ausgewertet, und schützende Wirkungen wurden gezeigt. Zum Beispiel wurde berichtet, dass IL-18 die Metastase und das Wachstum von Kolon-26-Adenokarzinom in Mäusen hemmt. Siehe Hanaya et al., "Anti-tumor effect of a new cytokine, IGIF, on the metastasis and growth of murine colon 26 adenocarcinoma", Proceedings of the American Association for Cancer Research 37: 451–452 (1996). weitere Untersuchungen bezüglich der Antitumoraktivität von IL-18 wurden in den folgenden Veröffentlichungen angegeben: Micallef et al., "Interleukin 18 induces the sequential activation of natural killer cells and cytotoxic T Lymphocytes to protect syngeneic mice from transplantation with Meth A sarcoma", Cancer Res. 57: 4557–4563 (1997); Yoshida et al., "Antitumor effect of human pancreatic cancer cells transduced with cytokine genes which activate Th1 helper T cells", Anticancer Res. 18: 333–336 (1998); Osaki et al., "IFN-γ-inducing factor/IL-18 administration mediates IFN-γ- and IL-12-independent antitumor effects", J. Immunol. 160: 1742–1749 (1998); and Micallef et al., "Augmentation of in vitro interleukin 10 production after in vivo administration of interleukin 18 is activated macrophage-dependent and is probably not involved in the antitumor effects of interleukin 18", Anticancer Res. 18(6A): 4267–74 (1998).
CD4⁺T-Zellen sind die zentralen regulatorischen Elemente aller Immunreaktionen. Sie werden in zwei Untergruppen unterteilt, Th1 und Th2. Jede Untergruppe wird durch ihre Fähigkeit zur Sezernierung unterschiedlicher Cytokine definiert. Interessanterweise sind die wirksamsten Induktoren für die Differenzierung selbst Cytokine. Die Entwicklung von Th2-Zellen aus naiven Vorstufen wird durch IL-4 induziert. Vor der Entdeckung von IL-18 wurde angenommen, das IL-12 das hauptsächliche Th1-induzierende Cytokin ist. IL-18 ist ebenfalls ein Th1-induzierendes Cytokin und ist wirksamer als IL-12 in der Stimulierung der Produktion von Interferon-γ.
Th1-Zellen sezernieren IL-2, Interferon-γ und TNF-β. Interferon-γ, das Signatur-Th1-Cytokin, wirkt direkt auf Makrophagen unter Steigerung ihrer mikrobioziden und phagozytischen Aktivitäten. Als Ergebnis können die aktivierten Makrophagen effektiv intrazelluläre Pathogene und Tumorzellen zerstören. Die Th2-Zellen erzeugen IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 und IL-13, die wirken, indem sie B-Zellen bei der Entwicklung zu Antikörper-erzeugenden Zellen helfen. Zusammengenommen sind Th1-Zellen primär verantwortlich für die zellvermittelte Immunität, während Th2-Zellen verantwortlich für die humorale Immunität sind.
I1-18, die codierende Nukleotidsequenz und bestimmte physikochemische und chemische Eigenschaften des gereinigten Proteins sind bekannt.
EP-A2-0 692 536 von Kabushiki Kaisha Hayashibara Seibutsu Kayaku Kenkyujo ("Hayashibara"), veröffentlicht am 17. Januar 1996, offenbart ein Mausprotein, das die IFN-γ-Produktion durch immunkompetente Zellen induziert, wobei das Protein weiter dadurch gekennzeichnet ist, dass es bestimmte physikochemische Eigenschaften und eine definierte Teilaminosäuresequenz aufweist. Ebenfalls offenbart werden ein Protein mit einer Sequenz mit 157 Aminosäuren, zwei Fragmente davon, DNA (471 bp), die das Protein codiert, Hybridome, Protein-Reinigungsverfahren und Verfahren zum Nachweis des Proteins.
EP-A2-0 712 931 von Hayashibara, veröffentlicht am 22. Mai 1996, offenbart ein menschliches Protein mit 157 Aminosäuren und Homologe davon, die das Protein codierende DNA, Transformanten, Verfahren zur Herstellung des Proteins, monoklonale Antikörper gegen das Protein, Hybridome, Protein-Reinigungsverfahren und Verfahren zum Nachweis des Proteins.
EP-A1-0 767 178 von Hayashibara, veröffentlicht am 9. April 1997, offenbart ein menschliches Protein mit einer Sequenz mit 10 Aminosäuren nahe des N-Terminus, das die Interferon-γ-Produktion durch eine immunkompetente Zelle induziert. Ebenfalls offenbart werden Verfahren zur Herstellung des Proteins, das Protein als pharmazeutisches Mittel, die Verwendung des Proteins als antionkotisches Mittel, Antitumormittel, antivirales Mittel, antibakterielles Mittel, Immunopathiemittel und zur Behandlung von atopischen Erkrankungen.
WO97/24441 von Incyte Pharmaceuticals, Inc., veröffentlicht am 10. Juli 1997, offenbart ein Protein mit 193 Aminosäuren, das der IL-18-Vorstufe entspricht, und codierende DNA.
Chemotherapeutika sind auf diesem Gebiet bekannt. Zum Beispiel werden Camptothecine, einschliesslich Topotecan, in US-PS 5 004 758 (Patent '758) von SmithKline Beecham Corporation, erteilt am 2. April 1991, offenbart. Camptothecine, einschliesslich Topotecan, werden ebenfalls offenbart in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 2. Auflage, herausgegeben von Bruce A. Chabner und Dan L. Longo, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, S. 463–484. Topotecan wird im Merck-Index, 12. Auflage, 1996, Merck & Co. Inc. unter der Monografie-Nr. 9687 offenbart. Anthracyclin-Antibiotika, einschliesslich Doxorubicin, werden offenbart in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 2. Auflage, herausgegeben von Bruce A. Chabner und Dan L. Longo, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, S. 409–434. Doxorubicin wird im Merck-Index, 12. Auflage, 1996, Merck & Co. Inc., unter der Monografie-Nr. 3495 offenbart. Alkylierende Mittel, einschliesslich Cyclophosphamid, werden offenbart in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 2. Auflage, herausgegeben von Bruce A. Chabner und Dan L. Longo, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, S. 297–332. Cyclophosphamid wird offenbart im Merck-Index, 12. Auflage, 1996, Merck & Co. Inc., unter der Monografie Nr. 2816. Antimikrotubulimittel, einschliesslich Paclitaxel, werden offenbart in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 2. Auflage, herausgegeben von Bruce A. Chabner und Dan L. Longo, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia, 1996, S. 263–296. Paclitaxel wird offenbart im Merck-Index, 12. Auflage, 1996, Merck & Co. Inc., unter der Monografie Nr. 7117. Andere Chemotherapeutika sind den Fachleuten bekannt.
ZUSAMMENFASSUNG DER ERFINDUNG:
In einem Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine Zusammensetzung bereit, die Topotecan in Kombination mit einer potenzierenden Menge eines IL-18-Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2 umfasst.
In einem anderen Aspekt stellt die vorliegende Erfindung eine pharmazeutische Zusammensetzung bereit, die eine potenzierende Menge eines IL-18-Polypeptids, Topotecan und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Herstellung der oben beschriebenen Zusammensetzung bereit, welches das Kombinieren einer potenzierenden Menge des Polypeptids mit Topotecan und Gewinnen der resultierenden Zusammensetzung umfasst.
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebs in einem Säugetier verfügbar, welches die Verabreichung einer krebshemmenden Menge einer Zusammensetzung umfasst, die eine potenzierende Menge eines IL-18-Polypeptids und Topotecan umfasst.
In einem weiteren Aspekt macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebs in einem Säugetier verfügbar, welches die Verabreichung einer krebshemmenden Menge einer Zusammensetzung umfasst, die eine potenzierende Menge eines IL-18-Polypeptids und Topotecan und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
In einem anderen Aspekt macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetier verfügbar, das für eine Zusammensetzung empfindlich ist, die eine potenzierende Menge eines IL-18-Polypeptids und Topotecan umfasst, worin ein solches Verfahren das Verabreichen einer wirksamen, das Tumorzellwachstum hemmenden Menge einer solchen Zusammensetzung an ein mit den Tumorzellen befallenes Säugetier umfasst.
In einem anderen Aspekt macht die vorliegende Erfindung ein Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetier verfügbar, das empfindlich für eine Zusammensetzung ist, die eine potenzierende Menge eines IL-18-Polypeptids und Topotecan und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst, worin ein solches Verfahren das Verabreichen einer effektiven, das Tumorzellwachstum hemmenden Menge einer solchen Zusammensetzung an ein Säugetier umfasst, das mit den Tumorzellen befallen ist.
KURZE BESCHREIBUNG DER ZEICHNUNGN:
1 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 allein und in Kombination mit Topotecan auf das Wachstum von fortgeschrittenem pulmonalem Lewis-Lungenkarzinom illustriert.
2 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 allein und in Kombination mit Topotecan auf die Anzahl der Lewis-Lungenkarzinomkolonien in der Lunge illustriert.
3 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 zusammen mit Topotecan zur Reduzierung der Anzahl von pulmonalen Tumorknötchen illustriert (Bestätigungsexperiment).
4 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 in Kombination mit Topotecan zur Reduzierung des pulmonalen Tumorwachstums illustriert (Bestätigungsexperiment).
5 ist ein Diagramm, das die Wirkung einer geringen Dosis von IL-18 auf das Wachstum von fortgeschrittenem subkutan implantiertem MOPC-315-Plasmazytom in weiblichen Balb/c-Mäusen illustriert.
6 ist ein Diagramm, das die kombinierte Wirkung von IL-18 mit einem MTD von Topotecan im fortgeschrittenen MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
7 ist ein Diagramm, das die kombinierte Wirkung von IL-18 mit einer suboptimalen Dosis von Topotecan im fortgeschrittenen MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
8 ist ein Diagramm, das die Wirkung einer hohen Dosis von IL-18 auf fortgeschrittenes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
9 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Kombination von IL-18 mit Topotecan gegen fortgeschrittenes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert (Bestätigungsexperiment).
10 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Kombination von IL-18 mit einer suboptimalen Dosis von Topotecan gegen fortgeschrittenes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert (Bestätigungsexperiment).
11 ist ein Diagramm, das die Wirkung der Kombination einer hohen Dosis von IL-18 intraperitoneal oder subkutan als einzelnes Mittel auf fortgeschrittenes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
12 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 bei intraperitonealer oder subkutaner Abgabe in Kombination mit Topotecan gegen subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
13 ist ein Diagramm, das die Wirkung von intermittierend subkutan verabreichtem IL-18 in Kombination mit Topotecan gegen fortgeschrittenes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom illustriert.
14 ist ein Diagramm, das die Wirkung von IL-18 zur Hemmung von Tumorwachstum von fortgeschrittenem subkutanem B16F10-Melanom illustriert.
15 ist ein Diagramm, das die Wirkung von Topotecan allein oder in Kombination mit IL-18 bei Mäusen illustriert, die ein fortgeschrittenes subkutanes B16F10-Melanom tragen.
AUSFÜHRLICHE BESCHREIBUNG DER ERFINDUNG:
Die vorliegende Erfindung betrifft allgemein Zusammensetzungen, die einen Potentiator wie IL-18 und Topotecan umfassen. Topotecan ist ein Beispiel für Camptothecine. Die vorliegende Erfindung betrifft ferner Verfahren zur Herstellung von Zusammensetzungen, die IL-18 und Topotecan enthalten, die Verwendung solcher Zusammensetzungen zur Vorbeugung und/oder Behandlung von Krebs und Verfahren zur Hemmung des Wachstums von Tumoren oder Zellen.
Die folgenden Definitionen werden zur Erleichterung des Verständnisses bestimmter Begriffe und Abkürzungen bereitgestellt, die häufig in dieser Anmeldung verwendet werden.
"CPA" bezeichnet Cyclophosphamid; "CR" bezeichnet die vollständige Regression; "i. p." bezeichnet intraperitoneal; "i. v." bezeichnet intravenös; "ILS" bezeichnet eine erhöhte Lebensdauer; "LTR" bezeichnet eine Langzeitregression; "MTD" bezeichnet die maximal tolerierte Dosis; "PR" bezeichnet die partielle Regression; "q1D" bezeichnet eine Dosis jeden Tag; "q4D" bezeichnet eine Dosis alle 4 Tage; "g4Dx6" bezeichnet eine Dosis alle 4 Tage × 6; "g4Dx7" bezeichnet eine Dosis alle 4 Tage × 7; "gDx5" bezeichnet eine Dosis jeden Tag für 5 Tage; "gDx21" bezeichnet eine Dosis jeden Tag für 21 Tage; "gDx26" bezeichnet eine Dosis jeden Tag für 26 Tage; "gDx30" bezeichnet eine Dosis jeden Tag für 30 Tage; "s. c." bezeichnet subkutan; "UID" bezeichnet eine Dosis pro Tag.
"Identität", wie es in diesem Gebiet bekannt ist, ist eine Beziehung zwischen zwei oder mehr Polypeptidsequenzen oder zwei oder mehr Polynukleotidsequenzen, bestimmt durch Vergleich der Sequenzen. In diesem Gebiet bezeichnet "Identität" ebenfalls den Grad der Sequenzverwandtschaft zwischen Polypeptid- oder Polynukleotidsequenzen, je nach Fall, bestimmt durch die Übereinstimmung zwischen Strängen solcher Sequenzen. "Identität" und "Ähnlichkeit" können leicht durch bekannte Verfahren berechnet werden, einschliesslich, aber nicht beschränkt auf diejenigen, die beschrieben werden in Computational Molecular Biology, A. M. Lesk, Hrsg., Oxford University Press, New York, 1988; Biocomputing: Informatics and Genome Projects, D. W. Smith, Herausgeber, Academic Press, New York, 1993; Computer Analysis of Sequence Data, Part I, A. M. Griffin und H. G. Griffin, Herausgeber, Humana Press, New Jersey, 1994; Sequence Analysis of Molecular Biology, G. von Heinje, Academic Press, 1987; und Sequence Analysis Primer, M. Gribskov und J. Devereux, Herausgeber, M Stockton Press, New York, 1991; und H. Carillo und D. Lipman, SIAM J. Applied Math., 48: 1073 (1988). Bevorzugte Verfahren zur Bestimmung von Identität sind konzipiert, um die grösste Übereinstimmung zwischen den untersuchten Sequenzen zu ergeben. Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit sind in öffentlich erhältlichen Computerprogrammen festgeschrieben. Bevorzugte Computerprogramm-Verfahren zur Bestimmung von Identität und Ähnlichkeit zwischen zwei Sequenzen schliessen ein, aber sind nicht beschränkt auf das GCG-Programm paket (J. Devereux et al., Nucleic Acids Research 12(1): 387 (1984)), BLASTP, BLASTN und FASTA (S. F. Altschul et al., J. Molec. Biol. 215: 403–410 (1990)). Das BLASTX-Programm ist öffentlich erhältlich von NCBI und anderen Quellen (BLAST Manual, S. Altschul et al., NCBI NLM NIH Bethesda, ND 20894; S. Altschul et al., J. Mol. Biol. 215: 403–410 (1990)). Der allgemein bekannte Smith-Waterman-Algorithmus kann ebenfalls zur Bestimmung von Identität verwendet werden.
"Isoliert" bedeutet "durch Menschenhand" aus dem natürlichen Zustand verändert. Falls eine "isolierte" Zusammensetzung oder Substanz in der Natur vorkommt, wurde sie aus ihrer ursprünglichen Umgebung verändert oder entfernt oder beides. Zum Beispiel ist ein Polynukleotid oder Polypeptid, das natürlicherweise in einem lebenden Tier vorhanden ist, nicht isoliert, aber das gleiche Polynukleotid oder Polypeptid, das aus den coexistierenden Materialien seines natürlichen Zustands abgetrennt wurde, ist "isoliert" gemäss dem hier eingesetzten Begriff.
"Polypeptid" bezeichnet jedes Peptid oder Protein, das zwei oder mehr Aminosäuren umfasst, die aneinander durch Peptidbindungen oder modifizierte Peptidbindungen gebunden sind, d. h. Peptidisostere. "Polypeptid" bezeichnet sowohl kurze Ketten, die üblicherweise als Peptide, Oligopeptide oder Oligomere bezeichnet werden, als auch längere Ketten, die allgemein als Proteine bezeichnet werden. Polypeptide können andere Aminosäuren als die 20 durch Gene codierten Aminosäuren enthalten. "Polypeptide" schliessen Aminosäuresequenzen ein, die entweder durch natürliche Prozesse, wie posttranslationale Reifung, oder durch chemische Modifikationstechniken, die auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, modifiziert sind. Solche Modifikationen sind in grundlegenden Texten und in grösserem Detail in Monografien sowie in der umfangreichen Forschungsliteratur allgemein beschrieben. Modifikationen können an beliebiger Stelle in einem Polypeptid auftreten, einschliesslich des Peptidgerüsts, der Aminosäure-Seitenketten und der Amino- oder Carboxyltermini. Man wird einsehen, dass der gleiche Typ von Modifikation in gleichen oder variierenden Graden an verschiedenen Stellen in einem gegebenen Polypeptid vorhanden sein kann. Ebenfalls kann ein gegebenes Polypeptid viele Typen von Modifikationen enthalten. Polypeptide können als Ergebnis von Ubiquitinierung verzweigt sein, und sie können cyclisch sein, mit oder ohne Verzweigung. Cyclische, verzweigte und verzweigte cyclische Polypeptide können aus post-translationalen natürlichen Prozessen resultieren oder sie können durch synthetische Verfahren hergestellt werden. Modifikationen schliessen Acetylierung, Acylierung, ADP-Ribosylierung, Amidierung, kovalente Anbindung von Flavin, kovalente Anbindung einer Häm-Einheit, kovalente Anbindung eines Nukleotids oder Nukleotidderivats, kovalente Anbindung eines Lipids oder Lipidderivats, kovalente Anbindung von Phosphatidylinosit, Vernetzung, Cyclisierung, Disulfidbindungsbildung, Desmethylierung, Bildung kovalenter Vernetzungen, Bildung von Cystin, Bildung von Pyroglutamat, Formylierung, γ-Carboxylierung, Glycosylierung, GPI-Ankerbildung, Hydroxylierung, Iodierung, Methylierung, Myristoylierung, Oxidation, proteolytische Verarbeitung, Phosphorylierung, Prenylierung, Racemisierung, Selenoylierung, Sulfatisierung, Transfer-RNA-vermittelte Addition von Aminosäuren an Proteine wie Arginylierung und Ubiquitinierung ein (siehe z. B. Proteins – Structure and Molecular Properties, 2. Aufl., T. E. Creighton, W. H. Freeman and Company, New York, 1993; F. Wold, Post-translational Protein Modifications: Perspectives and Prospects, S. 1–12 in Posttranslational Covalent Modification of Proteins, B. C. Johnson, Herausgeber, Academic Press, New York, 1983; Seifter et al., "Analysis for protein modifications and nonprotein cofactors", Meth Enzymol (1990) 182: 626–646 und Rattan et al., "Protein Synthesis: Post-translational Modifications and Aging", Ann. NY Acad. Sci. (1992) 663: 48–62).
"Variante" bezeichnet ein Polynukleotid oder Polypeptid, das sich von einem Referenz-Polynukleotid oder -Polypeptid unterscheidet, aber die wesentlichen Eigenschaften beibehält. Eine typische Variante eines Polynukleotids unterscheidet sich in der Nukleotidsequenz von einem anderen Referenz-Polynukleotid. Veränderungen in der Nukleotidsequenz der Variante können die Aminosäuresequenz eines Polypeptids, das durch das Referenz-Polynukleotid codiert wird, verändern oder nicht. Nukleotidveränderungen können in Aminosäuresubstitutionen, -additionen, -deletionen-, -fusionen und -kürzungen im Polypeptid resultieren, das durch die Referenzsequenz codiert wird, wie nachfolgend erörtert. Eine typische Variante eines Polypeptids unterscheidet sich in der Aminosäuresequenz von einem anderen Referenzpolypeptid. Allgemein sind Unterschiede begrenzt, so dass die Sequenzen des Referenz-Polypeptids und der Variante insgesamt sehr ähnlich und in vielen Regionen identisch sind. Eine Variante und ein Referenz-Polypeptid können sich in der Aminosäuresequenz durch eine oder mehrere Substitutionen, Additionen, Deletionen in jeder Kombination unterscheiden. Ein substituierter oder inserierter Aminosäurerest kann einer sein, der durch den genetischen Code codiert wird, oder nicht. Eine Variante eines Polynukleotids oder Polypeptids kann eine natürlich vorkommende sein, wie eine allelische Variante, oder sie kann eine Variante sein, die nicht als natürlich vorkommend bekannt ist. Nicht natürlich vorkommende Varianten von Polynukleotiden und Polypeptiden können durch Mutagenesetechniken oder durch direkte Synthese hergestellt werden.
Bevorzugte Parameter zum Polypeptid-Sequenzvergleich schliessen die folgenden ein:
(1) Algorithmus: Needleman und Wunsch, J. Mol. Biol. 48: 443–453 (1970)
Vergleichsmatrize: BLOSSUM62 von Hentikoff und Hentikoff, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89: 10915–10919 (1992)
Abzug bei Lücke: 12
Längenabhängiger Abzug bei Lücke: 4
Ein für diese Parameter nützliches Programm ist öffentlich erhältlich als das "gap"-Programm von Genetics Computer Group, Madison, WI. Die zuvor genannten Parameter sind die Standardparameter für Peptidvergleiche (neben keinem Abzug für Endlücken).
Eine Polypeptidsequenz der vorliegenden Erfindung ist identisch mit der Referenzsequenz SEQ ID NO: 1 oder SEQ ID NO: 2, d.h. 100 identisch.
"Fusionsprotein" bezeichnet ein durch zwei, häufig unverwandte fusionierte Gene oder Fragmente davon codiertes Protein. In einem Beispiel offenbart EP-A-0 464 Fusionsproteine, die verschiedene Teile der konstanten Region von Immunglobulinmolekülen zusammen mit einem anderen menschlichen Protein oder Teil davon umfassen. In vielen Fällen ist der Einsatz einer Immunglobulin-Fc-Region als Teil eines Fusionsproteins vorteilhaft zur Verwendung in der Therapie und Diagnose, was z. B. in verbesserten pharmakokinetischen Eigenschaften resultiert (siehe z. B. EP-A-O 232 262). Andererseits wäre es für andere Einsätze wünschenswert, den Fc-Teil zu deletieren, nachdem das Fusionsprotein exprimiert, detektiert und gereinigt wurde.
Potentiatoren:
Potentiatoren verstärken allgemein die Immunreaktion in Kombination mit einer cytoreduktiven Therapie. IL-18 ist ein Breitbandpotentiator, der seine immunstimulierende Wirkung bei Kombination mit unterschiedlichen Typen von Chemotherapeutika beibehält. Bestimmte Potentiatoren von Chemotherapeutika sind spezifisch und auf den Wirkungsmechanismus des modulierten Arzneistoffs bezogen, wie die Verwendung von Leukovorin in Kombination mit 5-Fluoruracil oder die Verwendung von Tirapazamin mit DNAschädigenden Mitteln wie Cisplatin oder alkylierenden Mitteln.
IL-18-Polypeptid:
In einem Aspekt betrifft die vorliegende Erfindung IL-18-Polypeptide in Kombination mit Topotecan als Chemotherapeutikum. Die Polypeptidkomponente der Zusammensetzungen der vorliegenden Erfindung, die Polypeptid und Camptothecinverbindung enthalten, ihre Isolierung, Identifizierung und bestimmte Herstellungstechniken werden in EP-A2-0 692 536, EP-A2-0 712 931, EP-A1-0 767 178 und W097/2441 offenbart. Die Polypeptide umfassen die Aminosäure von SEQ ID NO: 1 bzw. SEQ ID NO: 2.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung sind Interferon-γ-induzierende Polypeptide. Sie spielen eine primäre Rolle in der Induktion von Zellvermittelter Immunität, einschliesslich Induktion der Interferon-γ-Produktion durch T-Zellen und Splenozytensteigerung der Abtötungsaktivität von NK-Zellen und Förderung der Differenzierung von naiven CD4⁺T-Zellen zu Th1-Zellen. Diese Eigenschaften werden hier als "IL-18-Aktivität" oder "IL-18-Polypeptidaktivität" oder "biologische Aktivität von IL-18" bezeichnet. Ebenfalls eingeschlossen in diesen Aktivitäten sind antigene und immunogene Aktivitäten der IL-18-Polypeptide, insbesondere die antigenen und immunogenen Aktivitäten der Polypeptide von SEQ ID NO: 1 und SEQ ID NO: 2. Bevorzugt weist ein Polypeptid der vorliegenden Erfindung wenigstens eine biologische Aktivität von IL-18 auf.
Die Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in Form des "reifen" Proteins oder können ein Teil eines grösseren Proteins wie eines Fusionsproteins sein. Es ist häufig vorteilhaft, eine zusätzliche Aminosäuresequenz einzuschliessen, die sekretorische oder Leitsequenzen, Pro-Sequenzen, Sequenzen, die bei der Reinigung helfen, wie multiple Histidinreste, oder eine zusätzliche Sequenz zur Stabilität während der rekombinanten Erzeugung enthält, einzuschliessen.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können in jeder geeigneten Weise hergestellt werden. Solche Polypeptide schliessen isolierte natürlich vorkommende Polypeptide, rekombinant erzeugte Polypeptide, synthetisch erzeugte Polypeptide oder Polypeptide ein, die durch eine Kombination dieser Verfahren hergestellt wurden. Mittel zur Herstellung solcher Polypeptide sind allgemein verständlich auf diesem Gebiet.
Rekombinante Polypeptide der vorliegenden Erfindung können durch Verfahren, die auf diesem Gebiet allgemein bekannt sind, aus gentechnisch veränderten Wirtszellen hergestellt werden, die Expressionssysteme umfassen. Entsprechend betrifft die vorliegende Erfindung in einem weiteren Aspekt Expressionssysteme, die ein Polynukleotid oder Polynukleotide umfassen, das/die die Polypeptide der vorliegenden Erfindung codiert/codieren, Wirtszellen, die gentechnisch mit solchen Expressionssystemen verändert sind, und die Herstellung von Polypeptiden der Erfindung durch rekombinante Techniken. Zellfreie Translationssysteme können ebenfalls eingesetzt werden, um solche Proteine unter Verwendung von RNAs herzustellen, die aus den DNA-Konstrukten der vorliegenden Erfindung stammen.
Repräsentative Beispiele für geeignete Wirte schliessen bakterielle Zellen ein, wie Streptococci-, Staphylococci-, E. coli-, Streptomyces- und Bacillus subtilis-Zellen; Pilzzellen, wie Hefezellen und Aspergillus-Zellen, Insektenzellen wie Drosophila S2- und Spodoptera Sf9-Zellen; Tierzellen wie CHO-, COS-, HeLa-, C127-, 3T3-, BHK-, HEK 293- Bowes-Melanom-Zellen; und Pflanzenzellen.
Eine grosse Vielzahl von Expressionssystemen kann verwendet werden, z. B. chromosomale, episomale und aus Virus stammende Systeme, z. B. Vektoren, die aus bakteriellen Plasmiden, aus Bakteriophagen, aus Transposonen, aus Hefeepisomen, aus Insertionselementen, aus chromosomalen Hefeelementen, aus Viren wie Baculoviren, Papova-Viren, wie SV40, Vaccinia-Viren, Adenoviren, Windpocken-Viren, Pseudotollwut-Viren und Retroviren stammen, und Vektoren, die aus Kombinationen daraus stammen, wie diejenigen, die aus genetischen Plasmid- und Bakteriophagen-Elementen stammen, wie Cosmide und Phagemide. Die Expressionssysteme können Kontrollregionen enthalten, die die Expression regulieren sowie erzeugen. Allgemein kann jedes System oder jeder Sektor verwendet werden, das/der ein Polynukleotid aufrecht erhalten, vermehren oder exprimieren kann, um ein Polypeptid in einem Wirt zu erzeugen. Die geeignete Nukleotidsequenz kann in ein Expressionssystem durch jede einer Vielzahl allgemein bekannter und routinemässiger Techniken inseriert werden, wie z. B. durch diejenigen, die aufgeführt werden in Sambrook et al., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, 2. Aufl., Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N. Y. (1989). Geeignete Sekretionssignale können in das gewünschte Polypeptid eingefügt werden, um die Sekretion des translatierten Proteins in das Lumen des endoplasmatischen Retikulums, den periplasmatischen Raum oder die extrazelluläre Umgebung zu erlauben. Diese Signale können endogen für das Polypeptid sein, oder sie können heterologe Signale sein.
Polypeptide der vorliegenden Erfindung können aus rekombinanten Zellkulturen durch allgemein bekannte Verfahren gewonnen und gereinigt werden, einschliesslich Ammoniumsulfat- oder Ethanolausfällung, Säureextraktion, Anionen- oder Kationenaustauscherchromatographie, Phospho cellulosechromatographie, Chromatographie mit hydrophober Wechselwirkung, Hochleistungs-Flüssigkeitschromatographie, Hydroxyapatitchromatographie und Lectinchromatographie. Am meisten bevorzugt wird Affinitätschromatographie für die Reinigung eingesetzt. Allgemein bekannte Techniken zum Rückfalten von Proteinen können eingesetzt werden, um die aktive Konformation zu regenerieren, wenn das Polypeptid während der Isolierung oder Reinigung denaturiert wird.
Chemotherapeutika:
Die Erfindung erwägt die Verwendung von Topotecan in Kombination mit einem Potentiator, IL-18.
Topotecan ist ein Beispiel für Camptothecine. Camptothecine, einschliesslich Topotecan, werden im '758-Patent von SmithKline Beecham Corporation, erteilt am 2. April 1991, offenbart. Camptothecine, einschliesslich Topotecan, werden ebenfalls offenbart in Cancer Chemotherapy and Biotherapy, 2. Aufl., herausgegeben von Bruce A. Chabner und Dan L. Longo, Lippincott-Raven Publishers, Philadelphia 1996, S. 463–484. Topotecan wird ferner offenbart im Merck-Index, 12. Aufl., 1996, Merck & Co., Inc., unter der Monografie-Nr. 9687.
Die vorliegende Erfindung stellt eine Kombination aus Potentiatoren wie den oben beschriebenen IL-18-Polypeptiden und dem Chemotherapeutikum Topotecan, einem auf diesem Gebiet bekannten Camptothecin, bereit.
In einem weiteren Aspekt stellt die vorliegende Erfindung pharmazeutische Zusammensetzungen bereit, die eine therapeutisch wirksame Menge eines IL-18-Potentiators wie oben beschrieben in Kombination mit einem Topotecan-Chemotherapeutikum wie oben beschrieben umfassen. Pharmazeutisch akzeptable Träger oder Hilfsstoffe können ebenfalls eingesetzt werden. Der eingesetzte pharmazeutische Träger kann z. B. entweder ein Feststoff oder eine Flüssigkeit sein. Beispiele für feste Träger schliessen ein, aber sind nicht beschränkt auf Lactose, Kaolin, Saccharose, Talkum, Gelatine, Agar, Pectin, Gummi arabicum, Magnesiumstearat, Stearinsäure und dergleichen. Beispiele für flüssige Träger schliessen ein, aber sind nicht beschränkt auf Kochsalzlösung, gepufferte Kochsalzlösung, Dextrose, Wasser, Glycerin, Ethanol, Sirup, Erdnussöl, Olivenöl und Kombinationen daraus. In ähnlicher Weise kann der Träger oder das Verdünnungsmittel Zeitverzögerungsmaterial einschliessen, das allgemein auf diesem Gebiet bekannt ist, wie Glycerylmonostearat oder Glyceryldistearat allein oder mit einem Wachs, Ethylcellulose, Hydroxypropylmethylcellulose, Methylmethacrylat und dergleichen.
Die Erfindung betrifft ferner pharmazeutische Packungen oder Kits, die einen oder mehrere Behälter umfassen, die mit einem oder mehreren der Bestandteile der zuvor genannten Zusammensetzungen der Erfindung gefüllt sind. Die Kombination von Polypeptiden und Chemotherapeutika kann allein oder in Verbindung mit anderen Verbindungen wie therapeutischen Verbindungen eingesetzt werden.
Die Zusammensetzung wird dem Verabreichungsweg, z. B. auf einem systemischen oder oralen Weg, angepasst werden. Bevorzugte Formen der systemischen Verabreichung schliessen die Injektion ein, typischerweise durch intravenöse Injektion. Andere Injektionswege, wie subkutan, intramuskulär oder intraperitoneal, können verwendet werden. Falls die Kombination aus Polypeptid und Chemotherapeutikum in einer enterischen oder verkapselten Formulierung formuliert werden kann, kann zusätzlich die orale Verabreichung möglich sein. Alternative Mittel zur systemischen Verabreichung schliessen die transmukosale und transdermale Verabreichung unter Verwendung von Durchdringungsmitteln ein, wie Gallsalzen oder Fusidinsäuren oder anderen Detergentien. Die Verabreichung dieser Kombinationen kann ebenfalls topisch und/oder lokalisiert erfolgen, in Form von Salben, Pasten, Gelen und dergleichen.
Der erforderliche Dosierungsbereich der Zusammensetzung hängt von der Wahl des Potentiators, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Dosierungen der Zusammensetzungen sind jedoch für IL-18 im Bereich von 1 ng/kg bis 1 mg/kg Patient und sind für das Chemotherapeutikum im Bereich von 1/10 der klinisch akzeptierten Dosierung für das spezifische Chemotherapeutikum bis zum 10-fachen der klinisch akzeptierten Dosierung für das spezifische Chemotherapeutikum. Weite Variationen der erforderlichen Dosierung sind jedoch hinsichtlich der Vielzahl der verfügbaren Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege zu erwarten. Zum Beispiel würde man von der transdermalen Verabreichung erwarten, dass sie höhere Dosierungen als die Verabreichung durch die intravenöse Injektion erfordert. Variationen in diesen Dosierungsmengen können unter Verwendung empirischer Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es auf diesem Gebiet allgemein verständlich ist.
Das Schema für die Verabreichung der Zusammensetzung hängt von der Dosierung, von der Wahl des Potentiators, dem Verabreichungsweg, der Natur der Formulierung, der Natur des Zustands des Patienten und der Beurteilung des behandelnden Arztes ab. Geeignete Schemata zur Verabreichung sind jedoch 1 bis 3 Dosierungen jeden Tag bis 1 Dosierung jede Woche. Weite Variationen der Schemata zur Verabreichung der Zusammensetzung sind jedoch hinsichtlich der Vielzahl der verfügbaren Verbindungen und der unterschiedlichen Wirksamkeiten der verschiedenen Verabreichungswege zu erwarten. Zum Beispiel würde man erwarten, dass die transdermale Verabreichung höher Dosierungen als die Verabreichung durch intravenöse Injektion erfordert. Variationen in diesen Schemata zur Verabreichung der Zusammensetzung können unter Verwendung empirischer Standardroutinen zur Optimierung eingestellt werden, wie es auf diesem Gebiet allgemein verständlich ist.
Alle Veröffentlichungen, einschliesslich aber nicht beschränkt auf Patente und Patentanmeldungen, die in dieser Beschreibung zitiert sind, werden hier durch Verweis eingeführt, als ob jede individuelle Veröffentlichung spezifisch und individuell als hier durch Verweis eingeführt angegeben wäre, als ob vollständig angegeben.
Es wird angenommen, dass ein Fachmann unter Verwendung der vorangegangenen Beschreibung die vorliegende Erfindung in ihrem weitesten Ausmass nutzen kann. Die folgenden Beispiele sind daher als blosse Erläuterung und nicht als Beschränkung des Umfangs der vorliegenden Erfindung in irgendeiner Weise aufzufassen.
BEISPIEL 2(A) – Reduzierung von Tumorwachstum im Lewis-Lungenkarzinommodell
Experimentelles Protokoll:
In einem Experiment zum Aufzeigen der Aktivität der Kombination aus Topotecan und IL-18 im fortgeschrittenen soliden Tumormodell, hochmetastatisches Lewis-Lungenkarzinom, wurden weibliche B6D2F₁-Mäuse intravenös mit 10⁵ Lewis-Lungenkarzinomzellen beimpft und wurden willkürlich Behandlungsgruppen von 14 Mäusen jeweils am Tag 7 zugewiesen. Die Behandlung wurde bis zum Tag 7 verzögert, als die Tumoren festgestellt wurden und in den Lungen wuchsen. Die Hälfte der Mäuse in jeder Gruppe wurde am Tag 16 getötet, um die Wirkungen der Behandlung auf das pulmonale Tumorwachstum zu bestimmen, die verbleibenden Mäuse wurden unter Behandlung fortgeführt und auf Überleben überwacht (siehe Beispiel I(B)). Topotecan wurde intraperitoneal g4Dx7 beginnend am Tag 7 und endend am Tag 32 verabreicht, und die gezeigten Dosen sind in mg/kg. IL-18 der Maus wurde intraperitoneal UID von Tag 7 bis Tag 32 verabreicht, und die gezeigten Dosen sind in μg/Maus. Es gab drei Gruppen von Kontrolltieren, die alle zwischen Tag 17 und 30 starben.
Die Tiere wurden auf Überleben für 61 Tage überwacht (siehe 1 und 2 und Tabelle 1).
Ergebnisses
Es gab eine sehr hohe Tumorbelastung am Tag 16 in der Kontrollgruppe mit einem Durchschnitt von 350 mg von pulmonalem Tumor (siehe 1 und 2). Die Anzahl der deutlichen makroskopischen Tumoren in den Lungen war > 80 (siehe 2).
IL-18 allein verringerte signifikant das Lungentumorgewicht und die Knötchenzahl mit keiner klaren Dosisreaktion. Die Wirkung von IL-18 allein war nur moderat, und Tiere, die das Cytokin erhielten, besassen keine erhöhte mittlere Überlebensdauer. Ein MTD von Topotecan (15 mg/kg mit einem q4D-Schema) unterdrückte das Tumorwachstum um > 90 , aber die Mäuse hatten noch immer einen Durchschnitt von 45 pulmonalen Tumorknötchen. Die Zugabe von IL-18 ergab eine ähnliche starke Tumorwachstumshemmung. Jedoch gab es einen klaren Vorteil für die Kombination bei der suboptimalen Dosis (9 mg/kg mit einem q4D-Schema) von Topotecan (siehe 1 und 2).
BEISPIEL I(B) – überleben im Lewis-Lungenkarzinommodell
Experimentelles Protokolls
Siehe Protokollfür Beispiel I(A).
Ergebnisses
Wie in der nachfolgenden Tabelle 1 gezeigt wird, bestätigten die Überlebensdaten aus dem Versuch von IL-18 in Kombination mit Topotecan in Mäusen, die ein fortgeschrittenes systemisches Lewis-Lungenkarzinom tragen, die Aktivität von IL-18, die durch Tumor-Messungen beobachtet wurde. Wie erwartet hatte IL-18 bei alleiniger Verwendung keine Wirkung auf die Überlebensdauer. Topotecan allein verlängerte die Lebensspanne um 68% bei seinem MTD-Wert und um 63% bei 0,6 × MTD. IL-18 mit 0,5 mg/kg + der MTD-Wert von Topotecan (15 mg/kg) erhöhte die Lebensspanne um 145%; eine suboptimale Dosis von Topotecan (9 mg/kg), gekoppelt mit IL-18 mit 0,5 mg/kg, erhöhte die Lebensspanne um 82%.
TABELLE 1
BEISPIEL II(A) – Reduktion des Tumorwachstums im Lewis-Lungenkarzinommodell
Experimentelles Protokolls
In einem weiteren Experiment wurde die Aktivität der Kombination aus Topotecan plus IL-18 im fortgeschrittenen systemischen Lewis-Lungenkarzinommodell bestätigt. Dieses Experiment schloss die Verwendung höherer Dosen von IL-18 ein. Weibliche B6D2F1-Mäuse (22–24 g.) wurden intravenös mit 105 Lewis-Lungenkarzinomzellen beimpft und wurden statistisch Behandlungsgruppen von 12 bis 14 Mäusen jeweils am Tag 7 zugewiesen; die Hälfte der Mäuse in jeder Gruppe wurde am Tag 14 getötet, um die Wirkungen der Behandlung auf das pulmonale Tumorwachstum, einschliesslich Tumorgewicht und Knötchenzahl, zu bestimmen. Die verbleibenden Mäuse wurden unter Behandlung fortgesetzt und auf das Überleben überwacht. Topotecan wurde intraperitoneal g4Dx6 an den Tagen 7, 11, 15, 19, 23 und 29 verabreicht; die gezeigten Dosierungsmengen sind in mg/kg. IL-18 der Maus wurde intraperitoneal gD × 26 von Tag 7 bis Tag 33 verabreicht; die gezeigten Dosierungsmengen sind in μg/Maus. Es gab drei Gruppen von Kontrollen, die alle zwischen Tag 14 und Tag 28 starben (siehe 3 und 4 und Tabelle 2).
Ergebnisse:
Der MTD-Wert von Topotecan ergab eine gute Reduzierung von Tumorgewicht und Knötchenzahl, und es gab eine geringe Wirkung auf beide Parameter bei der niedrigeren Dosis von Topotecan. Die Kombination reduzierte die Tumorlast unter diejenige, die durch Topotecan allein erreicht wurde. Dies war am stärksten ersichtlich im Tumorgewicht, eher als in der Knötchenzahl, wo es eine grössere Wirkung bei niedrigeren Dosen von IL-18 gab. Dies bestätigt das positive Ergebnis, das bei der Anfangsuntersuchung dieser Kombination im Lewis-Lungenkarzinom festgestellt wurde (siehe 3 und 4).
BEISPIEL II(B) – Überleben im Lewis-Lungenkarzinommodell
Experimentelles Protokoll:
Siehe Protokoll für Beispiel II(A).
Ergebnisse:
Die Ergebnisse bezüglich der Überlebenshälfte des Experiments sind in der nachfolgenden Tabelle 2 zusammengefasst. Am MTD-Wert von Topotecan gab es eine signifikant längere Überlebensdauer für die Mäuse, die ebenfalls IL-18 erhielten. Bei der suboptimalen Topotecan-Dosis gab es eine Verdopplung der Lebensspannenverlängerung bei der höchsten Dosis von IL-18.
TABELLE 2
BEISPIEL III – MOPC-315-Plasmazytom
Experimentelles Protokollo
Das MOPC-315-Plasmazytom ist analog zum als multiples Myelom bekannten menschlichen Krebs. Dieser Tumor ist eine Malignität der Plasmazellen, eine reife Form von B-Lymphozyten, die an der Antikörper-Expression beteiligt sind. MOPC-315 wächst schnell zu einer sehr hohen Grösse in syngenen Balb/c-Mäusen. Es ist nicht hochmetastatisch oder invasiv.
IL-18 wurde in Mäusen ausgewertet, die etabliertes subkutanes MOPC-315-Plasmazytom tragen. Zur Erhöhung der Wahrscheinlichkeit, eine Wirkung der Immuntherapie zu beobachten, wurde IL-18 in Kombination mit einem effektiven Chemotherapeutikum sowie durch Einzeltherapie bewertet: IL-18 mit 0,3, 1,3 und 10 μg/Maus wurde täglich intraperitoneal verabreicht, und Topotecan wurde intraperitoneal mit einem q4D-Schema mit 9 und 15 mg/kg verabreicht. Beide Arzneistoffe wurden am Tag 11 nach der Implantation begonnen, als das mittlere Tumorvolumen im Bereich von 32 bis 88 mg war. Kontrolltumore benötigten 17,2 Tage, um auf 1 g zu wachsen (siehe 5 bis 7).
Ergebnisse:
IL-18-Behandlung allein hatte nur eine minimale Wirkung auf das Tumorwachstum von bestehenden Tumoren in den in diesem Experiment ausgewerteten Dosen. Das Tumorwachstum war um 1,3 bis 3,1 Tage verzögert (siehe 5). Topotecan allein erzeugte 1/7 vollständige Regressionen bei seinem MTD-Wert und verzögerte das Tumorwachstum um etwa 12 Tage. Die Kombination des MTD-Wertes von Topotecan plus IL-18 mit 10, 3 oder 1 μg/Maus/Tag war beträchtlich aktiver als Topotecan allein mit einer vollständigen Regression in bis zu 5 von 7 Mäusen und Langzeitregressionen. Bemerkenswert wuchsen die Tumoren zu einer relativ hohen Grösse vor der Regression. Ebenfalls bemerkenswert ist, dass die Tumoren nach der Unterbrechung der Behandlung erneut wuchsen und dann wieder in Abwesenheit weiterer Therapie regressierten, was eine Immun-vermittelte Reaktion vermuten lässt (siehe 6).
IL-18 zeigte ebenfalls gesteigerte und unerwartete Ergebnisse mit einer suboptimalen Dosis von Topotecan. Bei 9 mg/kg hatte Topotecan nur eine geringe oder keine Wirkung auf das Tumorwachstum ohne Regressionen und nur eine 4-tägige Verzögerung des Tumorwachstums. Bei der hohen Dosis von IL-18 gab es 5 vollständige Regressionen und 1 PR von 7 Mäusen. Zwei davon waren Langzeitregressionen, die noch nach 94 Tagen bestanden (siehe 7) .
BEISPIEL IV – MOPC-315-Plasmazytom
Experimentelles Protokoll:
Die Aktivität von IL-18 in Kombination mit Topotecan in Mäusen, die fortgeschrittenes MOPC-315-Plasmazytom trugen, wurde in einem grossen Experiment bestätigt, in dem höhere Dosen von IL-18 verwendet wurden. In diesem Experiment wurde Topotecan g4Dx6 beginnend am Tag 10 verabreicht, und IL-18 wurde gDx30 beginnend am gleichen Tag gegeben. Beide Arzneistoffe wurden intraperitoneal verabreicht, und die Aktivität wurde durch Tumormessungen beurteilt.
Ergebnisse:
Im früheren Experiment, in dem IL-18 mit einer Höchstdosis von 10 μg/ Maus/Tag verabreicht wurde, gab es keine Wirkung von IL-18 allein auf das Tumorwachstum. Jedoch wurde IL-18 im Bestätigungsversuch mit höheren Dosen gegeben, 100 und 30 μg/Maus/Tag, und es war bei der höchsten Dosis allein effektiv zur Induzierung einer verzögerten Tumorregression mit 4 von 6 vollständigen Regressionen. Niedrigere Dosen von IL-18 waren unwirksam, wie in 8 gezeigt.
Die hocheffektive Aktivität der Kombination von IL-18 mit Topotecan am MTD-Wert von Topotecan wurde bestätigt (siehe 9). Topotecan allein war relativ effektiv, wobei 2 von 6 vollständige Regressionen und eine in die Länge gezogene Hemmung des Tumorwachstums hervorgerufen wurden. Erneutes Wachstum war jedoch bei Unterbrechung von Topotecan am Tag 33 ersichtlich. Bei den höchsten drei Dosen von IL-18 gab es eine schnelle, voll-ständige und in die Länge gezogene Regression bei praktisch allen behandelten Mäusen. Diese Reaktionen traten bei Dosierungen von IL-18 auf, die bei alleiniger Verwendung unwirksam waren (siehe 9).
Eine suboptimale Dosis von Topotecan hatte praktisch keine Wirkung auf diesen fortgeschrittenen Tumor, während es vollständige Regressionen in fast allen Tieren bei den höchsten drei Dosen der IL-18-Kombination gab (siehe 10).
BEISPIEL V – MOPC-315-Plaamazytom (Schema und Weg-Untersuchung)
Experimentelles Protokoll:
Die Bewertung von IL-18 in Kombination mit einer Chemotherapie wurde wiederholt, um festzustellen: (a) wie wirksam IL-18 in Tumormodellen bei subkutaner Abgabe ist, und (b) ob IL-18 aktiv ist, wenn es mit einem unterbrochenen Schema gegeben wird, oder ob eine tägliche Behandlung erforderlich ist. Das Experiment wurde wiederum mit Topotecan im fortgeschrittenen MOPC-315-Plasmazytommodell mit einer am Tag 10 beginnenden Behandlung eingerichtet, als die Tumoren ein Volumen von ca. 100 mm³ hatten. Topotecan wurde mit seinem MTD-Wert von 15 mg/kg mit einem q4D-Schema gegeben, und IL-18 wurde über einen breiten Dosierungsbereich entweder intraperitoneal oder subkutan mit einem q1D- oder q4D-Schema gegeben. In diesem Experiment wurde eine stärkere Toxizität beider Kombinationen beobachtet, als sie in früheren Untersuchungen aus dem ernsten Gewichtsverlust ersichtlich war, so dass Topotecan nach nur zwei Durchläufen abgesetzt wurde. Jedoch wurde IL-18 fortgesetzt (siehe 11 bis 13).
Ergebnisse:
IL-18 allein war mit dem q1D-Schema mit der 100 μg/Tag-Dosierung aktiv, was die Ergebnisse des früheren Experiments bestätigt. Die Aktivität wurde sowohl für den intraperitonealen als auch den subkutanen Weg beobachtet, obwohl intraperitoneal wirksamer war (siehe 11). wie in 13 gezeigt wird; war unterbrochenes IL-18 mit 1.000 oder 100 μg/Dosis unwirksam bei der Induzierung von Regression, wenn das Cytokin allein verwendet wurde.
Die Aktivität von täglichem IL-18 in Kombination mit Topotecan wurde erneut bestätigt, und es gab eine äquivalente Aktivität, wenn IL-18 subkutan oder intraperitoneal gegeben wurde. Auf jedem Weg waren Dosen von 10 μg/Tag oder mehr erforderlich, um die gesteigerte Wirkung zu zeigen (siehe 12).
Die Verabreichung von IL-18 mit einem unterbrochenen Schema war genauso wirksam in Kombination mit der Chemotherapie. Die gleichen Dosen von 10 oder 100 μg/Maus/Dosis waren wirksam mit dem q4D-Schema wie mit dem q1D-Schema (siehe 13).
BEISPIEL VI – B16-Melanom
Experimentelles Protokoll:
In diesem Experiment wurde IL-18 in einem fortgeschrittenen syngenen Tumormodell allein und in Kombination mit Chemotherapie ausgewertet. Mäuse, die fortgeschrittenes subkutanes B16F10-Melanom trugen, wurden mit IL-18 allein oder in Kombination mit Topotecan behandelt. Die Behandlung wurde am Tag 11 nach der Implantation begonnen. Trägerkontrollen hatten eine mittlere Überlebensdauer von 20 Tagen.
Ergebnisse:
IL-18-Behandlung allein hatte keine Wirkung auf das Tumorwachstum und hatte eine minimale Wirkung auf die Überlebensdauer (< 30% ILS), obwohl bemerkt werden sollte, dass IL-18 nicht mit der hohen Dosis untersucht wurde, die sich allein als wirksam im Plasmacytommodell erwies (siehe
14). Topotecan war inaktiv bei seinem MTD-Wert (siehe 15).
Die Kombination eines MTD-Wertes von Topotecan mit IL-18 war nicht stärker effektiv als Topotecan allein bei der Verzögerung des Wachstums von B16F10 oder bei der Verlängerung der Lebensspanne in diesem metastatischen Tumormodell (siehe 15). Es sollte jedoch angemerkt werden, dass das B16F10-Melanom ein starker Tumor ist, der schlecht auf derzeit verfügbare therapeutische Ansätze reagiert.
SEQUENZPROTOKOLL

Claims

Zusammensetzung, die Topotecan in Kombination mit einer potenzierenden Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 (menschliches IL-18) umfasst.
Zusammensetzung, die Topotecan in Kombination mit einer potenzierenden Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 2 (mausartiges IL-18) umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung, die die Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger umfasst.
Verfahren zur Herstellung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 2, welches das Kombinieren einer potenzierenden Menge des Polypeptids mit Topotecan und Gewinnen der resultierenden Zusammensetzung umfasst.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krebs in einem Säugetier.
Verwendung einer potenzierenden Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 (menschliches IL-18) in Kombination mit Topotecan in der Herstellung eines Medikaments zur Behandlung und/oder Vorbeugung von Krebs in einem Säugetier.
Verwendung der Zusammensetzung gemäss einem der Ansprüche 1 bis 3 in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetier.
Verwendung einer potenzierenden Menge eines Polypeptids mit der Aminosäuresequenz SEQ ID NO: 1 (menschliches IL-18) in Kombination mit Topotecan in der Herstellung eines Medikaments zur Hemmung des Wachstums von Tumorzellen in einem Säugetier.