CN1367686A - 新组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明主要涉及含有增效剂例如IL－18—也称为干扰素－γ－诱导因子(IGIF)—和化学治疗剂的组合物,制备所述组合物的方法,所述组合物在预防和/或治疗癌症中的应用,和所述组合物在哺乳动物中抑制肿瘤或癌细胞生长的应用。

Description

新组合物
                      发明领域
本发明主要涉及含有增效剂例如IL-18-也称为干扰素-γ-诱导因子(IGIF)—和化学治疗剂的组合物。所述化学治疗剂可以是例如喜树碱如托泊替堪、蒽环类抗生素例如阿霉素、烷化剂例如环磷酰胺、或抗微管剂例如紫杉醇(paclitaxel)。本发明还涉及制备所述组合物的方法，所述组合物在预防和/或治疗癌症中的应用，和所述组合物在哺乳动物中抑制肿瘤或癌细胞生长的应用。
                      发明背景
在认识导致癌产生和导致发展成更恶性和转移性疾病的基因和细胞变化方面已经取得了显著进展。但是在转移性癌以及数目同样众多的高发生率肿瘤例如结肠癌、肺癌、前列腺癌和乳腺癌的治疗方面却取得了较少值得注意的进展，这些癌症甚至对最新化学治疗剂治疗措施也只能作出很弱的反应或者根本不反应。癌症的分子生物学研究已经对为何肿瘤不对化疗作出反应的原因提供了解释。在正常细胞中，化学治疗剂诱导的DNA损伤或其它代谢损害会招致细胞程序死亡途径(编程性细胞死亡)。作为肿瘤基因进化的一部分，存在对阻止细胞程序死亡的途径的上调。这是作为促进存活的选择性突变例如遗失p53功能或bcl-2过度表达的结果发生的，因为在癌细胞中发生的异常DNA复制通常会引发细胞程序死亡。在肿瘤细胞中抗细胞程序死亡途径被激活—这一事实意味着，无论以什么机制，这些细胞将耐许多不同化学治疗剂。因此，引入新治疗用药程式，例如抑制肿瘤诱导的血管生成、或刺激对肿瘤的免疫反应以在抗化疗型癌中产生反应是很重要的。
IL-18-也称为干扰素-γ-诱导因子(IGIF)—是最近发现的新细胞因子。活性IL-18含有157个氨基酸残基。其具有很强的生物活性，包括诱导T细胞和脾细胞生成γ-干扰素，增强NK细胞的杀伤活性，和促进原初CD4+T细胞分化成Th1细胞。此外，人IL-18还增加GM-CSF的生成，并减少IL-10的生成。人们已经表明IL-18的干扰素-γ诱导能力比IL-12强，并且似乎具有不同受体并利用不同的信号传导途径。
已经在动物模型中评价了IL-18在癌症治疗中的治疗潜力和其抗体在内毒素性休克诱导的肝脏损伤(与人肝脏衰竭类似)治疗中的治疗潜力，并证实了它们的保护作用。例如，已有报道IL-18能抑制小鼠中结肠26腺癌的转移和生长。参见Hanaya，等人，“新细胞因子IGIF对小鼠结肠26腺癌的转移和生长的抗肿瘤作用，”Proceeding ofthe American Association for Cancer Research 37：451-452(1996)。下述出版物中报道了关于IL-18抗肿瘤活性的其它研究：Micallef等人，“白细胞介素18诱导天然杀伤细胞和细胞毒性T淋巴细胞的顺序激活以保护同系小鼠免受移植的Meth A肉瘤的作用”，Cancer Res.57：4557-4563(1997)；Yoshida等人，“用激活Th1辅助T细胞的细胞因子基因转导的对人胰腺癌细胞的抗肿瘤作用”，Anticancer Res.18：333-336，(1998)；Osaki等人，“施用INF-γ-诱导因子/IL-18调节INF-γ-和IL-12独立性抗肿瘤作用”，J.Immunol.160：1742-1749(1998)；和Micallef等人，“体内施用白细胞介素18后，白细胞介素10体外生成的增加是依赖巨噬细胞激活的，并且可能不参与白细胞介素18的抗肿瘤作用”，Anticancer Res.18(6A)：4267-74(1998)。
CD4+T细胞是所有免疫反应的中枢调节单元。它们分为2个亚类，Th1和Th2。每一亚类是通过其分泌不同细胞因子的能力定义的。有趣的是，对于分化，最有效力的诱导物是细胞因子自身。从原初前体向Th2细胞的发育是由IL-4诱导的。在发现IL-18之前，IL-12被认为是主要的Th1诱导细胞因子。IL-18也是Th1诱导细胞因子，并且在刺激γ-干扰素生成方面，其效力比IL-12强。
Th1细胞分泌IL-2、γ-干扰素、和TNF-β。标志性Th1细胞因子-γ-干扰素直接作用于巨噬细胞以增强它们杀微生物和吞噬细胞的活性。结果使得激活的巨噬细胞可有效地破坏细胞内病原体和肿瘤细胞。Th2细胞生成IL-4、IL-5、IL-6、IL-10和IL-13，它们通过辅助B细胞发展成抗体生成细胞而起作用。总体来说，Th1细胞主要引起细胞介导的免疫，而Th2引起体液免疫。
IL-18、其编码核苷酸序列、以及该纯化蛋白的一些物理化学性质是已知的。
在1996年1月17日出版的Kabushiki Kaisha Hayashibara、Seibutsu Kayaku Kenkyujo(“Hayashibara”)的EP 0692536 A2公开了一种诱导免疫活性细胞生成γ-干扰素的鼠蛋白，该蛋白的其它特征是具有一些物理化学性质和确定的部分氨基酸序列。该文献还公开了具有157aa序列的蛋白、其两个片段、编码该蛋白的DNA(471bp)、杂交瘤、蛋白纯化方法、以及检测该蛋白的方法。
在1996年5月22日出版的Hayashibara的EP 0712931 A2公开了具有157aa序列的人蛋白及其同系物、编码该蛋白的DNA、转化体、制备该蛋白的方法、抗该蛋白的单克隆抗体、杂交瘤、蛋白纯化方法、以及检测该蛋白的方法。
在1997年4月9日出版的Hayashibara的EP 0767178 A1公开了一种能诱导免疫活性细胞生成γ-干扰素、在近N-末端具有10aa序列的人蛋白。该文献还公开了制备该蛋白的方法，用作药物的该蛋白，该蛋白作为消肿剂、抗肿瘤剂、抗病毒剂、抗菌剂、免疫活性剂、以及在治疗变应性疾病中的应用。
在1997年7月10日出版的Incyte Pharmaceuticals，Inc.的WO 97/24441公开了相当于IL-18前体的一种193aa蛋白及其编码DNA。
化学治疗剂是本领域已知的。例如，在1991年4月2日出版的SmithKline Beecham Corporation的US 5004758(’758专利)中公开了包括托泊替堪在内的喜树碱。Cancer Chemotherapy andBiotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.463-484中也公开了包括托泊替堪在内的喜树碱。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第9687号专题论文中公开了托泊替堪。Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-RavenPublishers，Philadephia1996.pp.409-434中公开了包括阿霉素在内的蒽环类抗生素。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第3495号专题论文中公开了阿霉素。Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.297-332中公开了包括环磷酰胺在内的烷化剂。TheMerck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第2816号专题论文中公开了环磷酰胺。Cancer Chemotherapy andBiotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.263-296中公开了包括紫杉醇在内的抗微管剂。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第7117号专题论文中公开了紫杉醇。其它化学治疗剂是本领域技术人员已知的。
                          发明简述
一方面，本发明提供了与化学治疗剂联合使用的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少70％同一性，所述同一性是指与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的全长序列比较而言的。
另一方面，本发明提供了与化学治疗剂联合使用的多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示氨基酸序列有至少70％同一性，所述同一性是指与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2的全长序列比较而言的。所述化学治疗剂优选包括喜树碱例如托泊替堪、蒽环类抗生素例如阿霉素、烷化剂例如环磷酰胺、或抗微管剂例如紫杉醇。所述化学治疗剂更优选为拓扑异构酶。所述化学治疗剂更优选为托泊替堪。所述多肽与本领域技术人员已知的其它化学治疗剂的组合也在本发明范围内。
另一方面，本发明提供了药物组合物，其中含有多肽例如IL-18、化学治疗剂、和可药用载体。
另一方面，本发明提供了制备上述组合物的方法，包括将所述多肽与化学治疗剂混合，并回收所得组合物。
另一方面，本发明提供了在哺乳动物中预防和/或治疗癌症的方法，包括将癌症抑制量的含有多肽例如IL-18和化学治疗剂的组合物给药。
另一方面，本发明提供了在哺乳动物中预防和/或治疗癌症的方法，包括将癌症抑制量的含有多肽例如IL-18、化学治疗剂和可药用载体的组合物给药。
另一方面，本发明提供了抑制哺乳动物中对含有多肽例如IL-18、和化学治疗剂的组合物敏感的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将肿瘤细胞生长有效抑制量的所述组合物对遭受所述肿瘤细胞侵害的哺乳动物给药。
另一方面，本发明提供了抑制哺乳动物中对含有多肽例如IL-18、和化学治疗剂、以及可药用载体的组合物敏感的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将肿瘤细胞生长有效抑制量的所述组合物对遭受所述肿瘤细胞侵害的哺乳动物给药。
                      附图简要说明
附图1是用于图解说明单独使用和与托泊替堪联合使用的IL-18对晚期肺Lewis肺癌生长的影响的图。
附图2是用于图解说明单独使用和与托泊替堪联合使用的IL-18对肺中Lewis肺癌集落数目的影响的图。
附图3是用于图解说明与托泊替堪联合使用的IL-18在减少肺肿瘤小结数目方面的作用的图(证明实验)。
附图4是用于图解说明与托泊替堪联合使用的IL-18在降低肺肿瘤生长方面的作用的图(证明实验)。
附图5是用于图解说明低剂量IL-18对皮下植入到雌性BALB/c小鼠中的晚期MOPC-315浆细胞瘤生长的影响的图。
附图6是用于图解说明IL-18与最大耐受剂量(MTD)托泊替堪对晚期MOPC-315浆细胞瘤的联合作用的图。
附图7是用于图解说明IL-18与次最适剂量托泊替堪对晚期MOPC-315浆细胞瘤的联合作用的图。
附图8是用于图解说明高剂量IL-18对晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图。
附图9是用于图解说明联合使用的IL-18与托泊替堪抗晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图(证明实验)。
附图10是用于图解说明联合使用的IL-18与次最适剂量托泊替堪抗晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图(证明实验)。
附图11是用于图解说明作为单一活性剂腹膜内或皮下施用的高剂量IL-18对晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图。
附图12是用于图解说明与托泊替堪联合腹膜内或皮下给药的IL-18抗晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图。
附图13是用于图解说明与托泊替堪联合间歇皮下给药的IL-18抗晚期皮下MOPC-315浆细胞瘤的作用的图。
附图14是用于图解说明IL-18抑制晚期皮下B16F10黑素瘤的肿瘤生长的作用的图。
附图15是用于图解说明IL-18延长环磷酰胺在晚期皮下B16F10黑素瘤中诱导的生长延迟的作用的图。
附图16是用于图解说明单独使用或与IL-18联合使用的托泊替堪在携带晚期皮下B16F10黑素瘤的小鼠中的作用的图。
附图17是用于图解说明单独使用的高剂量IL-18抑制晚期皮下B16F10黑素瘤肿瘤生长的作用的图。
附图18是用于图解说明与最大耐受剂量(MTD)环磷酰胺联合使用的IL-18对晚期皮下B16F10黑素瘤的作用的图(证明实验)。
附图19是用于图解说明与次最适剂量环磷酰胺联合使用的IL-18对晚期皮下B16F10黑素瘤的作用的图。
附图20是用于图解说明与紫杉醇联合使用的IL-18对晚期皮下Madison肺癌的作用的图。
附图21是用于图解说明阿霉素在晚期乳腺癌16/c中产生剂量依赖性生长延迟作用的图。
附图22是用于图解说明IL-18在晚期乳腺癌16/c中产生极小肿瘤生长延迟作用的图。
附图23是用于图解说明IL-18对阿霉素在晚期乳腺癌16/c中的活性的影响的图。
                       发明详述
本发明一般涉及含有增效剂例如IL-18和化学治疗剂的组合物。所述化学治疗剂可以是例如喜树碱如托泊替堪、蒽环类抗生素例如阿霉素、烷化剂例如环磷酰胺、或抗微管剂例如紫杉醇。本发明还涉及制备所述组合物的方法，所述组合物在预防和/或治疗癌症中的应用，和抑制肿瘤或细胞生长的方法。
提供下述定义以帮助理解在本申请中频繁使用的一些术语和缩写。
“CPA”表示环磷酰胺；“CR”表示完全消退；“ip”表示腹膜内；“iv”表示静脉内；“ILS”表示寿命增加；“LTR”表示长期退化；“MTD”表示最大耐受剂量；“PR”表示部分退化；“q1D”表示每天1次剂量；“q4D”表示每4天1次剂量；“q4D×6”表示每4天一次剂量，施用6次剂量；“q4D×7”表示每4天一次剂量，施用7次剂量； qD×5”表示每天一次剂量，施用5天；“qD×21”表示每天一次剂量，施用21天；“qD×26”表示每天一次剂量，施用26天；“qD×30”表示每天一次剂量，施用30天；“sc”表示皮下；“UID”表示每天一次剂量。
本领域已知的“同一性”是指通过比较序列确定的2个或2个以上多肽序列或2个或2个以上多核苷酸序列之间的联系。在本领域内，“同一性”还表示多肽或多核苷酸序列之间序列相关的程度，根据具体情况可通过序列串的匹配程度来确定。“同一性”和“相似性”可通过已知方法轻易地计算出，包括但不限于在下述文献中描述的方法：Computational Molecular Biology，Lesk，A.M.，ed.，OxfordUniversity Press，New York，1988；Biocomputing：Informaticsand Genome Projects，Smith，D.W.，ed.，Academic Press，NewYork，1993；Computer  Analysis of Sequence Data，Part I，Griffin，A.M.，和Griffin，H.G.，eds.，Humana Press，New Jersey，1994；Sequence Analysis in Molecular Biology，von Heinje，G.，Academic Press，1987；和Sequence Analysis Primer，Gribskov，M.和Devereux，J.，eds.，M Stockton Press，New York，1991；和Carillo，H.，和Lipman，D.，SIAM J.Applied Math.，48：1073(1988)。测定同一性的优选方法是设计用来在所测试序列之间给出最大匹配。测定同一性和相似性的方法被编辑在公众可得到的计算机程序中。用于测定两个序列之间的同一性和相似性的优选的计算机程序方法包括但不限于GCG程序包(Devereux，J.，等人，Nucleic AcidsResearch 12(1)：387(1984))、BLASTP、BLASTN、和FASTA(Atschul，S.F.等人，J.Molec.Biol.215：403-410(1990))。公众可从NCBI和其它来源获得BLAST X程序(BLAST Manual，Altschul，S.，等人，NCBI NLM NIH Bethesda，MD 20894；AltschuI，S.，等人，J.Mol.Biol.215：403-410(1990))。也可使用众所周知的Smith Watermanalgorithm来测定同一性。
“分离的”表示“通过人工”将天然状态改变。如果“分离的”组合物或物质在自然界中存在，则它们已经被改变或者从其最初的环境中移出或兼而有之。例如，如本文所用的此术语所表示的那样，天然存在于活生物体中的多核苷酸或多肽是未“分离的”，但是从其天然状态的共存材料中分离出的相同多核苷酸或多肽是“分离的”。
“多肽”是指包含彼此通过肽键或修饰的肽键即肽电子等排物连接的2个或2个以上氨基酸的肽或蛋白。“多肽”既包括通常称为肽、寡肽或低聚物的短链多肽，也包括通常称为蛋白的长链多肽。多肽可含有不同于20个基因编码氨基酸的氨基酸。“多肽”包括通过天然方法例如翻译后加工或通过本领域众所周知的化学修饰技术修饰的氨基酸序列。基本教科书和更详细的专题论文以及很多研究文献中清楚地描述了这些修饰。可在多肽的任意位置进行修饰，包括在肽骨架、氨基酸侧链、以及氨基或羧基末端上修饰。应当理解，在给定多肽中的几个位点上可存在相同或不同程度的相同类型修饰。给定多肽也可具有多种类型的修饰。多肽可以呈支链形式(这是遍在蛋白化的作用的结果)，也可以是具有或不具有支链的环状形式。环状、支链、和具有支链的环状多肽可以是通过翻译后天然过程产生的，或者可通过合成方法制得。修饰包括乙酰化、酰化、ADP-核糖基化、酰胺化、共价连接上黄素、共价连接上血红素部分、共价连接上核苷酸或核苷酸衍生物、共价连接上脂质或脂质衍生物、共价连接上磷酸肌醇、交联、环化、形成二硫键、去甲基化、形成共价交联、形成胱氨酸、形成焦谷氨酸盐、甲酰化、γ-羧基化、糖基化、形成GPI锚、羟基化、碘化、甲基化、肉豆蔻酰基化、氧化、蛋白水解过程、磷酸化、异戊二烯化、外消旋作用、硒代酰化、硫酸化、通过转移-RNA介导的向蛋白中加入氨基酸例如精氨酰化、和遍在蛋白化(参见，例如PROTEINS-STRUCTURE AND MOLECULAR PROPERTIES，2nd Ed.，T.E.Creighton，W.H.Freeman and Company，New York，1993；Wold，F.，Post-translational Protein Modifications：Perspectivesand Prospects，pgs.1-12 in POSTTRANSLATIONAL COVALENTMODIFICATION OF PROTEINS，B.C.Johnson，Ed.，Academic Press，New York，1983；Seifter等人，“蛋白修饰和非蛋白辅因子的检验”，Meth Enzymol(1990)182：626-646和Rattan等人，“蛋白合成：翻译后修饰和老化”，Ann NY Acad Sci(1992)663：48-62)。
“变体”是指与参考多核苷酸或多肽不同、但是仍然保留其本质性质的多核苷酸或多肽。典型的多核苷酸变体在核苷酸序列方面与其他的参比多核苷酸不同。变体核苷酸序列中的改变可能改变或不改变由参考多核苷酸编码的多肽的氨基酸序列。如下所述，核苷酸改变可在由参考序列编码的多肽中导致氨基酸替换、插入、缺失、融合和截短。多肽的典型变体在氨基酸序列方面与另一参考多肽不同。这些差异通常是有限的，这样参考多肽与变体的序列在总体方面很类似，并且在许多区域是同一的。变体和参考多肽在氨基酸序列方面可能由于一个或多个替换、插入、缺失(以任意组合)而不同。替换或插入的氨基酸残基可能或可能不是由遗传密码编码的。多核苷酸或多肽的变体有可能是天然产生的，例如等位变体，或者可以是已知不是天然产生的变体。非天然产生的多核苷酸和多肽变体可通过诱变技术或通过直接合成而制得。
用于多肽序列比较的优选参数包括：
1)算法：Needleman和Wunsch，J.Mol.Biol.48：443-453(1970)
比较模型：Hentikoff和Hentikoff，Proc.Natl.Acad.Sci.USA.89：10915-10919(1992)中的BLOSSUM62
缺口Penalty：12
缺口长度Penalty：4
使用这些参数的程序可以以“缺口”程序从Genetics ComputerGroup，Madison WI由公众获得。上述参数是用于比较肽的缺省参数(末端缺口没有任何penalty)。
本发明多肽序列可以与SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2所示参考序列同一，即100％同一性，或者当与参考序列比较时，其可包括一定整数数目的氨基酸变更，从而使％同一性低于100％。这种变更选自：至少一个氨基酸缺失、替换、包括保守替换和非保守替换、或插入，其中所述变更可在参考多肽序列的氨基或羧基末端发生，或者在这两个末端之间的任意位置发生，单独散布于参考序列的氨基酸上，或以一个或多个相连组散布于参考序列内。对于给定％同一性，氨基酸变更的数目是这样确定的：将SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的氨基酸总数乘以各自的同一性百分比(除以100)，然后分别从SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的氨基酸总数减去上面得到的乘积，或者：
                na≤xa-  (xa·y)，其中na是氨基酸变更的数目，xa是SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：2中的氨基酸总数，y是例如0.70(对于70％)、0.80(对于80％)、0.85(对于85％)等，在从xa中减去之前，将xa和y的任一非整数乘积下舍入最接近的整数。
“融合蛋白”是指由2个通常无关的融合基因或其片段编码的蛋白。在一个实例中，EP-A-0464公开了包含不同比例的免疫球蛋白分子的恒定区融合蛋白与另一人蛋白或其部分的融合蛋白。在许多情况下，对于产生例如改善的药动学特征的治疗和诊断应用，采用免疫球蛋白Fc区作为融合蛋白一部分是有利的[参见例如EP-A 0232262]。另一方面，对于某些应用，在融合蛋白表达、检测和纯化之后可能需要能够删除该Fc部分。增效剂
增效剂在与细胞减少性治疗联合使用时通常增强免疫反应。IL-18是广谱增效剂，当与不同类型化学治疗剂联合使用时，它维持其免疫刺激作用。化学治疗剂的一些增效剂是特定的，并且与所调节的药物的作用机制有关，例如将甲酰四氢叶酸与5-氟尿嘧啶联合使用，或者将替拉扎明与DNA破坏剂例如顺铂或烷化剂联合使用。
IL-18多肽
一方面，本发明涉及与化学治疗剂联合使用的IL-18多肽。含有该多肽和喜树碱化合物的本发明组合物中的多肽组分、其分离、鉴定和一些制备技术公开在EP0692536A2、EP0712931A2、EP0767178A1、和WO 97/2441中。所述多肽包括分离的多肽，其包含与SEQ ID NO：1(人IL-18)或SEQ ID NO：2(鼠IL-18)所示氨基酸序列有至少70％的同一性、优选有至少80％的同一性、更优选有至少90％的同一性、还更优选有至少95％的同一性、最优选有至少97-99％的同一性的氨基酸序列，其中所述同一性是指分别与SEQ IDNO：1和SEQ ID NO：2的全长序列比较而言的。这些多肽包括分别包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2所示氨基酸的多肽。
本发明多肽是干扰素-γ-诱导多肽。它们在诱导细胞介导的免疫中起主要作用，包括诱导T细胞和脾细胞生成γ-干扰素，增强NK细胞的杀伤活性，和促进原初CD4+T细胞分化成Th1细胞。这些特性在下文中称为“IL-18活性”或“IL-18多肽活性”或“IL-18的生物活性”。这些活性还包括所述IL-18多肽的抗原和免疫原性活性，尤其是SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2多肽的抗原和免疫原性活性。本发明多肽优选表现出至少一种IL-18的生物活性。
本发明多肽可以是“成熟”蛋白形式，或者可以是较大蛋白例如融合蛋白的一部分。包含下述另外的氨基酸序列通常是有利的：即含有分泌或前导序列、前序列、有助于纯化的序列例如多个组氨酸残基、或用于在重组制备期间起稳定作用的其它序列的氨基酸序列。
本发明还包括上述多肽的变体，即由于保守氨基酸替换(氨基酸残基被具有类似特性的另一氨基酸残基替换)而与参考多肽不同的多肽。典型的这种替换是在Ala、Val、Leu和Ile之间；在Ser和Thr之间；在酸性残基Asp和Glu之间；在Asn和Gln之间；在碱性残基Lys和Arg之间；或芳香残基Phe和Tyr之间替换。其中替换、缺失或插入(以任意组合)几个、5-10个、1-5个、1-3个、1-2个、或1个氨基酸的变体是特别优选的。
本发明多肽可通过任一适当方法制得。这些多肽包括分离的天然多肽、通过重组制得的多肽、通过合成制得的多肽、或通过联合采用这些方法制得的多肽。制备这些多肽的方法在本领域内是众所周知的。
本发明重组多肽可通过本领域众所周知的方法由包含表达系统的基因工程宿主细胞制得。因此，另一方面，本发明涉及包含多核苷酸或编码本发明多肽的多核苷酸的表达系统，具有所述表达系统的基因工程宿主细胞，和通过重组技术制备本发明多肽的方法。也可采用无细胞翻译系统、使用源自本发明DNA构建物的RNAs来制备本发明蛋白。
合适宿主细胞的代表性实例包括细菌细胞，例如链球菌(streptococci)、葡萄球菌(staphylococci)、大肠杆菌(E.coli)、链霉菌(Streptomyces)和枯草杆菌(bacillus subtilis)细胞；真菌细胞，例如酵母细胞和曲霉属(Aspergillus)真菌细胞；昆虫细胞，例如果蝇S2(Drosophila S2)和斜纹夜蛾Sf9(Spodoptera Sf9)细胞；动物细胞例如CHO、COS、HeLa、C127、3T3、BHK、HEK 293和鸭黑素瘤细胞；和植物细胞。
可使用多种表达系统，例如染色体系统、附加体系统和病毒衍生系统，例如源自细菌质粒的载体，源自噬菌体的载体，源自转座子的载体，源自酵母附加体的载体，源自插入单元的载体，源自酵母染色体单元的载体，源自病毒例如杆状病毒、乳多空病毒如SV40、牛痘病毒、腺病毒、禽痘病毒、假狂犬病病毒、和逆转录病毒的载体，和源自它们的组合的载体，例如源自质粒和噬菌体遗传因子的载体，例如粘粒和噬菌粒。表达系统可包含调控以及引起表达的控制区域。通常可使用能在宿主内维持、繁殖或表达多核苷酸以生成多肽的任何系统。可通过多种众所周知的常规技术，例如在Sambrook等人，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，2nd Ed.，ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，NY(1989)中描述的技术，将适当核苷酸序列插入表达系统中，可将适当分泌信号掺入到所需多肽中，以使得翻译的蛋白分泌到内质网腔、胞质或细胞外环境内。这些信号可以是多肽的内源性信号，或者可以是异源信号。
可通过众所周知的方法从重组细胞培养物中回收和纯化本发明多肽，包括硫酸铵或乙醇沉淀、酸提取、阴离子或阳离子交换层析、磷酸纤维素层析、疏水作用层析、高效液相层析、羟磷灰石层析、和凝集素层析。更优选使用亲和层析来进行纯化。当多肽在分离和纯化期间变性时，可采用用于将蛋白重折叠的众所周知的技术来使其再生。化学治疗剂
本发明涉及与增效剂例如IL-18联合使用的任一类化学治疗剂。化学治疗剂种类的实例是喜树碱如托泊替堪、蒽环类抗生素例如阿霉素、烷化剂例如环磷酰胺、和抗微管剂例如紫杉醇。化学治疗剂更优选为拓扑异构酶。化学治疗剂最优选为托泊替堪。其它本领域技术人员已知的化学治疗剂也在本发明范围内。
本领域内已知的化学治疗剂的实例是喜树碱。托泊替堪是喜树碱的实例。在1991年4月2日出版的SmithKline Beecham Corporation的’758专利中公开了包括托泊替堪在内的喜树碱。CancerChemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.463-484中也公开了包括托泊替堪在内的喜树碱。The MerckIndex，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第9687号专题论文中公开了托泊替堪。
本领域内已知的化学治疗剂的另一实例是蒽环类抗生素。阿霉素和柔红霉素是蒽环类抗生素的实例。这些治疗剂是一些目前在临床上使用最广泛的抗肿瘤药。阿霉素通常主要用于治疗实体瘤，尤其是乳腺癌和淋巴瘤。参见Cancer Chemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-RavenPublishers，Philadephia1996.pp.409-434。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第3495号专题论文中公开了阿霉素。
烷化剂是本领域内已知的化学治疗剂的另一实例。烷化剂的实例是环磷酰胺。这些治疗剂广泛用于化疗，既在常规联合治疗方案中使用，也在进行骨髓移植的高剂量治疗方案中使用。参见CancerChemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.297-332。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第2816号专题论文中公开了环磷酰胺。
抗微管剂是另一类本领域已知的化学治疗剂。抗微管剂的实例是紫杉烷紫杉醇。紫杉烷对于多种类型肿瘤都是有效的。参见CancerChemotherapy and Biotherapy，第2版，Bruce A.Chabner和Dan L.Longo编写，Lippincott-Raven Publishers，Philadephia1996.pp.263-296。The Merck Index，Twelfth Edition，1996 Merck&Co.，Inc.在第7117号专题论文中公开了紫杉醇。
本发明提供了增效剂例如上述IL-18多肽和本领域内已知的化学治疗剂例如上述化学治疗剂的组合。
另一方面，本发明提供了含有治疗有效量的增效剂例如上述增效剂和化学治疗剂例如上述化学治疗剂的药物组合物。还可以使用可药用载体或赋形剂。所用的可药用载体可以是例如固体或液体。固体载体的实例包括但不限于乳糖、白土、蔗糖、滑石、明胶、琼脂、果胶、阿拉伯胶、硬脂酸镁、硬脂酸等。液体载体的实例包括但不限于盐水、缓冲盐水、葡萄糖、水、甘油、乙醇、糖浆、花生油、橄榄油、和它们的混合物。同样，载体或稀释剂可包括本领域内众所周知的缓释材料，例如单独的甘油一硬脂酸酯或甘油二硬脂酸酯或它们与蜡，乙基纤维素，羟丙基甲基纤维素，异丁烯酸甲酯等的混合物。
本发明还涉及包含填充有一种或多种上述本发明组合物组分的一个或多个容器的药物包装或药盒。多肽和化学治疗剂的组合可独自使用，或者与其它化合物例如治疗化合物联合使用。
本发明组合物与给药途径相适应，例如适于系统给药或口服给药。优选的系统给药形式包括注射、一般是静脉内注射。可使用其它注射途径例如皮下注射、肌内注射、或腹膜内注射。此外，如果可在肠溶或胶囊制剂中配制多肽和化学治疗剂的组合，口服给药也是可能的。其它系统给药手段包括使用渗透剂例如胆汁盐或夫西地酸或其它洗涤剂的透粘膜给药和透皮给药。这些组合物还可以以软膏剂、糊剂、凝胶剂等剂型局部给药和/或定位给药。
本发明组合物所需的剂量取决于所选的增效剂和化学治疗剂、给药途径、制剂性质、个体的病症、以及临床医师的判断。然而，本发明组合物的适当剂量为，对于IL-18而言是1纤克/kg-1毫克/kg个体体重，对于化学治疗剂而言是具体化学治疗剂临床可接受剂量的1/10-具体化学治疗剂临床可接受剂量的10倍。然而，根据所用化合物的种类和不同给药途径的不同效力，所需剂量可有很大差异。例如，透皮给药将比静脉内注射给药需要更高的剂量。通过本领域内众所周知的用于最优化的标准经验常规手段可调节这些剂量水平中的差异。
本发明组合物的给药方案取决于剂量、所选的增效剂和化学治疗剂、给药途径、制剂性质、个体的病症、以及临床医师的判断。然而，合适的给药方案是每天给药1-3个剂量到每周给药1个剂量。但是，根据所用化合物的种类和不同给药途径的不同效力，本发明组合物的给药方案可有很大差异。例如，透皮给药将比静脉内注射给药需要更高的剂量。通过本领域内众所周知的用于最优化的标准经验常规手段可调节本发明组合物给药方案中的差异。
本说明书中引用的所有出版物，包括但不限于专利和专利申请都引入本发明以作参考，就像每一出版物都是具体和独自指明来全文引入以作参考一样。
据信，通过上文中的描述，本领域技术人员可最充分地利用本发明。因此，下述实施例仅是为了举例说明，并不是以任意方式对本发明的限制。实施例I(A)-在Lewis肺癌模型中的肿瘤生长减少实验方案
在表明托泊替堪和IL-18的组合在晚期实体瘤模型—高转移性Lewis肺癌中的活性的实验中，将105个Lewis肺癌细胞静脉内接种到B6D2F1雌性小鼠内，在第7天随机分成每组14只小鼠的治疗组。治疗推迟至第7天，即当肿瘤已经在肺中形成并生长时。在第16天，将每组中的一半小鼠杀死，以确定治疗对肺肿瘤生长的作用，剩余小鼠继续治疗并监视存活情况(参见实施例I(B))。将托泊替堪腹膜内给药(q4D×7)，在第7天开始，在第32天结束，剂量以mg/kg表示。在第7天-第32天将鼠IL-18腹膜内给药(UID)，剂量以μg/小鼠表示。有3组对照小鼠，它们都在第17天-第30天之间死亡。监视61天小鼠存活情况(参见附图1和附图2以及表1)。结果
在对照组中，在第16天有非常大的肿瘤，肺肿瘤平均重350mg(参见附图1和2)。在肺中肉眼可见的显著肿瘤的数目＞80(参见附图2)。
单独使用的IL-18显著地降低了肺肿瘤的重量和小结数目，其剂量-反应不清楚。单独使用的IL-18的作用仅是调节，并且接受细胞因子的动物的中值存活时间没有增加。最大耐受剂量(MTD)托泊替堪(15mg/kg，q4D给药方案)将肿瘤生长抑制了90％以上，但是小鼠仍然平均具有45个肺肿瘤小结。加上IL-18表现出类似强度的肿瘤生长抑制。然而，以次最适剂量(9mg/kg，q4D给药方案)托泊替堪联合给药的优点很清楚(参见附图1和2)。实施例I(B)-在Lewis肺癌模型中的存活实验方案见实施例I(A)。结果
如下表1所示，在携带晚期系统Lewis肺癌的小鼠中联合使用IL-18与托泊替堪进行的试验所获得的存活数据证实了通过肿瘤测定所观察到的IL-18活性。如预期的那样，当单独使用时，IL-18对于存活时间没有任何作用。单独使用的托泊替堪在其MTD时使存活时间延长了68％，在0.6×MTD时使存活时间延长了63％。0.5mg/kg的IL-18+最大耐受剂量(MTD)托泊替堪(15mg/kg)使存活时间延长了145％；次最适剂量(9mg/kg)托泊替堪+0.5mg/kg的IL-18使存活时间延长了82％。
                              表1
    治疗 剂量水平 中值存活时间(天) 存活时间增加(％)
    对照     -     22     -
    IL-18     10310.3     242322.522     9420
    托泊替堪     15     37     68
托泊替堪+IL-18     15+1015+315+115+0.3     54324741     1454511486
托泊替堪     9.0     36     63
托泊替堪+IL-18     9.0+109.0+39.0+19.0+0.3     40383528     82735927
托泊替堪腹膜内给药(q4D×7)，在第7天开始，在第32天结束，剂量以mg/kg表示。
在第7天-第32天将鼠IL-18腹膜内给药(UID)，剂量以μg/小鼠表示。实施例II(A)-在Lewis肺癌模型中的肿瘤生长减少实验方案
在另一实验中，在晚期系统Lewis肺癌模型中证实IL-18+托泊替堪的组合的活性。该实验包括使用较高剂量的IL-18。将105个Lewis肺癌细胞静脉内接种到B6D2F1雌性小鼠(22-24gm)内，在第7天随机分成每组12-14只小鼠的治疗组。在第14天，将每组中的一半小鼠杀死，以确定治疗对肺肿瘤生长(包括肿瘤重量和小结数目)的作用。剩余小鼠继续治疗并监视存活情况。在第7、11、15、19、23和29天将托泊替堪腹膜内给药(q4D×6)，剂量水平以mg/kg表示。在第7天-第33天将鼠IL-18腹膜内给药(qD×26)，剂量水平以μg/小鼠表示。有3组对照小鼠，它们都在第14天-第28天之间死亡。(参见附图3和附图4以及表2)。结果
最大耐受剂量(MTD)托泊替堪使肿瘤重量和小结数目有良好降低，较低剂量的托泊替堪在上述两个参数方面表现出较弱作用。托泊替堪+IL-18使肿瘤重量降至比单独使用托泊替堪所降至的重量要低的重量。这在肿瘤重量方面比小结数目方面是最好的佐证，在小结数目方面在较低剂量IL-18有较大作用。这证实了在Lewis肺癌中用这种组合进行的初始实验所观察到的阳性结果(参见附图3和4)。实施例II(B)-在Lewis肺癌模型中的存活实验方案见实施例II(A)。结果
该实验半数存活结果总结在下表2中。对于接受最大耐受剂量(MTD)托泊替堪和IL-18的小鼠，其具有显著延长的存活时间。次最适剂量托泊替堪+最高剂量IL-18使存活时间加倍。
                           表2
  治疗 剂量水平*   n 中值存活时间(天) 存活时间增加(％)
肿瘤对照   18     18
  IL-18   100301031   66666     2218.5181820     2230011
托泊替堪   15   6     33.5     86
托泊替堪+IL-18   15+10015+3015+1015+215+1   77776     4342414238     139133128133111
托泊替堪   9   6     25.5     42
托泊替堪+IL-18   9+1009+309+109+39+1   77777     3430273029     8967506761
在第7、11、15、19、23和29天将托泊替堪腹膜内给药(q4D×6)，剂量水平以mg/kg表示。
在第7天-第33天将鼠IL-18腹膜内给药(qD×26)，剂量水平以μg/小鼠表示。
               实施例III-MOPC-315浆细胞瘤实验方案
MOPC-315浆细胞瘤类似于称为多发性骨髓瘤的人癌症。该肿瘤是浆细胞—参与抗体表达的B淋巴细胞的成熟形式—的恶性肿瘤。MOPC-315在同系BALB/c小鼠中能迅速生长至非常大尺寸。它不是高度转移或侵袭性肿瘤。
在携带皮下建立的MOPC-315浆细胞瘤的小鼠中评价IL-18。为了提高观察到免疫治疗作用的机会，通过与有效的化学治疗剂联合使用以及通过单一治疗来评价IL-18。以0.3、1、3、和10μg/小鼠的日剂量腹膜内给予IL-18，按照q4D给药方案以9和15mg/kg的剂量腹膜内给予托泊替堪。两种药物都是在植入后第11天、即肿瘤中值体积为32-88mg时开始给药。对照肿瘤在17.2天内增加至1克(参见附图5-7)。结果
在该实验中，单独用IL-18以所评价剂量进行治疗对所建立的肿瘤的肿瘤生长仅有很小作用。肿瘤生长延迟了1.3-3.1天(参见附图5)。最大耐受剂量(MTD)托泊替堪单独产生了1/7完全消退，并且使肿瘤生长延迟了约12天。最大耐受剂量(MTD)托泊替堪+10、3或1μg/小鼠/天的IL-18联合比单独的托泊替堪更有效，在最高达5/7小鼠中产生了完全消退，并表现出长期消退作用。在消退前肿瘤显著地生长至很大的尺寸。中止治疗后肿瘤显著地重新生长，并且在没有进一步治疗的情况下又再次消退，这意味着免疫介导的反应(参见附图6)。
IL-18+次最适剂量托泊替堪表现出增强的和出乎意料的结果。9mg/kg托泊替堪对肿瘤生长具有很小作用或没有任何作用，没有任何退化，和仅有4天的肿瘤生长延迟。采用高剂量IL-18，在7只小鼠中，有5个完全消退和1PR。这些小鼠中有2只在第94天仍然表现出明显的长期消退(参见附图7)。
                   实施例IV-MOPC-315浆细胞瘤实验方案
在使用较高剂量IL-18的大型实验中证实了与托泊替堪联合使用的IL-18在携带晚期MOPC-315浆细胞瘤的小鼠中的活性。在该实验中，在第10天开始给予托泊替堪(q4D×6)，在同一天开始给予IL-8(qD×30)。这两种药物都是腹膜内给药，并且通过肿瘤测定评价其活性。结果
在其中以10μg/小鼠/天的最高剂量给予IL-18的较早实验中，单独使用的IL-18对肿瘤生长没有任何作用。然而，在证实试验中，以较高剂量—100和30μg/小鼠/天和最高剂量给予的IL-18在诱导延迟的肿瘤消退中是有效的，产生了4/6完全消退。如附图8所示，低剂量的IL-18是无效的。
结果证实了IL-18+最大耐受剂量(MTD)托泊替堪的高有效活性。单独使用的托泊替堪很有效，产生了2/6完全消退，并延迟了对肿瘤生长的抑制。然而，在第33天中止托泊替堪治疗后，肿瘤的重新生长表现得很明显。对于3个最高剂量的IL-18，所有治疗小鼠事实上都表现出迅速、完全和延迟的消退。在当单独使用时是无效的IL-18剂量水平上产生了这些反应(参见附图9)。
次最适剂量的托泊替堪对于该晚期肿瘤实际上没有任何作用，然而对于3个最高剂量IL-18(与托泊替堪联合使用)，几乎所有动物都产生了完全消退(参见附图10)。
实施例V-MOPC-315浆细胞瘤(给药方案和途径研究)实验方案
重复评价与化疗联合使用的IL-18以确定：(a)当皮下给予时IL-18在肿瘤模型中的有效性如何，和(b)当以间歇方式给予时IL-18是否有活性或者是否必须每天都进行治疗。在晚期MOPC-315浆细胞瘤模型中也用托泊替堪进行该实验，在第10天当肿瘤体积约为100mm3时开始治疗。托泊替堪以其最大耐受剂量(MTD)15/mg给药(按照q4D给药方案)，IL-18以宽的剂量范围腹膜内或皮下给药(按照q1D或q4D给药方案)。在该实验中，采用联合治疗观察到的毒性比前面的实验高，表现为严重的体重下降，因此2个疗程后中止托泊替堪。但是继续给予IL-18(参见附图11-13)。结果
以100μg/天的剂量水平按照q1D方案给药的单独使用的IL-18有活性，这证实了前述实验结果。对于腹膜内和皮下给药途径都观察到了活性，但是腹膜内给药更有效(参见附图11)。如附图13所示，当细胞因子单独使用时，以1000或100μg/剂量间歇给药的IL-18不能有效地诱导消退。
又一次证实了与托泊替堪联合使用的每日给药的IL-18的活性，并且当IL-18皮下或腹膜内给药时其表现出相等活性。无论通过哪一条给药途径，都需要10μg/天或更高的剂量来表现出增强作用(参见附图12)。
当与化疗联合使用时，以间歇方式给予IL-18才是有效的。同q1D给药方案一样，对于q4D给药方案，10或100μg/小鼠/剂量给药的相同剂量是有效的(参见附图13)。
                   实施例VI-B16黑素瘤实验方案
在该实验中，在晚期同系肿瘤模型中评价单独使用或与化疗联合使用的IL-18的活性。仅用IL-18、或用IL-18与环磷酰胺、或用IL-18与托泊替堪治疗携带晚期皮下B16F10黑素瘤的小鼠。植入后第11天开始治疗。载体对照的中值存活时间为20天。结果
单独用IL-18进行治疗对肿瘤生长没有任何作用，对存活时间有最小影响(≤30％ILS)，但是应当指出，没有采用据证明在浆细胞瘤模型中单独使用时有活性的高剂量来测试IL-18(参见附图14)。按照q7D给药方案以300mg/kg的最大耐受剂量(MTD)给予的环磷酰胺使存活提高了95％，使肿瘤生长延迟了14天(参见附图15)。托泊替堪在其MTD没有活性(见附图16)。
IL-18与最大耐受剂量(MTD)环磷酰胺的组合对于抗肿瘤活性具有最小的且剂量依赖性的作用。最小剂量的IL-18+环磷酰胺使存活时间延长了110％，并产生了另外3天的肿瘤生长延迟。较高IL-18剂量组合与单独使用的环磷酰胺之间没有不同(参见附图15)。
在该转移性肿瘤模型中，在延迟B16F10生长或延长存活时间方面，最大耐受剂量(MTD)托泊替堪与IL-18的组合不比单独使用的托泊替堪更有效(参见附图16)。应当指出，B16F10黑素瘤是恶性肿瘤模型，其对目前采用的治疗方法的反应很弱。
               实施例VII-B16黑素瘤实验方案
进行重复实验以确定与环磷酰胺联合使用的IL-18在B16黑素瘤模型中的有效性。将B16F10亚系从组织培养物中皮下植入，并且在治疗前让其生长至100mm3的中值体积。在该实验中，肿瘤的生长延迟了，因此直至第14天才达到100mm3的中值体积；在开始治疗时，肿瘤尺寸有很大差异，某些动物具有非常大的肿瘤。结果
使用IL-18、环磷酰胺、或二者的组合没有产生任何消退。单独使用IL-18仅使肿瘤最小生长延迟了约2天。最大耐受剂量(MTD)环磷酰胺使肿瘤生长延迟了14天，加上IL-18在这种活性方面没有表现出很好的作用。以高剂量IL-18联合治疗时，有明显的降低作用，然而这仅仅是因为开始治疗时该组中的肿瘤更大。然而，使肿瘤生长仅延迟4天的次最适剂量(180mg/kg)环磷酰胺在与IL-18联合使用时表现出正性作用，使肿瘤生长延迟了约10天和15天(除了在开始治疗时具有大肿瘤的联合治疗组以外)(参见附图17-19)。
               实施例VIII-Madison 109肺癌实验方案
进行该实验以确定与紫杉醇联合使用的IL-18在Madison 109肺肿瘤模型中的有效性。该肿瘤模型是对紫杉醇最敏感的同系鼠肿瘤，但是即使如此，其对紫杉醇也仅具有中度反应性。皮下植入肿瘤，并且在治疗前让其生长至126-326mm3的中值体积。在开始治疗时，肿瘤尺寸有很大差异，某些动物具有非常大的肿瘤。按照qD×5给药方案静脉内给予紫杉醇(12、24、48mg/kg)(第9-13天)。按照qD×21给药方案以1、10和100μg/小鼠的剂量给予IL-18。结果
单独以及联合使用时，紫杉醇在48mg/kg剂量表现出毒性，并且在24mg/kg剂量接近毒性，其中毒性是基于过度体重下降而定的。在该紫杉醇剂量基础上加上较高剂量的IL-18导致早期死亡。象前面实验一样，单独使用的IL-18被良好耐受(参见附图20和表3)。
单独治疗或联合治疗都没有产生消退。单独使用的紫杉醇产生了最小的肿瘤生长延迟作用和最小的存活延迟作用。采用联合治疗时没有任何显著改善，但是，12mg/kg剂量的紫杉醇+较低剂量IL-18延迟了肿瘤生长。以低剂量单独使用的IL-18将存活时间延长了77％，没有延迟肿瘤生长。当该剂量的IL-18与紫杉醇联合使用时，观察到了相同的存活时间延长作用(参见附图20和表3)。
                                   表3
  IL-18μg，sc                             紫杉醇mg/kg，iv
0 12 24 48
    0     T-C 3.5天，NT27％ILS     T-C 9.7天，-4.7g35％ILS   毒性
    1     T-C 1.7天，NT77％ILS     T-C 9.9天，-3.7g77％ILS     T-C 9.7天，-5.6g77％ILS   毒性
    10     T-C 2.1天，NT12％ILS     T-C6.4天，-4.2g21％ILS     毒性   毒性
    100     T-C 2.8天，NT0％ILS     T-C 3.3天，-3.5g46％ILS     毒性   毒性
T-C：肿瘤生长延迟
NT：无毒性，体重下降低于3gm。
                  实施例IX-乳腺癌16/C实验方案
进行该实验以确定单独使用或与阿霉素联合使用的IL-18在16/c乳腺癌肿瘤模型中的有效性。以1∶10浆液皮下植入16/c系，并且在治疗前让其生长至52-109mm3的中值体积。在第12和19天以7.2、12、和20mg/kg的剂量静脉内给予阿霉素。从第12天开始按照qD×21给药方案以1、10和100μg/小鼠的剂量皮下给予IL-18。该实验的终点是肿瘤生长延迟和消退。结果
单独的阿霉素或IL-18或二者的组合都没有产生消退。如表4所示，IL-18显著地加剧了阿霉素的毒性。阿霉素的MTD是20mg/kg。甚至与1μgIL-18联合使用时该剂量也会产生毒性。将阿霉素以不导致体重下降且具有很小效力或不具有任何效力的其1/3 MTD的剂量与10或100μg IL-18联合使用，结果产生了毒性。
                                     表4
    IL-18μg/小鼠，ip                         阿霉素mg/kg，iv
    0     7.2     12     20
    0     无毒性   无毒性   无毒性
    1   无毒性   无毒性(1/6) 有毒性(4/6) 有毒性(4/6)
    10   无毒性   有毒性(5/6) 有毒性(5/6) 有毒性(6/6)
    100   无毒性   有毒性(6/6) 有毒性(5/6) 有毒性(6/6)
(中毒死亡)
由于具有毒性，不能测定该组合在抗肿瘤活性方面的作用。如附图21所示，阿霉素产生剂量依赖性肿瘤生长延迟。单独使用的IL-18产生低于1周的最小的肿瘤生长延迟作用，在所评价的100倍剂量范围内，没有任何剂量-反应(参见附图22)。只有都在最小剂量的这两种活性剂的组合可以被耐受，但是阿霉素的抗肿瘤作用没有任何增强(参见附图23)。
                             序列表
<110>Johnson，Randall K
<120>新化合物
<130>P50777
<140>未知
<141>
<150>60/086,560
<151>1999-05-21
<160>2
<170>FastSEQ for Windows Version 3.0
<210>1
<211>157
<212>PRT
<213>人
<400>1Tyr Phe Gly Lys Leu Glu Ser Lys Leu Ser Val Ile Arg Asn Leu Asn1               5                  10                  15Asp Gln Val Leu Phe Ile Asp Gln Gly Asn Arg Pro Leu Phe Glu Asp
        20                  25                  30Met Thr Asp Ser Asp Cys Arg Asp Asn Ala Pro Arg Thr Ile Phe Ile
    35                  40                  45Ile Ser Met Tyr Lys Asp Ser Gln Pro Arg Gly Met Ala Val Thr Ile
50                  55                  60Ser Val Lys Cys Glu Lys Ile Ser Thr Leu Ser Cys Glu Asn Lys Ile65                  70                  75                  80Ile Ser Phe Lys Glu Met Asn Pro Pro Asp Asn Ile Lys Asp Thr Lys
            85                  90                  95Ser Asp Ile Ile Phe Phe Gln Arg Ser Val Pro Gly His Asp Asn Lys
        100                 105                 110Met Gln Phe Glu Ser  Ser Ser Tyr Glu Gly Tyr Phe Leu Ala Cys Glu
    115                  120                 125Lys Glu Arg Asp Leu Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Glu Asp Glu Leu
130                 135                 140Gly Asp Arg Ser Ile Met Phe Thr Val Gln Asn Glu Asp145                 150                 155
<210>2
<211>157
<212>PRT
<213>鼠
<400>2Asn Phe Gly Arg Leu His Cys Thr Thr Ala Val Ile Arg Asn Ile Asn1               5                  10                  15Asp Gln Val Leu Phe Val Asp Lys Arg Gln Pro Val Phe Glu Asp Met
        20                  25                  30Thr Asp Ile Asp Gln Ser Ala Ser Glu Pro Gln Thr Arg Leu Ile Ile
    35                  40                  45Tyr Met Tyr Lys Asp Ser Glu Val Arg Gly Leu Ala Val Thr Leu Ser
50                  55                  60Val Lys Asp Ser Lys Met Ser Thr Leu Ser Cys Lys Asn Lys Ile Ile65                  70                  75                  80Ser Phe Glu Glu Met Asp Pro Pro Glu Asn Ile Asp Asp Ile Gln Ser
            85                  90                  95Asp Leu Ile Phe Phe Gln Lys Arg Val Pro Gly His Asn Lys Met Glu
        100                 105                 110Phe Glu Ser Ser Leu Tyr Glu Gly His Phe Leu Ala Cys Gln Lys Glu
    115                 120                 125Asp Asp Ala Phe Lys Leu Ile Leu Lys Lys Lys Asp Glu Asn Gly Asp
130                 135                 140Lys Ser Val Met Phe Thr Leu Thr Asn Leu His Gln Ser145                 150                 155

Claims (12)

1.一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少70％同一性，所述同一性是指与SEQ ID NO：1的全长序列比较而言的，所述多肽与化学治疗剂组合。
2.一种多肽，其中所述多肽与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少70％同一性，所述同一性是指与SEQ ID NO：2的全长序列比较而言的，所述多肽与化学治疗剂组合。
3.一种多肽，所述多肽与SEQ ID NO：1所示氨基酸序列具有至少70％同一性，所述多肽与化学治疗剂组合，其中所述化学治疗剂是托泊替堪。
4.一种多肽，所述多肽与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列具有至少70％同一性，所述多肽与化学治疗剂组合，其中所述化学治疗剂是托泊替堪。
5.一种药物组合物，它包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂、以及可药用载体。
6.制备依据权利要求1-4任一项的组合物的方法，包括将所述多肽和化学治疗剂混合，并回收所得组合物。
7.治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括施用癌症抑制量的、包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂的组合物。
8.治疗哺乳动物癌症的方法，所述方法包括施用癌症抑制量的、包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂以及可药用载体的组合物。
9.预防哺乳动物癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的、包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂的组合物。
10.预防哺乳动物癌症的方法，所述方法包括施用治疗有效量的、包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂以及可药用载体的组合物。
11.抑制哺乳动物中对包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂的组合物敏感的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将肿瘤细胞生长有效抑制量的所述组合物对遭受所述肿瘤细胞侵害的哺乳动物给药。
12.抑制哺乳动物中对包含依据权利要求1-4任一项的多肽和化学治疗剂以及可药用载体的组合物敏感的肿瘤细胞生长的方法，所述方法包括将肿瘤细胞生长有效抑制量的所述组合物对遭受所述肿瘤细胞侵害的哺乳动物给药。
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