CN104736183A

CN104736183A - B细胞淋巴瘤的治疗

Info

Publication number: CN104736183A
Application number: CN201280068504.6A
Authority: CN
Inventors: J.E.汤普森
Original assignee: Senesco Technologies Inc
Current assignee: Eloxx Pharmaceuticals Inc
Priority date: 2011-11-30
Filing date: 2012-11-30
Publication date: 2015-06-24
Also published as: KR20140113647A; JP2015500808A; EP2785380A2; EP2785380A4; US20140314704A1; CA2857747A1; WO2013082449A2; AU2012345707A1

Abstract

本发明涉及在需要治疗B细胞淋巴瘤的人对象中治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法向人对象施用组合在人对象中表达突变eIF-5A的表达载体的靶向人eIF-5A的siRNA。本申请还涉及在需要治疗多发性骨髓瘤的人对象中治疗多发性骨髓瘤的方法，所述方法向人对象施用靶向人eIF-5A的siRNA、在人对象中表达突变eIF-5A的表达载体以及硼替佐米或来那度胺。

Description

B细胞淋巴瘤的治疗

背景

本发明涉及通过操纵eIF-5A1表达治疗B细胞淋巴瘤的方法。先前已经讨论了包含靶向针对eIF-5A1基因来抑制对象中该基因的内源表达的siRNA，和编码能够在对象中表达的突变的eIF-5A1的多核苷酸的组合物用于治疗多发性骨髓瘤的用途(参见US 20100076062和20100004314)。

发明概述

本发明涉及通过组合表达质粒施用siRNA治疗B细胞淋巴瘤，所述siRNA阻断内源型eIF-5A1表达，所述表达质粒提供在对象中不能被羟丁赖氨酸化（hypusinated）的eIF-5A1的表达。

本发明进一步提供通过组合硼替佐米或来那度胺共施用siRNA和表达质粒治疗多发性骨髓瘤，所述siRNA阻断内源型eIF-5A1表达，所述表达质粒提供不能被羟丁赖氨酸化的eIF-5A1的表达。

附图简述

图1：具有DLBCL肿瘤的小鼠中的SNS01-T剂量反应曲线。

图2：具有DLBCL肿瘤的小鼠中的SNS01-T剂量反应曲线。

图3：具有DLBCL肿瘤的小鼠中的具有截短的eIF5A的SNS01-T的剂量反应曲线。

图4：施用SNS01-T后小鼠体重。

图5：具有套细胞淋巴瘤肿瘤的小鼠中的SNS01-T剂量反应曲线。

图6：组合来那度胺的套细胞淋巴瘤肿瘤的SNS01-T治疗。

图7：SNS01-T eIF-5A表达质粒(SEQ ID NO: 13)的图谱。

发明详述

本发明提供用于治疗B细胞淋巴瘤，例如，如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤的方法。在一些实施方案中，本发明包括选择患有B细胞淋巴瘤的患者用于本文所述的治疗方法。

本发明提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括施用包含下列的组合物：靶向针对eIF-5A1的3'端的eIF-5A1 siRNA的复合物，包含编码突变eIF5A1的多核苷酸的表达载体，其中所述突变eIF5A1不能被羟丁赖氨酸化，其中所述siRNA和表达载体被络合到聚乙烯亚胺以形成复合物。

本发明提供了包含靶向针对靶基因的siRNA，和编码能够在对象中表达的靶蛋白的多核苷酸的组合物用于治疗B细胞淋巴瘤的用途，所述siRNA抑制对象中靶基因的内源表达，在某些实施方案中，所述多核苷酸在RNAi抗性质粒中（不会被siRNA抑制）。

在某些实施方案中，所述siRNA靶向SEQ ID NO: 1中所示的eIF-5A1序列，并且编码突变eIF-5A1的多核苷酸是eIF-5A1_K50R。表达载体包含编码突变eIF5-A1的多核苷酸和可操作地连接的启动子以提供对象中的多核苷酸的表达。所述启动子优选是组织特异性的或普遍存在的。例如，如果所述组合物用于治疗B细胞淋巴瘤，则所述启动子对于癌症驻留其中的组织是组织特异性的。因此，该启动子可以对于其中B细胞正常被发现的组织，如骨髓和淋巴组织（如淋巴结和脾脏）是特异性的，或者可以对于其中B细胞正常不驻留但其中已形成B细胞肿瘤的组织，例如肺或位于隔膜中其它组织部位是特异性的。例如，对于治疗B细胞淋巴瘤，优选使用B细胞特异性启动子，例如B29。在某些实施方案中，所述表达载体包含pCpG质粒。

本发明还提供了治疗B细胞淋巴瘤的方法，所述方法使用编码截短形式的eIF-5A1的分离的多核苷酸以及截短的eIF-5A1多肽。所述截短的eIF-5A1多核苷酸在诱导细胞凋亡和杀死癌细胞中是有用的。截短的多核苷酸可以在表达载体内使用，其然后施用给哺乳动物。所述截短的eIF-5A形式在哺乳动物内表达并杀死癌细胞。相对于全长eIF-5A1蛋白，其为约17kDa，所述截短的eIF-5A1蛋白为约16kDa。

在某些实施方案中，所述截短的eIF-5A1多核苷酸包含SEQ ID NO: 9所述的序列或由其组成，并且氨基酸序列包含SEQ ID NO: 10或由其组成。在某些实施方案中，所述截短的eIF-5A1多核苷酸包含在质粒或表达载体内。质粒和表达载体在下文更详细地描述。在某些实施方案中，所述表达载体是腺病毒表达载体或是pHM6。在某些实施方案中，当所述组合物或药物用于治疗多发性骨髓瘤时，所述表达载体包含组织特异性启动子，例如B细胞特异性启动子（即，B29）。所述表达载体可以包含pCpG质粒。如下文更详细地讨论，所述表达载体可以络合到聚乙烯亚胺。

在某些实施方案中，所述eIF-5A1 siRNA和包含突变eIF-5A1 siRNA多核苷酸的表达载体独立地络合到聚乙烯亚胺，例如体外JET-PEI。在其它实施方案中，所述eIF-5A1 siRNA和包含突变eIF-5A1多核苷酸的表达载体一起络合到聚乙烯亚胺。

本发明进一步提供在需要其的对象中治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括施用包含靶向针对eIF-5A1基因3'端的eIF-5A1 siRNA和表达载体的组合物，所述表达载体包含编码突变eIF-5A1的多核苷酸，其中所述突变eIF-5A1不能被羟丁赖氨酸化。所述B细胞淋巴瘤可以是任何弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤。

包含本文所述siRNA和质粒的组合物可以经由任何适当的方式施用，包括，例如胃肠外、透皮，鼻内和经口。用于递送的适当的剂型包括但不限于静脉内或肌内施用。在一些实施方案中，所述剂型包含脂质体，而在其它情况下其包含纳米颗粒。在一些实施方案中，所述纳米颗粒是聚乙烯亚胺（PEI）纳米颗粒。

编码突变的eIF-5A1的多核苷酸优选突变为使得其不能被羟丁赖氨酸化并从而将不可用于驱动细胞进入存活模式。例如，在一个实施方案中，所述编码eIF-5A的多核苷酸突变为使得位置50的赖氨酸（K）（其正常被DHS羟丁赖氨酸化）变为丙氨酸（A）或精氨酸（其不能被羟丁赖氨酸化）。此突变体分别表示为K50A或K50R。

在另一个实施方案中，eIF-5A1中位置67的赖氨酸变为精氨酸（R）。此突变体表示为（K67R）。在另一个实施方案中，位置67的赖氨酸（K）变为丙氨酸（A）并表示为（K67A）。在另一个实施方案中，考虑了位置47的赖氨酸（K）变为精氨酸的突变体（K47R）。

在其它实施方案中，使用eIF-5A1的双突变。一个双突变是其中在位置50的赖氨酸（K）变为精氨酸（R）并且在位置67的赖氨酸（K）变为精氨酸（R）。此双突变称为K50R/K67R。此双突变类似地不能被羟丁赖氨酸化，但是氨基酸的变化不改变eIF-5A1的三维结构，与单突变（K50A）差不多。该双突变从而提供与野生型的3-D形状和折叠非常类似的蛋白，但因此比单突变更稳定。由于更稳定，其在体内存在更长时间以提供更长的治疗益处。因此，机体将具有对于正常细胞功能所需但不能被羟丁赖氨酸化的eIF-5A，从而细胞不被锁入细胞生存模式并逃脱细胞凋亡。

由于机体需要eIF-tAa用于正常细胞生存和健康的细胞增殖，优选用siRNA在对象中不完全关闭表达，例如当siRNA全身递送时。通过使用不完全消除表达（即，减少表达但不完全关闭表达）的siRNA或可选地利用给药和/或治疗方案以平衡表达水平均可以实现eIF-5A表达的控制，以允许健康细胞正常生长和发挥功能并且迫使癌细胞发生细胞凋亡。

可选地，可以利用siRNA的局部递送。如果siRNA局部递送到癌细胞或肿瘤，则表达优选被敲除。通过敲除表达，周围没有可以被羟丁赖氨酸化的eIF-5A1并且从而没有羟丁赖氨酸化的eIF-A1来将细胞锁入生存模式。由于siRNA局部递送到癌症或肿瘤，不需要具有可用于正常细胞生长的eIF-5A。

在某些实施方案中，所述siRNA基本上由SEQ ID NO: 5和6中显示的siRNA构建体组成。例如，所述siRNA包含靶向针对eIF-5A1的核酸还包含突出，例如U或T核酸，或者还包含标签，例如his标签（经常称为HA标签，其经常用于体外研究）。在5'或3'端连接（或甚至在核酸的连续串内）的分子或额外的核酸可以被包括或落入本发明的范围，只要所述siRNA构建体能够减少靶基因的表达。优选siRNA靶向eIF-5A1基因的区域，以便不影响外源多核苷酸的表达。例如所述eIF-5A1 siRNA靶向3'UTR或3'端。在SEQ ID NO: 5和6中显示的siRNA是示例性的eIF-5A1 siRNA。

在一些实施方案中，突变编码eIF-5A1的多核苷酸以编码eIF5A1变体。突变的eIF-5A1设计以使得变体eIF-5A1不能被翻译后修饰（即，不能被羟丁赖氨酸化）。示例性突变在上文讨论。

本发明的方法还涵盖编码eIF-5A2同种型（GenBank登录号NM 020390）的多核苷酸的施用。当表达时，eIF-5A2同种型诱导癌细胞中的细胞凋亡（参见US 20070154457）。本发明从而提供用于治疗B细胞淋巴瘤的方法，例如，如弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤，通过施用造成癌细胞中eIF-5A2同种型表达的多核苷酸，由此诱导细胞凋亡。所述eIF-5A2多核苷酸可以在质粒、载体，例如腺病毒载体或任何适当的表达载体中递送。

在另一方面，本发明提供了治疗对象（例如人）中B细胞淋巴瘤或多发性骨髓瘤的方法，通过施用治疗有效量的靶向针对内源eIF-5A1基因的siRNA以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达，和向诊断有多发性骨髓瘤的对象组合硼替佐米（VELCADE）递送如本文所述的编码eIF-5A1蛋白或其部分的多核苷酸。在某些实施方案中，所述硼替佐米的治疗有效量范围从0.5 mg/m²至3 mg/m²。在某些实施方案中，硼替佐米的治疗有效量是约1.3 mg/m²。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5A1基因以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5A1蛋白或其部分的多核苷酸的递送的量的治疗有效量如本文所述。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5A1基因以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5A1蛋白或其部分的多核苷酸的递送每周施用两次或三次，并且硼替佐米每周施用两次。在一些实施方案中，本发明涵盖选择患有多发性骨髓瘤并早已接受硼替佐米治疗的患者用于本文所述的治疗方法。

在另一方面，本发明提供了治疗对象（例如人）中多发性骨髓瘤的方法，通过施用治疗有效量的靶向针对内源eIF-5A1基因的siRNA以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达，和向诊断有多发性骨髓瘤的对象组合来那度胺(REVLIMID)递送如本文所述的编码eIF-5A1蛋白的多核苷酸。在某些实施方案中，所述来那度胺的治疗有效量范围从每天5 mg至30 mg。在某些实施方案中，来那度胺的治疗有效量是约每天25 mg。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5A1基因以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5A1蛋白的多核苷酸的递送的量的治疗有效量是0.1 mg/kg至0.5 mg/kg。在某些实施方案中，靶向针对内源eIF-5A1基因以敲除或敲低对象中内源eIF-5A1基因的表达的siRNA的量，和编码eIF-5A1蛋白或其部分的多核苷酸的递送每周施用两次或三次，并且来那度胺至多每周施用五次。在一些实施方案中，本发明涵盖选择患有多发性骨髓瘤并早已接受来那度胺治疗的患者用于本文所述的治疗方法。

实施例

实施例1：SNS01-T 组合物

用于突变体eIF-5A1_K50R 表达的质粒(pExp5A)如图7中所述(SEQ ID NO: 13)。具有减少的CpG二核苷酸的表达质粒设计以驱动人eIF5A1^K50R (SEQ ID NO: 14)主要在B细胞谱系的细胞中表达。所述载体衍生自pCpG-LacZ，完全缺乏CpG二核苷酸的质粒。对于在大肠杆菌中复制和选择所需的所有元件都不含CpG二核苷酸。来自CpG-LacZ载体的最初的CMV增强子/启动子和LacZ基因已分别用人最小B细胞特异性启动子（B29/CD79b, Invivogen）和人eIF5A1K50R替换，以驱动eIF5A1K50R的B细胞特异性表达。B29 DHS4.4 3’增强子已被导入eIF5A1表达盒的质粒下游以增强B29启动子的活性并减少非B细胞中的表达（Malone (2006) J. Mol. Biol. 362: 173-183）。B29最小启动子、eIF5A1K50R和B29 DHS4.4 3’增强子的掺入已将32个CpG二核苷酸导入载体。

靶向人eIF-5A1的siRNA：eIF5A1 siRNA 靶 #1 (所述siRNA靶向人eIF5A1的该区域：5’-AAGCTGGACTCCTCCTACACA-3’ (SEQ ID NO: 1)。所述siRNA序列经常在本文中称为h5A1并且显示在SEQ ID NO: 5和6中。eIF5A1 siRNA 靶 #2 eIF5A1 (此siRNA靶向人eIF5A1的该区域： 5’-AAAGGAATGACTTCCAGCTGA-3’ (SEQ ID NO: 2)。（所述siRNA序列经常在本文中称为ash5A1-ALT）。对照siRNA显示在SEQ ID NO: 3和4中。

对于在微量离心管中制备1mL SNS01-T，向无菌Eppendorf管中添加21.8 μL 2.3 mg/mL 的pExp5A。向包含pDNA的Eppendorf管中添加25 μL 的 siRNA。用移液器吸头通过上下缓慢吸打5次轻轻混合。向DNA/siRNA混合物添加203μL11.3mM的Tris-HCl pH7.4。用移液器吸头通过上下缓慢吸打5次轻轻混合。添加250μ1 10％的葡萄糖。用移液器吸头通过上下缓慢吸打10-12次轻轻混合。将管放到一边，并继续下一个步骤。向分开的无菌Eppendorf管中添加9 μL的invivo-jetPEI。向包含invivo-jetPEI的Eppendorf管中添加241μL 11.3mM的Tris-HCl pH7.4。用移液器吸头通过上下缓慢吸打5次轻轻混合。向invivo-jetPEI/tris混合物添加250μ1 10％的葡萄糖。用移液器吸头通过上下缓慢吸打10-12次轻轻混合。使用设置1000μL体积的P1000，从包含来自步骤A的DNA/siRNA/tris/葡萄糖混合物的管将整个体积转移到包含来自步骤B的PEI/tris/葡萄糖混合物的管。用移液器吸头通过上下缓慢吸打10-12次轻轻混合。在室温下将管放在一边，并允许最少30分钟以使纳米颗粒在使用前形成。

实施例2：DLBCL研究设计

3-4周龄的雌性CB17-SCID小鼠皮下接种1.2 × 10⁷弥漫性大细胞B细胞淋巴瘤SU-DHL6细胞。不启动下文所述治疗方案，直到肿瘤已经达到50 mm³，此时治疗施用每周2或3次至多6周。

实施例3：DLBCL中的SNS01-T剂量反应

SNS01-T剂量反应在每周两次相对每周三次给药没有观察到差异（参见图1-2）。治疗结束（第38天）后肿瘤生长增加。对pEXp5A替换截短的eIF5A质粒（参见图3）不改善反应，但是针对DLBCL肿瘤仍然有活性（注意：来自此组的一只小鼠被治愈）。没有观察到对于小鼠体重的影响。用SNS01-T治疗的DLBCL小鼠的中位生存率如下所述。

实施例4：套细胞淋巴瘤研究设计

3-4周龄的雌性CB17-SCID小鼠皮下接种2.5 × 10⁶套细胞淋巴瘤MCL-JMV-2细胞。不启动下文所述治疗方案，直到肿瘤已经达到50 mm³，此时治疗施用每周2或3次（对于来那度胺为5次）至多3周。

实施例5：套细胞淋巴瘤中的SNS01

SNS01-T剂量反应展示肿瘤大小的依赖性减少（参见图5）。SNS01-T和来那度胺组合药物治疗比单一疗法在控制套细胞淋巴瘤异种移植物肿瘤生长方面更有效（图6）。SCID小鼠在右侧植入0.25 × 10⁶ JVM-2 MCL细胞。当肿瘤达到50 mm³的平均大小时开始治疗。小鼠每周治疗两次（注射之间3-4天），用0.375 mg/kg的对照纳米颗粒或SNS01-T。接受来那度胺（LEN）治疗的小鼠每周接受5次15 mg/kg的腹膜内注射。肿瘤尺寸每周测量2-3次。治疗继续51天。所示数据为平均肿瘤体积±标准误差（* p < 0.05，** p < 0.01，*** p < 0.001，相比对照组）。

实施例6：用SNS01-T与来那度胺或硼替佐米的多发性骨髓瘤治疗

组合SNS01-T与其它批准的多发性骨髓瘤药物例如来那度胺或硼替佐米具有额外的益处。我们已经证明这些药物当与SNS01-T组合使用时至多约40倍更有效地发挥作用。

	IC₅₀	与IC₂₀ SNS01-T的IC₅₀
			细胞系	硼替佐米，nM	硼替佐米，nM
KAS-6/1	7.31	2.64 (少~2.8×)
			U266	2.86	0.83 (少~3.4×)
RPMI-8226	2.12	1.51 (少~1.4×)
				来那度胺，μM	来那度胺，μM
KAS-6/1	69.78	2.37 (少~29×)
			U266	62.05	1.42 (少~43.7×)
RPMI-8226	84.94	3.28 (少~25.9×)

序列表

<110> Senesco Technologies, Inc.

THOMPSON, John E

<120> B细胞淋巴瘤的治疗

<130> 061945-5034-WO

<150> US 61/565,418

<151> 2011-11-30

<160> 14

<170> PatentIn 版本 3.5

<210> 1

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 1

aagctggact cctcctacac a 21

<210> 2

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 2

aaaggaatga cttccagctg a 21

<210> 3

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 3

acacauccuc cucaggucgt t 21

<210> 4

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 4

cgaccugagg aggaugugut t 21

<210> 5

<211> 21

<212> DNA

<213> 智人

<400> 5

gcuggacucc uccuacacat t 21

<210> 6

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 合成的寡核苷酸

<400> 6

uguguaggag gaguccagct t 21

<210> 7

<211> 1309

<212> DNA

<213> 智人

<220>

<221> CDS

<222> (122)..(586)

<400> 7

ggcacgaggg tagaggcggc ggcggcggcg gcagcgggct cggaggcagc ggttgggctc 60

gcggcgagcg gacggggtcg agtcagtgcg ttcgcgcgag ttggaatcga agcctcttaa 120

a atg gca gat gac ttg gac ttc gag aca gga gat gca ggg gcc tca gcc 169

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

1 5 10 15

acc ttc cca atg cag tgc tca gca tta cgt aag aat ggc ttt gtg gtg 217

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

20 25 30

ctc aaa ggc cgg cca tgt aag atc gtc gag atg tct act tcg aag act 265

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

35 40 45

ggc aag cac ggc cac gcc aag gtc cat ctg gtt ggt att gac atc ttt 313

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

50 55 60

act ggg aag aaa tat gaa gat atc tgc ccg tca act cat aat atg gat 361

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

65 70 75 80

gtc ccc aac atc aaa agg aat gac ttc cag ctg att ggc atc cag gat 409

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

85 90 95

ggg tac cta tca ctg ctc cag gac agc ggg gag gta cga gag gac ctt 457

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

100 105 110

cgt ctc cct gag gga gac ctt ggc aag gag att gag cag aag tac gac 505

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

115 120 125

tgt gga gaa gag atc ctg atc acg gtg ctg tct gcc atg aca gag gag 553

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

130 135 140

gca gct gtt gca atc aag gcc atg gca aaa taa ctggctccca ggatggcggt 606

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145 150

ggtggcagca gtgatcctct gaacctgcag aggccccctc cccgagcctg gcctggctct 666

ggcccggtcc taagctggac tcctcctaca caatttattt gacgttttat tttggttttc 726

cccaccccct caatctgtcg gggagcccct gcccttcacc tagctccctt ggccaggagc 786

gagcgaagct gtggccttgg tgaagctgcc ctcctcttct cccctcacac tacagccctg 846

gtgggggaga agggggtggg tgctgcttgt ggtttagtct tttttttttt tttttttttt 906

ttttaaattc aatctggaat cagaaagcgg tggattctgg caaatggtcc ttgtgccctc 966

cccactcatc cctggtctgg tcccctgttg cccatagccc tttaccctga gcaccacccc 1026

aacagactgg ggaccagccc cctcgcctgc ctgtgtctct ccccaaaccc ctttagatgg 1086

ggagggaaga ggaggagagg ggaggggacc tgccccctcc tcaggcatct gggagggccc 1146

tgcccccatg ggctttaccc ttccctgcgg gctctctccc cgacacattt gttaaaatca 1206

aacctgaata aaactacaag tttaatatga aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 1266

aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa aaa 1309

<210> 8

<211> 154

<212> PRT

<213> 智人

<400> 8

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

1 5 10 15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

35 40 45

Gly Lys His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

65 70 75 80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

115 120 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

130 135 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145 150

<210> 9

<211> 447

<212> DNA

<213> 智人

<400> 9

ttcgagacag gagatgcagg ggcctcagcc accttcccaa tgcagtgctc agcattacgt 60

aagaatggct ttgtggtgct caaaggccgg ccatgtaaga tcgtcgagat gtctacttcg 120

aagactggca agcacggcca cgccaaggtc catctggttg gtattgacat ctttactggg 180

aagaaatatg aagatatctg cccgtcaact cataatatgg atgtccccaa catcaaaagg 240

aatgacttcc agctgattgg catccaggat gggtacctat cactgctcca ggacagcggg 300

gaggtacgag aggaccttcg tctccctgag ggagaccttg gcaaggagat tgagcagaag 360

tacgactgtg gagaagagat cctgatcacg gtgctgtctg ccatgacaga ggaggcagct 420

gttgcaatca aggccatggc aaaataa 447

<210> 10

<211> 148

<212> PRT

<213> 智人

<400> 10

Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala Thr Phe Pro Met Gln Cys

1 5 10 15

Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val Leu Lys Gly Arg Pro Cys

20 25 30

Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr Gly Lys His Gly His Ala

35 40 45

Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe Thr Gly Lys Lys Tyr Glu

50 55 60

Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp Val Pro Asn Ile Lys Arg

65 70 75 80

Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp Gly Tyr Leu Ser Leu Leu

85 90 95

Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu Arg Leu Pro Glu Gly Asp

100 105 110

Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp Cys Gly Glu Glu Ile Leu

115 120 125

Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu Ala Ala Val Ala Ile Lys

130 135 140

Ala Met Ala Lys

145

<210> 11

<211> 19

<212> DNA

<213> 智人

<400> 11

gctggactcc tcctacaca 19

<210> 12

<211> 19

<212> RNA

<213> 智人

<400> 12

gcuggacucc uccuacaca 19

<210> 13

<211> 3370

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<223> 质粒 pExp5A

<400> 13

ttaattaaaa ttatctctaa ggcatgtgaa ctggctgtct tggttttcat ctgtacttca 60

tctgctacct ctgtgacctg aaacatattt ataattccat taagctgtgc atatgataga 120

tttatcatat gtattttcct taaaggattt ttgtaagaac taattgaatt gatacctgta 180

aagtctttat cacactaccc aataaataat aaatctcttt gttcagctct ctgtttctat 240

aaatatgtac aagttttatt gtttttagtg gtagtgattt tattctcttt ctatatatat 300

acacacacat gtgtgcattc ataaatatat acaattttta tgaataaaaa attattagca 360

atcaatattg aaaaccactg atttttgttt atgtgagcaa acagcagatt aaaaggaatt 420

ctcgagtcat cgatactagt gcgaccgcca aaccttagcg gcccagctga caaaagcctg 480

ccctccccca gggtccccgg agagctggtg cctcccctgg gtcccaattt gcatggcagg 540

aaggggcctg gtgaggaaga ggcggggagg ggacaggctg cagccggtgc agttacacgt 600

tttcctccaa ggagcctcgg acgttgtcaa gcttctgcct tctccctcct gtgagtttgg 660

taagtcactg actgtctatg cctgggaaag ggtgggcagg agatggggca gtgcaggaaa 720

agtggcacta tgaaccctgc agccctagga atgcatctag acaattgtac taaccttctt 780

ctctttcctc tcctgacagg ttggtgtaca gtagcttcca ccatggcaga tgatttggac 840

ttcgagacag gagatgcagg ggcctcagcc accttcccaa tgcagtgctc agcattacgt 900

aagaatggtt ttgtggtgct caagggccgg ccatgtaaga tcgtcgagat gtctacttcg 960

aagactggca ggcatggcca tgccaaggtc catctggttg gtattgatat ttttactggg 1020

aagaaatatg aagatatctg cccgtcgact cataacatgg atgtccccaa catcaaaagg 1080

aatgatttcc agctgattgg catccaggat gggtacctat ccctgctcca ggacagtggg 1140

gaggtacgag aggaccttcg tctgcctgag ggagaccttg gcaaggagat tgagcagaag 1200

tatgactgtg gagaagagat cctgatcaca gtgctgtccg ccatgacaga ggaggcagct 1260

gttgcaatca aggcgatggc aaaataactg gctagctggc cagacatgat aagatacatt 1320

gatgagtttg gacaaaccac aactagaatg cagtgaaaaa aatgctttat ttgtgaaatt 1380

tgtgatgcta ttgctttatt tgtaaccatt ataagctgca ataaacaagt taacaacaac 1440

aattgcattc attttatgtt tcaggttcag ggggaggtgt gggaggtttt ttaaagcaag 1500

taaaacctct acaaatgtgg tatggcggcc gcaccaccct gggccaggct gggccaagcc 1560

aggcggcccc tgtgttttcc ccagtctctg ggctgctgga gggaaccagg ttgttttggc 1620

atcagcctct actgagccgg agcccttcct ttcctgctgc tttgcatagt ggcactaatt 1680

ccgtcctcct acctccacca gggacctagg cagccgggta gatggtggga ggaggcttca 1740

cttctccccc aagcagggtc tccacctgct tgaggctgcc ctgggttggg ggaggccttg 1800

gctttaccta aagacttttt aacacctcta cgcgtaattc agtcaatatg ttcaccccaa 1860

aaaagctgtt tgttaacttg ccaacctcat tctaaaatgt atatagaagc ccaaaagaca 1920

ataacaaaaa tattcttgta gaacaaaatg ggaaagaatg ttccactaaa tatcaagatt 1980

tagagcaaag catgagatgt gtggggatag acagtgaggc tgataaaata gagtagagct 2040

cagaaacaga cccattgata tatgtaagtg acctatgaaa aaaatatggc attttacaat 2100

gggaaaatga tgatcttttt cttttttaga aaaacaggga aatatattta tatgtaaaaa 2160

ataaaaggga acccatatgt cataccatac acacaaaaaa attccagtga attataagtc 2220

taaatggaga aggcaaaact ttaaatcttt tagaaaataa tatagaagca tgccatcaag 2280

acttcagtgt agagaaaaat ttcttatgac tcaaagtcct aaccacaaag aaaagattgt 2340

taattagatt gcatgaatat taagacttat ttttaaaatt aaaaaaccat taagaaaagt 2400

caggccatag aatgacagaa aatatttgca acaccccagt aaagagaatt gtaatatgca 2460

gattataaaa agaagtctta caaatcagta aaaaataaaa ctagacaaaa atttgaacag 2520

atgaaagaga aactctaaat aatcattaca catgagaaac tcaatctcag aaatcagaga 2580

actatcattg catatacact aaattagaga aatattaaaa ggctaagtaa catctgtggc 2640

ttaattaaaa caggtagttg acaattaaac attggcatag tatatctgca tagtataata 2700

caactcacta taggagggcc atcatggcca agttgaccag tgctgtccca gtgctcacag 2760

ccagggatgt ggctggagct gttgagttct ggactgacag gttggggttc tccagagatt 2820

ttgtggagga tgactttgca ggtgtggtca gagatgatgt caccctgttc atctcagcag 2880

tccaggacca ggtggtgcct gacaacaccc tggcttgggt gtgggtgaga ggactggatg 2940

agctgtatgc tgagtggagt gaggtggtct ccaccaactt cagggatgcc agtggccctg 3000

ccatgacaga gattggagag cagccctggg ggagagagtt tgccctgaga gacccagcag 3060

gcaactgtgt gcactttgtg gcagaggagc aggactgagg ataacctagg aaaccttaaa 3120

acctttaaaa gccttatata ttcttttttt tcttataaaa cttaaaacct tagaggctat 3180

ttaagttgct gatttatatt aattttattg ttcaaacatg agagcttagt acatgaaaca 3240

tgagagctta gtacattagc catgagagct tagtacatta gccatgaggg tttagttcat 3300

taaacatgag agcttagtac attaaacatg agagcttagt acatactatc aacaggttga 3360

actgctgatc 3370

<210> 14

<211> 154

<212> PRT

<213> 人工序列

<220>

<223> eIF5A1K50R的氨基酸序列

<400> 14

Met Ala Asp Asp Leu Asp Phe Glu Thr Gly Asp Ala Gly Ala Ser Ala

1 5 10 15

Thr Phe Pro Met Gln Cys Ser Ala Leu Arg Lys Asn Gly Phe Val Val

20 25 30

Leu Lys Gly Arg Pro Cys Lys Ile Val Glu Met Ser Thr Ser Lys Thr

35 40 45

Gly Arg His Gly His Ala Lys Val His Leu Val Gly Ile Asp Ile Phe

50 55 60

Thr Gly Lys Lys Tyr Glu Asp Ile Cys Pro Ser Thr His Asn Met Asp

65 70 75 80

Val Pro Asn Ile Lys Arg Asn Asp Phe Gln Leu Ile Gly Ile Gln Asp

85 90 95

Gly Tyr Leu Ser Leu Leu Gln Asp Ser Gly Glu Val Arg Glu Asp Leu

100 105 110

Arg Leu Pro Glu Gly Asp Leu Gly Lys Glu Ile Glu Gln Lys Tyr Asp

115 120 125

Cys Gly Glu Glu Ile Leu Ile Thr Val Leu Ser Ala Met Thr Glu Glu

130 135 140

Ala Ala Val Ala Ile Lys Ala Met Ala Lys

145 150

Claims

1.在需要治疗B细胞淋巴瘤的人对象中治疗B细胞淋巴瘤的方法，其包括施用：

（a）包含编码在SEQ ID NO: 8的残基50包含突变的突变真核起始因子5A1（eIF-5A1）的多核苷酸的表达载体；和

（b）一定量的小干扰RNA（siRNA），其中所述siRNA的多核苷酸序列将干扰内源eIF-5A而非突变的eIF-5A的表达。

2.任一前述权利要求的方法，其中所述表达载体和siRNA连接到聚乙烯亚胺（PEI）纳米颗粒上。

3.前述权利要求任一项的方法，其中PEI纳米颗粒静脉内施用。

4.前述权利要求任一项的方法，其中siRNA的链之一包含5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’ 的多核苷酸序列，并且所述siRNA的相对链包含3’-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列。

5.前述权利要求任一项的方法，其中siRNA的链之一由5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’ 的多核苷酸序列组成，并且所述siRNA的相对链由3’-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列组成。

6.前述权利要求任一项的方法，其中所述B细胞淋巴瘤选自弥漫性大B细胞淋巴瘤（DLBCL）、慢性淋巴细胞性白血病（CLL）、套细胞淋巴瘤和滤泡型淋巴瘤。

7.前述权利要求任一项的方法，其中siRNA的链之一包含5’-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’的多核苷酸序列，并且所述siRNA的相对链包含3’-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列。

8.前述权利要求任一项的方法，其中siRNA的链之一由5’-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’的多核苷酸序列组成，并且所述siRNA的相对链由3’-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列组成。

9.前述权利要求任一项的方法，其中在SEQ ID NO: 8的K50的替换是K50R。

10.前述权利要求任一项的方法，其中编码包含残基50的替换的突变eIF-5A1的多核苷酸包含SEQ ID NO: 13的核苷酸827-1287。

11.前述权利要求任一项的方法，其中编码包含残基50的替换的突变eIF-5A1的多核苷酸由SEQ ID NO: 13的核苷酸827-1287组成。

12.前述权利要求任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含在B细胞中有活性的启动子，其中所述启动子控制在B细胞中包含SEQ ID NO: 8的残基50的替换的突变eIF-5A1的表达。

13.前述权利要求任一项的方法，其进一步包括对人对象施用硼替佐米或来那度胺。

14.在需要治疗多发性骨髓瘤的人对象中治疗多发性骨髓瘤的方法，其包括施用：

（a）包含编码在SEQ ID NO: 8的残基50包含突变的突变真核起始因子5A1（eIF-5A1）的多核苷酸的表达载体；

（b）一定量的小干扰RNA（siRNA），其中所述siRNA的多核苷酸序列将干扰内源eIF-5A而非突变的eIF-5A的表达；和

（c）选自硼替佐米或来那度胺的试剂。

15.权利要求14的方法，其中所述表达载体和siRNA连接到PEI纳米颗粒上。

16.权利要求14-15任一项的方法，其中PEI纳米颗粒静脉内施用。

17.权利要求14-16任一项的方法，其中siRNA的链之一包含5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’ 的多核苷酸序列，并且所述siRNA的相对链包含3’-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列。

18.权利要求14-17任一项的方法，其中siRNA的链之一由5’-GCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’ 的多核苷酸序列组成，并且所述siRNA的相对链由3’-dTdTCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列组成。

19.权利要求14-18任一项的方法，其中siRNA的链之一包含5’-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’的多核苷酸序列，并且所述siRNA的相对链包含3’-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列。

20.权利要求14-19任一项的方法，其中siRNA的链之一由5’-AAGCUGGACUCCUCCUACACAdTdT-3’的多核苷酸序列组成，并且所述siRNA的相对链由3’-dTdTUUCGACCUGAGGAGGAUGUGU-5’的多核苷酸序列组成。

21.权利要求14-20任一项的方法，其中SEQ ID NO: 8的K50的替换是K50R。

22.权利要求14-21任一项的方法，其中编码包含残基50的替换的突变eIF-5A1的多核苷酸包含SEQ ID NO: 13的核苷酸827-1287。

23.权利要求14-22任一项的方法，其中编码包含残基50的替换的突变eIF-5A1的多核苷酸由SEQ ID NO: 13的核苷酸827-1287组成。

24.权利要求14-23任一项的方法，其中所述表达载体进一步包含在B细胞中有活性的启动子，其中所述启动子控制在B细胞中包含SEQ ID NO: 8的残基50的替换的突变eIF-5A1的表达。