CN1106846C - 抗癌症剂 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种能抑制癌细胞和其周围组织或非病变部分的组织中癌症生长的药剂。一种含有甘露聚糖结合蛋白或其基因作为有效成分的抗癌症剂。甘露聚糖结合蛋白的例子有：一种具有序列表中序列1所示氨基酸序列的蛋白质，一种在其氨基酸序列中具有一个或多个至少被取代、缺失、添加或插入的氨基酸，并具有如甘露聚糖结合蛋白质活性的蛋白质。基因的例子有编码如序列表中序列1或序列2所述氨基酸序列或修饰氨基酸的基因，或含有所述基因的基因。

Description

抗癌症剂
技术领域
本发明涉及用于药物领域的药剂，其在肿瘤细胞和其周围组织或非病变部分的组织中使特定蛋白质浓度得到提高，籍此抑制肿瘤的生长。
现有技术
近年来，虽然对于癌症的治疗方法如用于癌症的化疗已有了显著进展，肿瘤以其作为遍及全球的死亡原因仍然是重要的一种疾病。因此，一直对用于癌症的新颖、切实有效的治疗方法有强烈的需求。
除了免疫球蛋白如血液族识别抗体之外，在动物组织和体液中存在一族通常称为“动物凝集素”的功能性蛋白质，其为可识别糖的蛋白质。
在对动物凝集素的研究过程中，本发明人从哺乳动物肝脏和血清中发现了以钙离子依赖方式结合甘露糖(Man)或N-乙酰葡糖胺(GlcNAc)的C型凝集素，称为“甘露聚糖结合蛋白(MBP)[生物化学与生物物理学研究通讯(Biochemical and Biophysical Research Communications)，81(1)，1018-1024(1978)；生物化学与生物物理学研究通讯，95(2)，658-664(1980)；等]。
业已从人肝脏和血清成功获得了MBP及其基因[生物化学杂志(Journal of Biochemistry)，115(6)，1148-1154(1994)]。顺便说明，甘露糖结合蛋白有时称为“甘露糖结合蛋白”或“甘露聚糖结合凝集素”。
在研究MBP的结构和功能的过程中，本发明人明确了血清MBP活化补体系统是通过经典途径或凝集素途径，不需要依赖作为补体成员的抗体或Clq。也已知血清MBP显示出直接的生物防御作用。例如，已知感染的抑制是MBP与人免疫缺陷病毒的包膜糖蛋白上寡甘露糖型糖链结合的结果，或是MBP促进通过吞噬细胞去除酵母或特定类型的革兰氏阴性细菌的结果。
然而，目前对于MBP对癌症组织或癌细胞的作用尚一点也不知晓。
本发明解决的问题
本发明的目的是提供一种药剂，其可抑制癌细胞和其周围组织或非病变部分的组织中癌症的生长。
解决问题的方法
为了达到上述目标，本发明人对MBP的结构与功能进行了多种研究，出人意料地发现在施用编码MBP基因的和未施用编码MBP基因的带有肿瘤的动物之间，施用编码MBP基因的带有肿瘤的动物中癌细胞的生长能力明显受到抑制，籍此完成了本发明。
总之，本发明涉及一种抗癌症剂，其特征在于具有甘露聚糖结合蛋白或其基因作为有效成分。
附图简述
图1.显示疫苗病毒载体pBSF2-16的限制性酶谱。
图2.显示MBP表达质粒pBSF2-16/MBP。
图3.显示体内评价抗癌症作用的实验结果。
实施本发明的最佳方案
如下更具体地描述本发明。
本说明书中，术语MBP不仅是指其天然形式，也涵盖了天然形式的氨基酸序列中被通过例如氨基酸残基取代、缺失、添加或插入修饰的任何蛋白质，只要该蛋白仍然显示MBP的活性。此处所述天然类型的MBP的例子是那些衍生自人和兔的MBP，虽然本发明不限于此，但涵盖了那些衍生自其他生物，如动物和植物的以及衍生自微生物如细菌、酵母、放线菌、丝状真菌、子囊菌和担子菌的MBP。
本说明书中，对编码MBP的基因无特别限制，只要该基因编码MBP，且该蛋白质具有如上述MBP活性。因此，本发明涵盖了编码具有MBP活性的蛋白质的基因，即使所述基因经过用于遗传工程的修饰，如取代、缺失、添加和插入。
通过将MBP导入癌细胞和其周围组织或非病变部分的组织中实现本发明的目的。导入MBP时，可通过向癌细胞直接施用的方法如可保持MBP活性的显微注射方法或通过可保持MBP活性的皮下施用法或静脉施用法，将其导入癌细胞。此外，可通过例如利用病毒等向癌细胞导入编码MBP的基因，或通过皮下施用法等向癌细胞导入编码MBP的基因，籍此表达MBP。
因此，当使用本发明的药剂时，可向癌细胞和其周围组织或非病变部分的组织中导入MBP或编码MBP的基因，籍此抑制癌症的生长。
MBP或编码MBP的基因可直接注射入组织表面的疾病部分或其周围组织。也可直接注射入组织内部的疾病部分或其周围组织，还可使用药物传递系统(DDS)。可使用任何DDS，只要该系统特异于癌细胞，例如，其可选自利用癌细胞受体、癌症特异性抗体等的常用系统。也可利用特异于周围组织的器官或细胞的配体或受体，籍此，将MBP特异性地导入那些器官中。顺便说明，通过传统手术方法切除癌症组织，随后向非癌性部分施用本发明的药剂也是抑制微小癌症生长非常有效的方法。
对于本发明的MBP或编码所述MBP的基因为其中有效成分的药剂，当将其向癌细胞和其周围组织或非病变部分施用时，无须说明，所述药剂应当以该药剂最有效的方式施用。本发明的抗癌症剂含有药学可接受范围的MBP或编码MBP的基因，且可用如普通基因疗法相同的方法制成药物制剂或含蛋白质的药剂。制剂之中可包括载体、赋形剂、稳定剂、增稠剂等。
用作抗癌症剂的本发明的MBP或编码所述MBP的基因的剂量可依其剂型、使用方法以及患者的年龄、体重、疾病进程等决定并适当调整。例如，对于蛋白质，成人每次施用的剂量为0.01μg-1g/kg。当使用表达蛋白质的重组病毒时，成人每次施用的剂量为1×102-1×1012PFU(噬斑形成单位)。无须赘述，剂量可依不同条件加以改变，因此，有时低于上述剂量的剂量就足够了，有时需要高于上述剂量的剂量。本发明的抗癌症剂中包含的MBP或编码MBP的基因是见于体内的物质，无毒性。
就用于本发明的MBP而言，其详细的蛋白质化学性质业已确定，例如，其可通过如下表1的步骤根据Kawasaki(川崎)等人的方法[生物化学杂志Journal of Biochemistry，94(3)，937-947(1983)]从人血清中制备。
表1
    步骤     比活性(单位/蛋白质(μg))     产率(％)
    1.血清     0.009     100
    2.Sepharose 4B-甘露聚糖1     19.7     4.5
    3.Sepharose 4B-甘露聚糖2     70.9     51.5
    4.Sepharose 4B-甘露聚糖3     79.5     43.6
    5.Sepharose CL-6B     160.6     29.6
MBP的结合活性可根据生物化学杂志(Journal of Bochemistry)，94(3)，937-947(1983)所述方法，用125I标记的甘露聚糖(125I-甘露聚糖)测定。MBP的比活性用结合的125I-甘露聚糖(ng)/蛋白质重量(μg)表示。利用牛血清白蛋白作为标准物以Lowry法测定蛋白质的量。
编码MBP的基因可例如，根据Kurata(仓田)等人，生物化学杂志(Journal of Bochemistry)，115(6)，1148-1154(1994)的方法获自人肝脏cDNA文库。
由所述方法获得的人MBP成熟蛋白质的氨基酸序列示于序列表中的序列号1，编码其的基因的核苷酸序列示于序列表中的序列号2。
当所述基因或其片断用作探针时，可制备能与所述基因杂交且编码具有MBP活性的蛋白质的基因。此外，当由所述基因或其片段设计引物并用所述引物进行PCR时，也可制备编码具有MBP活性的蛋白质的基因。
杂交的举例如下所述：制备其上固定了获自生物、微生物等的基因组DNA或cDNA文库的尼龙膜，65℃下于预杂交溶液中封闭。预杂交溶液中含有0.5％SDS，5X Denhardt溶液[含0.1％牛血清白蛋白(BSA)，0.1％聚乙烯吡咯烷酮和0.1％Ficoll400]，100μg鲑精DNA和6×SSC(1×SSC含0.15M NaCl和0.015M柠檬酸钠；pH7.0)。然后，加入各个用32P标记的探针，随后于65℃温育4小时至过夜。室温下用6×SSC洗涤尼龙膜10分钟，45℃下用0.1％SDS洗30分钟，通过放射自显影检测与探针杂交的DNA。顺便说明，通过不同条件(如洗涤)可制备具有不同同源性的基因。
当通过基因工程方法(如取代、缺失、添加和插入)对由序列表中序列2所示基因修饰处理时，也可以制备能与由序列表中序列2所示基因杂交且编码具有MBP活性的蛋白质的基因。
用于进行修饰的实用方法的例子如下：利用琥珀修饰的方法[缺口双链法；参见核酸研究(Nucleic Acids Research)，12(24)，9441-9456(1984)]，利用限制性酶切位点的方法[分析生物化学(AnalyticalBiochemistry)，200，81-88(1992)；基因(Gene)，102，67-70(1991)]，利用dut(dUTP酶)和ung(尿嘧啶DNA转葡糖基酶)修饰的方法[Kunkel方法，参见美国国家科学院院报(Proceedings of the National Academyof Sciences of the U.S.A.)，82，488-492(1985)]，用DNA聚合酶和DNA连接酶进行琥珀修饰的方法[寡核苷酸导引的双重琥珀(ODA)法；参见基因(Gene)，152，271-275(1995)]和利用两类引物的PCR方法，其中引物用于导入添加限制性酶识别位点的修饰(美国专利5,512,463)。
也可使用下列市售试剂盒，如利用缺口双链法的Mutan-G(由宝酒造制造)，利用Kunkel方法的Mutan-K(由宝酒造制造)，利用ODA法的Mutan-Express Km(由宝酒造制造)，利用用于引入修饰的引物和来自激烈热球菌Pyrococcus furiosus的QuikChangeTM定点突变试剂盒(由Stratageng制造)，利用PCR法的TaKaRa LA-PCR体外突变试剂盒(由宝酒造制造)，以及Mutan-Super Express Km(由宝酒造制造)。
通过根据生物化学杂志，94(3)，937-947(1983)或生物化学杂志，115(6)，1148-1154(1994)中所述方法测量MBP活性，可确定如上述制备的基因是否为编码具有MBP活性的蛋白质的基因。
这些基因及由所述基因获得的表达蛋白质也可用作本发明的药剂。
当利用编码MBP的基因自身将本发明的药剂导入癌细胞时，如果使用例如，编码MBP的基因及具有与之相关的调节基因的重组载体，可以方便地导入编码MBP的基因。就调节基因而言，除了含有编码MBP基因自身的启动子的载体外，也可用含有其他有效的启动子的那些载体，有效的启动子如：痘苗病毒A包含体(ATI)启动子，SV40启动子，衍生自逆转录病毒的LTR启动子，热休克启动子，金属硫蛋白启动子，和肌动蛋白启动子。
可以在细胞中保持为染色体外的载体的形式将这些载体导入癌细胞或尚未经致癌变转化的细胞中。在这种状态下，可由细胞自染色体外的位置表达基因，产生MBP并在细胞内增加MBP浓度，籍此实现本发明的目的。
用于保持在染色体外的载体，可利用本领域已知的适当的载体。就将所述载体导入细胞的方法而言，本领域已知如电穿孔法、磷酸钙共沉淀法、病毒转导法等，选择何种方法在本领域日常工作范围之内。
还可以整合入染色体的载体的形式将编码MBP的基因导入癌细胞或尚未经致癌变转化的细胞中。在这种状态下，可由细胞表达保留在染色体上的基因，产生MBP并在细胞内增加MBP浓度，籍此实现本发明的目的。
在将MBP基因导入细胞的过程中，含有所述基因的载体可通过使用病毒载体被高效导入。就这种载体而言，可使用已知可将目标DNA转运至细胞并且转染效率高的载体，如痘苗病毒载体、逆转录病毒载体、腺病毒载体、腺伴随病毒载体或非增殖性重组病毒载体。特别是非增殖性重组病毒载体，因重组病毒载体在导入目的细胞后不生长，因此，有必要每隔两周至两个月使用一次，便于每次进行施用时调整施用量。也可使用非病毒载体如人工制备的球囊脂质体，例如膜结合脂质体和阳离子脂质体。
构建作为本发明的药剂的重组病毒的方法的例子如下述。将人MBP的cDNA导入依病毒学进展(Archives of Virology)，138，315-330(1994)所述方法构建的痘苗病毒载体pBSF2-16(图1)的SmaI和SacI位点，制备重组载体pBSF2-16/MBP(图2)，其中MBP由ATI杂合启动子(一种由ATI启动子与数个串联7.5kDa的启动子相结合的启动子)控制。用重组载体pBSF2-16/MBP与野生型痘苗病毒DNA共转染COS-7细胞，通过例如，红细胞凝集素表型或MBP的表达量的方法选择重组痘苗病毒，籍此获得表达MBP的重组痘苗病毒。
就抗癌症剂而言，可通过例如如下方法评价抑制癌症生长的作用，将人癌细胞接种至裸鼠，然后向其施用本发明的药剂，随后测定癌症组织的生长能力。将人结肠癌细胞株SW1116皮下接种至KSN裸鼠中，三周后，向肿瘤处施用上述表达MBP的重组痘苗病毒，或向非病变部分皮下施用。两周后，以相同方式再次施用表达MBP的重组痘苗病毒，施用后测量肿瘤体积，籍此评价抑制癌细胞生长的能力。
实施例
通过如下实施例更具体描述本发明，而不将本发明局限于这些实施例。
实施例1表达载体和重组痘苗病毒的构建
将含有全长人MBP编码区的cDNA克隆H-3-1[(生物化学杂志，115(6)，1148-1154(1994)]亚克隆至痘苗病毒载体pBSF2-16[病毒学进展，138，315-330(1994)]SmaI和SacI位点，所述位点紧邻ATI杂合启动子的下游，而ATI杂合启动子是一种ATI启动子与数个7.5kD的启动子以串联方式结合的启动子，通过上述亚克隆制备由ATI杂合启动子控制的MBP表达质粒pBSF2-16/MBP。
图1显示了痘苗病毒载体pBSF2-16的限制性酶谱；图2显示了MBP表达质粒pBSF2-16/MBP。
用IBT(靛红-β-缩氨硫脲)依赖性痘苗病毒株((病毒学，155，97-105(1986))感染COS-7细胞(ATCC CRL1651)。然后将pBSF2-16/MBP及由野生型痘苗病毒WR株的病毒粒提取的基因组DNA利用DOTAP试剂(Boehringer Mannheim公司)导入已用IBT依赖性痘苗病毒株感染的COS-7细胞，籍此制备MBP重组痘苗病毒。
顺便说明，按照病毒学进展，138，315-330(1994)中所述的方法，根据血细胞凝集素表型筛选重组痘苗病毒，并用ELISA法在RK-13细胞中检出。用噬斑形成法测量病毒滴度，并用噬斑形成单位(PFU)表示。实施例2抗癌症作用的评价
体内抗癌症作用的评价如下进行。
以每只小鼠(KSN裸鼠；由日本SLC制造)107个细胞的量皮下接种人结肠癌细胞SW1116株(ATCC CCL233)，三周后，将实施例1中所述MBP重组痘苗病毒以每只鼠5×106PFU的量施入病变处肿瘤或者皮下施用于非病变处。作为对照，将相同量的野生型痘苗病毒WR株施入病变处肿瘤。
两周后，将MBP重组痘苗病毒或野生型痘苗病毒WR株以相同量相同方式施用，施用后测量肿瘤的体积，籍此评价对癌细胞生长的抑制能力。
作为对照，使用了向非病变处经皮下施用生理盐水溶液的一个组。结果示于图3。图3是显示体内评价抗癌症作用的试验结果的图，其中纵坐标表示肿瘤的体积(mm)，横坐标显示癌细胞移植后的周数。图中，黑色方块表示向非病变处经皮下施用生理盐水溶液的一个组，空心圆表示向病变处肿瘤施用野生型痘苗病毒WR株的一个组，实心圆表示向病变处肿瘤施用MBP重组痘苗病毒的一个组，黑色三角表示经皮下向非病变处施用MBP重组痘苗病毒的一个组。图中箭头表示分别施用MBP痘苗病毒、野生型痘苗病毒WR株及生理盐水的周。
由图3知，当将本发明的MBP重组痘苗病毒施用于病变处的肿瘤中，肿瘤明显变小，甚至当其经皮下施用于非病变处时，与施用了野生型痘苗病毒WR株及生理盐水溶液的对照相比，也可观察到明显的癌细胞生长抑制。
本发明的优点
根据本发明，提供了在肿瘤细胞中和其周围组织或在非病变部分的组织中提高MBP浓度的一种抗癌症剂，该药剂含有作为有效成分的MBP或其基因。所述抗癌症剂可用于癌症治疗领域。
序列表序列号1序列长度：228个氨基酸序列类型：氨基酸链型：单链拓扑结构：线性分子类型：肽序列：
Glu Thr Val Thr Cys Glu Asp Ala Gln Lys Thr Cys Pro Ala Val
 1               5                  10                  15
Ile Ala Cys Ser Ser Pro Gly Ile Asn Gly Phe Pro Gly Lys Asp
                 20                  25                  30
Gly Arg Asp Gly Thr Lys Gly Glu Lys Gly Glu Pro Gly Gln Gly
                 35                  40                  45
Leu Arg Gly Leu Gln Gly Pro Pro Gly Lys Leu Gly Pro Pro Gly
                 50                  55                  60
Asn Pro Gly Pro Ser Gly Ser Pro Gly Pro Lys Gly Gln Lys Gly
                 65                  70                  75
Asp Pro Gly Lys Ser Pro Asp Gly Asp Ser Ser Leu Ala Ala Ser
                 80                  85                  90
Glu Arg Lys Ala Leu Gln Thr Glu Met Ala Arg Ile Lys Lys Trp
                 95                 100                 105
Leu Thr Phe Ser Leu Gly Lys Gln Val Gly Asn Lys Phe Phe Leu
                110                 115                 120
Thr Asn Gly Glu Ile Met Thr Phe Glu Lys Val Lys Ala Leu Cys
                125                 130                 135
Val Lys Phe Gln Ala Ser Val Ala Thr Pro Arg Asn Ala Ala Glu
                140                 145                 150
Asn Gly Ala Ile Gln Asn Leu Ile Lys Glu Glu Ala Phe Leu Gly
                155                 160                 165
Ile Thr Asp Glu Lys Thr Glu Gly Gln Phe Val Asp Leu Thr Gly
                170                 175                 180
Asn Arg Leu Thr Tyr Thr Asn Trp Asn Glu Gly Glu Pro Asn Asn
                185                 190                 195
Ala Gly Ser Asp Glu Asp Cys Val Leu Leu Leu Lys Asn Gly Gln
                200                 205                 210
Trp Asn Asp Val Pro Cys Ser Thr Ser His Leu Ala Val Cys Glu
                215                 220                 225
Phe Pro Ile序列号2序列长度：684个碱基对序列类型：核酸链型：双链拓扑结构：线性分子类型：cDNA至基因组RNA序列：GAAACTGTGA CCTGTGAGGA TGCCCAAAAG ACCTGCCCTG CAGTGATTGC CTGTAGCTCT   60CCAGGCATCA ACGGCTTCCC AGGCAAAGAT GGGCGTGATG GCACCAAGGG AGAAAAGGGG  120GAACCAGGCC AAGGGCTCAG AGGCTTACAG GGCCCCCCTG GAAAGTTGGG GCCTCCAGGA  180AATCCAGGGC CTTCTGGGTC ACCAGGACCA AAGGGCCAAA AAGGAGACCC TGGAAAAAGT  240CCGGATGGTG ATAGTAGCCT GGCTGCCTCA GAAAGAAAAG CTCTGCAAAC AGAAATGGCA  300CGTATCAAAA AGTGGCTGAC CTTCTCTCTG GGCAAACAAG TTGGGAACAA GTTCTTCCTG  360ACCAATGGTG AAATAATGAC CTTTGAAAAA GTGAAGGCCT TGTGTGTCAA GTTCCAGGCC  420TCTGTGGCCA CCCCCAGGAA TGCTGCAGAG AATGGAGCCA TTCAGAATCT CATCAAGGAG  480GAAGCCTTCC TGGGCATCAC TGATGAGAAG ACAGAAGGGC AGTTTGTGGA TCTGACAGGA  540AATAGACTGA CCTACACAAA CTGGAACGAG GGTGAACCCA ACAATGCTGG TTCTGATGAA  600GATTGTGTAT TGCTACTGAA AAATGGCCAG TGGAATGACG TCCCCTGCTC CACCTCCCAT  660CTGGCCGTCT GTGAGTTCCC TATC                                         684

Claims (11)

1.一种抗癌症剂，其特征在于含有甘露聚糖结合蛋白或其基因作为有效成分。
2.根据权利要求1的抗癌症剂，其中甘露聚糖结合蛋白是一种具有序列表中序列1所示氨基酸序列的蛋白质。
3.根据权利要求1的抗癌症剂，其中甘露聚糖结合蛋白是一种在序列表中序列1所示氨基酸序列中具有一个或多个至少被取代、缺失、添加或插入的氨基酸，并具有如甘露聚糖结合蛋白活性的蛋白质。
4.根据权利要求1的抗癌症剂，其中基因是编码如序列表中序列1所述氨基酸序列，或含有该基因的基因。
5.根据权利要求4的抗癌症剂，其中基因是序列表中序列2所示的基因，或含有该基因的基因。
6.根据权利要求1的抗癌症剂，其中基因是一种编码如下蛋白质的基因，其中所述蛋白质是在如序列表序列1所示氨基酸序列中具有一个或多个至少被取代、缺失、添加或插入的氨基酸残基，并具有如甘露聚糖结合蛋白活性的蛋白质，或含有该基因的基因。
7.根据权利要求1的抗癌症剂，其中基因是可与序列表中序列2所示的基因杂交，并编码具有如甘露聚糖结合蛋白活性的蛋白质的基因，或含有该基因的基因。
8.根据权利要求1的抗癌症剂，其中在权利要求4-7中任一项所述的基因被整合入载体。
9.根据权利要求8的抗癌症剂，其中载体为质粒载体。
10.根据权利要求8的抗癌症剂，其中载体为病毒载体。
11.根据权利要求10的抗癌症剂，其中病毒载体为痘苗病毒载体。
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