CN1324046C - 一种具有抗hiv活性的蛋白和糖结合蛋白 - Google Patents
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Abstract
本发明是一种来自海洋无脊椎动物(Serpula lacrymans，Serpulavermicularis或Serpula rhizomorphs)的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的蛋白和糖结合蛋白，具体地说是一种在人类获得性免疫系统综合症病毒急性感染期，慢性感染时细胞融合过程中，该蛋白具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性，其具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；该糖结合蛋白，在体外细胞抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性指数比AZT高出近200倍，并且对人类T淋巴细胞系C8166细胞无毒性。通过该糖结合蛋白的N末端15个氨基酸序列，采用分子生物学的方法，在酵母菌中表达出该糖蛋白。其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。
Description
技术领域
本发明是一种来自海洋无脊椎动物(Serpula lacrymans，Serpulavermicularis或Serpula rhizomorphs)的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白及其制备，具体地说是一种在人类获得性免疫系统综合症病毒急性感染期，慢性感染时细胞融合过程中具有抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的(凝集素)糖结合蛋白及其制备。
背景技术
近几年来，由于出现很多严重危胁人们健康的新病毒，如SARS冠状病毒，人类获得性免疫系统综合症病毒(HIV)，禽流感病毒(H5N1)和埃博拉病毒(Ebola virus)等。这迫使人们去寻找可以做为药物的新的化合物。而海洋生物，尤其海洋无脊椎动物经过人们二十年来不断的研究，正逐渐成为新的药物化合物源泉。
海洋无脊椎动物由于其大多数运动性较差，物理防御能力较弱(如移动等)。在长期的进化过程中，化学防御能力得到了很好的发展。它们具有很多有特别生理活性的二级代谢产物；如O′Keefe B.R.等人从海棉Niphateserecta中分离出具有抗HIV活性的蛋白质[文献1：1997年245卷《欧洲生物化学杂志》“从海棉Niphates erecta中分离出具有抗HIV活性的蛋白质]。还有抗肿瘤物质，强心剂，病毒逆转录酶抑制剂，抗HSV-I、FELV、F-59、P-28病毒物质，抗菌物质等从海洋微生物中分离出来。
发明内容
本发明目的是提供一种来自海洋无脊椎动物(Serpula lacrymans，Serpulavermicularis或Serpula rhizomorphs)的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白；按照其结构合成的类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种具有抗HIV活性的蛋白，具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其氨基酸序列为：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸。
序列表SEQ ID NO.1的信息
序列特征：
长度：15个氨基酸
类型：氨基酸
链型：单链
拓扑结构：线形
来源：蠕虫(Serpula vermicularis)
与氨基酸有关的特征关键词：ACETYLATION，N-末端或其它；
序列：AlaAspThrPheCysGlnMetLeuGlySerArgTyrGlyTrpArg(ADTFCQMLGSRYGWR)
一种具有抗HIV活性的糖结合蛋白，该糖结合蛋白中氨基酸的摩尔百分含量(摩尔/100摩尔)为：天冬氨酸7.5％，天冬酰胺5.1％，苏氨酸2.8％，丝氨酸5.0％，谷氨酰3.7％，谷氨酸5.6％脯氨酸3.0％，甘氨酸14.9％，丙氨酸19％，半胱氨酸5.6％，缬氨酸5.7％，异亮氨酸1.1％，亮氨酸5.4％，酪氨酸1.1％，苯丙氨酸3.4％组氨酸1.1％精氨酸1.2％甲硫氨酸1.1％色氨酸5.4％赖氨酸2.3％；其N末端具有SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列(N末端为：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸)；其蛋白质三维结构为，α-螺旋含量为小于10％，β-层状含量为50-65％，β-折叠含量为15-35％和10-20％无规则结构；其糖在凝血活性的抑制反应中表现为：N-乙酰葡糖酰胺特异性为其1位糖苷键为β构象，同时表现为：N-乙酰葡糖酰胺特异性，α(1→2)、α(1→6)甘露聚糖特异性，卵粘蛋白特异性和卵类粘蛋白特异性；糖结合蛋白pI为8.6(等电聚焦电泳检测)，分子量为31000道尔顿，含两个15500道尔顿的亚基；每个亚基含有141个氨基酸。
所述的糖结合蛋白，其可按如下方法制备获得：在3-5℃时，将海洋无脊椎动物蠕虫(Serpula lacrymans，Serpula vermicularis或Serpularhizomorphs)用0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)，含0.9％NaCl，抽提12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白(蛋白质质量比3∶1)亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)；然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中(pH 6-9)，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量为31000道尔顿，含两个15500道尔顿的亚基。
所述的糖结合蛋白，其可按如下方法制备获得：
按照N末端氨基酸序列：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸，用3′RACE法扩增cDNA全长：
1)根据N端氨基酸序列按标准翻译准则推导出5′端核苷酸序列：5′GCNGAYACNT TYTGYCARAT GYTNGGNWSN MGNACNGGNT AYMGN 3′；
2)根据5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物(GSP)，序列如下：Sense primer：5′GCNGAYACNTTYTGYCARAT 3′起止碱基：1-20bp，GC％45.0；
3)引物序列：
RACE通用引物(Long)：5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′；
RACE通用引物(Short)：5′-ctaatacgactcactatagggc-3′；
3′RACE CDS Primer A：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′
4)总RNA提取，定量与完整性检测：液氮研磨蠕虫，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA；(1)RNA定量分析：测260、280nm处的吸光值，计算A260/A280的值以估计总RNA的纯度。通过A260的值计算总RNA的量；(2)RNA完整性检测：在1％甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，有两条清晰的带，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，则说明总RNA完整；
5).cDNA的3′末端的克隆：cDNA 3′末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行；用去除RNA酶的DNAase I(Pharmacia Biotech)去除总RNA中的DNA污染；用1μg蠕虫总RNA用于cDNA的合成(3′-RACE-Ready cDNA)，2.5μL逆转录产物用通用引物混合物和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长。扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序，长度为450bp；
6)将该cDNA转入到酵母菌中，其表达糖蛋白特征；经破碎酵母菌体，得到该糖结合蛋白粗品。再采用0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)，含0.9％NaCl，抽提该糖结合蛋白粗品12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白(蛋白质质量比3∶1)亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)。然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中(pH 6-9)，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
本发明具有如下优点：
1.低细胞毒性。本发明来自海洋无脊椎动物的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性的糖结合蛋白，在对人类T淋巴细胞系C8166的体外毒性检测中，在500毫克/毫升浓度时，没有观察到细胞毒性。
2.高抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性。在对人类T淋巴细胞系C8166急性感染人类获得性免疫系统综合症病毒(HIV-1IIIB)时，以及在慢性感染的细胞系H9/HIV-1IIIB和人类T淋巴细胞系C8166体外检测中均表现出很好的抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性，活性指数比AZT高出近200倍。
3.通过该糖结合蛋白的N末端15个氨基酸序列，采用分子生物学的实验方法，在酵母菌中表达出该糖蛋白；该方法可获得大量的专一表达的该糖结合蛋白；并不受海洋无脊椎动物蠕虫来源的限制。其结构类似物可成为一种潜在的抗爱滋病药物导向化合物。
具体实施方式
实施例1
在3-5℃时，将海洋无脊椎动物蠕虫(Serpula lacrymans，Serpulavermicularis或Serpula rhizomorphs)用0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)，含0.9％NaCl，抽提12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白(蛋白质质量比3∶1)亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH6-9)。然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中(pH 6-9)，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
该糖结合蛋白经常规氨基酸测序N末端为：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸。共含有141个氨基酸。
该糖结合蛋白的氨基酸含量(摩尔/100摩尔)：天冬氨酸7.5％，天冬酰胺5.1％，苏氨酸2.8％，丝氨酸5.0％，谷氨酰3.7％，谷氨酸5.6％脯氨酸3.0％，甘氨酸14.9％，丙氨酸19％，半胱氨酸5.6％，缬氨酸5.7％，异亮氨酸1.1％，亮氨酸5.4％，酪氨酸1.1％，苯丙氨酸3.4％组氨酸1.1％精氨酸1.2％甲硫氨酸1.1％色氨酸5.4％赖氨酸2.3％。
该结构具有N-乙酰葡糖酰胺特异性，α(1→2)、α(1→6)甘露聚糖特异性，卵粘蛋白特异性和卵类粘蛋白特异性。N-乙酰葡糖酰胺特异性为其1位糖苷键为β构象。三维结构特征在于：α-螺旋含量为小于10％，β-层状含量为50-65％，β-折叠含量为15-35％和10-20％无规则结构。经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量为31000道尔顿，含两个15500道尔顿的亚基。等电聚焦电泳检测，该糖结合蛋白pI为8.6。
其糖特征在凝血活性的抑制反应中表现为：N-乙酰葡糖酰胺特异性，α(1→2)、α(1→6)甘露聚糖特异性，卵粘蛋白特异性和卵类粘蛋白特异性。N-乙酰葡糖酰胺特异性为其1位糖苷键为β构象。
实施例2
根据N末端糖结合蛋白氨基酸序列所设计的引物，及跟据所设计的引物转录出的基因序列，经基因工程菌得到的该糖结合蛋白粗品；再经交联的卵粘蛋白亲和层析，离子交换层析和分子筛层析，得到纯品；具体过程如下：
按照N末端氨基酸序列：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸，用3′RACE法扩增cDNA全长：
1)根据N端氨基酸序列按标准翻译准则推导出5′端核苷酸序列：5′GCNGAYACNT TYTGYCARAT GYTNGGNWSN MGNACNGGNT AYMGN 3′；
2)根据5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物(GSP)，序列如下：Sense primer：5′GCNGAYACNTTYTGYCARAT 3′起止碱基：1-20bp，GC％45.0；
3)引物序列：
RACE通用引物(Long)：5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′；
RACE通用引物(Short)：5′-ctaatacgactcactatagggc-3′；
3′RACE CDS Primer A：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′
4)总RNA提取，定量与完整性检测：液氮研磨蠕虫，用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA；(1)RNA定量分析：测260、280nm处的吸光值，计算A260/A280的值以估计总RNA的纯度。通过A260的值计算总RNA的量；(2)RNA完整性检测：在1％甲醛变性琼脂糖凝胶上分离总RNA，有两条清晰的带，且大分子量(28SrRNA)的亮度近似为小分子量(18SrRNA)的亮度的2倍，则说明总RNA完整；
5).cDNA的3′末端的克隆：cDNA 3′末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行；用去除RNA酶的DNAase I(Pharmacia Biotech)去除总RNA中的DNA污染；用1μg蠕虫总RNA用于cDNA的合成(3′-RACE-Ready cDNA)，2.5μL逆转录产物用通用引物混合物和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长。扩增产物经1％琼脂糖电泳检测并纯化后连接到PMD18-T载体上，转化大肠杆菌Novanblue，蓝白斑筛选及酶切鉴定后，由宝生物工程(大连)有限公司测序，长度为450bp；
6)将该cDNA转入到酵母菌中，其表达糖蛋白特征；经破碎酵母菌体，得到该糖结合蛋白粗品。再采用0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)，含0.9％NaCl，抽提该糖结合蛋白粗品12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白(蛋白质质量比3∶1)亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)。然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中(pH 6-9)，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
实施例3
在4℃时，将150毫克海洋无脊椎动物(Serpula lacrymans，Serpulavermicularis或Serpula rhizomorphs)用50毫升0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH6-9)，含0.9％NaCl，抽提12小时；将盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白(蛋白质质量比3∶1)亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液(pH 6-9)。然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中(pH 6-9)，含0.9％NaCl，将1.5毫升该溶液加到分子筛层析Sephadex G-200(1.8×98cm)上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。制得4毫克该糖结合蛋白。经SDS聚丙酰胺凝胶电泳检测，糖结合蛋白分子量为31000道尔顿，含两个15500道尔顿的亚基。
实施例4
对人类T淋巴细胞系C8166细胞毒性检测，结果如表1所示；
表1
| 糖结合蛋白浓度(毫克/毫升) | 细胞存活率％ | 误差 |
| 500 | 67.35 | 0.00 |
| 100 | 116.37 | 4.24 |
| 20 | 103.67 | 3.55 |
| 4 | 97.73 | 1.01 |
| 0.8 | 101.92 | 2.76 |
| 0.16 | 87.94 | 2.93 |
C8166细胞系于该糖结合蛋白混合，在37℃，5％CO2培养三天，采用MTT(3，(4，5-dimethylthiazol-2-yl)-2，5-diphenyl tetrazolium bromide)比色法检测细胞毒性。该糖结合蛋白在500毫克/毫升细胞存活率大于50％。
实施例5
对人类获得性免疫系统综合症病毒(HIV-1IIIB)诱导致病变作用的抑制试验，结果如表2所示；
表2
| 糖结合蛋白浓度(毫克/毫升) | 合胞体抑制率％ | 误差 |
| 100 | 100.00 | 0.00 |
| 20 | 99.44 | 0.97 |
| 4 | 95.53 | 1.94 |
| 0.8 | 90.49 | 4.84 |
| 0.16 | 86.58 | 5.81 |
| 0.032 | 75.95 | 2.56 |
| 0.0064 | 61.41 | 1.68 |
| 0.00128 | 44.07 | 7.93 |
50μl培养液倍比稀释的该糖结合蛋白加入HIV-1稀释上清50μl，混合，37℃预处理1h，然后加入C8166细胞50μl(3×104个)及50μl含有相应浓度化合物的培养液，M.O.I.为0.03。同时设置不含化合物的对照孔。37℃，5％CO2培养三天，倒置显微镜下(100×)计数合胞体的形成。EC50(50％Effective Concentration)为抑制合胞体形成50％时的化合物浓度。糖结合蛋白EC50浓度为0.002毫克/毫升。培养上清离心后收集，Triton-X 100灭活后，ELISA检测HIV-1p24抗原水平。
实施例6
该糖结合蛋白对HIV-1复制的抑制作用，结果如表3所示；
表3
| 糖结合蛋白浓度(毫克/毫升) | 对抗原p24产生的抑制率％ | 误差 |
| 100 | 93.08 | 1.46 |
| 20 | 89.21 | 1.99 |
| 4 | 71.14 | 4.00 |
| 0.8 | 67.08 | 2.41 |
| 0.16 | 71.51 | 6.71 |
| 0.032 | 59.34 | 12.13 |
| 0.0064 | 51.59 | 10.14 |
| 0.00128 | 32.41 | 11.37 |
检测该糖结合蛋白对HIV-1复制的抑制作用采用捕捉p24抗原ELISA方法。简述如下：抗HIV-1 p24 McAb包被酶标板；ELISA封板液封板后，每孔加待测样品100μl，温育2h；加1∶5000稀释的AIDS病4人阳性血清(APS)100μl，温育1h；每孔加入适当浓度的HPR标记羊抗人IgG100μl。洗涤后，加入OPD底物使用液100μl。中止反应后，Elx800 ELISA Reader测定OD值(490nm/630nm)。糖结合蛋白EC50浓度为0.006毫克/毫升。AZT的EC50浓度为0.012毫克/毫升。
实施例7
HIV感染细胞融合的阻断试验，结果如表4所示；
表4
| 糖结合蛋白浓度(毫克/毫升) | 合胞体抑制率％ | 误差 |
| 100 | 96.67 | 0.44 |
| 20 | 90.27 | 3.20 |
| 4 | 71.07 | 3.94 |
| 0.8 | 39.32 | 8.02 |
| 0.16 | 17.05 | 1.09 |
在96孔细胞培养板上，将待测该糖结合蛋白倍比稀释，每个梯度3个重复孔，每孔50μl。同时设置不含化合物的对照孔。每孔滴加6×105/ml对数生长期的C8166细胞25μl和2×105/ml的HIV-1慢性感染的H9细胞25μl.37℃，5％CO2培养24小时，在显微镜下观察细胞融合形成合胞体的情况来推断化合物是否阻断病毒与细胞的结合过程。糖结合蛋白EC50浓度为1.37毫克/毫升。
结论：从抑制细胞病变、抑制HIV-1复制的试验结果，可得出该糖结合蛋白抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性指数(CC50/EC50)大于833333，AZT为大于416。在体外细胞抗人类获得性免疫系统综合症病毒活性指数比AZT高出近200倍，并且对人类T淋巴细胞系C8166细胞无毒性。
蛋白
SEQUENCE LISTING
<110>中国科学院大连化学物理研究所
<120>一种具有抗HIV活性的蛋白和糖结合蛋白
<130>
<160>1
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>15
<212>PRT
<213>蠕虫(Serpula vermicularis)
<220>
<221>ACETYLATION
<222>(1)..(15)
<223>
<400>1
Ala Asp Thr Phe Cys Gln Met Leu Gly Ser Arg Tyr Gly Trp Arg
1 5 10 15
Claims (3)
1.一种具有抗HIV活性的糖结合蛋白，其特征在于：该糖结合蛋白中氨基酸的摩尔百分含量为：天冬氨酸7.5％，天冬酰胺5.1％，苏氨酸2.8％，丝氨酸5.0％，谷氨酰3.7％，谷氨酸5.6％脯氨酸3.0％，甘氨酸14.9％，丙氨酸19％，半胱氨酸5.6％，缬氨酸5.7％，异亮氨酸1.1％，亮氨酸5.4％，酪氨酸1.1％，苯丙氨酸3.4％组氨酸1.1％精氨酸1.2％甲硫氨酸1.1％色氨酸5.4％色氨酸2.3％；其N末端为SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列；其蛋白质三维结构为，α-螺旋含量为小于10％，β-层状含量为50-65％，β-折叠含量为15-35％和10-20％无规则结构；其糖在凝血活性的抑制反应中表现为：N-乙酰葡糖酰胺特异性为其1位糖苷键为β构象，同时表现为：N-乙酰葡糖酰胺特异性，α(1→2)、α(1→6)甘露聚糖特异性，卵粘蛋白特异性和卵类粘蛋白特异性；糖结合蛋白pI为8.6，分子量为31000道尔顿，含两个15500道尔顿的亚基；每个亚基含有141个氨基酸。
2.按照权利要求1所述的糖结合蛋白的制备方法，其特征在于：
其按如下方法制备获得，在3-5℃时，将海洋无脊椎动物蠕虫用0.01-0.1M磷酸缓冲液，含0.9％NaCl，抽提12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液；然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
3.按照权利要求1所述的糖结合蛋白的制备方法，其特征在于：
其按如下方法制备获得，按照N末端氨基酸序列：丙氨酸-天冬氨酸-苏氨酸-苯丙氨酸-半胱氨酸-谷氨酰胺-甲硫氨酸-亮氨酸-甘氨酸-丝氨酸-精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-色氨酸-精氨酸，用3′RACE法扩增cDNA全长：
1)根据N端氨基酸序列按标准翻译准则推导出5′端核苷酸序列：5′GCNGAYACNT TYTGYCARAT GYTNGGNWSN MGNACNGGNT AYMGN 3′；
2)根据5′端核苷酸序列应用Primer premier 5设计正义基因特异引物，序列如下：Sense primer：5′GCNGAYACNTTYTGYCARAT 3′起止碱基：1-20bp，GC％45.0；
3)引物序列：
RACE通用引物Long：5′-ctaatacgactcactatagggcaagcagtggtatcaacgcagagt-3′；
RACE通用引物Short：5′-ctaatacgactcactatagggc-3′；
3′RACE CDS Primer A：5′-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTAC(T)30N-1N-3′
4)液氮研磨蠕虫，用TRIzol试剂提取总RNA；
5).cDNA的3′末端的克隆：cDNA3′末端快速扩增按照Clontech公司的SMART RACE cDNA扩增试剂盒说明书进行；用去除RNA酶的DNAase I去除总RNA中的DNA污染；合成3′-RACE-Ready cDNA，用逆转录产物用通用引物混合物和根据5′端序列设计的3′RACE基因特异引物，以3′-RACE-Ready cDNA为模板按照试剂盒说明书扩增目的基因全长；
6)将该cDNA转入到酵母菌中，其表达糖蛋白特征；经破碎酵母菌体，得到该糖结合蛋白粗品；再采用0.01-0.1M磷酸缓冲液，含0.9％NaCl，抽提该糖结合蛋白粗品12小时；盐抽提液加入到交联的卵粘蛋白-粘蛋白亲和层析柱上，上样缓冲液为0.01-0.1M磷酸缓冲液；然后用水洗脱，得到蛋白洗脱峰；将蛋白洗脱峰浓缩冻干；将冻干粉溶于0.01-0.1M磷酸缓冲液中，含0.9％NaCl，将该溶液加到分子筛层析上；检测蛋白洗脱峰，第一个蛋白洗脱峰具凝血活性，将具有凝血活性的洗脱成份冻干燥，冻干粉末即为糖结合蛋白。
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