CN1636016A - 抑制病毒复制的方法 - Google Patents

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CN1636016A CNA028120426A CN02812042A CN1636016A CN 1636016 A CN1636016 A CN 1636016A CN A028120426 A CNA028120426 A CN A028120426A CN 02812042 A CN02812042 A CN 02812042A CN 1636016 A CN1636016 A CN 1636016A
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Abstract

描述了具有酸性和芳族氨基酸特定模式的肽，这些肽能抑制病毒感染。这些肽包含15－18个氨基酸并可与其它的抗病毒制剂组合和/或以编码它们的核苷酸序列形式给药。

Description

抑制病毒复制的方法
技术领域
本发明涉及能有效抑制利用内部核糖体进入位点(IRES)起动翻译的传染性病毒的复制、和/或能抑制在病毒生命周期任何阶段利用La蛋白质的病毒的肽。这些肽能与La蛋白质竞争并抑制产毒性病毒生命周期对所需La蛋白质的多种生化和生理功能的利用。更具体说本发明包括在这种抑制中具优异性能的非天然产生的肽。
技术背景
纳入本文作为参考文献的PCT出版物WO96/11211描述了抑制信使RNA在内部核糖体进入位点(IRES)翻译的方法，依据的是能结合这种翻译所需蛋白质的一种寡核苷酸。如该PCT出版物所述，命名为“I-RNA”的此寡核苷酸是根据对表现出所需抑制性能的酵母菌60个核苷酸的RNA的鉴定。然而如本文进一步所述，该I-RNA也可采取此酵母RNA相关部分的各种模拟形式，如脊髓灰质炎病毒186-220核苷酸序列或脊髓灰质炎病毒578-618核苷酸序列和其它各种序列。此抑制性寡核苷酸(I-RNA)的重要性在于核苷酸序列本身和其结合内源蛋白质的能力。I-RNA结合的内源蛋白质命名为人La自身抗原，它能结合抑制性寡核苷酸从而防止抗原所需的与mRNA结合并抑制IRES与核糖体互相作用。如同样纳入本文参考文献的PCT出版物WO99/61613所述，此蛋白质的跨越野生型La自身抗原位置11-28的18个-氨基酸部分显示能抑制病毒复制。完整的La自身抗原的氨基酸序列先前已由Chambers，J.C.，等，J.Biol.Chem.(1988)253：18043-18061描述，也纳入本文参考文献。La自身抗原(LAP)的18个-氨基酸结合区域和前述寡核苷酸抑制病毒RNA翻译的机制在上面所引用的WO99/61613中有所描述。
如前所述，一些病毒包括小核糖核酸病毒、丙肝病毒和其它病毒利用IRES机制来起动翻译。由于上述寡核苷酸和LAP抑制此种翻译，它们也抑制病毒复制和其它病毒必需的功能。如这些出版物所证明，LAP能方便的进入细胞，并位于能影响此种抑制的位置上。
现已发现一个相关肽家族但不包括LAP，在抑制IRES起动翻译并从而抑制病毒复制中具有用途。这些肽因此可用于治疗病毒感染和研究病毒感染的机制。
发明公开的内容
本发明针涉及可用作抗病毒制剂和作为阐明病毒感染机制研究工具的一个肽家族。这些肽能抑制IRES-起动RNA翻译。
因此本发明一方面的内容所针对的肽公式为
A1n A2n A3n A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18  (1)
和其酰化和/或酰胺化形式，
其中各个n独立为0或1；
A1、A2和A3各自独立为任何氨基酸；
A4、A12和A17独立为酸性氨基酸；
A13、A14、A15和A18独立为芳族氨基酸；
A5、A7、A8、A11和A16代表任何氨基酸；
A6、A9和A10独立代表碱性氨基酸或极性中性氨基酸；
其中各所述氨基酸可以是L型、外消旋形式或D型，条件是所述肽不包括LAP且不包括LAP同源物，由于它们出现在其它种属中，除非以分离和纯化形式。
优选氨基酸A5、A7、A8、A11和A16独立为中性、非芳族氨基酸，更优选为疏水性中性、非芳族氨基酸。
优选A1、A2和A3为中性，优选非芳族氨基酸，优选疏水性。
在其它方面，本发明涉及抑制IRES起动的翻译和/或其它病毒功能的方法，这是通过将本发明的肽提供给无细胞系统或感染了利用IRES起动翻译的病毒的活细胞。本发明还涉及使用发明的肽或者其药学或兽医学组合物抑制病毒复制和治疗病毒感染的方法，且本发明也涉及这些药学或兽医学组合物。植物病毒感染也可用本发明的肽来抑制且这些肽和编码它们的核苷酸序列因此也可用于农业和园艺学。这些肽可这样提供或原位从核苷酸序列产生。
利用IRES介导的译从而成为本发明肽合适靶子的病毒包括但不限于脊髓灰质炎病毒、鼻病毒、脑心肌炎病毒、口蹄疫病毒、丙肝病毒(HCV)、经典的(classic)猪瘟病毒、牛病毒性腹泻病毒、弗罗得鼠白血病病毒、莫洛尼鼠白血病病毒、罗斯肉瘤病毒、人免疫缺陷病毒(HIV包括HIV-1和HIV-2)、Plautia stali肠病毒、Rhopalosiphum padi病毒、cricket麻痹病毒、Kaposi肉瘤-相关疱疹病毒、甲肝病毒(HAV)、乙肝病毒(HBV)、人乳头瘤病毒(HPV)、流感病毒HAV、艾可病毒、柯萨奇病毒、狗霍乱病毒、猪瘟病毒、猪水泡病毒、Pesti病毒和Poty病毒。
这些肽和编码它们的多核苷酸可与其它抗病毒制剂组合提供。具体说本发明的肽或它们的编码核苷酸序列与WO96/11211中所述I-RNA的组合是特别有用的。然而其它抗病毒制剂可和本发明的肽或与I-RNA组合的本发明的肽一起施用。
另一方面，本发明涉及能与本发明肽起特异性免疫反应的抗体。这些抗体包括它们的免疫反应片段，可用于纯化本发明的抑制蛋白质和评估其在各种药学、兽医和农业组合物中的水平。
此外，本发明的肽具有优先与一些组织，具体的肝脏相结合的特性。因此，这些肽可作为其它化合物和组合物的特殊输送系统，通过使本发明的肽与需要特殊输送的物质相融合或结合。
实施本发明的模式
本发明的肽具有上面列出的公式(1)，其中各氨基酸特征如上所确定。如所指出的，位置1、2和3中3个氨基酸残基之一可独立存在或缺失。这些氨基酸最优选是疏水性的，但一般任何中性氨基酸可替代且这些位置的氨基酸对于活性确实不重要，因此可使用任何氨基酸。优选的是A1、A2和A3从该肽中缺失。
除了一个例外(A14在一些实施方案中出可是中性/极性的)，该肽需要在A4、A12和A17具有酸性氨基酸并在A13、A14、A15和A18具有芳族氨基酸。其余位置不大关键。
常规氨基酸分类是根据它们的总体特性从而可进行保守替换而不改变分子的性质。最简单的分类是酸性和碱性氨基酸。酸性氨基酸在生理pH下具有负电荷且在天然产生的氨基酸中由谷氨酸(glu或E)和天冬氨酸(asp或D)为代表。
类似的，碱性氨基酸在生理pH下其有正电荷且在天然产生的氨基酸中由赖氨酸(lys或K)、精氨酸(arg或R)或更小程度上的组氨酸(his或H)为代表。其余氨基酸是中性的，但这些中性氨基酸可进一步分成亚类。具体讲含芳族体系的氨基酸可置于“芳族”氨基酸分类中且在天然产生的氨基酸中由色氨酸(trp或W)、苯丙氨酸(phe或F)和酪氨酸(tyr或Y)为代表。
中性氨基酸的另一亚类是极性氨基酸，在天然氨基酸中由谷氨酰胺(gln或Q)和天冬酰胺(asn或N)为代表。有时丝氨酸(ser或S)和苏氨酸(thr或T)由于存在OH也归于此类中。
中性氨基酸的又一亚类是明显为疏水性的氨基酸。在天然产生的氨基酸中，这些氨基酸包括缬氨酸(val或V)、亮氨酸(leu或L)、甲硫氨酸(met或M)和异亮氨酸(ile或I)。有时包括在此类中的有半胱氨酸(cys或C)和丙氨酸(ala或A)甚至甘氨酸(gly或G)。然而由于这些氨基酸的小尺寸，它们不象异亮氨酸、缬氨酸和亮氨酸归类为疏水氨基酸。
唯一的剩余基因-编码氨基酸脯氨酸(pro或P)很难分类，但显然是中性的。
因为本发明肽可以合成以及从核苷酸序列翻译，没有必要限制这些氨基酸残基为由基因编码的那些残基。因此这些肽可包括非天然氨基酸如β-丙氨酸(β-ala)、3-氨基丙酸、2，3-二氨基丙酸(2，3-diap)、4-氨基丁酸(4-aba)、α-氨基异丁酸(aib)、肌氨酸(sar)、鸟氨酸(orn)、瓜氨酸(cit)、t-丁基丙氨酸(t-bua)和其它。这些氨基酸可它们的结构分类酸性或碱性。中性形成的可分类为中性/极性或中性/疏水或中性/芳族。其它分类是中性/小氨基酸，其指含4个或更少碳的氨基酸。
另外，因为这些肽可合成产生，故天然肽联接可由(电子)等排性(isosteric)联接取代，如CH2H、CH2NS、CH2 CH2、CH＝CH(顺式和反式)、COCH2、CH(OH)CH2、CH2SO作为代表例子。用这些同位取代合成肽-类似分子的方法是本领域熟知的。
类似的，由于已有合成本发明化合物的合成方法，可采用天然产生和非天然产生的D型氨基酸以及它们的外消旋混合物。尤其优选的公式(1)化合物的实施方案包括所有残基为D构型的氨基酸。这种化合物可耐受生物降解并因此特别有效。
公式(1)化合物所述的肽类明确排除了由La抗原结合区域(LAP)为代表的肽，这是本领域已知的。此肽在表1中标注为LAP公式。表1也列出排布了号码的天然LAP的具体mutein。同样也显示了人LAP同源物中的LAP氨基酸序列。优选这些同源物也从权利要求的肽类中排除，除非这些肽以纯化或分离形式提供或以兽医、药学或农业/园艺学组合物提供。
如本文所用，“分离的”指一种状态，其中该“分离”物质取自其天然环境中。当分离时它可能是纯化或不纯化的，但至少与它天然相关的一些成分已被去除或被取代。
                      表1
       肽                           序列
       LAP                          AALEAKICHQIEYYFGDF
       702                          AALEAQICQQIEYYFGDF
       701                          AALQAKICHQIQYYFGQF
       761                          QQQEAKICHQIEYYFGDF
       762                          QQQEQKQCHQIEYYFGDF
       703                          AALEAKICHQIEQQQGDQ
       771                          AALEAKICHQIEYYQGDQ
       772                          AALEAKICHQIEQQFGDF
       631                          AALEAKICHQIEYYFGDQ
       632                          AALEAKICHQIEYYQGDF
       741                          AALEAKICHQIEQYFGDF
       633                          AALEAKICHQIEYQFGDF
       小鼠                         ALEAKICHQIEYYFGDF
       牛                           AALEAKICHQIEYYFGDF
       非洲爪蟾(XENOPUS)            LDLDTKICEQIEYYFGDF
       大鼠                         AALEAKICHQIEEYYFGDF
       线虫(C.ELEGANS)              DDADQRIIKQLEYYFGNI
       蚊子                         VSKLEASTIRQUYYFGDA
       果蝇(DROSOPHLIA)             QERAIIRQVEYYFGDF
在公式(1)所述本发明化合物中，A4、A12和A17必须为酸性氨基酸。这些氨基酸的优选实施方案是天冬氨酸和谷氨酸；较佳的A4和A12为谷氨酸且A17为天冬氨酸。优选的是任选纯化形式D或L存在于这些位置。
A13、A14、A15和A18必须为芳族氨基酸，除了A14可以是中性/极性。优选的芳族氨基酸为苯丙氨酸和酪氨酸。较佳的A13和A14为酪氨酸且A15和A18为苯丙氨酸。然而这些残基可重排如A13和/或A14是苯丙氨酸且A15和/或A18是酪氨酸，或所有这些残基可以是酪氨酸或所有都是苯丙氨酸。
公式(1)化合物中其余氨基酸较上述氨基酸不太关键。然而具体说，A6和/或A9的残基优选为碱性氨基酸或中性极性氨基酸。中性极性氨基酸优选在A10，但也可替换为碱性氨基酸。尽管不太优选，任何这些位置可由天冬酰胺取代。虽然在发明范围内但甚至更不优选的是这些位置由甘氨酸、丙氨酸、苏氨酸或丝氨酸取代。
A7和A3存在时优选疏水氨基酸，最优选的亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸或甲硫氨酸，最优选亮氨酸、异亮氨酸或缬氨酸。如果存在，A1和A2以及A5优选为疏水小氨基酸，例如丙氨酸、半胱氨酸或甘氨酸，优选丙氨酸。A16优选甘氨酸，但也可是小氨基酸如丙氨酸或丝氨酸或苏氨酸。A8优选半胱氨酸但也可替换为类似氨基酸，如丝氨酸、苏氨酸、丙氨酸或甘氨酸。
公式(1)化合物尤其优选的实施方案是肽702、肽761和肽633。
肽701也优选。
如上所述，本发明的肽可采用标准合成技术制备，液相或固相为基础的技术是本领域熟知的，或者如果包括基因-编码氨基酸的L-异构体，可重组获得。重组产生这些肽可采用合成性多核苷酸，其可用购买仪器方便地合成。编码区域可任选地添加能影响分泌的前导序列，随后在宿主细胞中表达，为此目的或事先可操作性连接于能影响表达的控制序列或使用内源性控制序列。此肽可在多种细胞中产生，包括原核和真核细胞如酵母和哺乳动物细胞。如果需要，此肽可在动物或植物中转基因产生。
产生本发明肽，可提供的形式为N-末端酰化例如乙酰化，和/或C-末端酰胺化如作为氨甲酰或作为通过羧酸残基与烃基或二烃基胺反应获得的酰胺。这种烃基或二烃基胺优选具有6个碳或更少碳。
除了衍生N或C末端或在此肽的侧链上衍生其它反应基团，此肽本身的酰胺键可由(电子)等排物(isostere)如CH2NH或CH2O、CH2CO等替换。合成这种假-肽的方法也是本领域熟知的。
本发明的肽也可作为它们的药学上可接受盐提供或可脂化或糖基化。
本发明的肽包括其酰化和/或酰胺化形式，可制成药学或兽医学组合物用于抗病毒治疗。这种肽的合适组合物可在雷明顿药物科学( Remington’s Pharmaceutical Sciences)，最新版，Mack出版公司，Easton，PA中找到，纳入本文参考文献。可将此化合物配制成用于口服、透皮、透粘膜或其它进入途径或者可注射。标准的组合物是本领域已知的包括片剂、胶囊、溶液、粉末、糖浆、洗液等。这种制剂中包含的赋形剂可包括多种运载体，包括脂质体和表面活性剂。给予肽的合适制剂和途径是普通开业医师所知道的。一种具体的有利制剂包括特此肽与靶因子或某因子如tat蛋白质(该蛋白质能促进相偶联的蛋白质进入细胞)相偶联。剂量水平随着患者的情况、病毒感染的严重性和主治医师的判断而变化。根据具体情况优化制剂和剂量在医师或兽医的普通技术范围内。
在许多可能采用本发明肽的药学/兽医学组合物中，可含有各种以聚合物为基础的缓-释系统，此聚合物可以或不降解从而以规则速度释放出活性成分或其它基质以提供此肽的恒定供应。
对于农业应用，采用的制剂应适于提供此肽给受影响或可能受影响的植物。这种组合物可包括土壤处理组合物、喷射或可采用对单株植物的更精确施用。
除了采用本发明化合物来治疗动物或植物中的病毒感染外，这些肽可用于研究实验室中病毒感染和复制的机制。因此，它们对病毒mRNA的各种修饰形式的效果，例如可在无细胞系统或细胞培养物中进行评估。在这些方面中使用这类肽的方法是熟知的。
在上面所有方面中，用于治疗的制剂也可采用编码核酸给药，作为裸露DNA或包括在表达系统中给予。构建用于各种宿主细胞的表达系统是本领域熟知的；已开发了在表达中行使重要功能的适当启动子、增强子、终止信号等，它们适用于各种哺乳动物细胞、鸟类细胞、植物细胞、酵母细胞、昆虫细胞等。启动子可以是组成型或诱导型。因此，设计了表达系统用于待治疗的对象。例如对于哺乳动物对象，适合的启动子包括metalathionin启动子、各种病毒衍生的启动子如SV40启动子等。该表达系统可包括对于哺乳动物对象给药特别方便的病毒载体，。特别优选的实施方案包括病毒载体如腺病毒载体、或其他病毒载体如逆转录病毒载体，这些是本领域已知的。可使载体有条件地复制从而仅在感染病毒的细胞中载体自身复制并产生蛋白质。
可设计出在对病毒感染的反应中或在对其它外部化学或物理信号的反应中能复制和表达的载体。该载体也可含同源序列用于将适当的表达系统整合到宿主细胞基因组中或者可另外设计当细胞分裂时能复制和传递给子代细胞的载体入。许多合适的载体在本领域已知的，包括例如采用于转导CD34(+)细胞的自身-失活慢病毒载体和腺病毒载体与野生型腺病毒的混合物。
如上所述，此肽可与其它抗病毒制剂组合给药，包括PCT出版物WO96/11211的描述的I-RNA。“I-RNA”指任何能模拟本文所述内源性酵母抑制性RNA的抑制效应的核苷酸序列。许多包括这类模拟物的核苷酸序列描述于PCT出版物中。应该强调的是I-RNA抑制效应是该核苷酸序列本身的一种功能；因此I-RNA可作为RNA、DNA或替换核酸骨架(如本领域熟知的肽核酸)给药。“I-RNA”因此包括与任何支持骨架偶联的核苷酸序列。确实，形成该核苷酸序列的碱基不需要是天然产生的A、T(U)、G、C，而且也可包括这些碱基的能保持天然核苷酸必须的互补特性的修饰形式。
可制成本发明方法中所用的一些结合组合物以控制病毒感染。这些包括将本发明的肽和上述的I-RNA相结合。本发明肽的表达系统与I-RNA的组合，本发明肽或其表达系统与不同的抗病毒制剂如无环鸟苷、反义抗病毒序列或其表达系统、靶向病毒RNA或其表达系统的核酶、或任何其它抗病毒制剂或组合的抗病毒剂的组合。这些抗病毒制剂也可用于与I-RNA和本发明的肽组合。
另一方面，本发明涉及能与本发明肽发生特异免疫反应的抗体。如上所指出，这些抗体可用于评估制剂中该肽的浓度以及监测本发明肽给药后的水平。如本文所定义，“抗体”或“免疫球蛋白”包括诸如Fab、Fab’等能保持完整抗体免疫特异性的片段，也包括这些抗体的重组形式，包括单链形式如Fv形式。产生针对本发明肽的抗体的方法是本领域熟知的；免疫特异性可通过与本发明蛋白质的结合试验的结果来确定，与类似但不同的肽的结合试验的结果相比较。10倍的结合差异，优选100倍，更优选1000倍的结合差异是这种特异性的指征。
本发明的免疫特异性抗体可以是多克隆或单克隆抗体和重组的或免疫产生的抗体。它们可使用本领域熟知的方法修饰成为种属-特异性。因此，如果需要，例如这些抗体可人源化。
可将上述本发明肽的特异性免疫球蛋白偶联于固体支持物并用于纯化本发明的肽。
虽然本发明的肽似乎能回到某些组织，具体是肝脏，但可通过将它们偶联于其它蛋白质或对具体器官或组织有特异性的其它组合物而自身靶向到所需部位。因此，可将这些肽偶联于能结合所需靶受体的配体或偶联于能与细胞表面蛋白质或肿瘤相关抗原反应的化合物。
然而，由于本发明肽确实能回到肝脏组织，故它们自身可用作输送系统以运输其它化合物到这些部位。因此，发明的另一方面是采用本发明的肽作为其它化合物的输送系统。
实施例
以下实施例旨在阐明而不是限制本发明。
制备A
制备试验肽
采用Stratagene的QuickChangeTM定点诱变试剂盒(#200518)，将氨基酸变化引入La的野生型cDNA克隆中(Dr.Jack Keene，Duke University，North Carolina友情提供)(Chambers，J.C.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1985)82：2115-2119)。该重组蛋白质通过0.4mM IPTG诱导4小时在大肠杆菌(BL21(DE3)pLysS)中表达。用超声波裂解细胞4℃离心裂解物(12,000Xg)30分钟。上清液用硫酸链霉素(3％终浓度)处理并如上离心。以缓冲液A(25mM Tris pH8.0，100mM NaCl)4℃透析上清液过夜并随后装到缓冲液A平衡的DEAE Sephacel柱上。收集流穿液并用FPLC通过肝素琼脂糖柱和0到1M NaCl梯度分离。合并含有纯化La或La突变体的组分并以缓冲液A透析。
对于测试此肽进入细胞能力的实验，用Molecular Probe的FluoReporter FITC蛋白质标记试剂盒(F-6434)根据厂商说明并作少量修改以FITC-标记这些肽。所有肽由Biosynthesis( http：//www.biosyn.com)合成并纯化至＞95％均一将这些。肽以5mg/ml溶解于100mM Tris-HCl，pH8.0中并用无核酸酶的水稀释至1mg/ml，用于随后的翻译试验。对于FITC-标记，将肽溶解在PBS，pH8.0中。
实施例1
各种肽对体外翻译的作用
在这些实验中，p2CAT(Coward，P.等，J.Virol(1992)66：286-285)质粒DNA用BamHI线性化并用SP6 RNA聚合酶体外转录。转录的mRNA用酚：氯仿抽提和乙醇沉淀来纯化。将脊髓灰质炎病毒5’UTR的一个克隆，PV 5’UTR(Das，S.，等，J.Virol(1994)68：7200-7211)用HindIII线性化并用T7 RNA聚合酶在存在α-32PUTP(3000Ci/mmole)时转录。放射性同位素标记的RNA用Quick Spin RNA柱(Roche)纯化。
将海拉细胞单层培养在添加了10％胚胎牛血清的基本必须培养基中。如上所述制备海拉细胞裂解物(Coward，等，同前；Rose，J.K.，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1978)75：2732-2736)。用海拉细胞提取物体外翻译p2CAT基本上如别处所述进行(Rose，等，同前)。当存在25μCi35S甲硫氨酸和40U RNAsin(Promega)时在25μl反应混合物中的80μg海拉细胞提取物中翻译微克的体外转录的p2CATRNA。每次反应加入20、40和60μM浓度的肽。作为阴性对照，也测试了3μl稀释(1∶5)的100mM Tris-HCl，pH8.0.。
表1显示了这些肽的结果如下：肽702在40和60μM浓度时有效抑制了CAT报道蛋白质的翻译，其中A6的赖氨酸和A9的组氨酸被中性极性氨基酸谷氨酰胺取代；然而肽701在这些浓度时丧失抑制翻译的能力，其中A4、A12和A17的酸性残基都被中性极性氨基酸谷氨酰胺取代。
肽761其A1、A2和A3被极性中性氨基酸谷氨酰胺取代，在60μM时为抑制性，40μM时为轻度抑制性。然而除了在A1-A3取代外当A5的丙氨酸和A7的异亮氨酸由谷氨酰胺取代时，此肽失去抑制翻译的能力。
在类似的实验中，采用肽703、771和772，其位置A13或更远位置的一个或多个芳族氨基酸由谷氨酰胺取代也失去抑制活性。在这些实施方案中，A13、A14、A15和A18的芳族残基至少两个这样被取代。
如果仅进行一个取代，如肽631、632、741和633中那样抑制翻译的能力再次减小。然而，肽633和631在更高浓度水平仍能抑制；肽631在40和60μM浓度抑制时，肽633在60μM时能抑制。肽631中，仅A18由谷氨酰胺取代；肽633中仅A14这样被取代。
因此，虽然A13、A14、A15和A18通常必须是芳族氨基酸残基，包括在本发明范围内的实施方案中A14或A18由中性氨基酸取代，优选不是小的中性氨基酸。
实施例2
本身结合mRNA的能力
对于此分析，将32P-标记的PV 5’UTR RNA(1×106cpm)探针与重组野生型La或其突变体30℃培养10分钟。结合后，如(Banerjee，R.，等)描述反应完成“RNA病毒的体外复制”(In-vitro Replication of RNA Viruses)，第158-164页，A.Cann(编辑)，RNA病毒：一种实践方法(2000)(RNA Viruses：A PracticalApproach)Oxford University Press，New York。
将标记的PV 5’UTR RNA通过UV交联于500ng、1μg或1.5μg野生型La抗原或两种肽771或772。RNase消化后，将该蛋白质核苷酸复合物在SDS聚丙烯酰胺上分析。结果显示对两种肽的结合显著降低。
在类似的实验中，肽741获得相似结果，其A13从酪氨酸变成谷氨酰胺。当A25从苯丙氨酸变成谷氨酰胺和当A24的酪氨酸变成谷氨酰胺时观察到结合仅轻微降低。
实施例3
细胞进入和保持
对于这些实验，使用FITC-标记的肽。肽标记见上面的制备a所述。标记后肽用Quick Spin RNA柱(Roche)纯化。将载玻片室(slide chamber)中培育的海拉或Huh-7细胞用5μM的各种肽培养过夜。(肝细胞癌细胞(Huh-7)培育在添加10％胚胎牛血清的RPMI培养基(GIBCO/BRL))中。细胞膜随后用1∶200稀释的DiIC18(Molecular Probes)以1mg/ml工作浓度染色20分钟然后用PBS洗3次。细胞用25μl Gelvatol分层并覆盖盖玻片。在Leitz共焦激光扫描显微镜系统中用100X油浸镜头分析细胞。
一般，结果显示肽进入和保持在细胞中的能力与它们抑制翻译的活性相平行。各种测试肽的结果总结于表2。
                      表2
    肽     突变     活性     细胞进入
    LAP     AALEAKICHQIEYYFGDF     +     +++
    702     AALEAQICQQIEYYFGDF     +     +++
    701     AALQAKICHQIQYYFGQF     -     +
    761     QQQEAKICHQIEYYFGDF     +     +
    762     QQQEQKQCHQIEYYFGDF     -     -
    703     AALEAKICHQIEQQQGDQ     -     -
    771     AALEAKICHQIEYYQGDQ     -     -
    772     AALEAKICHQIEQQFGDF     -     -
    741     AALEAKICHQIEQYFGDF     -     -
    633     AALEAKICHQIEYQFGDF     +     +++
    632     AALEAKICHQIEYYQGDF     -     -

Claims (35)

1.一种以下公式的化合物
A1n A2n A3n A4 A5 A6 A7 A8 A9 A10 A11 A12 A13 A14 A15 A16 A17 A18  (1)
及其酰化和/或酰胺化形式，
其特征在于，各个n独立为0或1；
A1、A2和A3各自独立为任何氨基酸；
A4、A12和A17独立为酸性氨基酸；
A13、A14、A15和A18独立为芳族氨基酸；
A5、A7、A8、A11和A16代表任何氨基酸；
A6、A9和A10独立代表碱性氨基酸或极性中性氨基酸；
其中各所述氨基酸可以是L型、外消旋形式或D型，条件是当所有氨基酸是L型时公式(1)的化合物不是AALEAKICHQIEYYFGDF；当所有氨基酸是L型且公式(1)是序列ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYF GNI、VSKLEASTIRQEYYFGDA或QERAIIRQVEYYFGDF时，公式(1)的化合物必须是分离形式。
2.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有氨基酸是基因编码的。
3.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai亚基之间的连接键是酰胺键。
4.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai是D型。
5.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中所有Ai是L型。
6.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中各A4、A12和A17各自独立为天冬氨酸或谷氨酸。
7.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A13、A14、A15和A18各自独立为苯丙氨酸或酪氨酸。
8.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A8是半胱氨酸。
9.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，其中A6、A9和A10各自独立为赖氨酸、组氨酸、精氨酸、谷氨酰胺或天冬酰胺。
10.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物选自AALEAQICQQIEYYFGDF、AALQAKICHQIQYYFGQF、QQQEAKICHQIEYYF GDF和AALEAKICHQIEYQFGDF。
11.如权利要求1所述的化合物，其特征在于，所述化合物为分离或纯化形式并选自ALEAKICHQIEYYFGDF、AALEAKICHQIEYYFGDF、LDLDTKICEQIEYY FGDF、AALEAKICHQIEEYYFGDF、DDADQRIIKQLEYYFGNI、VSKLEASTIRQ EYYFGDA和QERAIIRQVEYYFGDF。
12.一种药学、兽医或农业/园艺学组合物，其特征在于，所述组合物包括权利要求1所述的化合物和适当的赋形剂。
13.一种核酸分子，其特征在于，所述核酸分子包括编码权利要求2所述化合物的核苷酸序列。
14.一种重组表达系统，其特征在于，所述表达系统包括包括编码权利要求2所述化合物的核苷酸序列，该核苷酸序列操作性连接于有效控制其表达的序列。
15.一种重组宿主细胞，其特征在于，所述细胞被修饰而含有权利要求14所述的表达系统。
16.如权利要求15所述的重组宿主细胞，其特征在于，其中表达系统整合到所述宿主细胞基因组中。
17.一种产生权利要求2所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括影响权利要求14所述表达系统表达所述化合物。
18.如权利要求14所述的表达系统，其特征在于，所述表达系统包括在一病毒载体中。
19.如权利要求18所述的病毒载体，其特征在于，所述载体是腺病毒载体或逆转录病毒载体。
20.一种治疗植物或动物对象中病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象抗病毒有效量的权利要求1所述化合物。
21.如权利要求20所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予至少一种其它的抗病毒制剂。
22.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述化合物的施用和所述至少一种其它的抗病毒制剂的给药基本上同时进行。
23.如权利要求21所述的方法，其特征在于，权利要求1所述化合物和所述至少一种抗病毒制剂的所述给药是依次的。
24.如权利要求21所述的方法，其特征在于，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
25.一种治疗植物或动物对象中病毒感染的方法，其特征在于，所述方法包括给予所述对象抗病毒有效量的编码权利要求2化合物的核苷酸序列。
26.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述核苷酸序列包含在与所述对象细胞相容的表达系统中。
27.如权利要求25所述的方法，其特征在于，所述方法还包括给予至少一种其它的抗病毒制剂。
28.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述化合物和所述至少一种其它的抗病毒制剂的给药基本上同时进行。
29.如权利要求27所述的方法，其特征在于，权利要求1所述化合物和所述至少一种抗病毒化合物的所述给药是依次的。
30.如权利要求27所述的方法，其特征在于，所述其它的抗病毒化合物是I-RNA。
31.一种选择性输送化合物给肝脏的方法，其特征在于，所述方法包括给予对象肝脏偶联于权利要求1所述化合物的所需化合物。
32.能与权利要求1所述化合物发生特异性免疫反应的抗体。
33.如权利要求32所述的抗体，其特征在于，所述抗体是免疫特异性片断。
34.如权利要求33所述的抗体，其特征在于，所述抗体是单克隆抗体。
35.一种纯化权利要求1所述化合物的方法，其特征在于，所述方法包括使含所述化合物的样品与对其有特异免疫反应的抗体相接触，所述抗体偶联于一固体支持物上。
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