JPH11510361A

JPH11510361A - 内部開始ｒｎａ翻訳の選択的阻止

Info

Publication number: JPH11510361A
Application number: JP8512631A
Authority: JP
Inventors: ダス，サウミトラ; ダスグプタ，アシム; コワード，ピーター
Original assignee: ユニバーシティ・オブ・カリフォルニア
Priority date: 1994-10-11
Filing date: 1995-10-11
Publication date: 1999-09-14
Also published as: ATE276269T1; EP0784630B1; CA2201702A1; EP0784630A1; DE69533515D1; US5989904A; EP0784630A4; WO1996011211A1

Abstract

(57)【要約】ｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法であって、該ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする上記方法を開示する。該方法は、該ｍＲＮＡを翻訳することができる in vitro または in vivo 系において、タンパク質因子に対して選択的に結合する阻止有効量の分子を提供し、それによってその因子が該ｍＲＮＡに対して結合するのを妨げる工程を含む。そのインヒビター分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはこのようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体である。このようなインヒビターＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列としては、以下の配列、すなわち、酵母インヒビターＲＮＡの６０ヌクレオチド配列またはその酵母インヒビターＲＮＡに相補的な配列；ポリオウイルスのヌクレオチド１８６〜２２０（ステム−ループＤ）；ポリオウイルスのヌクレオチド５７８〜６１８（ステム−ループＧ）；ポリオウイルスのヌクレオチド２６０〜４１５（ステム−ループＥ）；ポリオウイルスのヌクレオチド４４８〜５５６（ステム−ループＦ）；および免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）の内部リボソームエントリー部位の配列の部分がある。

Description

【発明の詳細な説明】内部開始ＲＮＡ翻訳の選択的阻止本発明は、１９９４年１０月１１日出願の米国特許出願第08/321,427号明細書の一部継続出願であり、その開示はそのまま援用される。本発明は、米国国立保健研究所交付番号AI-18272、AI-27451およびAI-38056からの基金によって得られた。米国政府は本発明の当然の権利を有する。技術分野本発明は、ある種のｍＲＮＡの翻訳の選択的阻止に関する。更に詳しくは、本発明は、小ＲＮＡまたはその分子模擬体による、ピコルナウイルスＲＮＡなどの内部リボソームエントリー部位で開始されるｍＲＮＡの選択的阻止に関する。このＲＮＡまたは模擬体は、細胞タンパク質と特異的に相互作用して、内部リボソームエントリー部位に対するそのタンパク質の結合を妨げ、それによってそのエントリー部位での翻訳開始を阻止する。背景技術ピコルナウイルスには、特に、小児麻痺を引き起こすポリオウイルス、および風邪を引き起こすライノウイルスがある。ピコルナウイルスと同様の機序によって複製するピコルナに関連したウイルスには、ヒト肝炎の主要な原因であるＡ型およびＣ型肝炎がある。ポリオウイルスワクチンは利用可能であるが、ワクチン接種が適切に用いられないところでは、いまだにポリオの症例が見られる。他のピコルナウイルスに対するワクチンは、例えば、ライノウイルスのウイルスコートタンパク質の高い突然変異性率のために不可能であることがある。したがって、宿主細胞に対する毒性作用を伴うことなくピコルナウイルス複製を特異的に阻止するための方法および組成物に対する要求が存在する。ピコルナウイルス科の基本型メンバーであるポリオウイルスは、感染した細胞の細胞質中で増殖する一本鎖のプラスセンスＲＮＡウイルスである。そのＲＮＡゲノムは、約７．５００ヌクレオチドを含み且つ２５０ｋＤａポリタンパク質をコードする（キタムラ（Kitamura），Ｎ．ら Nature（1981）291:547-553およびラカニエロ（Racaniello），Ｖ．Ｒ．ら Proc Natl Acad Sci USA（1981）78 :4887-4891）。ポリオウイルスＲＮＡの異常に長い５′非翻訳部位（５′ＵＴＲ）（７５０ヌクレオチド）は、極めて構造がはっきりしていて（スキナー（Skin ner），Ｍ．Ａ．ら J Mol Biol（1989）207:379-392；アゴール（Agol），Ｖ．、Adv Virus Res（1991）40:103-180）且つ６〜８個上流にＡＵＧを含むが、それらの内で翻訳の開始に用いられると考えられるものはない（ペレティア（Pell etier），Ｊ．ら J Virol（1988a）62:4486-4492）。大部分の哺乳動物細胞ｍＲＮＡの翻訳は、５′キャップ構造に対するリボソームの結合に続いて、該リボーソームが適当なＡＵＧに出会うまでｍＲＮＡを走査することによって進行する（コザク（Kozak），Ｍ．Microbiol Rev（1983）47:1 -45）。対照的に、天然の無キャップポリオウイルスＲＮＡの翻訳は、イニシエーターＡＵＧ付近のリボソームの内部エントリーを必要とする機序によって媒介されることが分った（ペレティア，Ｊ．ら Nature（1988）334:320-325）。最近の研究は、リボソームの内部エントリーが、ポリオウイルスＲＮＡの５′ＵＴＲ中のヌクレオチド３２０〜６３１間に位置した要素を必要とすることを実証した（ペレティア，Ｊ．ら、上記）。この配列要素は、リボソーム結合パッド（la nding pad）（ＲＬＰ）、またはより一般的に、内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）と称された。多数の細胞ポリペプチドがＩＲＥＳ依存性翻訳に関係していたが、翻訳の内部開始の正確な機序はまだ十分に理解されていない。ポリオウイルスの他にも、多数の他のピコルナウイルスが、翻訳の開始のためにこの新規の機序を用いることが示された（ジャン（Jang），Ｓ．Ｋ．ら Gene s Dev （1990）4:1560-1572、ベルシャム（Belsham），Ｇ．Ｊ．ら J Virol（19 90）64:5389-5395、ジャクソン（Jackson），Ｒ．ら Trends Biochem Sci（199 0）15:477-483、ラズ（Luz），Ｎ．ら FEBS Letters（1990）269:311-314、ラズ，Ｎ．ら Virology（1991）65:6486-6494、ボンドパッダーエ（Bandopadhyay ），Ｐ．Ｋ．ら J Virol（1992）66:6249-6256、ボーマン（Borman），Ａ．ら Virology（1992）188:685-696、ボーマン，Ａ．ら Gen Virol（1993）74:177 5-1788）。２種類のピコルナ関連ウイルス、Ａ型およびＣ型肝炎のＲＮＡゲノムは、翻訳開始のために内部リボソームエントリーを用いることが示された（コハラ（Ko hara），Ｋ．Ｔ．ら J Virol（1992）66:1476-1483およびグラス（Glass），Ｍ．Ｊ．ら Virology（1993）193:842-852）。免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）をコードしている２種類の細胞ｍＲＮＡ、マウスアンドロゲン受容体（３２）およびショウジョウバエ（Drosophila）の触肢（antennapedia）もまた、翻訳の内部開始を用いることが示された（メイスジャク（Macejak），Ｄ．Ｇ．ら Nature（1991）353:90-94およびオー（Oh），Ｓ．Ｋ．ら Genes Dev（ 1992）6:1643-1653）。ＩＲＥＳ依存性翻訳を用いるピコルナウイルスｍＲＮＡは全て、５′ＵＴＲ中のＩＲＥＳ配列の３′境界に位置したポリピリミジン区域を含有する。最近の実証は、ポリオウイルス５′ＵＴＲのポリピリミジン区域とヌクレオチド５８６のクリプティックＡＵＧとの間の適当な間隔が、ウイルス翻訳にとって重要であることを示している（ジャクソンら（1990年、上記）、ジャンら（1990年、上記）、ピリペンコ（Pilipenko），Ｅ．Ｖ．ら Cell（1992）68:119-131）。ウサギ網状赤血球溶解産物中のポリオウイルスｍＲＮＡの正確な翻訳には、ヒーラ細胞タンパク質が必要であり、翻訳の内部開始における細胞タンパク質の関与が示される（ブラウン（Brown），Ｂ．Ａ．ら Virology（1979）97:376-405; ドーナー（Dorner ），Ｈ．Ａ．ら J Virol（1984）50:507-514）。５０ｋＤａタンパク質は、ポリオウイルス１型ＲＮＡ中のヌクレオチド１８６〜２２１間に位置したＲＮＡステム−ループ構造と相互作用することが示された（ナジタ（Na jita），Ｌ． Proc Natl Acad Sci USA（1990）87:5846-5850）。この結合の生理学的意義はまだ不明である。ウサギ網状赤血球中よりもヒーラ細胞中で豊富なｐ５２と称されるもう一つのタンパク質は、ポリオウイルス２型ＲＮＡのヌクレオチド５５９〜６２４間のステム−ループ構造に対して特異的に結合することが分った（ミーロビッチ（Meer ovitch），Ｋ．ら Genes Dev（1989）3:1026-1034）。このｐ５２タンパク質は、ヒトＬａ自己抗原と同一であると考えられる（ミーロビッチ，Ｋ．ら J Viro l （1993）67:3798-3807）。この核タンパク質は、自己免疫障害エリテマトーデスの患者からの抗体によって認識され、その核からポリオウイルスに感染したヒーラ細胞の細胞質中へ浸出する。Ｌａ抗体によって免疫衰弱した（immunodeplet ed）細胞抽出物は、キャップ非依存性翻訳を促進することができないし、そして精製Ｌａタンパク質の外部からの添加は、ｐ５２をほとんどまたは全く含まない網状赤血球溶解産物中のポリオウイルスＲＮＡの異常な翻訳を訂正する（ミーロビッチら（1993年、上記））。紫外線架橋実験は、もう一つの細胞タンパク質ｐ５７が、脳心筋炎（ＥＭＣ）ウイルス、口蹄疫ウイルス、ライノウイルス、ポリオウイルスおよびＡ型肝炎ウイルスのＩＲＥＳ要素と相互作用することを実証した（ジャンら、1990年、上記；ボロウジャギン（Borovjagin），Ａ．Ｖ．ら Nucleic Acids Res（1991）19: 4999-5005；ラズら、1991年、上記；ペストーバ（Pestova），Ｔ．Ｖ．ら J Vi rol （1991）65:6194-6204；ボーマンら、1993年、上記、およびチャン（Chang），Ｋ．Ｈ．ら J Virol（1993）67:6716-6725）。最近になって、ＥＭＣＶのＩＲＥＳに対するｐ５７結合は、ポリピリミジン区域結合タンパク質（ＰＴＢ）のそれと同一であることが実証されたが、おそらくは、それは核スプライシングにおいてある役割を果たしている（ヘレン（Ｈｅｌｌｅｎ），Ｃ．Ｕ．Ｔ．ら Pr oc Natl Acad Sci USA （1993）90:7642-7646）。抗ＰＴＢ抗体は、ＥＭＣＶおよびポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻止するので、ＰＴＢは、ＩＲＥＳに支配された翻訳に直接的に関与しているらしい。更に、分子量が３８および４８ｋＤａの２種類の他の細胞タンパク質は、ポリオウイルスのヌクレオチド２８６〜４５６にわたるＲＮＡ構造と特異的に相互作用することが示された。これら２種類のタンパク質は、網状赤血球溶解産物中よりも多量にヒーラ細胞中に存在することが報告され、ポリオウイルス翻訳に特異的に関与していると考えられる（ゲブハード（Gebhard），Ｊ．Ｒ．ら J Virol （1992）66:3101-3109）。もう一つの５４ｋＤａタンパク質は、ヌクレオチド４５６〜６２６間の部分に架橋し且つ全ｍＲＮＡの翻訳に必要とされる（ゲブハードら、1992年、上記）。最近の報告は、ヒトライノウイルスＲＮＡのＩＲＥＳ依存性翻訳における９７ｋＤａタンパク質の役割を示している（ボーマンら、1993 年、上記）。ＲＮＡ−タンパク質複合体形成は、更に、ポリオウイルスＲＮＡのヌクレオチド９８〜１８２および５１０〜６２９を包含する部分によって実証された（デル・アンジェル（del Angel），Ｐ．Ａ．Ｇ．ら Proc Natl Acad Sci USA （1989）86:8299-8303）。総合すると、上記の結果は、内部開始をもたらす細胞因子とＲＮＡ配列および／または二次構造との直接的相互作用を必要とするピコルナウイルス翻訳の機序と一致する。この機序における結合タンパク質の作用は知られていないが、トランス作用タンパク質は、リボソームがｍＲＮＡに入るように指示することができるしまたはＲＮＡ構造を変更してリボソーム結合を促進することができる。前の研究において、本発明者は、酵母細胞が in vivo でも in vitro でもポリオウイルスＲＮＡを翻訳することができないということ、および翻訳のこの欠如が、ウイルスＲＮＡの５′ＵＴＲを必要とする選択的翻訳阻止を表わしているということを示した（コワード（Coward），Ｐ．ら J Virol（1992）66:286-29 5）。その阻止作用は、ポリオウイルスＲＮＡを翻訳するヒーラ細胞抽出物の能力をも阻止することができる酵母溶解産物中に存在するトランス作用因子によることが分った。このインヒビターの初期の特性決定は、その活性が熱安定性で、プロテイナーゼＫ消化、フェノール抽出およびＤＮアーゼ消化に耐性であるが、ＲＮアーゼに対しては感受性であることを示した（コワードら、1992年、上記）。発明の開示本発明は、内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする、ポリオウイルスＲＮＡなどのｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法および組成物に関する。本発明は、内部開始翻訳を阻止するがキャップ依存性翻訳を阻止しない酵母Ｓ．セレビシエ（cerevisiae）からの６０ヌクレオチドのＲＮＡの識別に基く。酵母インヒビターＲＮＡ（Ｉ−ＲＮＡ）は、翻訳の内部開始に関与すると報告されている種々の細胞タンパク質を結合し、このようなタンパク質に対する結合に関してポリオウイルスＲＮＡの５′ＵＴＲと競合し、そして宿主細胞タンパク質合成に影響を与えることなくウイルスｍＲＮＡの翻訳を選択的に阻止する。宿主細胞中で発現された場合、インヒビターＲＮＡは、ポリオウイルスＲＮＡの翻訳を特異的に且つ効率よく阻止し、それによってこれらの細胞をウイルス感染から防護する。翻訳の阻止に対するこのＲＮＡの構造上の必要条件についての分析は、内部開始ＲＮＡ翻訳の実質的により小さいＲＮＡインヒビターの設計、そして最終的には、このようなインヒビターＲＮＡの非ＲＮＡ分子模擬体の設計を可能にした。したがって、一つの態様において、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法であって、その翻訳が、ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする上記方法に関する。この方法は、このｍＲＮＡを翻訳することができる系において、必要なタンパク質因子に対して選択的に結合する阻止有効量の分子を提供し、それによってその因子が該ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げる工程を含む。好ましい実施態様において、インヒビター分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチドまたはこのようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体である。他の態様において、本発明は、異型ヌクレオチド配列に対して結合した３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子をコードしている発現構築物、および本発明の翻訳阻止法において用いるのに適当なインヒビター分子であって、ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位によって示された分子間力の三次元配列を提供するインヒビター分子に関する。更に詳しくは、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法であって、その翻訳が、ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つ該部位に対するタンパク質因子の結合を必要とし、その方法が、対象ｍＲＮＡを翻訳することができる系において、該因子に対して選択的に結合する翻訳阻止有効量の分子を提供し、それによって該因子が該ｍＲＮＡの該部位に対して結合するのを妨げる工程を含み、ここにおいて該分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチド；および該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体から成る群より選択される上記方法に関する。該方法の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡは、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ラブドウイルス、アデノウイルスおよびパラインフルエンザウイルスから成る群より選択されるウイルスのウイルスＲＮＡである。特に、そのウイルスは、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、エコーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス、水泡性口内炎ウイルスおよびセンダイウイルスから成る群より選択されうる。或いは、阻止されるｍＲＮＡは、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）をコードしている細胞ｍＲＮＡのような、内部リボソームエントリー部位を含む細胞ｍＲＮＡでありうる。本発明の方法において、インヒビター分子は、ｍＲＮＡを翻訳することができる系に対して本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドを加えることによって提供されうる。或いは、該分子は、ｍＲＮＡを翻訳することができる系に対して、異型ヌクレオチド配列に対して結合したＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を加えることによって提供される。該ＲＮＡオリゴヌクレオチドはまた、対象ｍＲＮＡを翻訳することができる系でのＲＮＡオリゴヌクレオチドの in situ 生産のための発現構築物によって提供されうる。対象ｍＲＮＡを翻訳することができる、本発明の方法によって阻止される系は、細胞を含まない系であってよいし、または対象ｍＲＮＡを生産するウイルスに感染している若しくは感染の危険がある宿主細胞であってよい。該宿主細胞は、細胞培養物中かまたは、対象ｍＲＮＡの翻訳が阻止される宿主動物中の哺乳動物細胞であってよい。もう一つの態様において、本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する分子であって、その翻訳が、このｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする上記分子に関する。この分子は、該因子に対して選択的に結合し、それによって該因子が該ｍＲＮＡのリボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げる。本発明の分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチド；およびこのようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体から成る群より選択される。好ましい実施態様において、この分子は、図１Ａで示された配列；図１Ａで示された配列に相補的な配列；ポリオウイルスのヌクレオチド１８６〜２２０の配列（ステム−ループＤ）；ポリオウイルスのヌクレオチド５７８〜６１８の配列（ステム−ループＧ）；ポリオウイルスのヌクレオチド２６０〜４１５の配列（ステム−ループＥ）；ポリオウイルスのヌクレオチド４４８〜５５６の配列（ステム−ループＦ）；および該ｍＲＮＡの該内部リボソームエントリー部位に対して該タンパク質因子を結合する免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ｍＲＮＡの配列から成る配列の群より選択される少なくとも一部分を含む配列を有するＲＮＡオリゴヌクレオチドである。更に好ましい実施態様において、そのＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列は、リボヌクレオチド配列５′ＧＣＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＡ３′ である。他の態様において、本発明は、異型ヌクレオチド配列に対して結合した請求項１０のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子、およびＲＮＡ分子が、異型ヌクレオチド配列に対して結合した本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む該ＲＮＡ分子をコードしている発現構築物に関する。本発明は、更に、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する分子を識別するためのスクリーニング検定であって、その翻訳が、このｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする上記検定を提供する。このインヒビター分子は、翻訳開始因子に対して選択的に結合し、それによって該因子が該ｍＲＮＡのリボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げる。本発明の開始因子結合分子を識別する検定としては、固定化リガンド結合検定、溶液結合検定、シンチレーション近接検定、二遺伝子雑種スクリーニング検定等がある。本発明の方法および分子の好ましい実施態様において、タンパク質因子は５２ｋＤａＬａ自己抗原である。更に、見掛けの分子質量が８０、７０および３７ｋＤａの３種類の他のヒト細胞ポリペプチドを用いて、本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻止活性を示す分子を検出することができる。図面の簡単な説明図１は、典型的な酵母翻訳インヒビターＲＮＡ（Ｉ−ＲＮＡ）のヌクレオチド配列、クローニング、発現および活性を示す。パネルＡ：６０ヌクレオチド精製酵母インヒビターＲＮＡの配列［配列番号：１］は、材料および方法のところで記載のように決定された。ＲＮＡの５′および３′末端を示す。パネルＢ：ｐＳＤＩＲプラスミド発現Ｉ−ＲＮＡの略図。ＨｉｎｄＩＩＩおよびＥｃｏＲＩ制限エンドヌクレアーゼ部位の位置を示す。Ｔ７およびＳＰ６は、それぞれのプロモーターの位置を示し、そして矢印は転写方向を示す。パネルＣ：Ｉ−ＲＮＡ（センス転写物）は、ＨｉｎｄＩＩＩ制限酵素によって直鎖状にされたプラスミドｐＳＤＩＲから in vitro でＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写された。次に、合成されたＲＮＡ４マイクログラムを変性用ゲル添加染料（ＵＳバイオケミカルズ（Biochemicals））と混合し、５５℃で１０分間加熱した後、１．２％アガロース上においてＤＮＡ試料の分析用条件下で１ｋｂラダーＤＮＡ（ＢＲＬ）マーカー（Ｍ列）と一緒に分析した。ゲル上のＩ−ＲＮＡバンドの位置が示される。パネルＤ：ヒーラ細胞不含翻訳溶解産物中のｐＧ３ＣＡＴおよびｐ２ＣＡＴＲＮＡの in vitro 翻訳は、インヒビターＲＮＡの不存在下または存在下で行われた。ヒーラ細胞溶解産物８０μｇを含有する反応につき、ｐＧ３ＣＡＴまたはｐ２ＣＡＴＲＮＡ２μｇを加えた。部分精製された酵母インヒビターＲＮＡ約４μｇおよび合成インヒビターＲＮＡ１μｇを、図で示されたそれぞれの反応において用いた。ＣＡＴ遺伝子産物の位置をくさび形によって示す。図２は、酵母インヒビターＲＮＡによる翻訳の阻止に対するポリオウイルス５ ′ＵＴＲ配列の必要条件を図示する。パネルＡ、ＢおよびＣ：ヒーラ細胞不含翻訳溶解産物を用いて、各パネルの列の上に記載のＲＮＡを翻訳した。in vitro 翻訳は、それぞれの欠失突然変異構築物について示されたようなキャップ付きかまたは無キャップＲＮＡ約２μｇを用いて、精製Ｉ−ＲＮＡ１μｇの不存在下または存在下で行われた。各反応は、ヒーラ細胞溶解産物タンパク質８０μｇを含んだ。ＣＡＴタンパク質の位置をパネルＡの左側に示す。パネルＤ：略図は、上の実験に用いられたポリオウイルス５′−ＵＴＲ欠失突然変異構築物を示す。垂直に線を引いた箱形は、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼプロモーターを表す。黒一色の箱形は、ポリオウイルス５′−ＵＴＲからの配列を表し、そして斜線を引いた箱形は、ＣＡＴ遺伝子コーディング配列を示す。プラスミドの下の数は、欠失の先端のヌクレオチドを表す。図３は、Ｉ−ＲＮＡと細胞タンパク質との複合体の形成を図示するが、それは、ゲル電気泳動中にＩ−ＲＮＡを遅延させ且つポリオウイルスＲＮＡの５′−ＵＴＲによって競合的に阻止される。³²Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡプローブを、以下の実施例で記載の結合反応においてヒーラＳ−１０抽出物と一緒にまたは用いることなくインキュベートした。ＲＮＡ−タンパク質複合体を、非変性用４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。パネルＡは、Ｓ−１０抽出物不存在下の遊離プローブ（ＦＰ）（列２）からＳ−１０存在下の複合体形成された形（Ｃ）までの移動度変位を示す。バネルＢは、未標識コンペティター（competitor）ＲＮＡとの競合実験の結果を示す。結合反応において、１０倍、５０倍および１００倍モル過剰の未標識Ｉ−ＲＮＡ（列３〜５）または未標識５′−ＵＴＲ（列７〜９）を用いた。列１０の反応は、１００倍モル過剰の未標識非特異的ＲＮＡ（ＮＳＰ）を含んだ。図４は、Ｉ−ＲＮＡが、ポリオウイルス５′−ＵＴＲと相互作用するタンパク質を結合することを示す。ヒーラ細胞タンパク質による³²Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡの紫外線架橋は、以下の実施例で記載のように行われた。パネルＡ：左側の数は、Ｉ −ＲＮＡと相互作用するタンパク質のおよその分子質量を表す。競合実験に対しては、それぞれの結合反応において１００倍モル過剰のそれぞれの未標識コンペティター（competitor）ＲＮＡを加えた。用いられたコンペティターＲＮＡは、Ｉ−ＲＮＡ（列３）、５′−ＵＴＲ（列４）および非特異的（Ｎｓｐ）ＲＮＡ（列５）であった。パネルＢ：左側の数は、タンパク質マーカー（ＢＲＬ）（列Ｍ）の分子質量を表す。右側の数は、標識Ｉ−ＲＮＡプローブに対して架橋する各タンパク質の分子質量を表す。結合反応において、Ｉ−ＲＮＡ（列３）、ＵＴＲ５５９−６２４ＲＮＡ（列４）および非特異的（Ｎｓｐ）ＲＮＡ（列５）などの１００倍モル過剰の未標識コンペティターＲＮＡを用いた。図５は、異なった構造のドメインによる細胞タンパク質との可能な相互作用部位を示すポリオウイルスＲＮＡの５′ＵＴＲの予測される二次構造を図示する。それらの可能な相互作用部位（括弧内のヌクレオチドによって示される）を有する細胞タンパク質の分子質量を示す。図は、ピリペンコら（1992年、上記）、ジャクソンら（1990年、上記）およびディルジン（Dildine），Ｓ．Ｌ．ら J Vir ology （1992）66:4364-4376によって公開された二次構造予測の修飾された変形である。図６は、³²Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡ、５′ＵＴＲＲＮＡ、ステム−ループＳＬ−ＧおよびＳＬ−ＤＲＮＡプローブに対するヒーラ細胞タンパク質の紫外線架橋を図示する。パネルＡ：左側の数は、タンパク質マーカー（列Ｍ）の分子質量を表す。Ｉ−ＲＮＡ（列１、２）、５′ＵＴＲＲＮＡ（列３、４）、ステム−ループＧＲＮＡ（列５、６）およびステム−ループＤＲＮＡ（列７、８）などの個々の³²Ｐ標識ＲＮＡプローブを、結合反応においてヒーラＳ−１０抽出物と一緒に（列２、４、６、８）かまたは用いることなく（列１、３、５、７）インキュベートした後、紫外線架橋およびゲル分析を行った。パネルＡの右側の数は、架橋したタンパク質のおよその分子質量を表す。パネルＢ：列１および２それぞれの³²Ｐ標識ステム−ループＳＬ−Ｇ（ＵＴＲ５５９−６２４）およびＳＬ−Ｄ（ＵＴＲ１７８−２２４）ＲＮＡを、ヒーラＳ−１０抽出物と一緒にインキュベートし、架橋し、そして平行して分析して、架橋したタンパク質の移動度を比較した。右側の数は、くさび形によって示されたタンパク質の推定の分子質量を表す。図７は、Ｉ−ＲＮＡが、タンパク質結合に関してステム−ループＳＬ−ＧおよびＳＬ−Ｄ両方と競合することを示す。紫外線架橋実験で用いられた³²Ｐ標識ＲＮＡプローブを各パネルの上部に記載する。パネルＡの左側の数は、列Ｍのタンパク質マーカーの分子質量を示す。パネルＡ：列１、抽出物なし；列２、未標識コンペティターＲＮＡ不含抽出物；列３、未標識５′ＵＴＲコンペティター；列４、未標識Ｉ−ＲＮＡコンベティター；列５，未標識ステム−ループＳＬ−Ｇ（すなわち、ＵＴＲ５５９−６２４）；列６，未標識ＳＬ−Ｄ（すなわち、ＵＴＲ１７８−２２４）；列７、未標識非特異的ＲＮＡ；列８、未標識ＳＬ−ＢＲＮＡ（すなわち、ＵＴＲ５１−７８）；列９、未標識ＳＬ−ＣＲＮＡ（すなわち、ＵＴＲ１２４−１６２）。パネルＢ：列１、抽出物なし；列２、未標識ＲＮＡ不含抽出物；列３、未標識５′ＳＬ−ＧＲＮＡコンペティター；列４、未標識Ｉ−ＲＮＡコンペティター；列５，未標識５′ＳＬ−ＤＲＮＡコンペティター；列６，未標識非特異的ＲＮＡコンペティター；列７、未標識ＳＬ−ＢＲＮＡ；列８、未標識ＳＬ−ＣＲＮＡ。パネルＣ：列１、抽出物なし；列２、未標識コンペティター不含抽出物；列３、未標識ＳＬ−Ｄコンペティター；列４、未標識Ｉ−ＲＮＡコンペティター；列５、非特異的ＲＮＡ；列６、未標識ＳＬ−Ｇコンペティター；列７、未標識ＳＬ−ＢＲＮＡ；列８、未標識ＳＬ−ＣＲＮＡ。くさび形は、下部から上部までそれぞれ５２，５４および５７ｋＤａの分子質量のタンパク質とのタンパク質−ヌクレオチジル複合体を示す。図８は、Ｉ−ＲＮＡが、in vitro での翻訳の内部開始を阻止することを実証する。パネルＡ：リポーター遺伝子に対して結合したＢｉｐｍＲＮＡの５′ＵＴＲを含有する構築物ｐＢＩＰ−ＬＵＣ（ルシフェラーゼ）を、酵母インヒビターの不存在下（列１）または存在下（列２）において、ヒーラ細胞溶解産物中に in vitro で翻訳した。対照として、構築物ｐＧ３ＣＡＴもまた、酵母インヒビターの不存在下（列３）または存在下（列４２）で翻訳した。生産物をＳＤＳ− １４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。左側のくさび形は、ルシフェラーゼ遺伝子産物（ＬＵＣ）の位置を示し、そして右側のくさび形は、ＣＡＴ遺伝子産物（ＣＡＴ）を示す。パネルＢ：ＴＭＥＶ５′ＵＴＲに隣接したＣＡＴ遺伝子およびルシフェラーゼ遺伝子を含有するビシストロン構築物ｐＰＢ３１０を、Ｉ−ＲＮＡの不存在下（列１）または存在下（列２）において、ヒーラ細胞溶解産物中にin vitro で翻訳した。生産物をＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。左側のくさび形は、ＣＡＴ遺伝子の産物（ＣＡＴ）およびルシフェラーゼ遺伝子産物（ＬＵＣ）の位置をを示す。図９は、Ｉ−ＲＮＡが、in vivo でポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻止することを示す。ヒーラ細胞の単層を、ウイルスＲＮＡ単独によって、Ｉ−ＲＮＡ単独によって、またはウイルスＲＮＡおよびＩ−ＲＮＡ両方によってトランスフェクションした。トランスフェクション後、細胞を³⁵Ｓ−メチオニンによって標識し、そして in vivo で標識されたタンパク質を、以下の実施例で記載のように、直接的に（パネルＡ）かまたは抗キャプシド抗体による免疫沈降後に（パネルＢ）ＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲル上で分析した。パネルＡ：それぞれのトランスフェクション反応に対して加えられたＲＮＡは、図で示された通りである。パネルＢ：パネルは、パネルＡ、列１〜５で示されたトランスフェクション反応からの免疫沈降した in vivo 標識タンパク質を示す。ポリオウイルスキャプシドタンパク質の位置をパネルＢの左側に示す。図１０は、コンピューターで予測された酵母インヒビターＲＮＡの二次構造を図示する。パネルＡおよびＢは、ＲＮＡの二つの可能な二次構造を示す。数は、ＲＮＡの５′末端からのヌクレオチドの位置を表す。それぞれの予測された構造について計算された自由エネルギーをそれぞれの構造の下に与える。図１１は、酵母Ｉ−ＲＮＡが、in vitro において内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）に媒介される翻訳を特異的に阻止することを示す。（Ａ）ヒーラ細胞抽出物におけるビシストロン構築物からのＩＲＥＳに媒介される翻訳のＩ −ＲＮＡによる阻止。ルシフェラーゼ（Ｌｕｃ）の合成は、ウイルスＩＲＥＳ要素から内部開始され、そしてＣＡＴのそれは、Ｃａｐ依存性方式で開始される（５′Ｃａｐ−ＣＡＴ−ＩＲＥＳ−ＬＵＣ３′）。列１、４、５および７は、Ｉ− ＲＮＡを含まなかった。列２、３、６および８は、Ｉ−ＲＮＡ１μｇを含んでいた。（Ｂ）免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ、列１、２）、ＣＡＴ（列３、４、９、１０）、Ｐ２ＣＡＴ（ＰＶ５′ＵＴＲ含有、列７、８）、ｐＧｅｍＬＵＣ（列５、６）、ｐＣＩＴＥ（ＥＭＣＶＩＲＥＳ含有、列１１、１２）および酵母α３６ｍＲＮＡ（列１３、１４）の種々のモノシストロンＲＮＡによって媒介される in vitro 翻訳に対するＩ−ＲＮＡの作用。列１、３、５、７、９、１１、１３は、インヒビターを含まなかった。列２、４、６、８、１０、１２、１４は、Ｉ−ＲＮＡ１μｇを含んでいた。図１２は、ヒーラ５２ｋＤａＩ−ＲＮＡ結合タンパク質がＬａ自己抗原と同一であることを示す。二つの検定、すなわち、ゲル遅延に続くＬａ抗体による超移動（左）および紫外線架橋に続くＬａ抗体による免疫沈降（右）を行って、ヒーラ細胞タンパク質を結合した５２ｋＤａＩ−ＲＮＡをＬａ抗原として同定した。図１３は、アンチセンスＩ−ＲＮＡもまた、ＵＴＲ（５５９−６２４）と相互作用するヒーラ５２ｋＤａタンパク質を結合することを示す。³²Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡ（列１および２）またはアンチセンスＩ−ＲＮＡ（列３および４）とヒーラ細胞不含抽出物（Ｓ１０）Ａ５２ｋＤａタンパク質との紫外線架橋は、Ｉ−ＲＮＡおよび、コールド（cold）ＵＴＲ５５９−６２４（列２）によって競合されうる抗Ｉ−ＲＮＡ（くさび形で示された）の両方に対して複合体形成する。列Ｍは、上部からそれぞれ４３および２９ｋＤａの大きさの１４Ｃ標識タンパク質分子質量マーカーを含んだ。（Ａ）ゲル遅延：³²Ｐ標識Ｉ−ＲＮＡプローブを、ヒーラＳ１０抽出物５０μｇと一緒に（列２および３）またはクローンから発現された精製Ｌａタンパク質０．３μｇと一緒に（列４および５）、Ｌａタンパク質の抗体の存在下（列３および５）または不存在下（列２および４）でインキュベートした。ヒーラＳ１０または精製Ｌａタンパク質と一緒に形成されたＩ−ＲＮＡ− タンパク質複合体（Ｃで表される）は両方とも、抗Ｌａ抗体と一緒に超移動した（ＳＳによって示される）。前免疫ＩｇＧは、複合体（Ｃ）の泳動を変化させなかった。（Ｂ）³²Ｐ−Ｉ−ＲＮＡ（列１、２および３）または³²ＰＵＴＲ５５９−６２４ＲＮＡ（列４、５および６）を、ヒーラＳ１０タンパク質に対して（列２および５）または精製Ｌａタンパク質に対して（列３および６）紫外線架橋させた。ＲＮアーゼ消化後、タンパク質−ヌクレオチジル複合体を、抗Ｌａ抗体を用いて免疫沈降させた。前免疫ＩｇＧは、５２ｋＤａ（Ｌａ）−Ｉ−ＲＮＡ複合体を認識しなかったが、疑問符によって示された約１１０ｋＤａのところに泳動した非特異的タンパク質を認識した（データは示されなかった）。図１４は、キャップ依存性翻訳（ＣＡＴ）ではなく内部開始による翻訳（Ｐ２ＣＡＴ）を特異的に阻止する場合のＩ−ＲＮＡ配列を含有する１４ヌクレオチド長さＲＮＡ（ＢＩ−ＲＮＡ）の阻止活住を示す。図は、Ｉ−ＲＮＡ（列２）かまたはＢＩ−ＲＮＡ１μｇ（列３および６）および２μｇ（列４）の存在下、または不存在下（列１および５）でのＰ２ＣＡＴ（列１〜４）またはｐＣＡＴ（列２および６）構築物からのＣＡＴ遺伝子（くさび形によって示された）の翻訳を示す。図１５は、図１０で示されたような、コンピューターで予測された酵母インヒビターＲＮＡの二次構造の前後関係のＩ−ＲＮＡ配列を含有する活性１４ヌクレオチドＢＩ−ＲＮＡの配列を図示する。パネルＢ中の実線は、図１４で記載の内部開始を用いる翻訳を阻止することが示されたＢＩ−ＲＮＡの１４ヌクレオチドを包含する。ＢＩ−ＲＮＡ中において、天然のＩ−ＲＮＡ構造のヌクレオチド１３は、慣用的なホスホジエステル結合によってヌクレオチド３０に対して直接結合している。図１６は、翻訳阻止活性について試験されたＩ−ＲＮＡ欠失突然変異構築物を図示する。突然変異部位のヌクレオチド位置を、それぞれの突然変異体について示す。それぞれの突然変異体の名称を左端に挙げる。発明の実施態様一般的な説明および定義本発明の実施は、特に断らない限り、当該技術の範囲内の従来の生化学、免疫学、分子生物学および組換えＤＮＡ技術を用いるであろう。このような技術は、文献中で充分に説明されている。例えば、マニアティス（Maniatis）ら、Molecu lar Clonin:A Laboratory Manual （1982）；DNA Cloning ：A Practical Approa ch，ＩおよびII巻（Ｄ．グロバー（Grover）監修）；Oligonucleotide Synthesi s（Ｎ．ゲイト（Gait）監修、1984年）；Nucleic Acid Hybridization（Ｂ．ヘイムズ（Hames）およびＳ．ヒギンス（Higgins）監修、1985年）；Transcriptio n and Translation（Ｂ．ヘイムズおよびＳ．ヒギンス監修、1984年）；Animal Cell Culture（Ｒ．フレッシュニー（Freshney）監修、1986年）；パーバル（Pe rbal）、A Practical Guide to Molecular Cloning（1984）を参照されたい。以下の用語は、本発明を記載する場合の以下に示された定義にしたがって用いられるであろう。ＤＮＡ「対照配列」とは、集合的に、プロモーター配列、リボソーム結合部位、ポリアデニル化シグナル、転写終結配列、上流調節ドメイン、エンハンサー等を意味し、それは、集合的に、宿主細胞中のコーディング配列の転写および翻訳に対して与えられる。コーディング配列は、該コーディング配列の発現系が適当な宿主細胞中に包含されている場合にその発現が起こる場合に、「機能的に結合」して配列を制御する。「宿主細胞」は、外因性ＤＮＡまたはＲＮＡ配列を含むように修飾された、または含むように修飾可能である細胞である。これには、例えば、ウイルスに感染した細胞または組換えＤＮＡ分子によって形質転換された細胞がある。ＤＮＡまたはＲＮＡ構築物の「異型」部分は、天然の他の分子との関係が分らない別の核酸分子中のまたはそれに対して結合したＤＮＡまたはＲＮＡの識別可能なセグメントである。翻訳インヒビター分子の識別本発明は、ｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法であって、その翻訳が、そのｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つ該部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする上記方法に関する。該方法は、該ｍＲＮＡを翻訳することができる系において、該因子に対して選択的に結合する翻訳阻止有効量の分子を提供し、それによってその因子が該ｍＲＮＡの該リボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げる工程を含む。本発明の翻訳インヒビター分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチドおよび該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体から成る群より選択される。本発明による翻訳インヒビター分子の識別は、第一に、酵母Ｓ．セレビシエからの天然に存在するインヒビターＲＮＡの６０ヌクレオチド配列の単離および決定によって例証される。このＲＮＡは、例えば、ピコルナウイルスｍＲＮＡの内部開始翻訳を阻止するがキャップ依存性翻訳を阻止しない。この小インヒビターＲＮＡ（Ｉ−ＲＮＡ）の単離および配列順序決定は、実施例１で記載される。インヒビターＲＮＡの配列をコードしている合成ＤＮＡクローンの製造、およびＴ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写による該合成クローンからのＲＮＡの製造は、実施例２で例証される。これらの方法は、当該技術分野において周知である常套法を用いて、本発明の他のＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造に適応しうる。本発明による、キャップ依存性翻訳にほとんど影響を与えることなく内部リボソームエントリーによって開始される翻訳の選択的阻止は、ＩＲＥＳ−および５ ′キャップに媒介される翻訳開始部位両方を含む組換えＲＮＡ構築物を用いる i n vitro の方法によって都合よく実証されうる。例えば、実施例３を参照されたい。或いは、または更に、内部開始翻訳の選択的阻止は、実施例７で記載されたような別のウイルスｍＲＮＡの、または実施例８で例証される免疫グロブリン重鎖結合タンパク質をコードしているｍＲＮＡなどの内部開始細胞ｍＲＮＡの組換えビシストロンｍＲＮＡ構築物を用いて in vitro で実証されうる。本発明の翻訳インヒビター分子は、内部リボソームエントリー部位での翻訳の開始に必要とされるタンパク質因子に対して結合し、それによってその因子がｍＲＮＡの該リボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げることによって、内部リボソームエントリー部位からの翻訳を選択的に阻止する。インヒビター分子のこのような結合は、本発明の典型的な酵母Ｉ−ＲＮＡによるポリオウイルスＲＮＡ配列およびヒーラ宿主細胞タンパク質因子間の複合体の破壊について実施例４で記載されたように、競合的結合法を用いて、必要なタンパク質因子および選択されたｍＲＮＡ間の複合体を破壊させることができる。更に、翻訳の内部開始に必要なタンパク質因子に対する本発明のインヒビター分子の直接結合は、例えば、実施例５において酵母Ｉ−ＲＮＡ分子について記載された紫外線架橋法を用いて都合よく実証されうる。ウイルスｍＲＮＡの翻訳を in vivo で阻止する本発明のインヒビター分子の能力は、実施例９で例証される、ウイルス複製および病原性作用を阻止する、酵母Ｉ−ＲＮＡによるトランスフェクションされた細胞中でのポリオウイルスＲＮＡ翻訳の阻止について示されたように、細胞培養物中で都合よく実証されうる。したがって、本明細書中の一般的な指針および実施例に基き、ある与えられた分子が、本発明の翻訳インヒビターの活性、すなわち、ｍＲＮＡの翻訳の阻止であって、その翻訳が内部リボソームエントリー部位で開始され且つその部位に対するタンパク質因子の結合を必要とする該翻訳の、該因子に対して選択的に結合することによって該因子が対象ｍＲＮＡの該リボソームエントリー部位に対して結合するのを妨げることによる阻止を示すかどうかを常套法を用いて確認することができる。酵母Ｉ−ＲＮＡに基く活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの識別一つの好ましい実施態様において、本発明の翻訳インヒビター分子は、６０未満のヌクレオチドから成る、好ましくは３５未満のヌクレオチド、更に好ましくは２５未満のヌクレオチド、そしてなお更に好ましくは１５未満のヌクレオチドから成る、典型的な酵母Ｉ−ＲＮＡの配列に基くＲＮＡオリゴヌクレオチドである。当該技術分野で知られているように、６０ヌクレオチドより短い機能性Ｉ− ＲＮＡは、慣用的な化学合成による製造に関しておよび拡散による自然のままの細胞中へのそれらの侵入に関してより大きい効率を与えるので、タンパク質因子結合による翻訳阻止に必要なＩ−ＲＮＡの最小配列を決定することは好都合である。酵母Ｉ−ＲＮＡの１個または複数のフラグメントが、本発明による翻訳阻止活性を示すことを確認するために、慣用的な遺伝子工学技術を用いて、Ｉ−ＲＮＡの５′および３′両末端から欠失突然変異体を製追する。１０、２０または３０ヌクレオチドを、Ｉ−ＲＮＡの５′かまたは３′末端から一度に欠失させる。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼを用いる転写によってこれらのクローンから製造されたＲＮＡを、本明細書中の実施例で記載のように、キャップ依存性翻訳ではなくＩＲＥＳに媒介される翻訳を阻止する能力について試験する。慣用法を用いても、Ｉ−ＲＮＡ分子中の８〜１０ヌクレオチド配列の一組の欠失を生じる。これらの体系的欠失法は、ウイルス翻訳および宿主タンパク質因子に対する結合の阻止に必要な配列を識別するであろう。したがって、ＩＲＥＳに媒介される翻訳を阻止するこのような突然変異体は、酵母Ｉ−ＲＮＡに対して結合することが分ったｐ５２因子などのタンパク質因子、またはＩ−ＲＮＡに媒介されるウイルス翻訳の阻止に関与している本明細書中で前述の他の因子（例えば、ｐ５７）に対する結合活性の減損について試験されるであろう。図１２で図示されたように、酵母Ｉ−ＲＮＡに対して結合するｐ５２因子は、免疫学的検定によって示されたように、ヒトＬａ自己抗原と同一である。この同一性は、更に、免疫沈降に続くＩ−ＲＮＡに対する組換えＬａタンパク質の紫外線架橋および抗Ｌａ抗体とのＬａ−Ｉ−ＲＮＡ複合体を超移動させる能力両方によって確証される（図１２）。Ｉ−ＲＮＡに対するＬａの結合が翻訳阻止に関係しているということは、精製組換えＬａタンパク質が、ＰＶＩＲＥＳに媒介される翻訳をインヒビターＲＮＡの存在下において回復させることができるという事実によって示される。完全長さまたは欠失したＩ−ＲＮＡに対して結合するおよび本発明の他のインヒビター分子を識別するのに用いることができる更に別のタンパク質因子を以下に記載する。より選択的な突然変異分析を更に用いて、典型的な酵母Ｉ−ＲＮＡのような活性Ｉ−ＲＮＡの一層大きい配列に基く本発明の活性オリゴヌクレオチドを識別することができる。特に、酵母Ｉ−ＲＮＡの配列に対して正確に相補的な配列を有するアンチセンスＲＮＡは、ｐ５２を結合する場合にセンスＩ−ＲＮＡ分子と同程度に有効である。図１３を参照されたい。酵母Ｉ−ＲＮＡの配列相同性は明らかでなく、ポリオウイルスＲＮＡ配列が、翻訳の開始に必要な宿主細胞タンパク質因子を結合するということを総合したこの結果は、Ｉ−ＲＮＡの二次構造が、翻訳の内部開始の阻止において決定的な役割を果たしうることを示唆する。したがって、任意のＲＮＡに相補的な配列の二次構造の多数の態様は、概して、同一の鎖内塩基対合が元の配列中と同様に相補鎖で形成しうると考えられるので、配列それ自体の二次構造と類似していると考えられる。実際に、コンピューターで予測された２種類のＩ−ＲＮＡの二次構造が得られ、それらは熱力学的に比較的安定であり、−２７および−２１Ｋｃａｌ／モルの ΔＧを有する（図１０）。（これらの構造は、商業的に入手可能なＤＮＡＳｙＳと称されるソフトウェアを用いて予測されたが、他の同様のソフトウェアが広く知られており且つ入手可能である。例えば、ピリペンコら（1992年、上記）、ジャクソンら（1990年、上記）およびディルジン，Ｓ．Ｌ．ら（1992年、上記）を参照されたい。これらの二次構造は、部分的にはポリオウイルスｍＲＮＡ上のｐ５２結合部位に似ている。更に、６０ヌクレオチド長さの天然のＩ−ＲＮＡの二次構造（図１０）は、典型的なクローニング手順の際に生じた余分な１１ヌクレオチドの追加によってほとんど変化しない。したがって、二次構造の適当な分析により、異型配列に対する本発明の活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの結合が、該オリゴヌクレオチドの二次構造を脱安定化し、それによってその翻訳阻止活性を破壊するかどうかを予測することができる。更に、必要な活性の保持は、本明細書中に記載の常套法を用いて、任意の望ましいＲＮＡオリゴヌクレオチドについて容易に確認することができる。酵母Ｉ−ＲＮＡの予測された二次構造中の種々のループに対応するＲＮＡオリゴヌクレオチドを試験することにより、Ｉ−ＲＮＡの１４ヌクレオチド長さフラグメントは、ポリオウイルスＩＲＥＳに媒介される翻訳を特異的に阻止することが分った。図１４を参照されたい。コンピューターで予測された二次構造中のループを含むＲＮＡオリゴヌクレオチドを試験することは、酵母Ｉ−ＲＮＡのヌクレオチド３０〜３６に対して（慣用的な５′−３′ホスホジエステル結合によって）共有結合したヌクレオチド７〜１３から成る典型的な１４ヌクレオチドフラグメントのような、より大きいＩ−ＲＮＡ配列の非隣接部分を含有する活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの識別を可能にするということに注目すべきである。酵母Ｉ−ＲＮＡの体系的欠失分析の実験結果を実施例１０で例証する。この分析は、ＰＶＩＲＥＳに媒介される翻訳を阻止するのに必要な最小Ｉ−ＲＮＡ配列が、ヌクレオチド３０〜４５間にあるらしいことを示している。この結論は、二つの知見によって支持される。第一に、ヌクレオチド３１〜４５を除くＩ−ＲＮＡ配列全体を含む欠失突然変異体（Ｉ−３ＲＮＡ）は、ウイルスＩＲＥＳに媒介される翻訳を阻止する場合に完全に不活性である。第二に、切断されたＩ−ＲＮＡ（ｎｔ３０〜４５、Ｉ−９ＲＮＡ）は、相当な翻訳阻止活性を保持している。しかしながら、Ｉ−９ＲＮＡ配列を含有する２５ｎｔ長さの切断されたＲＮＡ（Ｉ−７ＲＮＡ）は、特に、in vivo において更に活性であるらしい。更に短いＩ−９ＲＮＡは、in vivo においてＩ−ＲＮＡと同程度の僅か５０％活性であった。Ｉ−７およびＩ−９ＲＮＡは両方とも、ステム・ループ配列を有する二次構造を仮定することができる。明らかに、より小さい寸法のために、Ｉ−９ＲＮＡは、細胞内のＩ−９ＲＮＡの安定性に影響を与えることがあるＩ−ＲＮＡよりもはるかに安定性が少ない。既知のチオ誘導体または他の耐ヌクレアーゼ性ヌクレオチド類似体は、Ｉ−９ＲＮＡまたは細胞に対して外因的に与えられる本発明の他のインヒビターＲＮＡの安定性、したがって活性を増加させるのに用いることができる。Ｉ−ＲＮＡまたはその切断された誘導体の１種類または複数の構造は、ＩＲＥＳに媒介される翻訳阻止において重要でありうる。Ｉ−７ＲＮＡ（ｎｔ２６〜５０）の３′末端に対する余分の１０ヌクレオチドの追加が、その（Ｉ− ６ＲＮＡ、ｎｔ２６〜６０）翻訳阻止活性を減少させるということは、本発明のインヒビターＲＮＡの３′末端を設計する場合に避けるべきであるこのＲＮＡの構造の変更を示すものでありうる。同様に、Ｉ−６ＲＮＡの５′末端に対する別の５ヌクレオチドの追加は、翻訳を阻止するその（Ｉ−５、ｎｔ２６〜５０）能力を劇的に減少させ、インヒビターＲＮＡ設計におけるこのような５′末端作用を考える必要性が示される。翻訳阻止の原因となる配列および二次構造を識別するための、例えば、ｐ５２結合によるもう一つの代替法は、ｐ５２に対して結合したＩ−ＲＮＡのドメインがＲＮアーゼ消化に耐えるかどうかを、当該技術分野において知られている常套法によって確認することである。この方法においては、³²Ｐ−ボディー標識Ｉ− ＲＮＡを、結合条件下において精製ｐＲ２と一緒にインキュベートする。得られた複合体を、ミクロコッカスヌクレアーゼまたはＲＮアーゼＴ１、Ｔ２およびＡの混合物によって消化する。次に、その混合物を、フェノール抽出およびエタノール沈降後に、１個またはそれ以上の保護されたフラグメントについて分析する。Ｉ−ＲＮＡの保護されたフラグメントを、例えば、商業的に入手可能な配列決定用キットを用いて直接的に配列順序決定する。代わりの配列決定法は、保護されたフラグメントを、Ｉ−ＲＮＡをコードしているｃＤＮＡとハイブリッド形成させた後、そのハイブリッドの一本鎖部分を消化し、そしてＲＮＡ配列決定よりも比較的容易である保護されたＤＮＡフラグメントの配列決定を行うことである。次に、保護されたフラグメントを、本明細書中に記載のように、翻訳阻止およびタンパク質因子に対する結合に関する非特異的ＲＮＡとではなく未標識Ｉ−ＲＮＡとの特異的競合について試験する。ｐ５２Ｌａ自己抗原タンパク質の他にも、他のタンパク質因子が識別されたが、それは、Ｉ−ＲＮＡまたはその欠失突然変異体に対して結合し、したがって本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻止活性を有する他の分子を識別するのに（例えば、結合検定において）用いることができる。種々の標識ＲＮＡを用いる紫外線架橋実験および競合実験は、Ｉ−７およびＩ−４突然変異体Ｉ−ＲＮＡ両方が、２種類の共通のポリペプチド、すなわち、５２および３７ｋＤａを結合したことを実証した（実施例１１を参照されたい）。しかしながら、これら二つのＲＮＡは、Ｉ−７ＲＮＡは８０ｋＤａポリペプチドを結合したが、Ｉ−４ＲＮＡは７０ｋＤａポリペプチドと相互作用したという点で互いに異なった。したがって、５２および３７ｋＤａポリペプチドに加えて、ウイルス５′−ＵＴＲに対する８０ｋＤａタンパク質の結合は、内部開始を引き起こすのに重要でありうるし、そしてＩ −７ＲＮＡは、これらのポリペプチドを結合する場合に５′−ＵＴＲと直接的に競合しうる。紫外線架橋実験を用いたマイヤー（Meyer）らによる最近の報告は、口蹄疫ウイルス（ＦＭＤＶ）のＩＲＥＳに媒介される翻訳における８０ｋＤａタンパク質の重要性を示している（マイヤー，Ｋ．、Ａ．ピーターセン（Peters en）、Ｍ．ニープマン（Niepmann）およびＥ．ベック（Beck）（1995）J.Virol. 69:2819-2824）。この８０ｋＤａタンパク質は、開始因子ｅＩＦ−４Ｂとして識別された。マイヤーらによって与えられた結果は、更に別のタンパク質因子が、ｅＩＦ −４ＢとＦＭＤＶＩＲＥＳとのこの相互作用の一因となっていることを示唆する。したがって、ウイルスＩＲＥＳに対するｅＩＦ−４Ｂの結合は、Ｌａおよび３７ｋＤａポリペプチド、およびまたは他のポリペプチドを必要としうる。Ｉ− ７ＲＮＡは、これらのポリプチドを結合することにより、ＩＲＥＳに媒介される翻訳を妨げることができる。したがって、８０ｋＤａタンパク質の結合を最終的に妨げる能力は、本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻止活性を有するインヒビターの指標であると考えられる。５２および３７ｋＤａポリペプチドとのそれらの相互作用にもかかわらず、Ｉ −４およびＩ−８ＲＮＡは、それらが８０ｋＤａポリペプチドと相互作用できないために、翻訳を効率よく阻止しないことがある。Ｉ−４およびＩ−８ＲＮＡに対する７０ｋＤａタンパク質の結合は、おそらくは、これらのＲＮＡが８０ｋＤａタンパク質と相互作用するのを妨げることにより、ＩＲＥＳに媒介される翻訳を妨げるそれらの能力を阻止することができる。したがって、７０ｋＤａタンパク質に対する結合の欠損もまた、本発明のＩ−ＲＮＡの翻訳阻止活性を有するインヒビターの指標であると考えられる。阻止ＲＮＡオリゴヌクレオチドの他のＲＮＡ配列の識別種々の別のＲＮＡ配列は、典型的な酵母Ｉ−ＲＮＡの配列の他に、本発明による更に別の翻訳阻止ＲＮＡオリゴヌクレオチドを誘導するのに用いることができることは上記から明らかなはずである。例えば、更に別の活性オリゴヌクレオチドは、この相補的配列もまたＩ−ＲＮＡ配列それ自体の翻訳阻止活性を示すので、酵母Ｉ−ＲＮＡの配列の補体（「アンチセンス」）から誘導することができる。図１３を参照されたい。Ｉ−ＲＮＡ配列について記載された同様の突然変異法および他の分析法を、適当な常套修飾と共に適用する。更に、典型的な酵母Ｉ−ＲＮＡとの配列相同性がほとんどまたは全くない天然に存在するＲＮＡ配列は、本明細書中に記載のように修飾されて、本発明の活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドを生じることができることは明らかである。したがって、上の背景のところで論及されたように、例えば、種々のピコルナウイルスＲＮＡの５′ＵＴＲの若干のループは、例えば、ＩＲＥＳに媒介される翻訳開始に必要であるタンパク質因子に対するそれらのｍＲＮＡの結合の原因であることが知られている。実際に、本開示は、欠失分析により、酵母Ｉ−ＲＮＡが、ポリオウイルスＲＮＡの翻訳を in vitro で阻止するためにｍＲＮＡが内部リボソームエントリー部位（ＩＲＥＳ）配列を有することを必要とすることを示している。これらの配列を含有するオリゴヌクレオチドもまた、本発明による翻訳阻止活性を有するあろう。しかしながら、先行技術は、本発明による翻訳阻止のために、このような因子結合ループの結合配列から成るＲＮＡオリゴヌクレオチドを用いる可能性を認めたとは考えられないし、そして３５未満のヌクレオチドを有するこのようなＲＮＡオリゴヌクレオチドの製造ですら、いずれの目的に対しても知らされていないと考えられる。同様に、この開示で例証されたｐ５２タンパク質の他に、他のタンパク質因子に対して結合することが分ったＲＮＡループはまた、本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドに適当な天然の配列源である。更に、３種類のデータベース、すなわち、ウイルス、構造ＲＮＡおよび酵母を含めた植物のＧＣＧ形式 Genbank の Biov ax コピーでＦＡＳＴＡ（ピアソン（Pearson）ら、1988年）を用いるＩ−ＲＮＡ配列と類似している配列についての研究（1993年９月見解）は、部分的に関係した配列を識別した。したがって、日本脳炎ウイルスゲノムの部分と（１９ｎｔ重複によって）８９．５％相同が見られた。同様に、単純ヘルペスウイルス、シンドビス（sindbis）ウイルス、エプスタイン・バールウイルス、デング熱ウイルスおよびインフルエンザウイルスのゲノムの種々の部分と７０〜８０％相同が見られた。構造ＲＮＡデータベースに対して比較した場合、最も顕著な相同（７０〜１００％、１１〜１９ｎｔ重複）は、種々の生物からの１６ＳｒＲＮＡについてであった。Ｉ−ＲＮＡはまた、トリパノソームの５ＳｒＲＮＡと広範な相同性（９３．８％、１６ｎｔ重複）を有する。酵母を含む植物データベースに対する比較は、ヒストンＨ４．１およびＨ３の酵母遺伝子と９３．３％相同（１５ｎｔ重複）を示した。Ｉ−ＲＮＡとの相同性を有することが分った唯一のｍＲＮＡは、トウモロコシスーパーオキシドジスムターゼ３イソ酵素であった（１００％相同、１３ｎｔ重複）。重複した配列の短い長さを考えると、これらの知見の意味は現在のところ明らかではないが；しかしながら、これらは、本明細書中に記載の本発明の阻止活性について試験するのに好ましい候補、特に、適当な予測された二次構造を示すものを配列順序決定する。活性ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体の識別Ｉ−ＲＮＡ分子中の二次構造がその翻訳阻止活性に重要であることを確認するために、１個または２個のヌクレオチドを一度に変更してＩ−ＲＮＡ二次構造を脱安定化させることによって部位特異的突然変異誘発を行う。２種類のコンピューターで予測されたＩ−ＲＮＡの二次構造を描くことができ、それらは比較的熱力学的に安定である。これらのコンピューターで予測されたＩ−ＲＮＡの二次構造は、硫酸ジメチル（ＤＭＳ）による修飾に対するその（それらの）利用しやすさ並びに一本鎖および二本鎖特異的ヌクレアーゼに対する感受性を確認することによって確証される。これらの方法は、コンピューターで予測されたＰＶ５′ ＵＴＲの二次構造を支持するのに用いられた。簡単にいうと、Ｉ−ＲＮＡを、ＤＭＳ、Ｓ１、コブラ毒（ＣＶ）、更には、記載されたような他のヌクレアーゼによって処理する（１１）。修飾および切断が起こった部位の識別のためには、プライマー伸長技術が用いられるであろう（１１）。ＤＮＡ鎖の伸長は、修飾された塩基の一つ前のヌクレオチドおよび切断されたヌクレオチド間結合の直前で停止するはずである。始めの方で記載された初期欠失実験および実験によって実証されたＩ−ＲＮＡの二次構造は、どのヌクレオチドがＩ−ＲＮＡ中で突然変異するかを決定可能にする。Ｉ−ＲＮＡの二次構造を脱安定化させ、更にその生物学的活性を（in vitro でも in vivo でも）破壊する突然変異を見つけることで、更に別の補償用突然変異を導入して二次構造を安定化させることができ、それは、その生物学的活性を回復させるはずであり、それによって本発明のＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体が生成される。更に、耐ヌクレアーゼ性または膜透過性が増大した構造模擬体は、当該技術分野において知られている慣用的なヌクレオチド類似体を用い且つ本明細書中に記載の活性について試験して合成することができる。更に、被検体に対して結合する分子の類似体を得る一般的な方法は、米国特許第5,133,866号明細書で記載されている。これは、第一部分に対する特異的親和性を有する被検体に関して、該第一部分の環境中に存在する更に別の部分と比較して、アフィニティークロマトグラフィーの実施に有用なパラログ（paralog）を識別する方法であって、該第一部分を選択的に結合する能力について、個々の候補パラログのパネルをスクリーニングすることを含み、ここにおいて、該候補パラログは少なくとも二つの異なったパラメーターの体系的に異なった値を有し、それらのパラメーターはそれぞれ他の物質を結合する該パラログの能力を決定する上記方法を記載し且つ請求の範囲に記載している。該方法は、核酸である候補パラログを包含する。該方法は、任意の選択された部分に対して特異的に結合しうる物質の体系的且つ容易な選択を可能にする。選択された部分が受容体または他の生物学的標的である場合、そのパラログは、種々の薬理学的および治療的用途において有用であろう。本発明のインヒビターのスクリーニング検定内部リボソームエントリー部位に対して結合し、そして本発明の酵母Ｉ−ＲＮＡに対して結合することによって阻止されるタンパク質翻訳開始因子の活性を調節する抗体または他の化合物のような、本発明の酵母Ｉ−ＲＮＡと同様の機序によってタンパク質翻訳を阻止する分子を識別するための in vitro 検定もまた、本発明によって提供される。このような検定は、固定されたリガンドを必要することがあり、例えば、ＩＲＥＳ依存性タンパク質翻訳開始に必要な適当な開始因子若しくはこのような因子の分子模擬体、または言い換えると、このような開始因子が結合する天然リガンド（例えば、Ｉ−ＲＮＡ）を固定化し、非固定化結合パートナーを検出可能に標識し、結合パートナーを一緒にインキュベートし、そして結合した標識の量に対する試験化合物の作用を決定し、ここにおいて、試験化合物の不存在下で結合した標識の量に対して比較された試験化合物の存在下で結合した標識の減少は、試験物質が開始因子結合のインヒビターであることを示す。翻訳開始因子とリガンドとの間の相互作用を調節する化合物を識別するための別の種類の検定は、該因子またはその模擬体若しくはフラグメントを、蛍光物質で被覆された（または含浸した）固体支持体上で固定化し、該蛍光物質を励起させることができる化合物によって該リガンドを標識し、該固定された開始因子と該標識リガンドとを推定上の調節化合物の存在下および不存在下で接触させ、該蛍光物質による発光を検出し、そして調節用化合物を、調節用化合物の不存在下の蛍光物質による発光との比較において蛍光物質による発光に影響を与える化合物として識別することを必要とするシンチレーション近接検定である。或いは、その検定において、開始因子リガンドを固定化してよいし且つ開始因子を標識してよい。ＩＲＥＳ依存性タンパク質開始因子とリガンドとの間の相互作用を調節する化合物を識別するための本発明によって考えられた更にもう一つの方法は、二遺伝子雑種スクリーニング検定である。この検定は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節されたプロモーターの制御下において、リポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物によって適当な宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクションし、該宿主細胞中において、ＩＲＥＳ依存性翻訳開始因子と該転写因子のＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインとの一部分または全部の第一融合をコードしている第一ハイブリッドＤＮＡ配列を発現させ、該宿主細胞中において、該リガンドと、該第一融合中に包含されない該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインとの一部分または全部をコードしている第二ハイブリッドＤＮＡ配列を発現させ、推定上のモジュレーターの存在下または不存在下において特定の宿主細胞中でのリポーター遺伝子産物の生産を測定することによって該宿主細胞中での開始因子に対するリガンドの結合を検出することにより、開始因子と該リガンドとの間の相互作用に対する推定上の調節化合物の作用を評価し、そして調節化合物を、調節用化合物の不存在下のリポーター遺伝子産物の生産との比較において、リポーター遺伝子産物の生産を変化させる化合物として識別することを必要とする。検定において用いるのに現在のところ好ましいのは、ｌｅｘＡプロモーター、ｌｅｘＡＤＮＡ結合ドメイン、ＧＡＬ４トランス活性化ドメイン、ｌａｃＺリポーター遺伝子および酵母宿主細胞である。二遺伝子雑種検定の変法には、翻訳装置の他の成分と相互作用するＬａまたはｐ８０タンパク質の相互作用が含まれうる。前述の検定の変法は、ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節されたプロモーターの制御下において、リポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物によって適当な宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクションし、該宿主細胞中において、該開始因子と該転写因子のＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインとの一部分または全部の第一融合をコードしている第一ハイブリッドＤＮＡ配列を発現させ、該宿主細胞中において、推定上の開始因子結合タンパク質またはＲＮＡと、該第一融合中に包含されない該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインとの一部分または全部の第二融合をコードしている第二ハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを発現させ、特定の宿主細胞中でのリポーター遺伝子産物の生産を検出することによって該宿主細胞中での開始因子に対する開始因子結合タンパク質またはＲＮＡの結合を検出することにより、翻訳開始因子に対して結合するタンパク質をコードしているポリヌクレオチドを単離する場合に用いることができる。本発明のＩ−ＲＮＡの活性を有する翻訳インヒビターについての更に別の検定は、Ｌａ依存性 in vitro 翻訳検定である。この方法は、実施例で記載のように、ＩＲＥＳに媒介される in vitro 翻訳の阻止についての直接的知見に基く。或いは、化合物を、トランスフェクションされた細胞中でのＩＲＥＳ依存性翻訳の阻止について、例えば、ビシストロンＲＮＡ分子を用いてスクリーニングすることができ、例えば、実施例１０で記載のように、一つのタンパク質産物はＣＡＰ依存性様式で翻訳され且つ第二タンパク質産物はＩＲＥＳによって翻訳される。このようなスクリーニングは、細胞培養物からのリポーター分子のＩＲＥＳ依存性翻訳の阻止に基くことができる。更に、インヒビターのスクリーニングはまた、ウイルス生産の阻止の検出を用いることができる（実施例１０で記載のキャプシドタンパク質かまたはプラーク検定によって）。最終的に、動物モデル系においてピコナウイルスに媒介される作用の生産を阻止する化合物についての動物基剤クリーニングを用いて、Ｉ−ＲＮＡ模擬体の有効性を評価する。本発明のインヒビター分子の使用および関連態様本発明の方法およびインヒビター分子は、細胞または動物若しくはヒト対象におけるウイルス感染の治療または予防に用いることができる。それは、更に、特定のＲＮＡが、概して、ウイルスｍＲＮＡを示すＩＲＥＳに媒介される翻訳を示すかどうかを確認する診断用手段として用いることができる。本発明に適したウイルスの範囲に関して、酵母からの阻止ＲＮＡは、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コクサッキーウイルスおよびピコルナウイルス科群の他のメンバーのそれらを含めた種々のピコルナウイルスＲＮＡによって、ＩＲＥＳに媒介される翻訳を特異的に阻止する。キャップ付き細胞ｍＲＮＡの翻訳は、in vitro または in vivo においてこの酵母インヒビターＲＮＡによって影響されるとは考えられないが、ピコルナウイルス複製は、ウイルスＲＮＡ翻訳の阻止のために、in vivo において酵母インヒビターＲＮＡによって阻止される。インヒビターＲＮＡは、ウイルス５′ＵＴＲ中のＲＮＡ構造要素と相互作用するタンパク質を特異的に結合する。ピコルナウイルス群に属さない多数の他のウイルスもまた、翻訳のために内部リボソームエントリー部位を用いる。主な例は、フラビウイルス、Ｃ型肝炎である（１，２）。酵母インヒビターはまた、Ｃ型肝炎ウイルス翻訳を阻止する。最近、コロナウイルスである伝染性気管支炎ウイルスのｍＲＮＡもまた内部リボソームエントリー機序を利用していることが報告された（３，４）。更に、アヒルおよびヒトＢ型肝炎ウイルスの逆転写酵素、水泡性口内炎ウイルスＮＳタンパク質、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびセンダイウイルスＰ／Ｃタンパク質をコードしているｍＲＮＡは、リボソームエントリーの内部開始を用いることが示された（５−９）。更にまた、内部リボソームエントリーは、レトロウイルス科（例えば、ネズミ白血病ウイルス；参考文献２９）、ペスチウイルス科（３０）および植物ポティ（poty）ウイルス（３１）における翻訳について示された。したがって、翻訳の内部開始を用いる多数の異なったウイルス群のメンバーに対する抗ウイルス薬は、本発明にしたがって製造することができる。本発明の阻止ＲＮＡおよび構造模擬体はまた、ウイルスｍＲＮＡなどの内部開始ｍＲＮＡの翻訳を、細胞培養物中またはこのようなｍＲＮＡを含有している宿主生物中において制御するのに用いることができる。阻止ＲＮＡまたは模擬体は、Remington's Pharmaceutical Sciences，マック・パブリッシング・カンパニー（Mack Publishing Company），イーストン，ＰＡ，最新版で記載されたような標準的な投与法を用いて与えられる。好ましくは、対象の in vivo 処置に対して、ＲＮＡまたは模擬体を注射によって与え、そしてリンガー液、ハンクス液等のようなそのための慣用的な賦形剤を用いて製剤化する。適当な製剤を用いる経口投与もまた行うことができる。大部分の投与は全身的であるが、ライノウイルスによる鼻腔感染のような局在した症状の場合、投与は局所的または他の方法で局部的であってよい。薬物供給のための徐放機序も用いることができる。或いは、阻止ＲＮＡ配列は、「逆方向」発現系において該ＲＮＡをコードしているＤＮＡまたはその阻止有効性フラグメントを含む発現系を提供することによって現場で生じることができる。該発現系はいずれも、逆方向の配列が、例えば、ＳＶ−４０プロモーター、アデノウイルスプロモーター、ワクシニアウイルスプロモーター等の制御下にある哺乳動物対象などの宿主対象において操作可能であるように設計されうるので、ＲＮＡは現場で転写される。宿主細胞の培養物中で用いられた場合、その発現系は、宿主細胞に適合したレプリコンに対して与えられるであろう。更に詳しくは、本発明の酵母Ｉ−ＲＮは、ヒトピコルナウイルス（ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎およびコクサッキーウイルスＢ３）および動物ピコルナウイルス（口蹄疫ウイルス；ＦＭＤＶ）を含めたピコルナウイルスの５ ′ＵＴＲからの翻訳並びにフラビウイルス（Ｃ型肝炎）ｍＲＮＡの内部翻訳のＩＲＥＳ依存性開始を阻止することが示された。更に、養鶏産業において重大な損失を引き起こすコロナウイルスである伝染性気管支炎ウイルスのｍＲＮＡ３もまた、内部リボソームエントリー機序を利用している（３，４）。更に、アヒル、更にはヒトのＢ型肝炎ウイルスの逆転写酵素、水泡性口内炎ウイルスＮＳタンパク質、アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼおよびセンダイウイルスＰ／Ｃタンパク質をコードしているｍＲＮＡは、リボソームエントリーの内部開始を用いることが示された（５−９）。更にまた、内部リボソームエントリーは、レトロウイルス科（例えば、ネズミ白血病ウイルス；参考文献２９）、ペスチウイルス科（３０）および植物ポティウイルス（３１）における翻訳について示された。したがって、本発明は、更に、利用可能な遺伝子工学技術を用いて、本発明のＩ−ＲＮＡ分子または関連した翻訳開始インヒビターを発現し、そしてそれによって、該Ｉ−ＲＮＡがＩＲＥＳ依存性翻訳を阻止するウイルスの病原性作用に対して耐性であるトランスジェニック動物およびトランスジェニック植物の生産を可能にする。本発明者は、翻訳の内部開始にその複製が依存しているウイルスまたは他の病原体に対して耐性であるトランスジェニック植物および動物の慣用的な技法による生産を考えている。本発明のもう一つの態様は、細胞中、特に、酵母細胞中における、このような細胞またはその抽出物中の望ましいｍＲＮＡのＩＲＥＳ依存性翻訳開始を妨げる本発明のＩ−ＲＮＡを発現するＩ−ＲＮＡ遺伝子の単離および修飾に関する。これらの遺伝子修飾は、Ｉ−ＲＮＡの発現または活性を阻止し、それによって所望のＩＲＥＳ依存性翻訳開始を可能にする。第一に、本明細書中に記載のような、酵母から単離されたＩ−ＲＮＡ分子の配列の識別は、慣用的な遺伝子工学方法によって用いられてＩ−ＲＮＡ遺伝子（例えば、サザンブロッティングによって）およびその初期転写産物（例えば、ノーザンブロッティングによって）を検出することができる標識プローブの製造を可能にする。更に、このようなプローブを、好ましくは緊縮ハイブリダイゼーション条件下で用いると、酵母Ｉ−ＲＡＮ遺伝子若しくは他の種からの相同遺伝子またはこのような遺伝子の転写物を、当該技術分野において周知の標準的な遺伝子クローニング法によって単離することができる。例えば、望ましい種のランダムゲノムライブラリーは、本発明によって与えられたＩ−ＲＮＡプローブを用いるハイブリダイゼーションによってスクリーニングされうる。酵母Ｉ−ＲＡＮ遺伝子および他の種からの相同遺伝子の構造およびゲノム体制についての考察は、このような遺伝子の正常な機能についてよりよく理解させるであろう。更に、本開示は、Ｉ−ＲＮＡの発現または活性を阻止するための宿主細胞の修飾を可能にする。第一に、このような修飾の導入は、このようなＩ−ＲＮＡを発現する宿主細胞の生存にとってＩ−ＲＮＡ活性が不可欠であるかどうかを決定するであろう。一つの方法において、Ｉ−ＲＮＡに相補的な配列を有するＲＮＡ（すなわち、「アンチセンスＩ−ＲＮＡ」）を、Ｉ−ＲＮＡ分子を発現する宿主細胞（例えば、酵母）中で発現させる。そのアンチセンスＩ−ＲＮＡの発現用ベクターは、選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ＵＲＡ３）を含んで、形質転換された細胞だけが回収されることを確実にする。アンチセンスＩ−ＲＮＡを発現する形質転換細胞が回収されない場合、誘導発現構築物を検査して、アンチセンスＲＮＡベクターが、アンチセンスＩ−ＲＮＡ発現の不存在下において細胞中に形質転換されうるかどうか、および引き続きの発現が、任意の１種類または複数の細胞機能を阻止するかどうかを確認することができる。或いは、Ｉ−ＲＮＡ遺伝子を、当該技術分野において知られている遺伝子「ノックアウト」法を用いて排除することができる。例えば、酵母細胞中において、細胞中に効率よく且つ安定して導入された外因性ＤＮＡは、相同的組換えによって染色体ＤＮＡ中に組込まれ、非機能性コピーによる野生型遺伝子の有効な置換を可能にする。典型的に、非機能性コピーは、野生型クローニング配列を選択可能なマーカー遺伝子（例えば、ＬＥＵまたはＵＲＡ）によって置換することにより生じる。二倍体細胞の形質転換は、細胞生存力のためにある種のＩ−ＲＮＡ活性が必要とされる場合に、潜在的な致死作用を回避させることができる。本発明によるアンチセンスかまたは遺伝子ノックアウト修飾の結果として減少したＩ−ＲＮＡ活性を有する酵母若しくは他のＩ−ＲＮＡ発現性宿主細胞またはそれらの抽出物は、ＩＲＥＳ依存性翻訳開始を必要とするｍＲＮＡの発現に有用である。更に考えられるのは、翻訳の内部開始にその合成が依存しているタンパク質の発現に寛容である宿主系統を生産するために、Ｌａをコードしている遺伝子またはその相同染色体を除去するように、当該技術分野において知られている遺伝子ノックアウト法によって修飾されうる酵母または他のＩ−ＲＮＡ宿主細胞である。以下の実施例は、本発明を例証するためのものであるが、制限するものではない。実施例１酵母阻害剤ＲＮＡの精製および配列決定使用されたサッカロミセスセレビジエ（Ｓａｃｃｈａｒｏｍｙｃｅｓｃｅｒｅｖｉｓｉａｅ）株はＡＢＹＳＩ（Ｄ．Ｍｅｙｅｒ，ＵＣＬＡから提供された）であった。ポリオウイルスＲＮＡからのＩＲＥＳ依存性翻訳を特異的に阻害できる酵母細胞からの阻害剤は最初、ＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌカラムを通過させることにより精製した（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記文献）。阻害剤はカラムに強く結合し、カラムを１Ｍ酢酸カリウムで洗浄することにより溶出された。ＤＮａｓｅおよびプロテイナーゼＫで切断し、続いてのフェノール−クロロホルム抽出によりＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅｌ精製阻害剤をさらに精製した。最後に、水相からのアルコール沈澱により得られたＲＮＡはγ³²Ｐ−ＡＴＰでその５ ’末端を末端標識し、２０％ＰＡＧＥ／８Ｍ尿素電気泳動により単一のバンドを分離した。各々のＲＮＡバンドはゲルスライスから溶出し、キャップ依存性様式で翻訳を開始することが知られている対照ＣＡＴ構築物からではなくポリオウイルス５’ＵＴＲ−ＣＡＴ構築物からの翻訳の内部開始を阻害する能力でアッセイした（Ｐｅｌｌｅｔｉｅｒら、１９８９）。６０ヌクレオチドのＲＮＡとして移動した単一バンドに阻害活性が付随していた。特に、酵母細胞溶解物は、それらが球菌ヌクレアーゼ処理されていない点を除いて以前に記載されているように（Ｒｏｔｈｂｌａｔｔら、１９８６）調製した。溶解物は０．１Ｍ酢酸カリウムでＤＥＡＥ−Ｓｅｐｈａｃｅ（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）カラムに加え、０．３、０．６および１Ｍ酢酸カリウムを含む緩衝液で段階的に溶出させた。分画は０．１Ｍ塩に対して透析し、翻訳阻害活性をアッセイした。阻害活性を示した１Ｍ分画をＤＮａｓｅ処理し、続いてプロテイナーゼＫで切断してフェノール−クロロホルム抽出した。この分画からのＲＮＡは次にアルコール沈澱により単離した。１Ｍ分画と共精製された酵母ＲＮＡは次に脱リン酸し、キナーゼ反応により５’末端を修飾した。標識ＲＮＡ種は２０％アクリルアミド−８Ｍ尿素シークエンシングゲルで分離した。標識および非標識ＲＮＡバンドは平行したレーンで分離し、ゲルから以下のように溶出した。個々のゲルスライスを３７℃で４時間、５００μｌの溶出緩衝液（２Ｍ酢酸アンモニウムおよび１％ＳＤＳ）に浸した。室温で軽く遠心分離した後、上清液を集め、フェノール −クロロホルム（１：１）で抽出し、２０μｇのグリコーゲン（Ｂｏｅｒｉｎｇｅｒ−ＭａｎｎｈｅｉｍＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓ）存在下でアルコール沈澱させた。沈澱したＲＮＡペレットはヌクレアーゼを含まない水に再懸濁し、無ヒーラー細胞系の翻訳系でｐ２ＣＡＴＲＮＡの翻訳を阻害する能力を試験した（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記文献）。ヒーラー細胞は１ｇ／Ｌのグルコースおよび６％ウシ新生児血清を補給した最少必須培地（ＧＩＢＣＯｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）中での撹拌培養で増殖させた。ヒーラー細胞抽出物は前に記載されているように（Ｒｏｓｅら、１９９２；Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記文献）調製した。無ヒーラー細胞抽出物系でのインビトロ翻訳は本質的には以前に記載されているように（Ｒｏｓｅら、１９７８）実施した。２５μＣｉの³⁵Ｓ−メチオニン（８００Ｃｉ／ミリモル；Ａｍｅｒｓｈａｍ）および４０単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）が存在する２５μｌの反応液中、２マイクログラムの各々のｍＲＮＡを８０μｇのヒーラー細胞抽出物とともに使用した。ウサギ網状赤血球溶解物（Ｐｒｏｍｅｇａ）での翻訳は、２５μＣｉの³⁵Ｓ− メチオニン（比活性＞１０００Ｃｉ／ミリモル）とともに、１２．５μｌの溶解物および２μｇのｍＲＮＡを含む１５μｌの反応液容量で３０℃にて１時間実施した。翻訳生成物の３マイクロリットルをドデシル硫酸ナトリウム（ＳＤＳ）− １４％ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。精製されたＲＮＡは市販品として入手可能なシークエンシングキット（ＵＳＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌｓＣｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ）を用いて配列決定した。末端標識されたＲＮＡは塩基特異的リボヌクレアーゼ緩衝液の組み合わせと混合し（ＵＳＢ−プロトコールに従って）、５０℃でインキュベートした後、２０％アクリルアミド−ＳＭ尿素シークエンシングゲルに加えた。図１Ａは６０ヌクレオチドＲＮＡの配列［配列ＩＤ番号：１］を示している。実施例２酵母阻害剤ＲＮＡのクローニングおよび転写決定されたＲＮＡ配列に基づいて、センスおよびアンチセンス鎖特異的デオキシオリゴヌクレオチドが合成され、アニール化、およびｐＧＥＭ３Ｚ発現ベクターのポリリンカー領域のＨｉｎｄIIIおよびＥｃｏＲＩ部位間にクローン化して、組換え体プラスミドｐＳＤＩＲ（図１Ｂ）を形成させた。クローンｐＳＤＩＲはＨｉｎｄIII制限酵素で線状化し、次にＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写して、阻害剤ＲＮＡ（センス転写体）を発生させた。線状化プラスミドからのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写により阻害剤ＲＮＡが合成された。ゲル電気泳動により分析した場合、酵母阻害剤ＲＮＡおよび５’ポリリンカー領域のＥｃｏＲＩ部位からの余分の１０ヌクレオチド、およびＨｉｎｄII I部位の３’末端の１ヌクレオチドからなる７１ヌクレオチドの単一バンドが観察された。合成クローンから合成されたＲＮＡが活性であるかどうかを決定するため、ＣＡＴ遺伝子の５’末端ポリオウイルス５’ＵＴＲを含むＣＡＴ構築物（Ｐ２−ＣＡＴ）からの翻訳に対するその効果を決定した。酵母からの部分精製阻害剤およびｐＳＤＩＲから転写された精製阻害剤の両方とも、無ヒーラー細胞抽出物系においてインビトロでＰ２ＣＡＴＲＮＡからの翻訳を阻害した（図１Ｄ、レーン４、５、６）。しかしながら、ＣＡＴＲＮＡからの翻訳（キャップ依存性翻訳）は両方の阻害剤により有意には阻害されなかった（図１Ｄ、レーン１、２、３）。従って、合成クローンから合成された阻害剤ＲＮＡは、酵母細胞からの部分精製阻害剤で以前観察されたように（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記文献）、ポリオウイルスＩＲＥＳ依存性翻訳を特異的に阻害することにおいて活性であった。実施例３酵母ＲＮＡ阻害剤による阻害に必要とされるポリオウイルス５’ＵＴＲ配列の同定ポリオウイルスＲＮＡの５’非翻訳領域（ＵＴＲ）内のどの特定の配列がＩＲＥＳ依存性翻訳を阻害するための酵母阻害剤ＲＮＡに必要とされるかを決定するため、Ｎ．Ｓｏｎｅｎｂｅｒｇ博士（ＭｃＧｉｌｌ大学）の研究室から多数の欠失５’ＵＴＲ−ＣＡＴ構築物を入手した。図２Ｄを参照されたい。異なった線状プラスミドからのＴ７かまたはＳＰ６プロモーターを用い、Ｔ７またはＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼによりインビトロでｍＲＮＡが転写された。プラスミドｐＧ３ＣＡＴおよびＰ２ＣＡＴ（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記文献）の両方がＢａｍＨＩで線状化され、ＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて転写体の混合物を発生させた。プラスミドｐＢＩＰ−ＬＣＵ構築物（Ｍａｃｅｊａｋら、１９９１）はＰ．Ｓａｒｎｏｗから入手され、ＨｐａＩ酵素で線状化してＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写された。ＴＭＥＶ−ＩＲＥＳ含有構築物ｐＰＢ３１０はＨｏｗａｒｄＬ．Ｌｉｐｔｏｎから入手し（Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙら、１９９２）、ＨｐａＩ酵素で線状化してＴ７ＲＮＡポリメラーゼで転写した。Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼによる転写のためのオリゴデオキシリボヌクレオチド鋳型はＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｎｔｈｅｓｉｓＤＮＡ合成機で合成され、その後精製された。当モルの１８ｍｅｒＴ７プライマーオリゴヌクレオチドおよび鋳型オリゴヌクレオチドを０．１ＭＮａＣｌ中で混合し、１００℃で５分間加熱することによりアニール化した後、室温まで徐々に冷却した。上記の方法に従ってインビトロでＳＬ−Ｂ、ＳＬ−Ｃ、ＳＬ−ＤおよびＳＬ−ＧＲＮＡが合成された。阻害剤はｐＧ３ＣＡＴ（またはｐＣＡＴ）構築物からの翻訳は阻害しないがｐＰ２ＣＡＴからの翻訳を効果的に阻害する（図１Ｄ）。Δ５’−３３ＣＡＴ構築物が阻害剤ＲＮＡ存在下で翻訳される場合、ほとんど完全な阻害が観察された（データは示されていない）。ＵＴＲの５’末端からの３２０ヌクレオチドの欠失はΔ５’−３２０／ＣＡＴ構築物からの翻訳を阻害する阻害剤の能力に対して有意な効果を示さなかった（図２Ａ、レーン１および２）。翻訳のほとんど８０％の阻害が阻害剤存在下で観察された（レーン１および２）。阻害剤で観察された阻害のいくつかは、鋳型ＲＮＡが翻訳に先だってキャップ化された場合は逆転できた（図２Ａ、レーン３および４）。同様な結果がΔ３’−６３１／ＣＡＴ構築物で得られた；阻害剤存在下この構築物からの翻訳のほとんど完全な阻害が観察され、キャップ化されたＲＮＡの添加は翻訳の阻害をある程度逆転させたがΔ５’−３２０／ＣＡＴ構築物ほどではなかった（図２Ｂ、レーン５−８）。対照的に、Δ５’−６３２／ＣＡＴ構築物からの翻訳は阻害剤存在下でもほとんど影響を受けなかった（図２Ｂ、レーン１および２）。従って、ウイルスＲＮＡの全ＩＲＥＳ領域のほとんどがほとんど全部のポリオウイルスＩＲＥＳ依存性翻訳を効果的に阻害するための阻害剤に対して必要である。しかしながら、有意な阻害はウイルスＵＴＲのヌクレオチド３２０−４６１のみを含む構築物で観察された。従って、ＵＴＲのヌクレオチド３２０−４６１のみを含む構築物Δ５’−３２０／Δ３’−４６１／ＣＡＴからの翻訳は阻害剤ＲＮＡにより有意に阻害された（図２Ｃ、レーン１および２）。この阻害は翻訳に先立ってＲＮＡをキャップ化することにより有意な程度克服でき（図２Ｃ、レーン３および４）、キャップ依存性翻訳は実質的に阻害剤により影響されないことを示している。実施例４ゲル電気泳動間のＲＮＡ遅延を用いる酵母Ｉ−ＲＮＡによる蛋白質因子およびｍＲＮＡ５’ＵＴＲの複合体の破壊の実証理論的に、阻害剤ＲＮＡは二つの可能な機構によりＩＲＥＳ依存性翻訳を阻害できる：アンチセンスＲＮＡとしてＵＴＲ配列に結合またはリボソームの内部的参加に必要とされる蛋白質因子への結合。これら二つの機構を区別するため、均一に³²Ｐ標識された阻害剤ＲＮＡプローブが調製されてヒーラーＳ１０抽出物と混合され、得られたＲＮＡ蛋白質複合体は未変性ポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析された。ヒーラーＳ１０細胞質抽出物は無ヒーラー細胞系翻訳抽出物を４℃にて３０分，１０，０００ｇで遠心分離した上清液を集めることにより調製された。Ｓ１０抽出物の試料５０μｇを、５ｍＭＨＥＰＥＳｐＨ７．５、２５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、０．１ｍＭＥＤＴＡ、３．８％グリセロールおよび２ｍＭＤＴＴを含む１５μｌの反応液中、４μｇのポリ［ｄ（Ｉ−Ｃ）］（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と３０℃で１０分間前もってインキュベートした。競合実験においては１０−１００倍過剰の非標識競合剤ＲＮＡを反応液に加え、３０℃で１０分間インキュベートした。最後に５−１０フェムトモルの標識ＲＮＡプローブを各々の反応混合物に加え、さらに３０℃で３０分間インキュベートした。競合アッセイに使用された非特異的ＲＮＡはｐＧｅｍ３ｚベクターのポリリンカー領域（ＥｃｏＲＩからＨｉｎｄIII）の配列（Ｐｒｏｍｅｇａ）であった。１０％グリセロールおよび０．２％ずつのブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールの最終濃度になるように反応混合物に３マイクロリットルのゲル負荷色素を添加した。ＲＮＡ−蛋白質複合体は次に０．５ＸＴＢＥ中４％ポリアクリルアミドゲル（３９：１−アクリルアミド：ビス）で分析した。図３Ａに示したように、単一の複合体（Ｃで示されている）がはっきりと観察された。非標識Ｉ−ＲＮＡの濃度の増加は標識化複合体の生成と競合した（図３Ｂ、レーン２−５）。競合のために非標識ポリオウイルス５’ＵＴＲＲＮＡが使用された場合、同様の結果が得られた。明らかに、試験された最も高い濃度では、ＵＴＲ配列はヒーラーＳ１０蛋白質への結合においてＩ−ＲＮＡと競合した（図３Ｂ、レーン６−９）。しかしながら、非相関ＲＮＡは標識Ｉ−ＲＮＡと競合できなかった（図３Ｂ、レーン１０）。従って、本阻害剤ＲＮＡは、ウイルス５’ＵＴＲ配列と特異的に競合できる、ヒーラーＳ１０蛋白質（類）とのゲル遅延複合体を形成できる。実施例５阻害剤ＲＮＡがポリオウイルス５’ＵＴＲと相互作用する蛋白質を結合することの実証ウイルス５’ＵＴＲと相互作用する特異的ポリペプチドが酵母阻害剤ＲＮＡとも相互作用するかどうかを決定するために、一連のＵＶ架橋実験が実施された。これらの実験において、均一に標識された阻害剤ＲＮＡは最初にヒーラーＳ１０抽出物とインキュベートし、次にＵＶ光を用いて架橋させた。リボヌクレアーゼ処理後、蛋白質−ヌクレオチド複合体をＳＤＳポリアクリルアミドゲル電気泳動により分析した。４０から５０フェムトモルの³²Ｐ標識ＲＮＡプローブ（８ｘ１０⁴ｃｐｍ）を上記のように５０−１００μｇのヒーラー細胞のＳ−１０抽出物とインキュベートした。結合反応が完了した後、試料にＵＶランプ（マルチバンドＵＶ−２５４／３６６ＮＭモデルＵＧＬ−２５；ＵＶＰ，Ｉｎｃ）からのＵＶ光を３−４ｃｍの距離から１０分間照射した。結合されていないＲＮＡは２０μｇのＲＮａｓｅＡおよび１０ＵのＲＮａｓｅＴ１の混合物を用いて３７℃で３０分間切断し、ＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ヒーラー抽出物中の蛋白質を架橋するために³²Ｐ標識阻害剤ＲＮＡが使用された場合、おおよそ１００、７０、５２および３７ｋＤａの分子量を持つポリペプチドが検出された（図４Ａ、および４Ｂレーン２）。これらのポリペプチドの内、いくつかの実験で５２ｋＤａ蛋白質が最も強く標識された（図４Ｂ，レーン２）。非標識阻害剤ＲＮＡの添加は５２ｋＤａ蛋白質と首尾よく競合した（図４Ａ、レーン３）。非標識ポリオウイルス５’ＵＴＲを競合剤として用いた場合、５２ｋＤａ並びに１００、７０および３７ｋＤａバンドが競合により完全に消失した（図４Ａ、レーン４）。対照的に、非標識、非相関ＲＮＡは阻害剤ＲＮＡへ架橋したポリペプチドと競合することはできなかった。５２ｋＤａ蛋白質は以前にウイルス５’ＵＴＲの特異的領域（ヌクレオチド５５９−６２４）と相互作用することが示されているので、標識Ｉ−ＲＮＡへ架橋された５２ｋＤａバンドと競合するこの配列（”ＵＴＲ５５９−６２４”）を含むＲＮＡの能力が決定された。図４Ｂ（レーン４）に示したように、非標識ＵＴＲ５５９−６２４はＩ−ＲＮＡ−５２ｋＤａ複合体の形成を完全に阻害した。全５’ＵＴＲ配列と異なり、ＵＴＲ５５９−６２４は５２ｋＤａ蛋白質のみと競合した（図４Ａおよび４Ｂのレーン４を比較されたい）。これらの結果は酵母阻害剤ＲＮＡはポリオウイルス５’ＵＴＲ配列５５９−６２４が結合するのと類似のまたは同一の様式で５２ｋＤａ蛋白質と結合することを示している。実施例６蛋白質結合において酵母阻害剤ＲＮＡがステムループＤおよびＧの両方と競合することの実証ポリオウイルス５’ＵＴＲは、ウイルスＲＮＡ複製および翻訳に重要な役割を果たすと信じられているいくつかの熱力学的に安定なステムループ構造を含んでいる（図５）。これらの内ステムループＡ、ＢおよびＣは多分ＲＮＡ複製に関与しているであろう。一方、ステムループＤ−ＧはウイルスｍＲＮＡ翻訳に関与していると信じられている（Ｄｉｌｄｉｎｅら、１９９２）。ヌクレオチド１８６ −２２１から成るステムループＤ（ＳＬ−Ｄ）は５０ｋＤａ蛋白質（ｐ５０）へ結合することが示されており（Ｎａｊｉｔａら、（１９９０、上記文献））、一方、５５９−６２４からのポリオウイルス５’ＵＴＲ配列を示すステムループＧ（ＳＬ−Ｇ）は、最近ヒトＬａ蛋白質と同定された５２ｋＤａ蛋白質（ｐ５２）（Ｍｅｅｒｏｖｉｔｃｈら、（１９９３、上記文献））へ結合する。前の実施例で示された結果は、阻害剤ＲＮＡが通常ウイルス５’ＵＴＲ内のステムループＧへ結合するｐ５２と相互作用することを示している。阻害剤ＲＮＡがｐ５０へも結合でき、ステムループＤとも競合できるかどうかを決定するため、５’ＵＴＲのヌクレオチド１７８−２２４に対応するＲＮＡが調製された。最初の実験において、個々に³²Ｐ標識されたＩ−ＲＮＡ、全５’ＵＴＲ、ステムループＧ（ＵＴＲ５５９−６２４）およびステムループＤ（ＵＴＲ１７８−２２４）は別々にヒーラーＳ−１０抽出物とインキュベートされ、得られた蛋白質−ヌクレオチド複合体は図６Ａに示したようにＵＶ架橋により分析された。約５２ｋＤａの主蛋白質−ヌクレオチド複合体が４つすべての反応において検出された（レーン２、４、６および８）。ステムループＧが標識プローブとして使用された場合、５４ｋＤａに追加のバンドが検出された（図６Ａ、レーン６）。３７から４８ｋＤａの範囲の他の架橋蛋白質もまた４つすべての標識プローブで検出された。標識ステムループＧによる蛋白質結合を示しているレーン（図６Ａ、レーン６）は相対的に過剰暴露であったため、ＳＬ−ＧおよびＳＬ−Ｄの結合を比較する別の実験が行われた（図６Ｂ、レーン１および２）。この実験はステムループＤおよびＧの両方ともＳＤＳゲル上で等しく移動する蛋白質（５２ｋＤａバンド）を結合することを明らかに示している。類似の蛋白質がＩ−ＲＮＡおよびステムループＤおよびＧと相互作用するであろうという結果を確認するため、以下の競合実験が実施された。³²Ｐ標識５’ＵＴＲまたはＳＬ−Ｄ（ＵＴＲ１７８−２２４）またはＳＬ−Ｇ（ＵＴＲ５５９− ６２４）ＲＮＡを単独でまたは非標識競合ＲＮＡ（例えば、５’ＵＴＲ、ＳＬ− Ｄ，Ｉ−ＲＮＡ、ＳＬ−Ｂ、ＳＬ−Ｃ、非特異的ＲＮＡ）の存在下でヒーラーＳ１０抽出物とインキュベートした。生じた複合体は次にＵＶ架橋実験により分析された。ステムループＢおよびＣ（ＳＬ−ＢおよびＳＬ−Ｃ）を示すＲＮＡ配列は陰性対照として使用された。ポリオウイルス５’ＵＴＲが標識プローブとして使用された場合、非標識ＵＴＲ、Ｉ−ＲＮＡおよびステムループＧで５２ｋＤａ蛋白質−ヌクレオチド複合体形成のほとんど完全な阻害が観察された（図７Ａ、レーン２−５）。ステムループＤはｐ５２結合に対して標識５’ＵＴＲと一部競合した（図７Ａ、レーン６）。非標識ＳＬ−Ｂ、ＳＬ−Ｃおよび非特異的ＲＮＡはｐ５２結合に対し５’ＵＴＲとの競合は相対的に無効であった（図７Ａ、レーン７−９）。非標識ＵＴＲＲＮＡのみがすべての標識バンドの形成で競合し、一方、Ｉ−ＲＮＡおよびステムループＧおよびＤはｐ５２バンドの形成を特異的に阻害した。ステムループＧが標識プローブとして使用された場合、期待されたように５２および５４ｋＤａで移動するタブレットが検出された（図７Ｂ、レーン２）。非標識ＳＬ−Ｇによる相同的阻害ではこれらの複合体の形成が完全に阻害された（図７Ｂ、レーン３）。非標識Ｉ−ＲＮＡおよびＳＬ−ＤＲＮＡ存在下では、これらのＵＶ架橋複合体形成の約８０％の阻害が観察された（レーン４、５）。しかしながら、競合剤として非相関ＲＮＡおよびＳＬ−ＢまたはＳＬ−ＣＲＮＡが使用された場合は何の阻害も観察されなかった（レーン６−８）。ＵＶ架橋アッセイにおいてプローブとして放射性標識ＳＬ−ＤＲＮＡが使用された場合、類似の結果が得られた。蛋白質−ヌクレオチド複合体形成のほとんど完全な阻害が非標識Ｉ−ＲＮＡ、ＳＬ−ＧＲＮＡおよび相同的ＳＬ−ＤＲＮＡの存在下で観察された（図７Ｃ、レーン２−４および６）。予想されるように、ＳＬ−ＢおよびＳＬ−ＣＲＮＡは標識ＳＬ−Ｄプローブと競合できなかった。これらの結果を総合すると、５２ｋＤａの大体の分子量を持つ類似のまたは同一の蛋白質は３つすべてのＲＮＡ（ステムループＤおよびＧ、およびＩ−ＲＮＡ）と相互作用することが示される。実施例７酵母阻害剤ＲＮＡはインビトロで翻訳の内部開始を優先的に阻害することの実証クローン化および精製Ｉ−ＲＮＡが５’キャップから開始されるＲＮＡからの翻訳の内部開始を優先的に阻害するかどうかを試験するため、ビシストロンメッセンジャーからの翻訳におけるその効果を決定した。この目的のため、チーラーマウス脳脊髄炎ウイルス（ＴＭＥＶ）５’ＵＴＲが隣接するＣＡＴおよびルシフェラーゼ（ＬＵＣ）を含むビシストロン構築物を入手した。ＴＭＥＶ５’ＵＴＲはＩＲＥＳ配列を含んでいることが知られており、内部翻訳を開始することが示されている（Ｂａｎｄｏｐａｄｈｙａｙら、１９９２）。ＴＭＥＶ５’ＵＴＲから内部的に起こる翻訳の開始はルシフェラーゼの合成を生じるであろうし、一方、キャップ依存性翻訳では普通はＣＡＴ蛋白質を産生するであろう。網状赤血球溶解物中で翻訳された場合、ビシストロンメッセンジャーからの翻訳はＣＡＴおよびルシフェラーゼ蛋白質の両方を産生した（図８Ｂ、レーン１）。精製酵母阻害剤ＲＮＡ存在下では著しいＣＡＴ合成は観察されたが、ルシフェラーゼの合成はほとんど完全に阻害された。標識ＣＡＴおよびルシフェラーゼバンドの定量は、ルシフェラーゼ合成は対照と比較して９０％を超えて阻害されたが、一方、ＣＡＴ合成は２０％のみの阻害しか観察されなかったことを示した。翻訳反応のバックグランド取り込みもまた、阻害剤を含む反応で著しく少なかったが、その理由は完全には解っていない。ビシストロンＲＮＡ構築物を用いて、ポリオウイルス、ライノウイルス、肝炎Ａウイルス、ＴＭＥＶウイルスなどのＲＮＡを含む種々のピコルナウイルスＲＮＡによる内部リボソーム侵入部位（ＩＲＥＳ）媒介翻訳を優先的に阻害することが示されている。例えば、図１１を参照されたい。これらの結果は酵母阻害剤ＲＮＡは第二のウイルス調節領域（ＴＭＥＶ５’ ＵＴＲ）での翻訳の内部開始を優先的に阻害することを示している。実施例８酵母阻害剤ＲＮＡが細胞ｍＲＮＡの内部開始を阻害することの実証最近の研究結果はいくつかの細胞ｍＲＮＡが内部から翻訳を開始することを示している（Ｍａｃｅｊａｋら、１９９１；Ｏｈら、１９９２）。例えば、イムノグロブリン重鎖結合蛋白質（Ｂｉｐ）は内部開始により合成できる。Ｂｉｐ合成が阻害剤ＲＮＡにより特異的に阻害できるかどうかを決定するため、レポーター遺伝子（ルシフェラーゼ）に連結されたＢｉｐｍＲＮＡの５’ＵＴＲを含む構築物をＰ．Ｓａｒｎｏｗ（Ｃｏｌｏｒａｄｏ大学）から入手した。ヒーラー抽出物中でのこのｍＲＮＡの翻訳はルシフェラーゼ蛋白質を発生させた（図８Ａ、レーン１）。酵母阻害剤ＲＮＡの添加はこのＲＮＡ構築物からのルシフェラーゼ合成を完全に阻害した（レーン２）。予想されるように、ＣＡＴ構築物からのキャップ依存性翻訳は同一の条件下少しも阻害されなかった（レーン３および４）。実際、ＣＡＴ翻訳は以前に観察されているように（Ｃｏｗａｒｄら、１９９２、上記）対照よりも著しく刺激された。これらの結果は、酵母阻害剤ＲＮＡは細胞ｍＲＮＡならびにウイルスｍＲＮＡからの内部開始を阻害することができることを示している。実施例９インビボでのポリオウイルスＲＮＡ翻訳阻害の実証クローン化阻害剤ＲＮＡがインビボでポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害するかどうかを決定するため、ポリオウイルスＲＮＡを単独でまたは精製酵母ＲＮＡと一緒にヒーラー細胞内へトランスフェクトした。ヒーラー細胞単層は組織培養フラスコを用い、５％ウシ胎児血清を補給した最少必須培地（ＧＩＢＣＯ）中で増殖させた。ポリオウイルスＲＮＡ（タイプ１マホネイ（Ｍａｈｏｎｅｙ））は以前に記載されているように（Ｄａｓｇｕｐｔａ、１９８３）感染ヒーラー細胞から単離された。合成Ｉ−ＲＮＡまたはポリオＲＮＡをキャリアー酵母ｔＲＮＡと混合してトランスフェクション反応当たり総量で２０μｇのＲＮＡを得た。ＲＮＡ試料は次に３０μｇのリポフェクチン（ＧＩＢＣＯ−ＲＥＬ）および２０単位のＲＮａｓｉｎ（Ｐｒｏｍｅｇａ）と混合し、室温で３０分インキュベートした。最後に、試料を４ｍｌの２．５％のウシ胎児血清を含む最少必須培地（ＧＩＢＣＯ）と混合し、７０−８０％コンフルエントのヒーラー単層細胞を含むペトリ皿へ加えた。細胞はＣＯ₂インキュベーター中、３７℃で２４時間インキュベートした。蛋白質は³⁵Ｓ−メチオニンを加えることにより標識し、ウイルス蛋白質の合成は無細胞系抽出物の直接分析により（図９、パネルＡ）、または抗キャプシド抗血清によるウイルスキャプシド蛋白質の免疫沈降により（図９、パネルＢ）モニターした。特に、トランスフェクション後の蛋白質のインビボ標識のためには、細胞はメチオニンを含まない培地（ＭＥＭ，ＧＩＢＣＯ）中、３７℃で４０分間インキュベートした。次に、１００μＣｉのトランス標識メチオニン（比活性、＞１０００Ｃｉ／ミリモル）を細胞に加え、さらに１時間インキュベーションを続けた。³⁵Ｓ−メチオニン標識ヒーラー細胞抽出物は以前に記載されているように（Ｒａｎｓｏｎら、１９８７）調製された。トランスフェクトされた細胞のインビボ標識ウイルス蛋白質はポリオウイルス抗キャプシド抗体（ＡｍｅｒｉｃａｎＴｙｐｅＣｕｌｔｕｒｅＣｏｌｌｅｃｔｉｏｎから購入された）による免疫沈降により検出された。免疫沈降は１ｘＲＩＰＡ緩衝液（５ｍＭトリスｐＨ７．９、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．１％ＳＤＳ、１％デオキシコール酸ナトリウム）を含む５００μｌの反応液容量中、５μｌの抗キャプシド抗体と４℃で一夜実施された。免疫複合体はプロテインＡセファロース（７５μｌ、０．２％ＢＳＡを加えたＲＩＰＡ緩衝液中２０％溶液として）で沈澱させ、前記のように（Ｃｏｗａｒｄ等、１９９２、前記）ＳＤＳ−１４％ポリアクリルアミドゲルで分析した。ウイルスＲＮＡおよび阻害剤ＲＮＡを加えないと、細胞蛋白質の合成は明らかであった（パネルＡ、レーン１）。ウイルスＲＮＡ（１μｇ）が細胞内へトランスフェクトされた場合、別個のウイルス蛋白質の合成が観察された（レーン２）。さらに、ポリオウイルスによる宿主細胞蛋白質合成の遮断のため宿主細胞蛋白質のバックグラウンドがかなり減少した（レーン２）。阻害剤ＲＮＡをウイルスＲＮＡ（１μｇ）とヒーラー細胞内へ同時にトランスフェクトした場合、ウイルス蛋白質の合成は検出できず、宿主細胞蛋白質合成が回復した（レーン３）。阻害剤ＲＮＡ単独の発現は細胞蛋白質の合成を妨害しなかった（レーン４）。レーン５（パネルＡ）はトランスフェクション実験で使用されたキャリアーｔＲＮＡは細胞蛋白質合成に何の影響も与えなかったことを示している。ポリオウイルスＲＮＡの量を増加させての（２μｇ）細胞のトランスフェクションは、ウイルス蛋白質の合成および細胞蛋白質合成のより顕著な遮断を生じた（レーン６）。しかしながら、阻害剤ＲＮＡ存在下ではウイルス蛋白質合成は阻害され、宿主細胞蛋白質合成は対照反応で観察されたレベルまで回復した（レーン７）。パネルＢに示された結果から阻害剤ＲＮＡを含んでいる細胞においてはウイルス蛋白質合成が阻害されたという事実が確認された。ウイルスキャプシド蛋白質の合成は、ウイルスＲＮＡおよび阻害剤ＲＮＡで同時にトランスフェクトされた細胞においては阻害された（レーン３、パネルＢ）。従って、インビボにおいて酵母阻害剤ＲＮＡはポリオウイルスの翻訳を効果的に阻害した。さらに、酵母阻害剤ＲＮＡの存在下でのポリオウイルス感染の細胞毒性効果からの単層細胞の保護はレーン３および７（図９Ａ）にみられるように宿主細胞蛋白質合成の回復と平行していた。実施例１０酵母１−ＲＮＡの欠失突然変異体の分析ポリオウイルスＩＲＥＳ媒介翻訳の阻害に必要とされるＩ−ＲＮＡ配列を決定するため、酵母Ｉ−ＲＮＡの１５ｎｔ長欠失の組を発生させた（Ｉ−１、Ｉ−２、Ｉ−３およびＩ−４と称される：図１６）。Ｉ−ＲＮＡ欠失突然変異体はオリゴヌクレオチド鋳型からのＴ７ＲＮＡポリメラーゼによるインビトロ転写により発生させた。各々Ｔ７プロモーターアダプター配列で始まりＴ−ＲＮＡ配列の異なった領域からの種々の長さが続く、異なった長さのオリゴヌクレオチドが合成された（ＢｉｏｓｙｎｔｈｓｉｓＩｎｃ．）。オリゴデオキシリボヌクレオチド鋳型は０．１ＭＮａＣｌ中で当モル量の１７ｍｅｒＴ７プライマーオリゴヌクレオチドと混合し、１００℃で５分間加熱した後に室温まで徐々に冷却してアニール化した。異なったＩ−ＲＮＡ欠失突然変異体のヌクレオチド位置は図１６に示されている。ポリオウイルス５ＵＴＲを含むＰ２ＣＡＴＲＮＡによりプログラムされているインビトロ翻訳に対する端を切り取ったＩ−ＲＮＡの影響が決定された。Ｉ −１およびＩ−２ＲＮＡの両方とも無傷のＩ−ＲＮＡのようには活性でないけれども、翻訳−阻害では依然として活性であった。しかしながら、Ｉ−ＲＮＡからのヌクレオチド３１−４５または４６−６０の欠失は、ポリオウイルスＲＮＡの５’ＵＴＲによりプログラムされているヒーラー溶解物でのインビトロ翻訳の阻害により示されるように、ＩＲＥＳ媒介翻訳を阻害する能力をほとんど全部破壊していた。特に、ヒーラー溶解物中でのｐＧ３ＣＡＴおよびＰ２ＣＡＴＲＮＡのインビトロ翻訳に対する異なったＩ−ＲＮＡ欠失突然変異体の影響が決定された。インビトロ翻訳は２ｐｇの欠失Ｉ−ＲＮＡの存在下または不在下、約２ｐｇのキャップされていないｐ２ＣＡＴＲＮＡかまたはｐＧ３ＣＡＴＲＮＡで実施された。これらの試験の結果は、Ｉ−ＲＮＡの３’末端半分がウイルスＩＲＥＳ媒介翻訳の阻害に必要とされる主配列を含んでいることを示している。しかしながら、最初の１５ヌクレオチド（即ち、Ｉ−１で欠失している）または次の１５ヌクレオチド（Ｉ−２）内に存在する配列を欠く突然変異体は無傷のＩ−ＲＮＡほど活性でないので、これらの配列もまた阻害に一つの役割を果たしている。さらなる欠失分析でＩ−ＲＮＡの２５ｎｔ長断片（Ｉ−７ＲＮＡ、ｎｔ２６−５０）はウイルス翻訳−阻害においてＩ−ＲＮＡのように活性であることが示された。その３’末端に余分の１０ヌクレオチドを含む類似の欠失突然変異体（Ｉ−６ＲＮＡ、ｎｔ２６−６０）もまた活性であったがＩ−７ＲＮＡほど活性ではなかった。しかしながら、ｎｔ１−２５を含むＩ−ＲＮＡの断片（Ｉ−８ＲＮＡ）は翻訳 −阻害においてまったく不活性であった。Ｉ−７のさらなる欠失はより小さな断片を生じさせ（Ｉ−９、ｎｔ３０−４５）、それはＩＲＥＳ媒介翻訳を阻害することができた。翻訳を阻害するこの断片（Ｉ−９）の能力は、Ｉ−３ＲＮＡに翻訳を阻止する能力がないことを前に指摘したこととまったく一致している（なぜなら、Ｉ−３ＲＮＡではｎｔ３１−４５が欠失している、図３）。試験された突然変異体Ｉ−ＲＮＡのどれもｐＣＡＴＲＮＡのキャップ依存性翻訳を阻害することはできなかった。端が切断されたＩ−ＲＮＡが翻訳の内部開始を阻害できるかどうかを決定するため、ビシストロン構築物からの翻訳に対するそれらの効果が決定された。ポリオウイルス５’ＵＴＲが隣接するＣＡＴおよびルシフェラーゼ（ＬＵＣ）遺伝子を含むビシストロン楕築物がこの実験で使用された。ポリオウイルス５’ＵＴＲから内部的に起こるキャップ非依存性翻訳の開始はルシフェラーゼの合成を生じるであろうし、一方、キャップ依存性翻訳では普通はＣＡＴ蛋白質を産生するであろう。非感染セーラー細胞抽出物において、キャップ化ビシストロンメッセージからの翻訳は異なった細胞抽出物を用いた別々の実験においてＣＡＴおよびルシフェラーゼ蛋白質の両方を産生した。完全長Ｉ−ＲＮＡの添加はルシフェラーゼの合成を優先的に阻害したが、ＣＡＴの合成は阻害しなかった。２５ｎｔ長Ｉ −７ＲＮＡはルシフェラーゼの産生をほとんど完全に阻害した。しかしながら、ＣＡＴ合成はＩ−７を含む反応において有意に刺激された。突然変異体Ｉ−４ＲＮＡではルシフェラーゼ合成の阻害は明らかではなかった。ＣＡＴ蛋白質の合成はＩ−４によっても刺激された。類似の結果がＩ−９およびＩ−８ＲＮＡで得られた。１６ｎｔ長Ｉ−９ＲＮＡはルシフェラーゼ合成を対照と比較すると有意にルシフェラーゼ合成を阻害した。Ｉ−９存在下、ＣＡＴ産生の２０％の阻害が観察されたが、ルシフェラーゼ合成は対照のほぼ８５％以上が阻害された。対照的に、Ｉ−８ＲＮＡはルシフェラーゼまたはＣＡＴ両方の合成を有意に阻害しなかった。これらの結果はＩ−７およびＩ−９ＲＮＡはポリオウイルス５’ＵＴＲによりプログラムされている翻訳の内部開始を優先的に阻害するが、Ｉ−４およびＩ−８ＲＮＡは阻害しないことを示唆している。突然変異体Ｉ−ＲＮＡがインビボでポリオウイルスＲＮＡの翻訳を阻害するかどうかを決定するため、ヒーラー細胞内へポリオウイルスＲＮＡが単独でまたは精製Ｉ−７、Ｉ−９、Ｉ−４、Ｉ−８およびＩ−ＲＮＡと一緒にトランスフェクトされた（リポソームを用いて）。蛋白質は³⁵Ｓ−メチオニンで標識され、ウイルス蛋白質の合成は抗キャプシド抗血清を用いて細胞抽出物からのウイルスキャプシド蛋白質の免疫沈降によりモニターした。偽トランスフェクト細胞からはキャプシド蛋白質は沈澱できなかった。ポリオウイルスＲＮＡ単独での細胞のトランスフェクションでは、キャプシド蛋白質の合成が明瞭に検出された。Ｉ−７ＲＮＡまたはＴ−ＲＮＡとポリオウイルスＲＮＡの同時トランスフェクションはキャプシド蛋白質合成の９０％を超える阻害が得られた。Ｉ−９ＲＮＡの活性はＩ −７またはＩ−ＲＮＡで観察された活性の約５０％であった。しかしながら、Ｉ −９ＲＮＡのより高い濃度では、Ｉ−７ＲＮＡで観察された程度までウイルス蛋白質合成を阻害した。予想されるように、Ｉ−８ＲＮＡおよびＩ−４ＲＮＡはウイルス蛋白質の翻訳を阻害できなかった。ポリオウイルスＲＮＡ単独でトランスフェクトされた細胞およびＰＶＲＮＡおよびＩ−７またはＩ−９ＲＮＡの混合物でトランスフェクト細胞両方で類似の量の細胞内ポリオウイルスＲＮＡが検出されたことに注目すべきであり、Ｉ−ＲＮＡまたはその誘導体を含む細胞においてもＰＶＲＮＡの安定度は有意に変化しないことを示唆している。実施例１１完全長および欠失Ｉ−ＲＮＡと相互作用する細胞性蛋白質の同定上記５２ｋＤａＩ−ＲＮＡ結合蛋白質はヒトＬａ自己抗原と同一であるべきことが示され、および種々の他の細胞性蛋白質因子が完全長または欠失Ｉ−ＲＮＡへ結合することが示された。移動度シフト実験のため、５０マイクログラムのヒーラーＳ１０抽出物または１０ｐｇのヒーラーリボソーム塩洗浄物（ＲＳＷ）を５ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．６）、２５ｍＭＫＣｌ、２ｍＭＭｇＣｌ₂、２ｍＭＤＴＴ、０．１ｍＭＥＤＴＡ、１．５ｍＭＡＴＰ、２ｍＭＧＴＰおよび３．８％グリセロールを含む１５μｌの反応混合物中、４ｐｇのポリ（ｄＩ−ｄＣ）（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）と３０℃にて１０分間、前もってインキュベートした。競合実験のためには、１００倍モル過剰の非標識競合剤ＲＮＡを反応液に加え、３０℃にて１０分間インキュベートした。最後に、５から１０フェムトモルの標識ＲＮＡプローブを各々の反応混合物を加えさらに３０℃にて２０分間インキュベートした。５％グリセロールおよび０．０２％ずつのブロモフェノールブルーおよびキシレンシアノールの最終濃度になるように反応混合物に３マイクロリットルのゲル負荷色素を添加した。スーパーシフトアッセイのため、Ｓ１０抽出物は２．５μｌの非免疫ヒト血清かまたは２．５μｌのＬａ蛋白質に対する免疫ヒト血清と氷上で１０分、前もってインキュベートし、各々の³²Ｐ−標識ＲＮＡプローブを反応混合物に加えた後、氷上でさらに２０分インキュベーションを続けた。ＲＮＡ−蛋白質複合体は０．５ＸＴＢＥ中に５％グリセロールを含む４％ポリアクリルアミドゲル（アクリルアミド：ビスの比３９：１）で分析した。ＵＶ−誘導架橋形成および免疫沈降分析のためには、上記のように発生させた³² Ｐ−標識ＲＮＡ−蛋白質複合体をマイクロタイタープレート中、２から３ｃｍの距離からＵＶランプ（マルチバンドＵＶ、２５４／３６６ｎｍ、モデルＵＧＬ；２５ＵＶＰＩｎｃ．）で１５分間照射した。非結合ＲＮＡは２０μｇのＲＮａｓｅＡおよび２０単位のＲＮａｓｅＴ１の混合物を用い、３７℃で１５分間切断した。標識複合体の免疫沈降のためには、２−５μｌの非免疫ヒト血清かまたは狼瘡症患者からの免疫ヒト血清（標品Ｌａ抗体）を加え、２００μｌの１ｘＲＩＰＡ緩衝液［５ｍＭトリス（ｐＨ７．９）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１％トリトンＸ−１００、０．１％ＳＤＳおよび１％デオキシコール酸ナトリウム］存在下、氷上に２時間維持した。各々の反応チューブに５ｍｇのプロテインＡセファロースを加え、低温室で１時間ゆっくりと振動させ、その後４℃で５分間、１２，０００ｒｐｍにて遠心分離した。ビーズは１ｘＲＴＰＡで３回洗浄して非特異的結合を減少させた。最後に、１ｘＳＤＳゲル負荷色素（５０ｍＭトリス［ｐＨ６．８］、１００ｍＭＤＴＴ、２％ＳＤＳ、０．１％ＢＰＢ、１０％グリセロール）に再懸濁したビーズを１００℃で５分間加熱し、ＳＤＳ１４％ポリアクリルアミドゲルで分析した。図１２に示したように、標識Ｉ−ＲＮＡおよびヒーラー細胞蛋白質を含んでいるゲル遅延複合体（Ｃで示されている）はヒトＬａ蛋白質への抗体によりスーパーシフトされた（ＳＣで示されている）（図１２、左のゲル、レーン３および４）。標識Ｉ−ＲＮＡおよび精製組換え体Ｌａ蛋白質と形成された類似の複合体（レーン５、複合体Ｃ）もまたヒーラー細胞抽出物で観察されたように同一の相対的位置へ抗Ｌａ抗体でスーパーシフトできた。第二のより遅く移動する複合体もまた精製Ｌａ蛋白質（レーン５）で観察され、その大部分は抗Ｌａ抗体でスーパーシフトできなかった（レーン６）。これらの結果は、標識Ｉ−ＲＮＡおよびヒーラー細胞抽出物をインキュベートすることにより形成された複合体ＣはＬａ自己抗原を含んでいることを示唆している。複合体Ｃが本当にＬａ蛋白質を含んでいることを確認するため、ヒーラー細胞抽出物または精製Ｌａ蛋白質を用いて³² Ｐ−標識Ｉ−ＲＮＡまたは５’ＵＴＲ（５５９−６２４ｎｔ）プローブでのＵＶ架橋形成研究が実施された。ＵＶ架橋複合体は次に抗Ｌａまたは非免疫血清で免疫沈降され、ＳＤＳ−ＰＡＧＥにより分析された。標識Ｉ−ＲＮＡかまたはＵＴＲプローブを用いてヒーラー細胞抽出物で複合体が形成された場合、５２ｋＤａＵＶ架橋蛋白質は抗Ｌａ抗体により特異的に免疫沈降された（図１２、右のゲル、レーン２および５）。この５２ｋＤａバンドは精製Ｌａ蛋白質と³²ＰＩ−ＲＮＡ（レーン３）または³²Ｐ５’ＵＴＲ（レーン６）をインキュベートすることにより形成されたＵＶ架橋、抗Ｌａ免疫沈降複合体と共移動した。レーン２および５に観察される顕著な〜１２０ｋＤａ複合体はＬａ抗体に対して特異的ではなく、非免疫血清を含むレーンにおいても検出されている。これらの結果は、Ｉ−ＲＮＡがヒトＬａ自己抗原と相互作用することを示している。Ｉ−ＲＮＡにより結合されたｐ５２蛋白質の同一性はＩＲＥＳ媒介翻訳の阻害がＬａ抗原の添加により逆転されることを実証することによりさらに確認された。ポリオウイルスはキャップ結合蛋白質複合体のｐ２２０成分を蛋白分解的に切断することにより宿主細胞ｍＲＮＡのキャップ依存性翻訳を阻害することが知られている。従って、ウイルス感染細胞から誘導された抽出物はキャップ非依存性ＩＲＥＳ媒介翻訳にのみ活性であり、キャップ依存性翻訳には活性を示さない。ＩＲＥＳ媒介翻訳のＩ−ＲＮＡ誘導阻害が外因性精製Ｌａ蛋白質の添加により特異的になくなるかどうかを決定するため、ウイルス感染細胞抽出物におけるｐ２ＣＡＴＲＮＡ（５−ＵＴＲ−ＣＡＴ）の翻訳が実施された。ＰＶ感染セーラー細胞抽出物においてのｐ２ＣＡＴＲＮＡの翻訳はＩ−ＲＮＡにより有意に阻害された。感染細胞抽出物へ精製Ｌａ蛋白質が添加された場合、ウイルス５’ ＵＴＲ媒介翻訳の有意な刺激が観察された。このことは多分、ウイルス感染細胞におけるＬａ蛋白質が極限量であるためであろう。Ｉ−ＲＮＡにより媒介された翻訳の阻害は精製Ｌａ蛋白質の添加により、ほとんどＬａ蛋白質のみを含む抽出物で観察された程度まで逆転できる。対照的に、等量のＢＡＳの添加はＩＲＥＳ媒介翻訳を回復できなかった。ウイルス感染細胞抽出物の代わりに偽感染抽出物が使用された場合、類似の結果が観察された。Ｉ−ＲＮＡ突然変異体への種々の蛋白質因子の結合も試験された。上に示した結果はＩＲＥＳ媒介翻訳の阻害における種々のＩ−ＲＮＡ突然変異体の特異な活性を示した。Ｉ−７およびＩ−９ＲＮＡはポリオウイルスＩＲＥＳ媒介翻訳を阻害できたのに対し、Ｉ−４およびＩ−８ＲＮＡは翻訳阻害剤としてはほとんど全く不活性であった。類似のまたは異なった蛋白質がこれらのＲＮＡにより結合されるかどうかを決定するため、種々の標識ＲＮＡプローブがヒーラー蛋白質とインキュベートされ、蛋白質−ＲＮＡ複合体はＵＶ架橋形成、続いてのリボヌクレアーゼ消化により試験された。これらの実験のためヒーラー蛋白質の２つの供給源が使用された、Ｓ１０およびリボソーム塩洗浄（ＲＳＷ）。無ヒーラー細胞系抽出物（Ｓ１０）およびＲＳＷ調製物。ヒーラーＳ１０細胞抽出物は前に記載したように調製された。ヒーラー細胞からのリボソーム塩洗浄物はＢｒｏｗｎおよびＥｈｒｅｎｆｅｌｄ（３３）により記載されている方法をいくつか変更して調製された。ヒーラー細胞培養物（４ｘ１０⁵細胞／ｍｌ）を遠心分離して集め、冷等張緩衝液（３５ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．５、１４６ｍＭＮａＣｌ１１ｍＭグルコース）で３回洗浄し、充填細胞容量の２倍の溶解緩衝液（１０ｍＭＫＣｌ、１．５ｍＭ酢酸マグネシウム、２０ｍＭＨＥＰＥＳ、ｐＨ７．４、および１ｍＭＤＴＴ）に再懸濁し、続いて膨潤させるために氷上で１０分間インキュベーションを行った。細胞は０℃にてタイプＢダウンスホモジナイザー中、５０ストロークで破壊した。破壊後、抽出物はＳｏｒｖａｌｌＳＳ３４ローター中、４℃で１５分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離して核およびミトコンドリア分画を除去した。上清液（Ｓ１０）はＢｅｃｋｍａｎＴｉ６０ローター中４℃で２時間５０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。リボソームペレットは氷浴上穏やかに振とうさせながら溶解緩衝液に約２５０Ａ２６０／ｍｌの濃度で再懸濁した。次に、ＫＣｌ濃度を５００ｍＭに調節し、溶液を氷浴上で３０分間撹拌した。得られた溶液は４℃ で２時間５０，０００ｒｐｍにて遠心分離した。上清液（塩洗浄）には次に０− ７０％硫酸アンモニウム沈澱を実施した。開始因子を含むペレットは少量の透析緩衝液（グリセロールなし）に溶解し、５ｍＭのトリス、１００ｍＭＫＣｌ、０．０５ｍＭＥＤＴＡ、１ｍＭＤＴＴおよび５％グリセロールを含む透析緩衝液（ｐＨ７．５）に対して４℃で一夜透析した。透析物は４℃で１０分間１０，０００ｒｐｍにて遠心分離し、上清を少量ずついくつかの前もって冷却した試験管に入れ、−７０℃で保存した。完全長標識Ｉ−ＲＮＡがヒーラーＳ１０抽出物とインキュベートされた場合、１００、７０、４８および４６ｋＤａの副バンドに加えて、約５２ｋＤａおよび１１０ｋＤａの分子量を持つ２つの主バンドが検出された。リボソーム塩洗浄蛋白質が使用された場合、蛋白質−ヌクレオチド複合体のプロフィールはＳ１０のものと著しく異なっていた。第一に、１１０ｋＤａバンドはＲＳＷを含む反応では非常に少量しか存在しない。第二に、５２ｋＤａ蛋白質は５４−５２ｋＤａのタブレットとして存在し、Ｓ１０のものと比較して相対的に量が少なかった。第三に、ＲＳＷ含有反応においては約８０および３７ｋＤａの新しいバンドが明かであった。完全長Ｉ−ＲＮＡと対照的に、ＵＶ架橋形成実験において端が切断された標識Ｉ−ＲＮＡが使用された場合、各々のＲＮＡの蛋白質−ヌクレオチドプロフィールはＳ１０およびＲＳＷの間で著しく類似していた。Ｉ−４およびＩ− ８ＲＮＡは主として７０、５２、４８、４６および３７ｋＤａポリペプチドに結合するのに対し、Ｉ−７およびＩ−９ＲＮＡは８０ｋＤａの新規バンドと相互作用した。８０ｋＤａバンドはＩ−７ＲＮＡでより著しかった。さらに、Ｉ−４およびＩ−８ＲＮＡにより結合された７０ｋＤａポリペプチドはＩ−７およびＩ− ９ＲＮＡでは検出できなかった。別の非常に大きい分子量のポリペプチド（２２０ｋＤａマーカーより速く移動する）はＩ−４およびＩ−８ＲＮＡを含む反応においてのみ存在した。同様に、ＲＳＷを利用する実験において、１００ｋＤａポリペプチドはＩ−７およびＩ−９ＲＮＡにより優先的に結合された。競合実験において、非標識Ｉ−７およびＩ−４ＲＮＡは標識Ｉ−７およびＩ−４ＲＮＡプローブにより結合されたすべての主蛋白質バンドで競合した。例えば、Ｉ−７ＲＮＡに複合した３つすべてのポリペプチド（８０ｋＤａ、５２ｋＤａおよび３７ｋＤａ）は非標識Ｉ−７ＲＮＡおよびＩ−４ＲＮＡにより競合されて解離されるが、非特異的ＲＮＡではそういうことはなかった。標識Ｉ−４ＲＮＡでも同様に、７０、５２および３７ｋＤａバンドは非標識Ｉ−７およびＩ−４ＲＮＡと競合するが、非特異的競合剤は競合しなかった。より大きな分子量のポリペプチドは非特異的にＩ−４へ結合するが、非特異的競合剤により完全に競合されて解離される。これらの結果は、活性なＩ−７および不活性なＩ−４ＲＮＡは同一の２つのポリペプチド（５２および３７ｋＤａ）を結合するが、これらの端を切り取った２つのＩ−ＲＮＡは少なくとも１つのポリペプチドへの結合においてお互いに異なっていることを示している：Ｉ−７ＲＮＡは８０ｋＤａポリペプチドを結合するが、Ｉ−４ＲＮＡは７０ｋＤａポリペプチドを結合する。引用文献 Agol，V.I．Adv virus Res（1991）40:103−180 Altman，M．et al．Biochem Biphys Acta（1990）1050 :155-159 Bandopadhyay，P.K．et al．J Virol（1992）66: 6249-6256 Belsham，G.J．et al．J Virol（1990）64:5389-5395 Bonman，A．et al．Virology（1992）188: 685-696 Borman，A．et al．J Gen Virol（1993）74:1775-1788 Borovjagin，A.V．et al．Nucleic Acids Res（1991）19 :4999-5005 Brown，B.A．et al．Virology（1979）97: 376-405 Chang，K.H．et al．J Virol（1993）67:6716-6725 Coward，P．et al．J Virol（1992）66:286-295 Dasgupta，A．Virology（1983）128:245-251 del Angel，Papvassiliou，A.G．Proc Natl Acad Sci USA（1989）86:8299-8303 Dildine，S.L．et al．J Virology（1992）66 :4364-4376 Dorner，H.A．et al．J Virol（1984）50:507-514 Gebhard，J.R．J ．Virol（1992）66:3101-3109 Glass，M.J．et al．Virology（1993）193:842-852 Haller，A.A．et al．J Virol（1992）66:5075-5086 Hellen，C.U.T．et al．Proc Natl Acad Sci USA（1993）90:7642-7646 Jackson，R．et al．Trends Biochem Sci（1990）15:477-483 Jang，S.K．et al．J Virol（1988）62:2636-2643 Jang，S.K．et al．Enzyme（1990）44:292-309 Jang，S.K．et al．Genes Dev（1990）4:1560-1572 Kitamura，N．et al．Nature London（1981）291:547-553 Kohara，K.T．et al．J Virol（1992）66:1476-1483 Kozak，M．Microbiol Rev（1983）47:1-45 Luz，N．et al．FEBS Letters（1990）269:311-314 Luz，N．et al．Virology（1991）65:6486-6494 Macejak，D.G．et al．Nature London（1991）353:90-94 Meerovitch，K．et al．Genes Dev（1989）3:1026-1034 Meerovitch，K．et al．J Virol（1993）67:3798-3807 Najita，L．et al．Proc Natl Acad Sci USA（1990）87:5846-5850 Oh，S．K．et al．Genes Dev（1992）6:1643-1653 Pearson，W.R．et al．Proc Natl Acad Sci USA（1988）85:2444-2448 Pelletier，J．et al．J Virol（1988）62:2219-2227 Pelletier，J．et al．J Virol（1988a）62:4486-4492 Pelletier，J．et al．Nature London（1988）334:320-325 Pelletier，J．et al．Mol Cell Biol（1988）8:1103-1112 Pelletier，J．et al．J Virol（1989）63:441-444 Percy，N．et al．J Virol（1992）66:1695-1701 Pestova，T.V．et al．J Virol（1991）65: 6194-6204 Pilipenko，E.V．et al．Cell（1992）68:119-131 Racaniello，V.R．et al．Proc Natl Acad Sci USA（1981）78:4887-4891 Ransone，L.J．et al．J Virol（1987）61:1781-1787 Rose，J.K．et al．Proc Natl Acad Sci USA（1978）75:2732-2736 Rothblatt，J.A．et al．Cell（1986）44:619-628 Skinner，M.A．et al．J Mol Biol（1989）207:379-392 番号により引用されている参照文献１．Tsukiyama-Korhara,K.l.,N.Zuka,51.Kohara,and A.Nomoto．1992．肝炎ＣウイルスＲＮＡ内の内部リボソーム侵入部位. J．Virol，66: 1476-1483. ２．Fukushi,S.,K.Katayama,C.Kurillar.l,N.Islliyama,F.B.Hoshino,T.Andor a nd A.Oya．1994．肝炎ＣウイルスＲＮＡの効果的な内部開始のためには競合５’ −非コード領域が必要である．Biochem．Biophys．Res．Commun.199:425-432. ３．Liu,D.X.M.,and S.C.Inglis.1992.感染性気管支炎ウイルスによりコードされているトリ−シストロンｍＲＮＡ上のリボソームの内部侵入．J．Virol．66:6 143-6154. ４．Le,S.-Y.,N.Sonenberg,and J.V.Maizel,Jr.1994．感染性気管支炎ウイルスによりコードされているｍＲＮＡ中の固有の構造要素およびリボソームの内部侵入．Virology 198:405-411. ５．Chang,L.-J.,P.Prycrak,and D.Ganem．1989．肝炎Ｂウイルスの逆転写酵素の生合成は初めからリボソームフレームシフトではない翻訳開始を含んでいる． Nature．337:364-368. ６．Roy Choudury,S,C.Shih.1990 内部ＡＴＧの作製によるヒト肝炎Ｂウイルスの突然変異逆転写酵素のシス救出．J.Virol．64:1063-1069. ７．Herman，R.C．1986．水疱性口内炎ウイルスリン蛋白質ｍＲＮＡ翻訳の内部開始は第二の蛋白質を与える．J.Virol．58:797-804. ８．Hassin,D.,R.Korn,and M.S.Horwitz．1986．アデノウイルスＤＮＡポリメラーゼのインビトロ翻訳のための主内部開始部位．Virology．155:214-224. ９．Curran,J.,and D.Kolakofsky．1989．インビトロおよびインビボにおけるセンダイウイルスＹ蛋白質の走査非依存性リボソームの開始．EMBO J．8:521-526. 10．Das,S.,P.Coward,and A.Dasgupta．1994．小さな酵母ＲＮＡはポリオウイルスＲＮＡによりプログラムされている翻訳の内部開始を阻止する：ウイルス５’ −非翻訳領域へ結合する細胞性蛋白質との特異的相互作用．J．Virol.（印刷中）. 11．Pilipenko,E.V.,Blinov,V.M.,Rolmanova,L.I.,Sinyakov,A.N.,Maslova,S.V. ,and Agol,V.l．1989．ピコルナウイルスゲノムの５’−非翻訳領域中の保存的構造ドメイン：翻訳および神経毒性を調節しているセグメントの分析．Virology ．168:201-209. 12．Meerovitch,K.,Y.V.Svitkin,I.S.Lee,F.Lejbkowicz,D.J.Kenan,E.K.L.Chan, V.l.Agol,J.D.Keene,and N.Sonenberg．1993．Ｌａ自己抗原は網状赤血球溶解物中のポリオウイルスＲＮＡの異常な翻訳を促進および訂正する．J．Virol．67:3 798-3807. 13．Svitkin,Y.V.,K.Meerovitch,H.S.Lee,J.N.PholaKia,D.Kenan,V.Agol,and N. Sonenberg．1994．ポリオウイルスＲＮＡ上の内部翻訳開始：インビトロでのポリオウイルス翻訳におけるＬａ機能のさらなる特性評価．J．Virol．68:1544-15 50. 14．Das,S.,and A.Dasgupta．1993．ヒトＴＡＴＡ結合転写因子ＴＢＰのポリオウイルス３Ｃ触媒切断に必要な切断部位および決定基の同定．J.Virol．67:3326 -3331. 15．Haller,A.A.,J.H.C.Nguyen,and B.L.Semler．1993．ポリオウイルス感染性に必要な最少内部リボソーム侵入部位．J．Virol．67:7461-7471. 16．Molla,A.,A.V.Paul,and E.Wimmer．1991．ポリオウイルスの無細胞、初めからの合成．Science．254: 1647- 1651. 17．Barton,D.J.,and J.B.Flanegan．1993．インビトロでのポリオウイルスＲＮＡの共役した翻訳および複製：機能性３Ｄポリメラーゼの合成および感染性ウイルス．J.Virol．67:822-831. 18．Kooter,J.M.,and Borst,P．1984．変異体表面糖蛋白質遺伝子のアルファ− アマニチン非感受性転写はトリパノソームでの非連続的転写のさらなる証拠を提供する．Nucl.Acid Res．12:9457-9472. 19．Dasgupta,A．1983．ポリオウイルスＲＮＡのインビトロ転写に必要な宿主因子の精製．Virology．128:245-951. 20．Takeda,N.,C.F.Yang,R.J.Kuhn,and E.Wimmer．1987. インビトロでのポリオウイルスのゲノム連結蛋白質のウリジル化は外因性ＲＮＡ鋳型に依存している．Virus Res．8:193-204 21．Toyoda,H.,C.F.Yang,A.Nomoto,and E.Wimmer．1987. インビトロ分子遺伝学的方法を用いることによるタイプＩポリオウイルスのＲＮＡ合成の分析．J.Vi rol．61:2816-2822 22．Borman,A.,M.T.Howell,J.G.Patton,and R.J.Jackson．1993．ヒトライノウイルスＲＮＡ翻訳の内部開始におけるスプライスソーム成分の関与．J.Gen.Viro l．74:1775- 1788. 23．Pattanaik,A.,Ball,L.A.,LeGrone,A.W.,and Wertz,G.W．1992．ｃＤＮＡクローン転写体からのＶＳＶの感染性欠陥干渉性粒子．Cell 69:1011-1020. 24．Sharmeen,L.,Kuo,M.Y.P.,Dinter-Gottlieb,G.,and Taylor，J．1988．ヒト肝炎デルタウイルスの抗ゲノムＲＮＡは自己切断できる．J.Virol．62:2674-267 9. 25．Coward,P.,and A.Dasgupta.(1992)．酵母細胞はポリオウイルス５’−非翻訳領域を含むＲＮＡを翻訳できない：翻訳阻害剤の証拠．J．Virol．66:286-295 ． 26．Chambers,J.C.,D.Kenan,B.J.Martin,and J.D.Keene．1988．ヒトＬａ自己抗原のゲノム構造およびアミノ酸配列．J．Biol．Chem 263:18043-18051. 27．Meerovitch,K.,J.Pelletier,and N.Sonenberg．1989．ポリオウイルスＲＮＡの５’−非コード領域へ結合する細胞性蛋白質：内部翻訳開始の含み．Genes Dev．3:1026-1034. 28．Hellen,C.U.T.,T.V.Pestova.M.Litterst,and E.Wimmer．1994．細胞性ポリペプチドｐ５７（ピリミジン系結合蛋白質）はポリオウイルス５’非翻訳領域の多くの部位に結合する．Virology．68:941-950. 29．Berlioz,C.,and J.L.Darlix(1995)．内部リボソーム侵入機構はマウス白血病ウイルスｇａｇポリ蛋白質前駆体の翻訳を促進する．J ．Virol．69:2214-2222 . 30．Poole,T.L.,R.A.Popp,L.N.Potgieter,A.Siddique,M.S.Collett．(1995)．ペスチウイルス翻訳開始は内部リボソーム侵入により起こる．Virology 206:750-7 54. 31．Riechman,J.L.,S.Lain,J.A．(1991)．プラムポックスポチウイルスゲノムＲＮＡの開始コドンの同定．Virology 185:544-552. 32．He,W.W.,J.K.Lindzey,J.L.Prescott,M.V.Kumar.D.J.Tindall．(1994)．睾丸女性化（Ｔｆｍ）マウスのアンドロジェンレセプターは内部翻訳開始の生成物であろう．Receptor（1994，夏）4(2):121-134. 33．Brown,B.A.,and E.Ehrenfeld(1979)．インビトロでのポリオウイルスの翻訳：リボソーム塩洗浄による切断パターンおよび開始部位の変化. Virology 97:3 96-405. これまで説明および例示してきた原理を応用して、当業者は、一つまたはそれ以上の蛋白質の結合により翻訳が内部リボソーム結合部位で開始される任意の所望の標的ＲＮＡに対し、効果的な阻害剤ＲＮＡまたはその構造模倣物を設計し、および本発明に従った翻訳阻害の最適条件を決定できることは明白である。本明細書に引用した各々の報文の全記述は、本明細書において援用される。

【手続補正書】【提出日】１９９７年４月１６日【補正内容】１．明細書の記載を以下の通り補正する。頁行補正前補正後８２２図１図１Ａ〜１Ｄ８２３パネルＡ図１Ａ８２５パネルＢ図１Ｂ８２８パネルＣ図１Ｃ９６パネルＤ図１Ｄ９１２図２図２Ａ〜２Ｄ９１３パネルＡ、ＢおよびＣ図２Ａ〜２Ｃ９１９パネルＡ図２Ａ９１９パネルＤ図２Ｄ１０７図４図４Ａ〜４Ｂ１０９パネルＡ図４Ａ１０１４パネルＢ図４Ｂ１０２６図６図６Ａ〜６Ｂ１０２８パネルＡ図６Ａ１１４パネルＡ図６Ａ１１５パネルＢ図６Ｂ１１１１図７図７Ａ〜７Ｃ１１１３各パネル各図１１１３パネルＡ図７Ａ１１１４パネルＡ図７Ａ１１２０パネルＢ図７Ｂ１１２４パネルＣ図７Ｃ１２１図８図８Ａ〜８Ｂ１２２パネルＡ図８Ａ１２９パネルＢ図８Ｂ１２２６図１０図１０Ａ〜１０Ｂ１２２７パネルＡおよびＢ図１０Ａおよび１０Ｂ１３１図１１図１１Ａ〜１１Ｂ１３１５図１２図１２Ａ〜１２Ｂ１３１７左図１２Ａ１３１７右図１２Ｂ１４１９図１５図１５Ａ〜１５Ｂ１４１９図１０図１０Ａ〜１０Ｂ１４２１パネルＢ図１５Ｂ

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (72)発明者ダスグプタ，アシムアメリカ合衆国カリフォルニア州90034, ロサンジェルス，マルコルム・アベニュー 3314 (72)発明者コワード，ピーターアメリカ合衆国カリフォルニア州94141− 9100，サンフランシスコ，ピーオーボックス 419100，グラッドストン・インスティチュート（番地なし)

Claims

【特許請求の範囲】１．ｍＲＮＡの翻訳を阻止する方法であって、その翻訳が、該ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つ該部位に対するタンパク質因子の結合を必要とし、該方法が該ｍＲＮＡを翻訳することができる系において、該因子に対して選択的に結合する翻訳阻止有効量の分子を提供し、それによって該因子が該ｍＲＮＡの該部位に対して結合するのを妨げる工程を含み、ここにおいて、該分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチド；および該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体から成る群より選択される上記方法。２．前記ｍＲＮＡが、ピコルナウイルス、フラビウイルス、コロナウイルス、Ｂ型肝炎ウイルス、ラブドウイルス、アデノウイルスおよびパラインフルエンザウイルスから成る群より選択されるウイルスのウイルスＲＮＡである請求項１に記載の方法。３．前記ウイルスが、ポリオウイルス、ライノウイルス、Ａ型肝炎ウイルス、コクサッキーウイルス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫ウイルス、エコーウイルス、Ｃ型肝炎ウイルス、伝染性気管支炎ウイルス、アヒルＢ型肝炎ウイルス、ヒトＢ型肝炎ウイルス、水泡性口内炎ウイルスおよびセンダイウイルスから成る群より選択される請求項２に記載の方法。４．前記ｍＲＮＡが、免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）をコードしている細胞ｍＲＮＡである請求項１に記載の方法。５．前記分子を、前記ｍＲＮＡを翻訳することができる前記系に対して前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを加えることによって提供する請求項１に記載の方法。６．前記分子を、前記ｍＲＮＡを翻訳することができる前記系に対して、異型ヌクレオチド配列に対して結合した前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子を加えることによって提供する請求項１に記載の方法。７．前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドを、前記ｍＲＮＡを翻訳することができる前記系での前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドの in situ 生産のための発現構築物によって提供する請求項１に記載の方法。８．前記ｍＲＮＡを翻訳することができる前記系が、細胞を含まない系である請求項１に記載の方法。９．前記ｍＲＮＡを翻訳することができる前記系が、前記ｍＲＮＡを生産するウイルスに感染しているまたは感染の危険がある哺乳動物細胞である請求項１に記載の方法。１０．ｍＲＮＡの翻訳を阻止する分子であって、その翻訳が、該ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位で開始され且つ該部位に対するタンパク質因子の結合を必要とし、該分子は該因子に対して選択的に結合し、それによって該因子が該ｍＲＮＡの該部位に対して結合するのを妨げ、ここにおいて、該分子は、３５未満のヌクレオチドから成るＲＮＡオリゴヌクレオチド；および該ＲＮＡオリゴヌクレオチドの構造模擬体から成る群より選択される上記分子。１１．前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、図１Ａで示された配列；図１Ａで示された配列に相補的な配列；ポリオウイルスのヌクレオチド１８６〜２２０の配列（ステム−ループＤ）；ポリオウイルスのヌクレオチド５７８〜６１８の配列（ステム−ループＧ）；ポリオウイルスのヌクレオチド２６０〜４１５の配列（ステム−ループＥ）；ポリオウイルスのヌクレオチド４４８〜５５６の配列（ステム−ループＦ）；および前記ｍＲＮＡの前記内部リボソームエントリー部位に対して前記タンパク質因子を結合する免疫グロブリン重鎖結合タンパク質（Ｂｉｐ）ｍＲＮＡの配列から成る配列の群より選択される少なくとも一部分を含む請求項１０に記載の分子。１２．前記ＲＮＡオリゴヌクレオチドのヌクレオチド配列が、５′ＧＣＧＣＧＧＧＣＡＧＣＧＣＡ３′である請求項１０に記載の分子。１３．異型ヌクレオチド配列に対して結合した請求項１０に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含むＲＮＡ分子。１４．ＲＮＡ分子をコードしている発現構築物であって、該ＲＮＡ分子が、異型ヌクレオチド配列に対して結合した請求項１０に記載のＲＮＡオリゴヌクレオチドを含む上記発現構築物。１５．前記タンパク質因子が、５２ｋＤａＬａ自己抗原または８０ｋＤａポリペプチドである請求項１０に記載の分子。１６．ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位に対して結合して該ｍＲＮＡの翻訳を開始するのに必要とされる翻訳開始因子に対して結合するタンパク質またはＲＮＡをコードしているポリヌクレオチドを単離する方法であって、（ａ）ＤＮＡ結合ドメインおよび活性化ドメインを有する転写因子によって調節されたプロモーターの制御下において、リポーター遺伝子を含むＤＮＡ構築物によって適当な宿主細胞を形質転換するまたはトランスフェクションし；（ｂ）該宿主細胞中において、該翻訳開始因子と、該転写因子のＤＮＡ結合ドメインかまたは活性化ドメインとの一部分または全部の第一融合をコードしている第一ハイブリッドＤＮＡ配列を発現させ；（ｃ）該宿主細胞中において、推定上の開始因子結合タンパク質またはＲＮＡと、該第一融合中に包含されない該転写因子のＤＮＡ結合ドメインまたは活性化ドメインとの一部分または全部の第二融合をコードしている第二ハイブリッドＤＮＡ配列のライブラリーを発現させ；（ｄ）特定の宿主細胞中でのリポーター遺伝子産物の生産を検出することによって該宿主細胞中での該開始因子に対する結合タンパク質またはＲＮＡの結合を検出し；そして（ｅ）該特定の宿主細胞からの開始因子結合タンパク質またはＲＮＡをコードしている第二ハイブリッドＤＮＡ配列を単離する工程を含む上記方法。１７．ｍＲＮＡの内部リボソームエントリー部位に対して結合して該ｍＲＮＡの翻訳を開始するのに必要とされる翻訳開始因子と特異的に反応することができる化合物であって、該開始因子と該開始因子の結合パートナーとの相互作用を調節することができる該化合物を識別する方法であって、（ａ）該開始因子若しくはそのフラグメントまたは該開始因子の結合パートナー若しくはそのフラグメントを固体支持体上に固定化し；（ｂ）非固定化結合パートナーを検出可能な物質によって標識し；（ｃ）該固定化結合パートナーと該標識結合パートナーとを、該開始因子と特異的に反応しうる推定上の調節化合物の存在下および不存在下で接触させ；（ｄ）該固定化結合パートナーおよび該標識結合パートナー間の結合を検出し；そして（ｅ）調節用化合物を、該固定化結合パートナーおよび該標識結合パートナー間の結合に影響を与える化合物として識別する工程を含む上記方法。１８．前記開始因子または前記開始因子の結合パートナーを、蛍光物質によって被覆されたまたは含浸した固体支持体上に固定化し；そして該開始因子の結合パートナーとの該開始因子相互作用を、該蛍光物質からの発光によって検出する請求項１７に記載の方法。