JPH0769899A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 【構成】 ウイルス遺伝子の５’非翻訳領域に存在する
特異的な構造であるＩＲＥＳ（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉ
ｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ Ｓｉｔｅ）領域に結合して
該ウイルス遺伝子の翻訳に関与するタンパク質と該ウイ
ルス遺伝子のＩＲＥＳ領域との結合を阻害する物質を有
効成分とする抗ウイルス剤。ＩＲＥＳ領域を有するウイ
ルスとしては、例えばＣ型肝炎ウイルス、ポリオウイル
ス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫病ウイルス、ヒトライノ
ウイルス等が挙げられる。 【効果】 本発明の抗ウイルス剤は、ＨＣＶ等のＩＲＥ
Ｓを有するウイルスに起因するウイルス性疾患に対する
予防または治療薬を提供するものである。ＩＲＥＳが関
与する翻訳機構は、通常の真核細胞の翻訳系にはほとん
ど見られない特殊なものであることから、副作用の少な
い、極めて選択的な抗ウイルス剤としての利用が期待さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【産業上の利用分野】本発明は抗ウイルス剤に関し、詳
細にはＩＲＥＳと呼ばれる特異領域を有するウイルスが
関与する各種疾患に対する治療または予防薬を提供する
ものである。

【０００２】

【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、後天性免疫不全症候群（ＡＩＤＳ）や肝炎に代表さ
れるように、感染性のウイルス疾患が医学上、さらには
社会的にも重篤な問題として認識されるようになった。
これらのウイルス性疾患を治療する目的で、従来より種
々の抗ウイルス剤が開発されてきた。例えばわが国にお
いてはアシクロビル、ビダラビン、ジドブジン（アジド
チミジン）、イドクスウリジン、ガンシクロビル、イン
ターフェロン等が販売されている。これらは、大別する
と直接ウイルスの酵素の機能を阻害する薬物と、免疫機
構を介してウイルスを攻撃する薬物との、大きく２つの
タイプに分類される。

【０００３】このような抗ウイルス剤の開発は、年々盛
んになりつつある。それは、慢性疾患と考えられてきた
ものが、実はウイルスがその原因であるということが往
々にしてあるからである。また高齢化社会が進むに従
い、潜伏感染していたウイルスが免疫力の低下した老人
で発病する、いわゆる日和見感染の問題も、抗ウイルス
剤の需要を喚起する一因となっている。

【０００４】ところが従来の抗ウイルス剤は、副作用が
強すぎたり、薬剤耐性ウイルスが出現するなど、必ずし
も満足のいくものが得られていないのが現状であった。

【０００５】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を鑑みて、従来にない新しい作用機序の抗ウイルス剤を
開発するべく検討を重ねてきた。その結果、一部のウイ
ルス遺伝子に見られる特殊な翻訳機構領域、ＩＲＥＳ
（Ｉｎｔｅｒｎａｌ Ｒｉｂｏｓｏｍｅ Ｅｎｔｒｙ
Ｓｉｔｅ）に着目し、この機能を利用することでウイル
ス蛋白の翻訳を阻害できることを初めて見出し、本発明
を完成するに至った。

【０００６】すなわち本発明の要旨は、ウイルス遺伝子
のＩＲＥＳ領域に結合して該ウイルス遺伝子の翻訳に関
与するタンパク質と該ウイルス遺伝子のＩＲＥＳ領域と
の結合を阻害する物質を有効成分とする抗ウイルス剤に
存する。以下、本発明につき詳細に説明する。本発明に
おいて、ＩＲＥＳ領域とは、前述のように一部のウイル
ス遺伝子の５’非翻訳領域（５’ＵＴＲ）に存在する特
異的な構造で、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス、口
蹄疫病ウイルス、ヒトライノウイルス等のピコルナウイ
ルス科に属するウイルスや、Ｃ型肝炎ウイルス（以下、
「ＨＣＶ」と略記することがある）（Ｊ．Ｖｉｒｏ
ｌ．，６６，１４７６−１４８３（１９９２））等に存
在する。この構造はステムループに富む複雑な高次構造
をとると考えられ、この領域に結合してウイルス遺伝子
の翻訳、転写に機能する宿主細胞タンパク質、例えば分
子量５２Ｋ（ｐ５２タンパク質）、５７Ｋ（ｐ５７タン
パク質）、５０Ｋのタンパク質の存在が確認され（Ｐｒ
ｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８７，５
８４６−５８５０（１９９０））、リボソームはこの宿
主細胞タンパク質が結合したＩＲＥＳ領域を認識して結
合することが知られている（Ｃｕｒｒ．Ｔｏｐ．Ｍｉｃ
ｒｏｂｉｏｌ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．，１６１，２３−４７
（１９９０）；Ｅｎｚｙｍｅ，４４，２９２−３０９
（１９９０））。

【０００７】また、Ｊａｎｇらは、ピコルナウイルス
５’ＵＴＲに存在するオリゴピリミジン（Ｙn ）とＡＵ
Ｇトリプレットを含むＹn −Ｘm −ＡＵＧユニット（Ｘ
m ：ランダムヌクレオチド）がＩＲＥＳに多く存在する
と述べており（ｉｎ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎａｌｌｙ
Ｒｅｇｕｌａｔｅｄ Ｇｅｎｅｓ ｉｎ Ｈｉｇｈｅ
ｒ Ｅｕｋａｒｙｏｔｅｓ，２９２−３０９，Ｂａｓｅ
ｌ（１９９０））、Ｐｉｌｉｐｅｎｋｏらは、Ｙn とＡ
ＵＧエレメント間の距離（Ｘm ）が２２ヌクレオチド付
近であり、このＹn エレメントがＳＤ配列様の機能を果
たしている可能性を示している（Ｃｅｌｌ，６８，１１
９−１３１（１９９２））。

【０００８】本発明においては、ウイルス遺伝子のＩＲ
ＥＳ領域に結合して該ウイルス遺伝子の翻訳に関与する
タンパク質と該ウイルス遺伝子のＩＲＥＳ領域との結合
を阻害する手段としては、前述のＩＲＥＳ領域に結合し
てウイルス遺伝子の翻訳、転写に機能する宿主細胞タン
パク質とＩＲＥＳ領域との結合を阻害する方法が挙げら
れ、特にＩＲＥＳ領域のＹn −Ｘm ユニット（Ｙn はオ
リゴピリミジンを表し、Ｘm はランダムヌクレオチドを
表す）に結合してウイルス遺伝子の翻訳に関与するタン
パク質と該ウイルス遺伝子のＩＲＥＳ領域との結合を阻
害する方法が挙げられる。従って本発明の抗ウイルス剤
は、ＩＲＥＳに対する結合を宿主細胞タンパク質と拮抗
する物質や、Ｙn −Ｘm ユニットとハイブリッドを形成
して宿主細胞タンパク質との結合を阻害する化合物など
が好適に用いられる。

【０００９】以下にＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ領域とハイ
ブリッドを形成して宿主細胞タンパク質との結合を阻害
する化合物（以下、「ハイブリッド化合物」と略記す
る）を提供する場合を例にとり、具体的に説明する。Ｈ
ＣＶは、１９８８年５月カイロン社が、従来の伝統的な
ウイルス探索法とは全く異なる方法により、その遺伝子
断片を世界で初めて取得した。

【００１０】Ｃ型肝炎が発症すると高い確率で急性肝
炎、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と移行し、患者を死亡させ
るが、現在まで、ＨＣＶの発現または増殖を抑制する薬
剤は見つかっておらず、ＨＣＶによるこの病状を治す薬
剤の開発が待たれている。ＨＣＶの遺伝子は非常に変異
しやすく、この変異によって、ＨＣＶにはいくつかのサ
ブタイプの異なるものが見出されている。しかしＨＣＶ
遺伝子のＩＲＥＳ領域は、ピコルナウイルスと同様に
５’ＵＴＲ領域に存在し、この領域はＨＣＶの各サブタ
イプ間でも特に変異が少ない領域である。よってこの領
域との相補鎖を作ることで、ウイルスのサブタイプに関
係なくＨＣＶの複製およびＨＣＶ遺伝子産物の発現を阻
害することができる。

【００１１】ＨＣＶの遺伝子は１本のＲＮＡ鎖から成る
とされている。それにコードされているＨＣＶ由来蛋白
質もまず１本のポリペプチドとして翻訳され、これを前
駆体としてＨＣＶ遺伝子から生産されるウイルスの構造
蛋白質（例えば、コア蛋白など）、ＲＮＡポリメラー
ゼ、プロテアーゼ、ヘリカーゼなどがプロセッシングさ
れながら分かれてできるとされている。すなわち、最初
にできる１本のポリペプチドの生産が阻害されれば、ウ
イルスのプロテアーゼも発現せず、ウイルスのＲＮＡポ
リメラーゼによるＨＣＶの複製も起こらないと考えられ
る。最終的には、ＨＣＶ遺伝子由来蛋白質ができなけれ
ば、ＨＣＶは増殖しないことになる。

【００１２】ＨＣＶ遺伝子の阻害活性は、例えばＨＣＶ
遺伝子の５’末端からＥ２の途中までのｍＲＮＡをＴ７
ＲＮＡポリメラーゼ（ストラテージーン社製）を用いて
合成し、ラビット赤血球ライセートとイヌのマイクロゾ
ーマルメンブラン（ともにプロメガ社製）を用いたイン
ビトロ翻訳系でＨＣＶ由来蛋白を合成し抗ＨＣＶコア抗
体により免疫沈降させたコア蛋白質の量を測定して、Ｈ
ＣＶ遺伝子からＨＣＶ由来蛋白の翻訳活性をみることに
より、さらにはＨＣＶ遺伝子の５’末端から少なくとも
コア蛋白をコードする領域をワクシニアウイルスに挿入
して組換えウイルスを作製し、これをヒト由来の細胞株
に感染させることによって発現されるＨＣＶ由来ポリペ
プチドの産生量をみることにより測定することができ
る。

【００１３】ハイブリッド化合物としては、デオキシリ
ボヌクレオシド同志を結合しているホスホジエステル結
合部のリン原子に二重結合している酸素原子が硫黄原子
に置換されたホスホロチオエート型、硫黄原子の代わり
にメチル基が導入されたメチルホスホネート型や無置換
のホスホネート型、αオリゴヌクレオシド型など（Ｃｒ
ｏｏｋｅ，Ｒ Ｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｄｒｕｇ
Ｄｅｓ．（アンチキャンサー ドラッグ デザイン）、
６、６０６−６４６、１９９１；Ｔｉｄｄ，ＤＭ、Ａｎ
ｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅａｒｃｈ（アンチキャンサ
ー リサーチ）、１０、１１６９−１１８２、１９９
０）等が使用できる。また、対象とした配列とハイブリ
ッドを形成し、ＨＣＶ遺伝子と対象とした領域において
２本鎖を形成しうるものであれば、ヌクレオシド誘導体
でなくても良い。さらに言えば、Ａｎｔｉｓｅｎｓｅ
ｒｅｓｅａｒｃｈ ａｎｄ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ
（アンチセンス リサーチ ディベロップメント）、
１、６５−１１３、１９９１にＣｈｒｉｓｅｙ，Ｌ Ａ
によって紹介されたアンチセンスとして使われた総ての
アンチセンス化合物も、使用可能である。

【００１４】また、ハイブリッド化合物としては、より
ＤＮａｓｅ抵抗性であることや、ｍＲＮＡとハイブリッ
ドした時、細胞内のＲＮａｓｅＨ活性で相補鎖のＲＮＡ
を分解できるものが望ましいことも容易に類推できる
（Ｔｉｄｄ，Ｄ Ｍ、Ａｎｔｉｃａｎｃｅｒ Ｒｅｓｅ
ａｒｃｈ（アンチキャンサー リサーチ）、１０、１１
６９−１１８２、１９９０）。また、全てのホスホジエ
ステル結合部がホスホロチオエート型やメチルホスホネ
ート型であるハイブリッド化合物においては、ＩＲＥＳ
領域とのハイブリッド形成能を上げながらもハイブリッ
ド化合物自体の分解活性をあまり下げない手段として、
５’末端側からと３’末端側からの数塩基のホスホジエ
ステル結合をホスホロチオエート型やメチルホスホネー
ト型にして内側の塩基のホスホジエステル結合は修飾し
ない方法等が挙げられる。

【００１５】かかるハイブリッド化合物としては、ＩＲ
ＥＳ領域と相補的な配列を有するものであれば特に制限
はされないが、好ましくは前述したＹn −Ｘm ユニット
に相補的な配列を有するもの、より好ましくはオリゴピ
リミジン領域であるＹn に相補的な配列を有するもので
あることが望ましい。ＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ領域に
は、オリゴピリミジン領域と推定される部位として、シ
トシンリッチな領域が見出される（例えば、配列表の配
列番号１において３３番目のシトシンから３８番目のチ
ミンまでの６ｍｅｒ、６７番目のシトシンから７３番目
のチミンまでの７ｍｅｒ、１３８番目のシトシンから１
４２番目のシトシンまでの５ｍｅｒ、１４７番目のシト
シンから１５７番目のシトシンまでの１１ｍｅｒ、２６
３番目のシトシンから２６７番目のシトシンまでの５ｍ
ｅｒなど）。そこでＨＣＶに対しては、ハイブリッド化
合物としてグアニンリッチな配列を有するものが特に好
ましい。具体的には、配列表の配列番号２〜１７に示す
ようなものが挙げられる。

【００１６】またかかるハイブリッド化合物は、塩基の
長さで表した場合、１５ｍｅｒから３０ｍｅｒの長さと
なるように設計することが望ましい。なお、本発明では
ハイブリッド化合物の構造を表すにあたり、便宜上「塩
基配列」の形式による配列表として表したが、前述した
ように、対象とした配列とハイブリッドを形成し、ＨＣ
Ｖ遺伝子のＩＲＥＳ領域において２本鎖を形成しうるも
のであるならば、必ずしもヌクレオシド誘導体である必
要はない。またハイブリッド形成能を損なわない範囲に
おいて、一部の配列を任意の塩基、好ましくはプリンに
置換しても差し支えない。

【００１７】ハイブリッド化合物を培養細胞に取り込ま
せるには、例えば上記したハイブリッド化合物をそのま
ま培養液に含ませる等により可能であり、長さが１５塩
基から２８塩基ぐらいのホスホロチオエート型やメチル
ホスホネート型であればこの条件で容易に取り込ませる
ことができる。また、取り込みを積極的に行わせるため
に、動物細胞などで盛んに行われているトランスフェク
ション法（燐酸カルシウム法、エレクトロポーレーショ
ン法、リポソーム法など）を用いることも好ましい方法
の一つである。

【００１８】また、人体に投与する場合も、上記ハイブ
リッド化合物をそのまま静脈に送り込めば、動物実験な
どからも容易に推測できるように肝臓に半分ぐらいは吸
収されると思われる。更に、ハイブリッド化合物の構造
や性質によっては、リポソームなどで保護したり、ハイ
ブリッド化合物に細胞を認識できる物質を付加するなど
して取り込み効率を上げることもできる。ハイブリッド
化合物の製造法およびその評価方法について以下にさら
に詳細に述べる。

【００１９】（１）ｍＲＮＡ Ｔ７Ｎ１−１９の取得 例えば、プラスミドｐＵＣＴ７１−１９（欧州公開特許
公報第１８３１３号）をアルカリ法、さらにはＣｓＣｌ
を用いた密度勾配超遠心法で調整する。次に、該プラス
ミドをＥｃｏＲＩ等の制限酵素で完全に切断し、クロー
ンＴ７Ｎ１−１９の３’側の１箇所で切断された線状Ｄ
ＮＡを得る。この線状ＤＮＡ１μｇ程度を用いて、イン
ビトロ トランスクリプションをＴ７ＲＮＡポリメラー
ゼを用いて行わせることにより、ＨＣＶ ｍＲＮＡ Ｔ
７Ｎ１−１９を約８０から１００μｇ得ることができ
る。この時の反応はストラテージーン（Ｓｔｒａｔａｇ
ｅｎｅ）社製のＲＮＡ ＴＲＡＮＳＣＲＩＰＴＩＯＮ
Ｋｉｔを用いてもよいが、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼの活
性条件であれば、別途、試薬を調整し反応させてもよ
い。得られたｍＲＮＡは、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンで確認できる。プローブはクローンＴ７Ｎ１−１９
の３’末端領域のＤＮＡ断片を用いラベリング法で調整
できる。定量は、波長２６０ｎｍでの吸光度により計算
できる。

【００２０】（２）ハイブリッド化合物の合成 例えばアプライド バイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ
Ｂｉｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のＤＮＡシンセサイザー３
９４型を用いることにより、ホスホジエステル型のオリ
ゴヌクレオチドもホスホロチオエート型オリゴヌクレオ
チドも合成することができる。反応はジメトキシトリチ
ル基ＯＮで行い、ＨＰＬＣで精製し（目的産物のジアス
テレオマーは全て１つにまとめた）、その後、酢酸処理
で目的のハイブリッド化合物を調整できる。

【００２１】（３）インビトロ トランスレーション法
を用いたハイブリッド化合物によるＨＣＶ由来蛋白合成
阻害効果 上記（１）で作成したｍＲＮＡを用いてインビトロ ト
ランスレーションを行い、該ｍＲＮＡにコードされてい
るＨＣＶ由来蛋白のＩＲＥＳ活性のもとで発現させる。

【００２２】インビトロ トランスレーションは、例え
ばプロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社製のウサギ赤血球ライ
セート、イヌ マイクロゾーマル メンブランを用い
る。マイクロゾーマル メンブランはコア蛋白とエンベ
ローブ（Ｅ１）の間とエンベローブ（Ｅ１）とＥ２（Ｎ
Ｓ１）の間をシグナルペプチダーゼで切断させるのに必
要と考えられる。翻訳されたポリペプチドには［³⁵Ｓ］
メチオニンが取り込まれる。抗ＨＣＶコア抗体によりＨ
ＣＶコア蛋白質を含むポリペプチドを免疫沈降させ、こ
れをＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動させて、富士写真フィル
ム社製バイオイメージアナライザー ＢＡＳ２０００
（ＢＩＯ−ＩＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ）等を用いる
ことにより解析することができる。

【００２３】ハイブリッド化合物は、ｍＲＮＡとインビ
トロ トランスレーション用試薬が混ざる直前にインビ
トロ トランスレーション試薬に混ぜ、翻訳阻害効果を
見ることが好ましい。その結果、ＨＣＶ遺伝子配列から
設計しうる長さ１５塩基から３０塩基以下のハイブリッ
ド化合物が阻害効果に深く関わっていることが確認され
る。

【００２４】（４）組換えワクシニアウイルスを用いた
細胞評価系における、ハイブリッド化合物によるＨＣＶ
遺伝子の翻訳阻害効果 外来遺伝子の両端にワクシニアウイルス中の特定部位の
配列を連結したものは、かかる部位とワクシニアウイル
ス遺伝子中の対応配列との間に相同性組換えが起こるこ
とが知られている。この方法を用いてＨＣＶ遺伝子を導
入した組換えワクシニアウイルスを作製し、これを適当
な細胞に感染させることにより細胞中でＨＣＶ遺伝子を
発現させることができるので、翻訳されるＨＣＶタンパ
クをアッセイする適当な評価系を構築することにより、
ハイブリッド化合物による翻訳阻害効果を測定すること
ができる。

【００２５】具体的には、後述の実施例に示すように、
ＨＣＶ由来の遺伝子をワクシニアウイルスのヘマグルチ
ニン（ＨＡ）遺伝子中に挿入する。ＨＡはワクシニアウ
イルスの増殖に必須ではない。またＨＡ遺伝子の機能が
失われた場合、そのようなワクシニアウイルスを血球凝
集機能の喪失として、ニワトリ赤血球によるウイルスプ
ラークの染色等により同定することができることから、
外来遺伝子の挿入部位として好適に使用される。しかし
かかる部位としては、外来遺伝子の挿入によりウイルス
の増殖が本質的な影響を受けず、しかも外来遺伝子が挿
入されたウイルスの簡単な同定を可能にする部位である
ならば、特に制限はされない。挿入するＨＣＶ由来の遺
伝子としては、ＨＣＶ由来のものであり、５’側の非翻
訳領域にあるＩＲＥＳ領域を含む遺伝子であることが必
要である。前述したように、ＨＣＶ遺伝子がコードする
ポリペプチドはまず約３，０００アミノ酸からなる１本
のポリペプチド（前駆体タンパク質）として翻訳され、
これがプロセッシングを受けて各機能タンパクができる
とされている。前駆体タンパク質はＮ末端側からコア蛋
白、Ｅ１（エンベロープ）蛋白、Ｅ２（ＮＳ１あるいは
エンベロープ２）蛋白などがこの順で続いているので、
ＨＣＶ遺伝子の構成も５’末端側から非翻訳領域、コア
蛋白をコードする遺伝子、Ｅ１蛋白をコードする遺伝子
等と続く。よってＨＣＶポリペプチドの翻訳阻害効果を
測定するためには、正常にＨＣＶ由来ポリペプチドが産
生される必要があるので、挿入するＨＣＶ由来の遺伝子
は５’側非翻訳領域にあるＩＲＥＳ領域を含み、かつそ
の３’側に続くコア蛋白をコードする遺伝子を少なくと
も含む遺伝子でなければならない。具体的には、配列表
の配列番号１に記載の塩基配列において、５’末端の２
５〜３０番目から９１０ｂｐ程度の長さの塩基配列で表
される遺伝子が挙げられる。この場合、コア蛋白が発現
されればウエスタンブロッティングにより約２２ＫＤａ
の蛋白として確認することができる。

【００２６】かかるＨＣＶ由来の遺伝子は、その５’上
流側にプロモーターを連結してｐＵＣ１９等のベクター
に挿入される。プロモーターとしては、ワクシニアウイ
ルス内で機能するものであれば特に制限はされない。好
ましくは、ワクシニアウイルス由来のｅａｒｌｙプロモ
ーターで、高発現のプロモーターが使用される。具体的
には、ワクシニアウイルス由来の７．５ｋプロモーター
（Ｃｅｌｌ，１２５，８０５−８１３，１９８１）、も
しくはこれに点変異を導入して改変したもの（Ｊ．Ｍｏ
ｌ．Ｂｉｏｌ．，２１０，７４９−７６９，１９８８）
等が挙げられる。また発現量を増強させる目的で、配列
表の配列番号２７に示すような合成ＤＮＡを前記プロモ
ーターと組み合わせて使用することも好ましい態様の一
つである。また、ＨＣＶ由来遺伝子の３’側にルシフェ
ラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を挿入しておくと、
この融合遺伝子が翻訳されて融合蛋白が発現される。融
合蛋白はＨＣＶ由来ポリペプチドとレポーター遺伝子が
コードするポリペプチドとが融合されたものであること
から、適当な条件下でプロセッシングをかけてレポータ
ー遺伝子がコードするポリペプチドを測定することによ
り、間接的にＨＣＶ由来ポリペプチドを測定することが
できる。ＨＣＶ遺伝子には、コア蛋白とＥ１蛋白とをプ
ロセッシングするシグナル配列が存在する。従って、Ｈ
ＣＶコア蛋白の翻訳阻害効果を測定する場合は、このシ
グナル配列を利用してコア蛋白のＣ末端が切断されるよ
うに設計することが望ましい。ベクターの構築は、常法
に従って行うことができる。

【００２７】かくして得られるトランスファーベクター
から、ベクターＤＮＡを常法に従って調製し、このＤＮ
Ａとワクシニアウイルスの野生株とを混合することによ
って相同性組換えを行わせる。こうして得られた組換え
ワクシニアウイルスを、例えばヒト由来の細胞株に感染
させる。この感染細胞中に組換えタンパクが発現される
ので、感染細胞の培養物から常法に従ってタンパク成分
を得、ウエスタンブロッティング等によりＨＣＶ由来の
ポリペプチドを測定することができる。

【００２８】ハイブリッド化合物は、組換えワクシニア
ウイルスを細胞株に感染させる前及び／又は後に添加さ
れる。対象としてハイブリッド化合物を加えないときの
組換えＨＣＶ由来ポリペプチドの産生量、又はＩＲＥＳ
領域の相補鎖とホモロジーの低い、すなわちハイブリッ
ドをほとんど形成しない化合物を加えたときの組換えＨ
ＣＶ由来ポリペプチドの産生量等と比較を行うことによ
り、ハイブリッド化合物の翻訳阻害効果を求めることが
できる。

【００２９】かかるハイブリッド化合物を抗ウイルス剤
として使用する際には、当該化合物を経口により、また
は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等の注射剤とし
て、さらには坐剤中に封入して用いることもできる。こ
のとき、必要に応じて薬学的に許容され得る担体を常法
に従って調製・含有させることもできる。ハイブリッド
化合物の投与量に関しては、アンチセンス化合物におい
てアメリカのバイオベンチャー会社をはじめ多くのグル
ープから論文や学会などで発表され、それらによると培
養細胞（動物細胞）などで１０から１００μＭで効果を
示すアンチセンス化合物は、人体においてもある程度の
効果を示すという例がＨＩＶ患者などの難治病患者に対
して得られている。従って本発明においても、ハイブリ
ッド化合物を１日あたり１００μＭ以下、好ましくは
０．１〜５０μＭの濃度となるように使用することが好
ましい。なお言うまでもないが、かかる投与量は患者の
年齢、病態、症状等により適宜増減される。

【００３０】以上、対象とするウイルスがＨＣＶの場合
を例にとり具体的に説明を行ってきたが、本発明の抗ウ
イルス剤はＩＲＥＳと呼ばれる特殊な翻訳機構領域をそ
のウイルス遺伝子内に有するものであれば、いずれのウ
イルスにおいても抗ウイルス効果を発揮することができ
る。具体的には、ＨＣＶの他に小児麻痺の原因となるポ
リオウイルス（ＰＶ）、脳心筋炎の原因となる脳心筋炎
ウイルス（ＥＭＣＶ）、口腔（咽頭粘膜）に特有の水疱
や口内疹を作る口蹄疫病ウイルス（ＦＭＤＶ）、鼻かぜ
を引き起こしたり上部気道の粘膜などに自然感染するヒ
トライノウイルス（ＨＲＶ）等のピコルナウイルスが関
与する各種の疾患に対する有効な予防、または治療薬と
なり得る。なおピコルナウイルス科に分類されるウイル
スにおいては、ＩＲＥＳ領域のオリゴピリミジンとして
通常ポリＵの存在が認められる。従ってピコルナウイル
ス科に属するウイルスを標的としたハイブリッド化合物
を提供する場合には、該ポリＵとハイブリッド形成能の
高い化合物、具体的にはポリＡ等のアデニンリッチな配
列を有するものが好適に使用される。

【００３１】

【発明の効果】本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス遺伝
子の特殊な翻訳機構に着目した新規な思想に基づくもの
であり、ＨＣＶ等のＩＲＥＳを有するウイルスに起因す
るウイルス性疾患に対する予防または治療薬を提供する
ものである。ＩＲＥＳが関与する翻訳機構は、通常の真
核細胞の翻訳系にはほとんど見られない特殊なものであ
ることから、副作用の少ない、極めて選択的な抗ウイル
ス剤としての利用が期待される。

【００３２】

【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。

【００３３】参考例１ ｍＲＮＡ Ｔ７Ｎ１−１９の取
得 配列表の配列番号１に示すクローンＴ７Ｎ１−１９を、
ｐＵＣ１９のクローニングサイトに持つｐＵＣＴ７１１
９（欧州公開特許公報第５１８３１３号）をアルカリ
法、さらにはＣｓＣｌを用いた密度勾配超遠心法（モレ
キュラー クローンニング、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、
１．３３−１．５２、１９８９）で該プラスミドＤＮＡ
を約１００μｇ調整した。

【００３４】この高純度に精製された該プラスミド１０
μｇを制限酵素ＥｃｏＲＩで完全に切断し、クローンＴ
７Ｎ１−１９の３’側の１箇所で切断された線状ＤＮＡ
を得た。該線状ＤＮＡ１μｇを４０ｍＭ Ｔｒｉｓ−Ｈ
Ｃｌ（ｐＨ８．０）、５ｍＭＤＴＴ、５０μｇ／ｍｌ
ＢＳＡ、２ｍＭ 各ＮＴＰ、４０ｍＭ ＭｇＣｌ2、 １
ｍＭ スペルミジン、ＲＮａｓｅ インヒビター ５０
ｕｎｉｔおよびＴ７ＲＮＡポリメラーゼ １．４２μｇ
からなる組成の反応溶液５０μｌで反応を開始した。３
７℃で２０分後、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ １０ユニッ
トを加え、さらに３７℃で２０分インキュベーションし
た。最後にＤＮａｓｅＩ（Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社製）
を１０ユニット（１μｌ）加え、３０℃で１０分インキ
ュベーションし、この反応溶液にフェノール・クロロホ
ルム溶液（フェノール：クロロホルム＝１：１）５０μ
ｌを加え反応を止め、混和後、水相５０μｌを回収し、
いわゆるエタノール沈殿を行うため、３Ｍ酢酸ナトリウ
ム（ｐＨ５．５）を５．５μｌを混和して、さらにエタ
ノール約１５０μｌを混和して、１５０００ｒｐｍ １
５分間遠心し、得られたＲＮＡ（転写物）を乾燥させ
た。

【００３５】得られたＲＮＡは、３０μｌのＤＥＰＣ処
理された滅菌水（モレキュラー クローンニング、２ｎ
ｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．２６、１９８９）に溶解さ
れ、そのうち３μｌは、波長２６０ｎｍの吸光度を測定
し、１ＯＤ＝４０μｇ／ｍｌとして計算し、定量した。
この定量値より、得られたＲＮＡ量は約８０μｇであっ
た。また、転写物の長さを見るため、ホルムアミドを用
いたアガロース電気泳動（モレキュラー クローンニン
グ、２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．４３、１９８９）を
行った。その結果、得られたＲＮＡは、シングルバンド
で、しかも長さも分子量マーカー（ＧＩＢＣＯ ＢＲＬ
社製：０．２４−９．５Ｋｂ ＲＮＡ Ｌａｄｄｅｒ）
と比較し妥当なものであった。また、この電気泳動後の
アガロースをメンブランに転写し、いわゆるノーザンハ
イブリダイゼーション（モレキュラー クローニング、
２ｎｄ ｅｄｉｔｉｏｎ、７．３９−７．５２、１９８
９）を行い、転写物のＲＮＡが確かにクローンＴ７Ｎ１
−１９由来であることも確認した。この時、用いたプロ
ーブはクローンＴ７Ｎ１−１９の３’領域のクローンＮ
１９の配列を持つＤＮＡ断片より、ラベリング法により
（モレキュラー クローンニング、２ｎｄ ｅｄｉｔｉ
ｏｎ、１０．１３−１０．１７、１９８９）作成した。

【００３６】参考例２ ＨＣＶ由来蛋白質のインビトロ
での合成とその解析 参考例１で合成した転写物であるｍＲＮＡ Ｔ７Ｎ１−
１９は、１本鎖ＲＮＡであるＨＣＶゲノム遺伝子（欧州
公開特許公報第５１８３１３号）の５’領域側、２００
７塩基とほぼ同じ構造を持っている。異なるのは、ＨＣ
Ｖ遺伝子の５’側にＴ７ＲＮＡポリメラーゼに作用する
Ｔ７のプロモーター増強配列を５’末端に付加している
事である。

【００３７】インビトロ トランスレーション反応は、
ウサギ赤血球ライセート（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）１１．
３７５μｌ、イヌ マイクロゾーマル メンブラン（Ｐ
ｒｏｍｅｇａ社製）１．１７μｌ、アミノ酸ミックス
（Ｐｒｏｍｅｇａ社製）５．２μｌ、Ｌ−［35Ｓ］−メ
チオニン（Ａｍｅｒｓｈａｍ社製）１．３μｌ（７２９
ＫＢｑ）およびＲＮａｓｅ インヒビター（宝酒造社
製）０．２μｌと混ぜ、最終量１４．３７μｌとして、
該転写物 約３．５μｇに加えて反応を開始した。基本
的には、プロメガ（Ｐｒｏｍｅｇａ）社の「Ｔｒａｎｓ
ｌａｔｉｏｎ ｉｎｖｉｔｒｏ Ｔｅｃｈｎｉｃａｌ
Ｍａｎｕａｌ」のプロトコールに従って反応させた。

【００３８】また、試薬のロットチェックを兼ねてＲＮ
Ａ（転写物）のみを除いた系で反応させ、何も合成され
ないことを確認した。また、コントロールとして、Ｅ．
ｃｏｌｉ β−ｌａｃｔａｍａｓｅ ｍＲＮＡ（Ｐｒｏ
ｍｅｇａ社製のイヌ マイクロゾーマル メンブランに
添付）０．５μｇを、該転写物 約３．５μｇの代わり
に用いた。

【００３９】３０℃で１時間１５分インキュベーション
後、そのままＳＤＳ−ＰＡＧＥ電気泳動すると、１レー
ンあたりの蛋白量が多すぎて合成された蛋白質の解析が
困難となることが予想されたので、免疫沈降法でＨＣＶ
コア蛋白質を含むポリペプチドのみを分離させ、電気泳
動させた。すなわち、翻訳反応溶液全量に対して最終濃
度０．５％ＳＤＳになるように２．５％ＳＤＳを加え
た。さらに、４倍量のＲＩＰＡバッファー１（１％Ｔｒ
ｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙ
ｃｈｏｌａｔｅ、０．１５ＭＮａＣｌおよび５０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））を加え、反応液を氷
上で冷やした後、抗ＨＣＶコア抗体（ラビット血清より
精製、ポリクローナル抗体、１μｇ／１μｌ）１μｌを
加え、１時間、０℃で静置。さらにザイソルビン（ザイ
メット社製、１０％Ｗ／Ｖ）３．１２５μｌを加えて１
時間、０℃で静置。その後、３０００ｒｐｍ ３分で遠
心し、ＲＩＰＡバッファー２（１％Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−
１００、１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏｘｙｃｈｏｌａｔ
ｅ、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ ＮａＣｌおよび５０
ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５））１００μｌを
加えて洗浄し、同じ操作をＲＩＰＡバッファー３（１％
Ｔｒｉｔｏｎ Ｘ−１００、１％ｓｏｄｉｕｍ ｄｅｏ
ｘｙｃｈｏｌａｔｅ、０．１％ＳＤＳ、０．１５Ｍ Ｎ
ａＣｌ、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）お
よび１ｍｇ／ｍｌ ＢＳＡ）１００μｌで繰り返し、最
後にもう１度ＲＩＰＡバッファー２で洗浄した。得られ
た沈殿をＳＤＳローディングバッファー（９．１％Ｔｒ
ｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ６．８）、１６．１％（ｖ／ｖ）グ
リセリン、４．２Ｍウレア、３．１５％ＳＤＳ、１２．
７％（ｖ／ｖ）β−メルカプトエタノールおよび０．０
４％ＢＰＢ）８μｌでサスペンジョンした。

【００４０】次に、これらの試料を９５℃、５分間煮沸
した。このようにして得られた試料８μｌを、０．１％
ＳＤＳ−１５．０％ポリアクリルアミドゲル（７０×８
５×１ｍｍ）に添加した。その際、マーカータンパク質
としてＡｍｅｒｓｈａｍ社製「Ｒａｉｎｂｏｗ［¹⁴Ｃ］
ｍｅｔｙｌａｔｅｄｐｒｏｔｅｉｎ ｍｏｌｅｃｕｌａ
ｒ ｗｅｉｇｈｔ ｍａｒｋｅｒｓ」（分子量レンジ１
４３００から２０００００）を使用した。電極液として
トリス緩衝液（２５ｍＭ トリス（ｐＨ８．３）、１９
２ｍＭ グリシンおよび０．１％ＳＤＳ）を用い、３０
ｍＡの定電流で４５分間泳動後、ワットマン３ＭＭの紙
の上にのせ、透明のラップフィルム（サランラップ）を
上からかぶせてゲルドライアーでゲルを乾燥させた。乾
燥されたゲルは富士写真フィルム社製イメージングプレ
ート（ＴＹＰＥ ＢＡＳ−ＩＩＩ）にはさんで、指定の
カセットに入れ（この操作は富士写真フィルム社製バイ
オイメージアナライザー ＢＡＳ２０００（ＢＩＯ−Ｉ
ＭＡＧＥ ＡＮＡＬＹＺＥＲ）のプロトコールに従っ
た）、約１２時間室温放置した。イメージングプレート
をバイオイメージアナライザーで解析することにより、
³⁵ＳメチオニンにラベルされたＨＣＶ由来コア蛋白約２
２ＫＤａとその前駆体蛋白質（５５５アミノ酸からなる
ポリペプチド）約６１ＫＤａがシャープなバンドとして
検出された。

【００４１】参考例３ ハイブリッド化合物の合成 アプライド バイオシステム社（Ａｐｐｌｉｅｄ Ｂｉ
ｏｓｙｓｔｅｍｓ社）のＤＮＡシンセサイザー３９４型
で、ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチドを合成
した。添付のプロトコールに従って、合成中に付加され
た塩基の保護基をはずして、さらにＨＰＬＣによって目
的の長さのホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド
を精製した。これは、ホスホジエステル型と違い１ピー
クに分離されないが、目的とするホスホロチオエート型
ジアステレオマーは全てまとめて１ロットとした。その
後、５’末端の水酸基についている保護基（ジメトキシ
トリチル基）を常法により酢酸水溶液で脱保護し、さら
にフェノール処理をした後波長２６０ｎｍでの吸光度に
より定量して調整して、目的のハイブリッド化合物を得
た（この時、１ＯＤ＝３５μｇ／ｍｌとして換算され
た）。

【００４２】実施例１ 組換えワクシニアウイルスｒＶ
Ｖ５ＣＬの作製 〔１〕組換えワクシニアウイルス作製用トランスファー
ベクターの作製 特開昭６３−６３３８０号公報の実施例１に記載の方法
に従い、ワクシニアウイルスＷＲ株よりＨＡ蛋白遺伝子
を精製した。すなわち、ワクシニアウイルスＷＲ株のウ
イルスを精製し、５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ
７．４）（１ｍＭ

【００４３】ＥＤＴＡ及び０．５％ ドデシル硫酸ナト
リウム含有）中に懸濁し、プロテイナーゼＫを２５０〜
１０００μｇ／ｍｌに加えて３７℃にて一夜インキュベ
ートした後、緩衝液で飽和されたフェノール：クロロホ
ルム（１：１）で３回抽出し、そしてエタノールにより
ウイルスＤＮＡを沈殿させた（エタノール沈殿とは、水
相に１０分の１量の３Ｍ酢酸ナトリウムもしくは等量の
４Ｍ酢酸アンモニウムと水相の２．５倍容のエタノール
を加え混和し、半径５cm程度のロータを用いて１５，０
００ｒｐｍ，４℃で１５分間冷却遠心を行い、その沈殿
を乾燥させる処理。以下同様）。このＤＮＡを１０ｍＭ
Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ８．０）（１ｍＭ ＥＤＴＡ
含有）に溶解し、ＨｉｎｄＩＩＩにより消化し、アガロ
ースゲル電気泳動により約５０ｋｂのＨｉｎｄＩＩＩＡ
断片を単離した。このＨｉｎｄＩＩＩＡ断片を、高塩濃
度緩衝液（５０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，１００ｍＭ
ＮａＣｌ，１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１ｍＭ ＤＴＴ（ｐ
Ｈ７．５））中でＳａｌＩにより消化し、ＨｉｎｄＩＩ
ＩＡ断片の３’末端に存在する約１．８ｋｂのＨｉｎｄ
ＩＩＩ−ＳａｌＩ断片を、アガロース電気泳動により単
離した。このＤＮＡをＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑
末端とした。さらにこのＤＮＡをライゲーションキット
（宝酒造社製）を用いて、マルチクローニングサイト内
にあるＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩで消化し、さらに
Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑末端としたｐＵＣ１９
クローニングベクターに組み込んだ。

【００４４】また、特開昭６３−６３３８０号公報の実
施例４に記載の方法に従いワクシニアウイルスＷＲ株よ
り７．５ｋ蛋白質プロモーター断片を精製した。すなわ
ち、上記のように調製したウイルスＤＮＡを高塩濃度緩
衝液中でＳａｌＩにより消化し、アガロース電気泳動に
より分離することにより、約０．９ｋｂのＳａｌＩ断片
を得た。他方、プラスミドｐＵＣ１８を高塩濃度緩衝液
中でＳａｌＩにより消化し、フェノール抽出及びエタノ
ール沈殿により分離することにより、線状プラスミドを
得た。次に、前記約０．９ｋｂのＳａｌＩ断片と線状プ
ラスミドとをライゲーション緩衝液（６６ｍＭ Ｔｒｉ
ｓ−ＨＣｌ，１ｍＭ ＡＴＰ，５ｍＭＭｇＣｌ₂ ，５ｍ
Ｍ ＤＴＴ（ｐＨ７．６））中でＴ４ＤＮＡリガーゼに
より連結し、この反応混合物を用いて大腸菌ＪＭ１０３
株を形質転換した。形質転換クローンからのプラスミド
をＳａｌＩにより消化することにより切り出した上記Ｄ
ＮＡ断片をＲｓａＩ、ＡｌｕＩ、ＨａｐＩＩ及びＤｄｅ
Ｉで消化してスクリーニングすることにより、プラスミ
ドｐ０９０１を得た。このプラスミドを中塩濃度緩衝液
（１０ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ，５０ｍＭ ＮａＣｌ，
１０ｍＭ ＭｇＣｌ₂ ，１ｍＭ ＤＴＴ（ｐＨ７．
５））中でＲｓａＩ及びＨｉｎｃＩＩで消化し、アガロ
ース電気泳動で分離することにより、０．２６ｋｂから
なる平滑末端のＲｓａＩ−ＨｉｎｃＩＩ断片を得た。か
かる断片中に、７．５ｋ蛋白質プロモーターが含まれ
る。このＤＮＡをライゲーションキット（宝酒造社製）
を用いて、マルチクローニングサイト内にあるＨｉｎｃ
ＩＩで消化したｐＵＣ１９クローニングベクターに組み
込んだ。

【００４５】上記のライゲーションに用いたベクターＤ
ＮＡとしては、次の様に用意されたものを５ｎｇ〜１０
ｎｇ使用した。即ち、ｐＵＣ１９クローニングベクター
を制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩ、またはＨｉ
ｎｃＩＩ（東洋紡績社製）で切断し、フェノール／クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿させた後、さらにアルカ
リフォスファターゼ（ベーリンガーマンハイム社製）で
５′末端を脱リン酸化して〔モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning),１９８２，コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Har
bor Lab. Press) 〕、フェノール／クロロホルム処理
し、エタノール沈殿させた。

【００４６】この様にして作成したＤＮＡを用いて大腸
菌ＪＭ１０９を形質転換させた（この時、コンピテント
セルは東洋紡績社製のものを用いた）。形質転換させる
方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT
HIGH)のプロトコールに従った。このようにして得られ
た組換え体から常法によりミニスクリーニングを行い
〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),１
９８２，コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕、ｐＵ
ＣのマルチクローニングサイトにあるＥｃｏＲＩ側にＨ
Ａ蛋白遺伝子の５’側があるプラスミドを選択し、ｐＵ
ＣＨＡと命名した。また、７．５ｋプロモーターの５’
側がｐＵＣ１９のマルチクローニングサイトにあるＨｉ
ｎｄＩＩＩ側にくるようなプラスミドを選択し、ｐＵＣ
７．５と命名した。

【００４７】このようにして得られた形質転換体ｐＵＣ
ＨＡ及びｐＵＣ７．５からそれぞれプラスミドＤＮＡを
調製し、デュポン社製蛍光シークエンサーGENESIS ２０
００システムを用いて、配列を決定した。シークエンス
プライマーとして次の２種の合成プライマー５′ｄ（Ｇ
ＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列表の配
列番号２０）、５′ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴ
ＧＡＣ）３′（配列表の配列番号２１）を用いた。

【００４８】次に、ｐＵＣ７．５プラスミド１μｇを制
限酵素ＳｍａＩで切断し、フェノール／クロロホルム処
理、エタノール沈殿させ、さらにアルカリフォスファタ
ーゼ（ベーリンガーマンハイム社製）で５′末端を脱リ
ン酸化して〔モレキュラー・クローニング(Molecular C
loning),１９８２，コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Pres
s) 〕、フェノール／クロロホルム処理し、エタノール
沈殿させた。このようにして得たＤＮＡ１０ｎｇに、合
成リンカー５’ｄ（ｐＣＡＧＡＴＣＴＧＣＡＡＧＣＴＴ
Ｇ）３’（配列表の配列番号２２）５ｎｇをライゲーシ
ョンキット（宝酒造社製）を用い挿入した。この様にし
て作成したＤＮＡを用いて大腸菌ＤＨ５を形質転換させ
た（この時、コンピテントセルは東洋紡績社製のものを
用いた）。形質転換させる方法は、東洋紡績社製のコン
ピテント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従っ
た。この様にして得た組換え体から、常法によりミニス
クリーニングを行い〔モレキュラー・クローニング(Mol
ecular Cloning),１９８２，コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor La
b. Press) 〕、上記の合成リンカーが７．５ｋプロモー
ターと順方向にＢｇｌＩＩ、ＨｉｎｄＩＩＩとなるよう
に組み込まれたプラスミドｐＵＣ７．５ＧＨを得た。

【００４９】このプラスミドを用いてSaiki らの方法
〔ネーチャー(Nature), ３２４，１２６，（１９８
６）〕に準じて、いわゆるＰＣＲ法により特異的配列を
持つＤＮＡを増幅し、７．５ｋプロモーターの改変を行
った。即ち、プラスミドｐＵＣ７．５ＧＨ１０ｎｇ、１
０×ＰＣＲ緩衝液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐ
Ｈ８．３、５００ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣ
ｌ₂ 、１％ゼラチン） １０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄ
ＮＴＰ １６μｌ、合成ＤＮＡプライマー５′ｄ（ＣＡ
ＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡＣ）３′（配列表の配列
番号２３）及び５’ｄ（ＧＡＡＴＡＧＴＴＴＴＴＣＡＡ
ＴＴＴＴＴＡＣＧ）３’（配列表の配列番号２４）各
（２０μＭ）５μｌ、または５’ｄ（ＣＧＴＡＡＡＡＡ
ＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＴＴＣ）３’（配列表の配列番
号２５）及び５′ｄ（ＧＴＡＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡ
ＧＴ）３′（配列表の配列番号２６）各（２０μＭ）５
μｌ、に水を加えて合計が１００μｌになるようにし
て、まず９５℃に５分間保温後、０℃に急冷した。１分
後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（７ユニット／μｌ、
AmpliTaqTM宝酒造社製）０．５μｌを加え混和後、ミネ
ラルオイルを重層した。このサンプルを、パーキン エ
ルマー シータス社製のＤＮＡ Thermal Cyclerで９５
℃１分、４８℃１分、７２℃１分で３０回処理した。最
後に７２℃で７分保温した後、この反応水溶液をフェノ
ール／クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、それ
ぞれ２５０ｂｐと１１０ｂｐの２本の増幅ＤＮＡ断片を
得、５％アクリルアミドゲルで精製した。次に、このよ
うにして得たＤＮＡ断片各５ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝液
（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５００
ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１％ゼラチン）
１０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μｌ、合
成ＤＮＡ５′ｄ（ＣＡＧＧＡＡＡＣＡＧＣＴＡＴＧＡ
Ｃ）３′（配列表の配列番号２３）及び５′ｄ（ＧＴＡ
ＡＡＡＣＧＡＣＧＧＣＣＡＧＴ）３′（配列表の配列番
号２６）各（２０μＭ）５μｌ、に水を加えて合計が１
００μｌになるようにして、まず９５℃に５分間保温
後、０℃に急冷した。１分後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラ
ーゼ（７ユニット／μｌ、AmpliTaq^TM宝酒造社製）０．
５μｌを加え混和後、ミネラルオイルで重層した。この
サンプルを、パーキン エルマー シータス社製のＤＮ
Ａ Thermal Cyclerで９５℃１分、４８℃１分、７２℃
１分で３０回処理した。最後に７２℃で７分保温した
後、この反応水溶液をフェノール／クロロホルム処理、
エタノール沈殿を行い、３３０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を
得、制限酵素ＥｃｏＲＩ及びＰｓｔＩで消化し、５％ア
クリルアミドゲルで精製した。このようにして得られた
ＤＮＡ断片５ｎｇをライゲーションキット（宝酒造社
製）を用いマルチクローニングサイト内にあるＥｃｏＲ
Ｉ及びＰｓｔＩで消化したｐＵＣ１９クローニングベク
ターに組み込み、大腸菌ＤＨ５を形質転換させた（この
時、コンピテントセルは東洋紡績社製のものを用い
た）。形質転換させる方法は、東洋紡績社製のコンピテ
ント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従った。
この様にして得た組換え体から常法によりミニスクリー
ニングを行い〔モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning),１９８２，コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss) 〕、ワクシニアウイルスの強力プロモーターを持つ
プラスミドｐＵＣＳＰを得た。該プラスミドのマルチク
ロニングサイトに挿入されたＤＮＡ断片はデュポン社製
蛍光シークエンサーGENESIS ２０００システムを用い
て、配列を決定した。

【００５０】このようにして得られたプラスミドｐＵＣ
ＳＰのＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩサイトに第４０回日本
ウイルス学会総会演説抄録４０７５に記載のプロモータ
ーを両端がＢａｍＨＩ及びＢｇｌＩＩサイトとなるよう
にした合成ＤＮＡ（配列表の配列番号２７）

【００５１】

【表１】 ５’ｄ（ＧＡＴＣＣＡＡＡＡＡＴＴＧＡＡＡＡＡＣＴＡＧＴＣＴＡＡＴＴＴＡＴ ３’（ＧＴＴＴＴＴＡＡＣＴＴＴＴＴＧＡＴＣＡＧＡＴＴＡＡＡＴＡ ＴＧＣＡＣＧＧＡ）３’ ＡＣＧＴＧＣＣＴＣＴＡＧ）５’ を常法により挿入し（ライゲーションには、宝酒造社製
のライゲーションキットを用い、方法は宝酒造社のライ
ゲーションキット用のプロトコールに従った）、大腸菌
ＤＨ５を形質転換しミニスクリーニングにより順方向に
合成ＤＮＡが６個タンデムに挿入されたプラスミドｐＵ
ＣＳＥを得た。

【００５２】このようにして得られたプラスミドｐＵＣ
ＳＥを制限酵素ＰｓｔＩ及びＥｃｏＲＩで切断し、フェ
ノール／クロロホルム処理、エタノール沈殿させ、さら
にＴ４ ＤＮＡポリメラーゼで平滑端とした後、５５０
ｂｐの断片を５％アクリルアミドゲルで精製した。この
ようにして得られたＤＮＡ断片５ｎｇを制限酵素Ｎｒｕ
Ｉで消化したプラスミドｐＵＣＨＡ１０ｎｇとライゲー
ションし、大腸菌ＤＨ５を形質転換させた（この時、コ
ンピテントセルは東洋紡績社製のものを用いた）。形質
転換させる方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ
(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従った。この様にし
て得た組換え体から、常法によりミニスクリーニングを
行い〔モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g),１９８２，コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press)
〕、ＨＡ遺伝子と順方向にワクシニアウイルスプロモ
ーターが挿入されたプラスミドｐＨＡＳＥを得た。該プ
ラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されたＤＮ
Ａ断片はデュポン社製蛍光シークエンサーGENESIS ２０
００システムを用いて、配列を決定した。決定されたＤ
ＮＡ配列は該プラスミドのマルチクローニングサイトの
ＳａｌＩサイトからＨｉｎｄＩＩＩまでを配列表の配列
番号３０に示す。

【００５３】次に、ＨＣＶ遺伝子の５’端からコア蛋白
遺伝子までをＰＣＲ法で増幅した。即ち、欧州公開特許
公報第５１８３１３号に記載の実施例２８の〔２〕、ク
ローンＴ７Ｎ１１９のＤＮＡ５ｎｇ、１０×ＰＣＲ緩衝
液（１００ｍＭ Ｔｒｉｓ−ＨＣｌ、ｐＨ８．３、５０
０ｍＭ ＫＣｌ、１５ｍＭ ＭｇＣｌ2 、１％ゼラチ
ン） １０μｌ、１．２５ｍＭ ４ｄＮＴＰ １６μ
ｌ、合成ＤＮＡ５’ｄ（ＣＧＡＡＧＣＴＴＧＣＣＡＧＣ
ＣＣＣＣＴＧＡＴＧＧＧ）３′（配列表の配列番号２
８）及び５′ｄ（ＣＣＧＧＡＴＣＣＣＧＧＡＡＧＣＴＧ
ＧＧＡＴＧＧＴＣＡＡＣ）３′（配列表の配列番号２
９）各（２０μＭ）５μｌ、に水を加えて合計が１００
μｌになるようにして、まず９５℃に５分間保温後、０
℃に急冷した。１分後、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ
（７ユニット／μｌ、AmpliTaqTM宝酒造社製）０．５μ
ｌを加え混和後、ミネラルオイルを重層した。このサン
プルを、パーキン エルマー シータス社製のＤＮＡ
Thermal Cyclerで９５℃１分、５８℃１分、７２℃１分
で３０回処理した。最後に７２℃で７分保温した後、こ
の反応水溶液をフェノール／クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿を行い、９１０ｂｐの増幅ＤＮＡ断片を得、制
限酵素ＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩで消化した後、５
％アクリルアミドゲルで精製し、ルシフェラーゼアッセ
イ用のピッカジーン^TMカセットベクター（東洋インキ製
造株式会社）のＨｉｎｄＩＩＩ及びＢａｍＨＩサイトに
挿入した。ミニスクリーニングによりルシフェラーゼ遺
伝子の上流にＣ型肝炎ウイルス遺伝子の５’端からコア
蛋白遺伝子までが順方向に挿入されたプラスミドｐＣＳ
５ＣＬを得た。

【００５４】次に、プラスミドｐＣＳ５ＣＬを制限酵素
ＥｃｏＲＩで部分消化後、制限酵素ＨｉｎｄＩＩＩで完
全消化し、２．６ｋｂｐ断片をアガロースゲルより切り
出し精製した。この断片をプラスミドｐＨＡＳＥのＨｉ
ｎｄＩＩＩ及びＥｃｏＲＩサイトに挿入し、ミニスクリ
ーニングによりワクシニアウイルスＨＡ蛋白遺伝子中に
ワクシニアウイルスプロモーター、ＨＣＶ遺伝子の５’
端からコア蛋白遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子の順に並
んだプラスミドｐＨＡ５ＣＬを得た。

【００５５】〔２〕組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５
ＣＬの作製 アフリカミドリザル腎由来細胞ＣＶ−１（理化学研究所
細胞開発銀行ＲＣＢ０１６０）を３．５ｃｍシャーレに
セミコンフルエントに培養したものに、ワクシニアウイ
ルスＬＣ１６ｍ０株（臨床とウイルス，３（３），２２
９−２３５，１９７５）をＭＯＩ（ｍｕｌｔｉｐｌｉｃ
ｉｔｙ ｏｆ ｉｎｆｅｃｔｉｏｎ）＝０．１ＰＦＵ／
Ｃｅｌｌで１時間室温で吸着させた。また、〔１〕で作
製したプラスミドｐＨＡ５ＣＬを、Ｍａｎｉａｔｉｓら
の方法（「モレキュラ・クローニング」、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、８６頁〜９６頁
（１９８２））に従い組換え大腸菌から回収、精製しト
ランスファーベクターｐＨＡ５ＣＬＤＮＡを大量に得
た。このようにして得たｐＨＡ５ＣＬＤＮＡ１０μｇを
リポフェクチン（Ｌｉｐｏｆｅｃｔｉｎ、ライフテクノ
ロジー社製）３０μｌとＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地（ライフ
テクノロジー社製）１７０μｌ中で混合し、室温で１０
分静置しトランスフェクション液とした。

【００５６】次にシャーレからウイルス液を除き、Ｏｐ
ｔｉ−ＭＥＭ培地で細胞を２回洗浄した後、先述のＤＮ
Ａを混合したトランスフェクション液にＯｐｔｉ−ＭＥ
Ｍ８００μｌを加えたものをシャーレに入れ、３７℃、
５％ＣＯ₂ インキュベーターで培養した。４時間後培地
を除き１０％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地をシャーレ
に加えた。さらに、２日間３７℃、５％ＣＯ₂ インキュ
ベーターで培養した後、この感染細胞を３回凍結融解
し、ウイルスを回収した。

【００５７】このウイルス液には１ｍｌあたり約１０⁸
個のウイルスが含まれており、またそのうちの約０．１
％が組換え体である。組換えウイルスを単離するために
プラーク単離法を用いた。その方法は以下の通りであ
る。ウイルス液を１０⁵ 倍に希釈した。予め１０ｃｍシ
ャーレに１枚当り２×１０⁶ 個のウサギ腎由来細胞ＲＫ
−１３（理化学研究所細胞開発銀行ＲＣＢ０１８３）細
胞をまき、培養したものを用意し、培地を完全に除いた
後、１０⁵ 倍に希釈した液を一枚のシャーレあたりそれ
ぞれ１ｍｌずつ加えた。細胞の乾燥を防ぐため、シャー
レを１５分おきに傾けてウイルス液が全面に行き渡るよ
うにした。このようにして室温で１時間ウイルスを吸着
させた後、２％ウシ胎児血清を含むＭＥＭ培地をシャー
レに加え、３７℃、５％ＣＯ2 インキュベーターで培養
した。

【００５８】２日後、培地を除きウイルス液を完全に吸
い取り、１％ニワトリ赤血球液をシャーレ１枚あたり３
ｍｌずつ静かに加え室温で１時間吸着させた後、完全に
吸い取った。ニワトリ赤血球を吸着しないプラークをチ
ップで吸い取り、１ｍｌＰＢＳ中でピペッテイングして
組換えウイルスを浮遊させた。これら一連の操作（感染
させてから、２日間培養し該組換えウイルスを単離する
操作）をプラーク純化法と呼ぶ。該ウイルス浮遊液２μ
ｌをとり同様のプラーク純化法を行った。これら一連の
操作を３回繰り返して野性株の混入のないＨＣＶ由来遺
伝子とルシフェラーゼ遺伝子を持つ組換えウイルスｒＶ
Ｖ５ＣＬを得た。

【００５９】〔３〕組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５
ＣＬによるＣ型肝炎ウイルス遺伝子とルシフェラーゼ遺
伝子の発現 ２４ｗｅｌｌプレートに約６０％コンフレントにヒト肝
臓細胞由来ＷＲＬ６８（ヒト胎児肝細胞，ＡＴＣＣ Ｃ
Ｌ６８）を１０％ウシ胎児血清を含むＴＳ−２培地で培
養したものに組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５ＣＬを
２％ウシ胎児血清含むＰＢＳに均一に混和し、ＭＯＩ＝
４ＰＦＵ／Ｃｅｌｌで１時間室温で吸着させた。その
後、Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地５００μｌで２回洗浄し、Ｏ
ｐｔｉ−ＭＥＭ培地５００μｌを加えて１６時間、３７
℃、５％ＣＯ₂ インキュベーターで培養した。その後、
培地を除き、前述のＳＤＳローディングバッファー１０
０μｌを加えて、感染細胞を溶解後、２０μｌを常法に
従い、煮沸し、１２．５％ＳＤＳ−ＰＡＧＥで電気泳動
した。その後、常法に従い、ニトロセルロースフィルタ
ーにウェスタンブロッティングし、欧州公開特許公報第
５１８３１３号に記載の実施例と同様な方法で抗ＨＣＶ
コア抗体を用いて発色させた。結果を図１に示す。この
結果からも分かるように、約２２ＫＤａのＨＣＶコア蛋
白がメインのバンドとして検出され、感染細胞内では、
発現されたＨＣＶコア蛋白とルシフェラーゼ蛋白の融合
蛋白が細胞内シグナルペプチダーゼによりＨＣＶコア蛋
白のＣ末端に存在するシグナル配列を認識してプロセッ
シングを行ったことを示している。また、２２ＫＤａよ
り高分子量の蛋白として検出されたバンドは、該融合蛋
白遺伝子で組換わってない、ワイルドタイプのワクシニ
アウイルスで感染させた細胞を並べて電気泳動させ、同
じ抗体で同様に発色させているにもかかわらず何も検出
されないことから、プロセッシングが十分されていない
該融合蛋白であろうと予想される。すなわち、ここで検
出されたバンドは組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５Ｃ
Ｌが細胞内で発現させたＨＣＶコア蛋白とルシフェラー
ゼ蛋白の融合蛋白由来であろうと予想できる。

【００６０】また、該感染細胞内でのルシフェラーゼ蛋
白の発現の検出として、東洋インキ製造株式会社より販
売されているピッカジーンキット付属の細胞溶解液と基
質発色液を使用した。即ち、前述のように、培養された
感染細胞へＳＤＳローディングバッファーの代わりに該
細胞溶解液を５００μｌ入れ、室温で３０分放置後、該
基質発色液８０μｌへ５μｌを混和し、１０秒後に、ベ
ルトールドジャパン社製ＭＵＬＴＩ−ＢＩＯＬＵＭＡＴ
ＬＢ９５０５Ｃで測定した。その結果、感染させてな
い細胞（バックグラウンド）に比して細胞溶解液５μｌ
あたり約１０⁵以上の酵素量は発現していることが分か
った。

【００６１】実施例２ ハイブリッド化合物による細胞
内でのＨＣＶ遺伝子の翻訳阻害効果 〔１〕ハイブリッド化合物の合成と調製 前述したように、ＨＣＶ遺伝子のＩＲＥＳ領域は５’Ｕ
ＴＲ領域に存在する。そこで、配列表の配列番号１に記
載の塩基番号で２７番目のチミンから始まり４０１番目
のシトシンまでの領域の中で、特にピリミジン（シトシ
ン）リッチな領域を対象として、ハイブリッド化合物で
ハイブリット形成させたい領域を指定し、指定された塩
基配列より決定される相補鎖の配列をハイブリッド オ
リゴヌクレオチドの配列とした。

【００６２】ハイブリッド化合物は、前述の参考例３に
記載の方法に従って合成した。該ハイブリッド化合物
は、超純水（ミリポア社製のＭｉｌｌｉ−ＸＱを使用。
約１８．３ＭΩ・ｃｍの水）をオートクレーブした滅菌
水に溶かした。濃度は、波長２６０ｎｍでの吸光度によ
り得られた値をｎｅａｒｅｓｔ−ｎｅｉｇｈｂｏｒ法
（Ｍｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ，１９
８９，ＡＣＡＤＥＭＩＣ ＰＲＥＳＳ，ｖｏｌ．１８
０，３０４−３２５）で定量した。更に、ミリポア社製
ＵＦＣ３ ＯＧＶＯＳを用いて滅菌された。調製したハ
イブリッド化合物の配列は、以下の通りである。

【００６３】

【表２】 名称 長さ（ｍｅｒ） 配列（左から順に５’末端から３’末端） ＳＭＳ３８ ２０ ＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧＧ （配列表の配列番号７） また対照として、以下のハイブリッド化合物も調製し
た。

【００６４】

【表３】 ＳＭＳ３９ ２０ ＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡＡ （配列表の配列番号１８） ＳＭＳ４１ ２０ ＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴＴ （配列表の配列番号１９） なお、上記表２および表３に示した塩基間のリン酸ジエ
ステル結合は、すべてホスホロチオエート型で合成し
た。

【００６５】〔２〕ハイブリッド化合物による細胞内で
のＨＣＶ由来蛋白の翻訳阻害測定系 ２４ｗｅｌｌプレートに約６０％コンフルエントのヒト
肝臓細胞由来ＷＲＬ６８を１０％ウシ胎児血清を含むＴ
Ｓ−２培地で培養したものに組換えワクシニアウイルス
ｒＶＶ５ＣＬを２％ウシ胎児血清含むＰＢＳに均一に混
和し、ＭＯＩ＝０．０１ＰＦＵ／Ｃｅｌｌで１時間室温
で吸着させた。その後、すぐにＯｐｔｉ−ＭＥＭ培地５
００μｌで２回洗浄し、ハイブリッド化合物を添加した
Ｏｐｔｉ−ＭＥＭ培地５００μｌを加えて１６時間、３
７℃、５％ＣＯ₂ インキュベーターで培養した。実施例
１の〔３〕で記述したように、感染細胞は培地を除いた
後、ピッカジーン細胞溶解液５００μｌを加え、室温で
３０分放置され、よく混和された後、該基質発色液８０
μｌへ８μｌを混和し、１０秒後に、ベルトールドジャ
パン社製ＭＵＬＴＩ−ＢＩＯＬＵＭＡＴ ＬＢ９５０５
Ｃで２７℃、２．５分間、測定した。検量線を書くため
に、１％ＢＳＡを含むＰＢＳで希釈されたルシフェラー
ゼを１０^-15 、１０^-16 、１０^-17 、１０^-18 、１０
^-19 ｍｏｌ／μｌに調製しスタンダード試薬として用い
た。このスタンダード試薬を上記のように該基質発色液
８０μｌへ８μｌを混和し、測定した。

【００６６】スタンダード試薬のルシフェラーゼ濃度の
常用対数とその測定値（蛍光の積算値）の常用対数が１
次関数として直線に乗るので、これを検量線とした。感
染細胞中に発現されたルシフェラーゼの量は、測定値
（蛍光の積算値）に対応する蛋白量を検量線から求め
た。このようにして得られたルシフェラーゼの量は、Ｈ
ＣＶ由来コア蛋白とルシフェラーゼの融合蛋白遺伝子か
らの該融合蛋白発現量として評価した。

【００６７】該遺伝子のＩＲＥＳの予測には、５’非翻
訳領域からＨＣＶ遺伝子のエンベローブ１領域付近（配
列表の配列番号１に示す塩基番号で１から１２００番に
相当する）のＲＮＡの配列から２次構造を解析プログラ
ムＦＯＬＤ（ＵＷＧＣＧ Ｓｏｆｔｗａｒｅ，Ｕｎｉ
ｖ．Ｗｉｓｃｏｎｓｉｎ）によって解析し、参考にし
た。

【００６８】結果を図２に示す。これらのハイブリッド
化合物は、感染細胞の培地に最終濃度が５μＭ、１μ
Ｍ、０．５μＭ、０．２５μＭとなるような条件で添加
した。１回に全く同じ条件で細胞に感染させ、アッセイ
できる検体数には限りがあるので、１度に用意した２４
ｗｅｌｌプレートの枚数は、操作上、実験条件がずれな
い程度の範囲を考慮して、最大６プレートとした。ハイ
ブリッド化合物の濃度の種類数は、このことからも制限
されたので、毎回必ずハイブリッド化合物を入れないウ
ェル（標準は４ウェル）を作り、また効果のない対照の
化合物（前記表２）も対象として必ず入れて指標とし
た。細胞密度やインフェクション時間、インフェクショ
ン後の培養時間の条件において若干異なったが、５μＭ
で行った実験においては、ＳＭＳ３８についてのルシフ
ェラーゼの発現量が、効果の殆どない化合物（ＳＭＳ３
９およびＳＭＳ４１）に対して約５分の１にまで減少さ
せた。また、ＳＭＳ３８においては、用量依存的にルシ
フェラーゼの発現量を減少させることも確認された。

【００６９】

【配列表】

配列番号：１ 配列の長さ：２０３３ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 アンチセンス：Ｎｏ トポロジー：直鎖状 起源：Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名：T7N1-19 配列 ACTAGTTAAT ACGACTCACT ATAGGGTGCC AGCCCCCTGA TGGGGGCGAC ACTCCACCAT 60 AGATCACTCC CCTGTGAGGA ACTACTGTCT TCACGCAGAA AGCGTCTAGC CATGGCGTTA 120 GTATGAGTGT CGTGCAGCCT CCAGGACCCC CCCTCCCGGG AGAGCCATAG TGGTCTGCGG 180 AACCGGTGAG TACACCGGAA TTGCCAGGAC GACCGGGTCC TTTCTTGGAT CAACCCGCTC 240 AATGCCTGGA GATTTGGGCG TGCCCCCGCG AGACTGCTAG CCGAGTAGTG TTGGGTCGCG 300 AAAGGCCTTG TGGTACTGCC TGATAGGGTG CTTGCGAGTG CCCCGGGAGG TCTCGTAGAC 360 CGTGCATC ATG AGC ACA AAT CCA AAA CCC CAA AGA AAA ATC AAA CGT AAC 410 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Ile Lys Arg Asn 1 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 458 Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 506 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG CCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 554 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Pro Gln Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAA CCC GAG GGT AGG GCC TGG GCT CAG 602 Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG TGG GCA 650 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG 698 Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 95 100 105 110 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC 746 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 115 120 125 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC 794 Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 130 135 140 CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCT CTA GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 842 Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu 145 150 155 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT CTG CCT GGT TGC TCC TTT 890 Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 160 165 170 TCT ATC TTC CTT TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC 938 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 175 180 185 190 GCC TAC CAA GTG CGC AAC GCG TCC GGG GTG TAC CAT GTC ACG AAC GAC 986 Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 195 200 205 TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCG GCG GAC GTG ATT ATG CAC 1034 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His 210 215 220 ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTC CGG GAG AAC AAT TCC TCC CGC TGC 1082 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys 225 230 235 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTT GCG GCC AGG AAC AGC AGC ATC CCC 1130 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Ile Pro 240 245 250 ACT ACG ACA ATA CGG CGT CAT GTC GAC TTG CTC GTT GGG GCA GCT GCT 1178 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 255 260 265 270 CTC TGT TCC GCT ATG TAT GTG GGG GAT TTT TGC GGA TCT GTT TTC CTC 1226 Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Phe Cys Gly Ser Val Phe Leu 275 280 285 GTC TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGC CGG TAT GAG ACG GTG CAA 1274 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln 290 295 300 GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAT GTA TCA GGC CAT CGC ATG 1322 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 305 310 315 GCT TGG GAT ATG ATA ATG AAT TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTA 1370 Ala Trp Asp Met Ile Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 320 325 330 TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTG GTG GAT ATG GTG GCA GGG 1418 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 335 340 345 350 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1466 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 355 360 365 AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTG CTC TTC GCC GGT GTT GAC 1514 Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 370 375 380 GGG GGG ACC CAC GTG ACA GGG GGG AAG GTA GCC TAC ACC ACC CAG GGC 1562 Gly Gly Thr His Val Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr Thr Thr Gln Gly 385 390 395 TTT ACA TCC TTC TTT TCA CGA GGG CCG TCT CAG AAA ATC CAA CTT GTA 1610 Phe Thr Ser Phe Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val 400 405 410 AAC ACT AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAT AGG ACT GCC CTC AAT TGC AAT 1658 Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 415 420 425 430 GAC TCC CTT AAC ACC GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACC CAC AGC 1706 Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser 435 440 445 TTC AAC GCG TCC GGA TGT CCG GAG CGT ATG GCC GGT TGC CGC CCC ATT 1754 Phe Asn Ala Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Gly Cys Arg Pro Ile 450 455 460 GAC GAG TTC GCT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT CAT GTT GTG CCT AAC 1802 Asp Glu Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Val Pro Asn 465 470 475 ATC TCG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT 1850 Ile Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys 480 485 490 GGT ATC GTA CCC GCG TCG CAG GTG TGT GGT CCG GTG TAT TGC TTC ACC 1898 Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 495 500 505 510 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCC ACG 1946 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr 515 520 525 TAC AAC TGG GGA AAC AAT GAG ACG GAT GTG CTA CTC CTC AAC AAC ACA 1994 Tyr Asn Trp Gly Asn Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 530 535 540 CGG CCG CCG CAG GGC AAC TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG 2033 Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 545 550 555

【００７０】配列番号：２ 配列の長さ：１５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGG 15

【００７１】配列番号：３ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGG 16

【００７２】配列番号：４ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGG 17

【００７３】配列番号：５ 配列の長さ：１８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGG 18

【００７４】配列番号：６ 配列の長さ：１９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGG 19

【００７５】配列番号：７ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG 20

【００７６】配列番号：８ 配列の長さ：２１ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG G 21

【００７７】配列番号：９ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GG 22

【００７８】配列番号：１０ 配列の長さ：２３ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGG 23

【００７９】配列番号：１１ 配列の長さ：２４ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGG 24

【００８０】配列番号：１２ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGG 25

【００８１】配列番号：１３ 配列の長さ：２６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGG 26

【００８２】配列番号：１４ 配列の長さ：２７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGG 27

【００８３】配列番号：１５ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGG 28

【００８４】配列番号：１６ 配列の長さ：２９ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGG 29

【００８５】配列番号：１７ 配列の長さ：３０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG 30

【００８６】配列番号：１８ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 20

【００８７】配列番号：１９ 配列の長さ：２０ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 アンチセンス：Ｙｅｓ トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 20

【００８８】配列番号：２０ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17

【００８９】配列番号：２１ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17

【００９０】配列番号：２２ 配列の長さ：１６ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGATCTGCA AGCTTG 16

【００９１】配列番号：２３ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17

【００９２】配列番号：２４ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GAATAGTTTT TCAATTTTTA CG 22

【００９３】配列番号：２５ 配列の長さ：２２ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGTAAAAATT GAAAAACTAT TC 22

【００９４】配列番号：２６ 配列の長さ：１７ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17

【００９５】配列番号：２７ 配列の長さ：４０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 GATCCAAAAA TTGAAAAACT AGTCTAATTT ATTGCACGGA 40 GTTTTT AACTTTTTGA TCAGATTAAA TAACGTGCCT CTAG

【００９６】配列番号：２８ 配列の長さ：２５ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CGAAGCTTGC CAGCCCCCTG ATGGG 25

【００９７】配列番号：２９ 配列の長さ：２８ 配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖 トポロジー：直鎖状 配列の種類：他の核酸 合成ＤＮＡ 配列 CCGGATCCCG GAAGCTGGGA TGGTCAAC 28

【００９８】配列番号：３０ 配列の長さ：２３６０ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：Vaccinia virus 直接の起源：pHASE 配列 TCGACGATTG TTCATGATGG CAAGATTTAT ATATCTGGAG GTTACAACAA TAGTAGTGTA 60 GTTAATGTAA TATCGAATCT AGTCCTTAGC TATAATCCGA TATATGATGA ATGGACCAAA 120 TTATCATCAT TAAACATTCC TAGAATTAAT CCCGCTCTAT GGTCAGCGCA TAATAAATTA 180 TATGTAGGAG GAGGAATATC TGATGATGTT CGAACTAATA CATCTGAAAC ATACGATAAA 240 GAAAAAGATT GTTGGACATT GGATAATGGT CACGTGTTAC CACGCAATTA TATAATGTAT 300 AAATGCGAAC CGATTAAACA TAAATATCCA TTGGAAAAAA CACAGTACAC GAATGATTTT 360 CTAAAGTATT TGGAAAGTTT TATAGGTAGT TGATAGAACA AAATACATAA TTTTGTAAAA 420 ATAAATCACT TTTTATACTA ATATGACACG ATTACCAATA CTTTTGTTAC TAATATCATT 480 AGTATACGCT ACACCTTTTC CTCAGACATC TAAAAAAATA GGTGATGATG CAACTCTATC 540 ATGTAATCGA AATAATACAA ATGACTACGT TGTTATGAGT GCTTGGTATA AGGAGCCCAA 600 TTCCATTATT CTTTTAGCTG CTAAAAGCGA CGTCTTGTAT TTTGATAATT ATACCAAGGA 660 TAAAATATCT TACGACTCTC CATACGATGA TCTAGTTACA ACTATCACAA TTAAATCATT 720 GACTGCTAGA GATGCCGGTA CTTATGTATG TGCATTCTTT ATGACATCAA CTACAAATGA 780 CACTGATAAA GTAGATTATG AAGAATACTC CACAGAGTTG ATTGTAAATA CAGATAGTGA 840 ATCGACTATA GACATAATAC TATCTGGATC TACACATTCA CCAGAAACTA GCTAGTTCTG 900 AGAAACCAGA GGATATAGAT AATTTTAATT GCTCGTCGGT ATTCGAAATC GGGTCGACAT 960 CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA ACTGATACAA TCTCTTATCA 1020 TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGATAGCCA TATGCCCGGT AGTTGCGATA TACATAAACT 1080 GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCACTTTTT ATAGTAAGTT TTTCACCCAT AAATAATAAA 1140 TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAATTGAA AAACTATTCT AATTTATTGC ACGGTAAGGA 1200 AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACTCTAGA GGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1260 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1320 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1380 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1440 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCTGCAA GCTTGGGGTA CCGAGCTCGA 1500 ATTCGACTCC GGAACCAATT ACTGATAATG TAGAAGATCA TACAGACACC GTCACATACA 1560 CTAGCTAGTG ATAGCATTAA TACAGTAAGT GCATCATCTG GAGAATCCAC AACAGACGAG 1620 ACTCCGGAAC CAATTACTGA TAAAGAAGAA GATCATACAG TCACAGACAC TGTCTCATAC 1680 ACTACAGTAA GTACATCATC TGGAATTGTC ACTACTAAAT CAACCACCGA TGATGCGGAT 1740 CTTTATGATA CGTACAATGA TAATGATACA GTACCACCAA CTACTGTAGG CGGTAGTACA 1800 ACCTCTATTA GCAATTATAA AACCAAGGAC TTTGTAGAAA TATTTGGTAT TACCGCATTA 1860 ATTATATTGT CGGCCGTGGC AATATTCTGT ATTACATATT ATATATATAA TAAACGTTCA 1920 CGTAAATACA AAACAGAGAA CAAAGTCTAG ATTTTTGACT TACATAAATG TCTGGGATAG 1980 TAAAATCTAT CATATTGAGC GGACCATCTG GTTCAGGAAA GACAGCCATA GCCAAAAGAC 2040 TATGGGAATA TATTTGGATT TGTGGTGTCC CATACCACTA GATTTCCTCG TCCTATGGAA 2100 CGAGAAGGTG TCGATTACCA TTACGTTAAC AGAGAGGCCA TCTGGAAGGG AATAGCCGCC 2160 GGAAACTTTC TAGAACATAC TGAGTTTTTA GGAAATATTT ACGGAACTTC TAAAACTGCT 2220 GTGAATACAG CGGCTATTAA TAATCGTATT TGTGTGATGG ATCTAAACAT CGATGGCGTT 2280 AGAAGTCTTA AAAATACGTA CCTAATGCCT TACTCGGTGT ATATAAGACC TACCTCTCTT 2340 AAAATGGTTG AGACCAAGCT 2360

【００９９】配列番号：３１ 配列の長さ：４９８７ 配列の型：核酸 鎖の数：二本鎖 トポロジー：直鎖状 起源：Vaccinia virus, Hepatitis C virus, Firefly
luciferase gene 直接の起源：pHA5CL 配列 TCGACGATTG TTCATGATGG CAAGATTTAT ATATCTGGAG GTTACAACAA TAGTAGTGTA 60 GTTAATGTAA TATCGAATCT AGTCCTTAGC TATAATCCGA TATATGATGA ATGGACCAAA 120 TTATCATCAT TAAACATTCC TAGAATTAAT CCCGCTCTAT GGTCAGCGCA TAATAAATTA 180 TATGTAGGAG GAGGAATATC TGATGATGTT CGAACTAATA CATCTGAAAC ATACGATAAA 240 GAAAAAGATT GTTGGACATT GGATAATGGT CACGTGTTAC CACGCAATTA TATAATGTAT 300 AAATGCGAAC CGATTAAACA TAAATATCCA TTGGAAAAAA CACAGTACAC GAATGATTTT 360 CTAAAGTATT TGGAAAGTTT TATAGGTAGT TGATAGAACA AAATACATAA TTTTGTAAAA 420 ATAAATCACT TTTTATACTA ATATGACACG ATTACCAATA CTTTTGTTAC TAATATCATT 480 AGTATACGCT ACACCTTTTC CTCAGACATC TAAAAAAATA GGTGATGATG CAACTCTATC 540 ATGTAATCGA AATAATACAA ATGACTACGT TGTTATGAGT GCTTGGTATA AGGAGCCCAA 600 TTCCATTATT CTTTTAGCTG CTAAAAGCGA CGTCTTGTAT TTTGATAATT ATACCAAGGA 660 TAAAATATCT TACGACTCTC CATACGATGA TCTAGTTACA ACTATCACAA TTAAATCATT 720 GACTGCTAGA GATGCCGGTA CTTATGTATG TGCATTCTTT ATGACATCAA CTACAAATGA 780 CACTGATAAA GTAGATTATG AAGAATACTC CACAGAGTTG ATTGTAAATA CAGATAGTGA 840 ATCGACTATA GACATAATAC TATCTGGATC TACACATTCA CCAGAAACTA GCTAGTTCTG 900 AGAAACCAGA GGATATAGAT AATTTTAATT GCTCGTCGGT ATTCGAAATC GGGTCGACAT 960 CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA ACTGATACAA TCTCTTATCA 1020 TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGATAGCCA TATGCCCGGT AGTTGCGATA TACATAAACT 1080 GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCACTTTTT ATAGTAAGTT TTTCACCCAT AAATAATAAA 1140 TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAATTGAA AAACTATTCT AATTTATTGC ACGGTAAGGA 1200 AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACTCTAGA GGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1260 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1320 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1380 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1440 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCTGCAA GCTTGCCAGC CCCCTGATGG 1500 GGGCGACACT CCACCATAGA TCACTCCCCT GTGAGGAACT ACTGTCTTCA CGCAGAAAGC 1560 GTCTAGCCAT GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT GCAGCCTCCA GGACCCCCCC TCCCGGGAGA 1620 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC ACCGGAATTG CCAGGACGAC CGGGTCCTTT 1680 CTTGGATCAA CCCGCTCAAT GCCTGGAGAT TTGGGCGTGC CCCCGCGAGA CTGCTAGCCG 1740 AGTAGTGTTG GGTCGCGAAA GGCCTTGTGG TACTGCCTGA TAGGGTGCTT GCGAGTGCCC 1800 CGGGAGGTCT CGTAGACCGT GCATC ATG AGC ACA AAT CCA AAA CCC CAA AGA 1852 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg 1 5 AAA ATC AAA CGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG 1900 Lys Ile Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro 10 15 20 25 GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC 1948 Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly 30 35 40 CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG CCG CAA 1996 Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Pro Gln 45 50 55 CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAA CCC GAG GGT 2044 Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly 60 65 70 AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG 2092 Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu 75 80 85 GGC TTG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT 2140 Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro 90 95 100 105 AGT TGG GGC CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG 2188 Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys 110 115 120 GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT 2236 Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile 125 130 135 CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCT CTA GCG CAT 2284 Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 140 145 150 GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT CTG 2332 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 CCT GGT TGC TCC TTT TCT ATC TTC CTT TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 2380 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 170 175 180 185 ACC ATC CCA GCT TCC GGG ATC CAA ATG GAA GAC GCC AAA AAC ATA AAG 2428 Thr Ile Pro Ala Ser Gly Ile Gln Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys 190 195 200 AAA GGC CCG GCG CCA TTC TAT CCT CTA GAG GAT GGA ACC GCT GGA GAG 2476 Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu 205 210 215 CAA CTG CAT AAG GCT ATG AAG AGA TAC GCC CTG GTT CCT GGA ACA ATT 2524 Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile 220 225 230 GCT TTT ACA GAT GCA CAT ATC GAG GTG AAC ATC ACG TAC GCG GAA TAC 2572 Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr 235 240 245 TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCA GAA GCT ATG AAA CGA TAT GGG CTG 2620 Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu 250 255 260 265 AAT ACA AAT CAC AGA ATC GTC GTA TGC AGT GAA AAC TCT CTT CAA TTC 2668 Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe 270 275 280 TTT ATG CCG GTG TTG GGC GCG TTA TTT ATC GGA GTT GCA GTT GCG CCC 2716 Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro 285 290 295 GCG AAC GAC ATT TAT AAT GAA CGT GAA TTG CTC AAC AGT ATG AAC ATT 2764 Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile 300 305 310 TCG CAG CCT ACC GTA GTG TTT GTT TCC AAA AAG GGG TTG CAA AAA ATT 2812 Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile 315 320 325 TTG AAC GTG CAA AAA AAA TTA CCA ATA ATC CAG AAA ATT ATT ATC ATG 2860 Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met 330 335 340 345 GAT TCT AAA ACG GAT TAC CAG GGA TTT CAG TCG ATG TAC ACG TTC GTC 2908 Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val 350 355 360 ACA TCT CAT CTA CCT CCC GGT TTT AAT GAA TAC GAT TTT GTA CCA GAG 2956 Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu 365 370 375 TCC TTT GAT CGT GAC AAA ACA ATT GCA CTG ATA ATG AAT TCC TCT GGA 3004 Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly 380 385 390 TCT ACT GGG TTA CCT AAG GGT GTG GCC CTT CCG CAT AGA ACT GCC TGC 3052 Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys 395 400 405 GTC AGA TTC TCG CAT GCC AGA GAT CCT ATT TTT GGC AAT CAA ATC ATT 3100 Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile 410 415 420 425 Ｐｒｏ Ａｓｐ Ｔｈｒ Ａｌａ Ｉｌｅ Ｌｅｕ Ｓｅｒ Ｖａｌ Ｖａｌ
Ｐｒｏ Ｐｈｅ Ｈｉｓ Ｈｉｓ Ｇｌｙ Ｐｈｅ Ｇｌｙ 430 435 440 ATG TTT ACT ACA CTC GGA TAT TTG ATA TGT GGA TTT CGA GTC GTC TTA 3196 Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu 445 450 455 ATG TAT AGA TTT GAA GAA GAG CTG TTT TTA CGA TCC CTT CAG GAT TAC 3244 Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr 460 465 470 AAA ATT CAA AGT GCG TTG CTA GTA CCA ACC CTA TTT TCA TTC TTC GCC 3292 Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala 475 480 485 AAA AGC ACT CTG ATT GAC AAA TAC GAT TTA TCT AAT TTA CAC GAA ATT 3340 Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile 490 495 500 505 GCT TCT GGG GGC GCA CCT CTT TCG AAA GAA GTC GGG GAA GCG GTT GCA 3388 Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala 510 515 520 AAA CGC TTC CAT CTT CCA GGG ATA CGA CAA GGA TAT GGG CTC ACT GAG 3436 Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu 525 530 535 ACT ACA TCA GCT ATT CTG ATT ACA CCC GAG GGG GAT GAT AAA CCG GGC 3484 Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly 540 545 550 GCG GTC GGT AAA GTT GTT CCA TTT TTT GAA GCG AAG GTT GTG GAT CTG 3532 Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu 555 560 565 GAT ACC GGG AAA ACG CTG GGC GTT AAT CAG AGA GGC GAA TTA TGT GTC 3580 Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val 570 575 580 585 AGA GGA CCT ATG ATT ATG TCC GGT TAT GTA AAC AAT CCG GAA GCG ACC 3628 Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr 590 595 600 AAC GCC TTG ATT GAC AAG GAT GGA TGG CTA CAT TCT GGA GAC ATA GCT 3676 Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala 605 610 615 TAC TGG GAC GAA GAC GAA CAC TTC TTC ATA GTT GAC CTC TTG AAG TCT 3724 Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val Asp Leu Leu Lys Ser 620 625 630 TTA ATT AAA TAC AAA GGA TAT CAG GTG GCC CCC GCT GAA TTG GAA TCG 3772 Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser 635 640 645 ATA TTG TTA CAA CAC CCC AAC ATC TTC GAC GCG GGC GTG GCA GGT CTT 3820 Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu 650 655 660 665 CCC GAC GAT GAC GCC GGT GAA CTT CCC GCC GCC GTT GTT GTT TTG GAG 3868 Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu 670 675 680 CAC GGA AAG ACG ATG ACG GAA AAA GAG ATC GTG GAT TAC GTG GCC AGT 3916 His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser 685 690 695 CAA GTA ACA ACC GCG AAA AAG TTG CGC GGA GGA GTT GTG TTT GTG GAC 3964 Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp 700 705 710 GAA GTA CCG AAA GGT CTT ACC GGA AAA CTC GAC GCA AGA AAA ATC AGA 4012 Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg 715 720 725 GAG ATC CTC ATA AAG GCC AAG AAG GGC GGA AAG TCC AAA TTG TAA AAT 4060 Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu Stop 730 735 740 GTAACTGTAT TCAGCGATGA CGAAATTCTT AGCTATTGTA ATCCTCCGAG GCCTCGAGGT 4120 CGACGAATTC CGACTCCGGA ACCAATTACT GATAATGTAG AAGATCATAC AGACACCGTC 4180 ACATACACTA GCTAGTGATA GCATTAATAC AGTAAGTGCA TCATCTGGAG AATCCACAAC 4240 AGACGAGACT CCGGAACCAA TTACTGATAA AGAAGAAGAT CATACAGTCA CAGACACTGT 4300 CTCATACACT ACAGTAAGTA CATCATCTGG AATTGTCACT ACTAAATCAA CCACCGATGA 4360 TGCGGATCTT TATGATACGT ACAATGATAA TGATACAGTA CCACCAACTA CTGTAGGCGG 4420 TAGTACAACC TCTATTAGCA ATTATAAAAC CAAGGACTTT GTAGAAATAT TTGGTATTAC 4480 CGCATTAATT ATATTGTCGG CCGTGGCAAT ATTCTGTATT ACATATTATA TATATAATAA 4540 ACGTTCACGT AAATACAAAA CAGAGAACAA AGTCTAGATT TTTGACTTAC ATAAATGTCT 4600 GGGATAGTAA AATCTATCAT ATTGAGCGGA CCATCTGGTT CAGGAAAGAC AGCCATAGCC 4660 AAAAGACTAT GGGAATATAT TTGGATTTGT GGTGTCCCAT ACCACTAGAT TTCCTCGTCC 4720 TATGGAACGA GAAGGTGTCG ATTACCATTA CGTTAACAGA GAGGCCATCT GGAAGGGAAT 4780 AGCCGCCGGA AACTTTCTAG AACATACTGA GTTTTTAGGA AATATTTACG GAACTTCTAA 4840 AACTGCTGTG AATACAGCGG CTATTAATAA TCGTATTTGT GTGATGGATC TAAACATCGA 4900 TGGCGTTAGA AGTCTTAAAA ATACGTACCT AATGCCTTAC TCGGTGTATA TAAGACCTAC 4960 CTCTCTTAAA ATGGTTGAGA CCAAGCT 4987

【図面の簡単な説明】

【図１】組換えワクシニアウイルスにより発現されたＨ
ＣＶコア蛋白をウエスタンブロッティングにて検出した
結果を表す電気泳動パターンの図面である。図中、レー
ン１は組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５ＣＬを、レー
ン２および３はワイルドタイプのワクシニアウイルスの
結果をそれぞれ表す。

【図２】組換えワクシニアウイルスｒＶＶ５ＣＬをＷＲ
Ｌ６８株に感染させた後に本発明の抗ウイルス剤を０．
２５、０．５、１、５μＭとなるように添加したとき
の、発現されたルシフェラーゼの酵素量を測定して表し
た図面である。図中、（−）とは抗ウイルス剤無添加の
場合の結果を表し、縦軸は（−）のルシフェラーゼ酵素
量（×１０^-20 ｍｏｌ／８μＭ）の平均値を１００とし
たときの相対値を表す。

─────────────────────────────────────────────────────

【手続補正書】

【提出日】平成６年６月３日

【手続補正１】

【補正対象書類名】明細書

【補正対象項目名】図１

【補正方法】変更

【補正内容】

【図１】組換えワクシニアウイルスにより発現されたＨ
ＣＶコア蛋白をウエスタンブロッティングにて検出した
結果を電気泳動パターンで表した図面に代わる写真であ
る。図中、レーン１は組換えワクシニアウイルスｒＶＶ
５ＣＬを、レーン２および３はワイルドタイプのワクシ
ニアウイルスの結果をそれぞれ表す。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁶ 識別記号 庁内整理番号 ＦＩ 技術表示箇所 // Ｃ０７Ｈ 21/04 Ｚ

Claims (5)

【特許請求の範囲】
1. 【請求項１】 ウイルス遺伝子のＩＲＥＳ領域に結合し
   て該ウイルス遺伝子の翻訳に関与するタンパク質と該ウ
   イルス遺伝子のＩＲＥＳ領域との結合を阻害する物質を
   有効成分とする抗ウイルス剤。
2. 【請求項２】 ＩＲＥＳ領域のＹn −Ｘm ユニット（Ｙ
   n はオリゴピリミジンを表し、Ｘm はランダムヌクレオ
   チドを表す）に結合してウイルス遺伝子の翻訳に関与す
   るタンパク質と該ウイルス遺伝子のＩＲＥＳ領域との結
   合を阻害する物質を有効成分とする、請求項１記載の抗
   ウイルス剤。
3. 【請求項３】 Ｙn −Ｘm ユニットまたはその部分配列
   とハイブリッドを形成する化合物を有効成分とする請求
   項２に記載の抗ウイルス剤。
4. 【請求項４】 オリゴピリミジンとハイブリッドを形成
   する化合物を有効成分とする請求項２または３に記載の
   抗ウイルス剤。
5. 【請求項５】 ウイルス遺伝子がＣ型肝炎ウイルス遺伝
   子であることを特徴とする請求項１〜４のいずれかに記
   載の抗ウイルス剤。