JPH0769899A - 抗ウイルス剤 - Google Patents

抗ウイルス剤

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JPH0769899A
JPH0769899A JP5241973A JP24197393A JPH0769899A JP H0769899 A JPH0769899 A JP H0769899A JP 5241973 A JP5241973 A JP 5241973A JP 24197393 A JP24197393 A JP 24197393A JP H0769899 A JPH0769899 A JP H0769899A
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JP
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gly
sequence
leu
ala
val
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JP5241973A
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English (en)
Inventor
Makoto Seki
誠 関
Yoshikazu Honda
喜員 本多
Suguru Yamada
英 山田
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Mitsubishi Chemical Corp
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Mitsubishi Chemical Corp
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    • Y02ATECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
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Abstract

(57)【要約】 【構成】 ウイルス遺伝子の5’非翻訳領域に存在する
特異的な構造であるIRES(Internal Ri
bosome Entry Site)領域に結合して
該ウイルス遺伝子の翻訳に関与するタンパク質と該ウイ
ルス遺伝子のIRES領域との結合を阻害する物質を有
効成分とする抗ウイルス剤。IRES領域を有するウイ
ルスとしては、例えばC型肝炎ウイルス、ポリオウイル
ス、脳心筋炎ウイルス、口蹄疫病ウイルス、ヒトライノ
ウイルス等が挙げられる。 【効果】 本発明の抗ウイルス剤は、HCV等のIRE
Sを有するウイルスに起因するウイルス性疾患に対する
予防または治療薬を提供するものである。IRESが関
与する翻訳機構は、通常の真核細胞の翻訳系にはほとん
ど見られない特殊なものであることから、副作用の少な
い、極めて選択的な抗ウイルス剤としての利用が期待さ
れる。

Description

【発明の詳細な説明】
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は抗ウイルス剤に関し、詳
細にはIRESと呼ばれる特異領域を有するウイルスが
関与する各種疾患に対する治療または予防薬を提供する
ものである。
【0002】
【従来の技術および発明が解決しようとする課題】近
年、後天性免疫不全症候群(AIDS)や肝炎に代表さ
れるように、感染性のウイルス疾患が医学上、さらには
社会的にも重篤な問題として認識されるようになった。
これらのウイルス性疾患を治療する目的で、従来より種
々の抗ウイルス剤が開発されてきた。例えばわが国にお
いてはアシクロビル、ビダラビン、ジドブジン(アジド
チミジン)、イドクスウリジン、ガンシクロビル、イン
ターフェロン等が販売されている。これらは、大別する
と直接ウイルスの酵素の機能を阻害する薬物と、免疫機
構を介してウイルスを攻撃する薬物との、大きく2つの
タイプに分類される。
【0003】このような抗ウイルス剤の開発は、年々盛
んになりつつある。それは、慢性疾患と考えられてきた
ものが、実はウイルスがその原因であるということが往
々にしてあるからである。また高齢化社会が進むに従
い、潜伏感染していたウイルスが免疫力の低下した老人
で発病する、いわゆる日和見感染の問題も、抗ウイルス
剤の需要を喚起する一因となっている。
【0004】ところが従来の抗ウイルス剤は、副作用が
強すぎたり、薬剤耐性ウイルスが出現するなど、必ずし
も満足のいくものが得られていないのが現状であった。
【0005】
【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を鑑みて、従来にない新しい作用機序の抗ウイルス剤を
開発するべく検討を重ねてきた。その結果、一部のウイ
ルス遺伝子に見られる特殊な翻訳機構領域、IRES
(Internal Ribosome Entry
Site)に着目し、この機能を利用することでウイル
ス蛋白の翻訳を阻害できることを初めて見出し、本発明
を完成するに至った。
【0006】すなわち本発明の要旨は、ウイルス遺伝子
のIRES領域に結合して該ウイルス遺伝子の翻訳に関
与するタンパク質と該ウイルス遺伝子のIRES領域と
の結合を阻害する物質を有効成分とする抗ウイルス剤に
存する。以下、本発明につき詳細に説明する。本発明に
おいて、IRES領域とは、前述のように一部のウイル
ス遺伝子の5’非翻訳領域(5’UTR)に存在する特
異的な構造で、ポリオウイルス、脳心筋炎ウイルス、口
蹄疫病ウイルス、ヒトライノウイルス等のピコルナウイ
ルス科に属するウイルスや、C型肝炎ウイルス(以下、
「HCV」と略記することがある)(J.Viro
l.,66,1476−1483(1992))等に存
在する。この構造はステムループに富む複雑な高次構造
をとると考えられ、この領域に結合してウイルス遺伝子
の翻訳、転写に機能する宿主細胞タンパク質、例えば分
子量52K(p52タンパク質)、57K(p57タン
パク質)、50Kのタンパク質の存在が確認され(Pr
oc.Natl.Acad.Sci.USA,87,5
846−5850(1990))、リボソームはこの宿
主細胞タンパク質が結合したIRES領域を認識して結
合することが知られている(Curr.Top.Mic
robiol.Immunol.,161,23−47
(1990);Enzyme,44,292−309
(1990))。
【0007】また、Jangらは、ピコルナウイルス
5’UTRに存在するオリゴピリミジン(Yn )とAU
Gトリプレットを含むYn −Xm −AUGユニット(X
m :ランダムヌクレオチド)がIRESに多く存在する
と述べており(in Translationally
Regulated Genes in Highe
r Eukaryotes,292−309,Base
l(1990))、Pilipenkoらは、Yn とA
UGエレメント間の距離(Xm )が22ヌクレオチド付
近であり、このYn エレメントがSD配列様の機能を果
たしている可能性を示している(Cell,68,11
9−131(1992))。
【0008】本発明においては、ウイルス遺伝子のIR
ES領域に結合して該ウイルス遺伝子の翻訳に関与する
タンパク質と該ウイルス遺伝子のIRES領域との結合
を阻害する手段としては、前述のIRES領域に結合し
てウイルス遺伝子の翻訳、転写に機能する宿主細胞タン
パク質とIRES領域との結合を阻害する方法が挙げら
れ、特にIRES領域のYn −Xm ユニット(Yn はオ
リゴピリミジンを表し、Xm はランダムヌクレオチドを
表す)に結合してウイルス遺伝子の翻訳に関与するタン
パク質と該ウイルス遺伝子のIRES領域との結合を阻
害する方法が挙げられる。従って本発明の抗ウイルス剤
は、IRESに対する結合を宿主細胞タンパク質と拮抗
する物質や、Yn −Xm ユニットとハイブリッドを形成
して宿主細胞タンパク質との結合を阻害する化合物など
が好適に用いられる。
【0009】以下にHCV遺伝子のIRES領域とハイ
ブリッドを形成して宿主細胞タンパク質との結合を阻害
する化合物(以下、「ハイブリッド化合物」と略記す
る)を提供する場合を例にとり、具体的に説明する。H
CVは、1988年5月カイロン社が、従来の伝統的な
ウイルス探索法とは全く異なる方法により、その遺伝子
断片を世界で初めて取得した。
【0010】C型肝炎が発症すると高い確率で急性肝
炎、慢性肝炎、肝硬変、肝癌と移行し、患者を死亡させ
るが、現在まで、HCVの発現または増殖を抑制する薬
剤は見つかっておらず、HCVによるこの病状を治す薬
剤の開発が待たれている。HCVの遺伝子は非常に変異
しやすく、この変異によって、HCVにはいくつかのサ
ブタイプの異なるものが見出されている。しかしHCV
遺伝子のIRES領域は、ピコルナウイルスと同様に
5’UTR領域に存在し、この領域はHCVの各サブタ
イプ間でも特に変異が少ない領域である。よってこの領
域との相補鎖を作ることで、ウイルスのサブタイプに関
係なくHCVの複製およびHCV遺伝子産物の発現を阻
害することができる。
【0011】HCVの遺伝子は1本のRNA鎖から成る
とされている。それにコードされているHCV由来蛋白
質もまず1本のポリペプチドとして翻訳され、これを前
駆体としてHCV遺伝子から生産されるウイルスの構造
蛋白質(例えば、コア蛋白など)、RNAポリメラー
ゼ、プロテアーゼ、ヘリカーゼなどがプロセッシングさ
れながら分かれてできるとされている。すなわち、最初
にできる1本のポリペプチドの生産が阻害されれば、ウ
イルスのプロテアーゼも発現せず、ウイルスのRNAポ
リメラーゼによるHCVの複製も起こらないと考えられ
る。最終的には、HCV遺伝子由来蛋白質ができなけれ
ば、HCVは増殖しないことになる。
【0012】HCV遺伝子の阻害活性は、例えばHCV
遺伝子の5’末端からE2の途中までのmRNAをT7
RNAポリメラーゼ(ストラテージーン社製)を用いて
合成し、ラビット赤血球ライセートとイヌのマイクロゾ
ーマルメンブラン(ともにプロメガ社製)を用いたイン
ビトロ翻訳系でHCV由来蛋白を合成し抗HCVコア抗
体により免疫沈降させたコア蛋白質の量を測定して、H
CV遺伝子からHCV由来蛋白の翻訳活性をみることに
より、さらにはHCV遺伝子の5’末端から少なくとも
コア蛋白をコードする領域をワクシニアウイルスに挿入
して組換えウイルスを作製し、これをヒト由来の細胞株
に感染させることによって発現されるHCV由来ポリペ
プチドの産生量をみることにより測定することができ
る。
【0013】ハイブリッド化合物としては、デオキシリ
ボヌクレオシド同志を結合しているホスホジエステル結
合部のリン原子に二重結合している酸素原子が硫黄原子
に置換されたホスホロチオエート型、硫黄原子の代わり
にメチル基が導入されたメチルホスホネート型や無置換
のホスホネート型、αオリゴヌクレオシド型など(Cr
ooke,R M、Anticancer Drug
Des.(アンチキャンサー ドラッグ デザイン)、
、606−646、1991;Tidd,DM、An
ticancer Research(アンチキャンサ
ー リサーチ)、10、1169−1182、199
0)等が使用できる。また、対象とした配列とハイブリ
ッドを形成し、HCV遺伝子と対象とした領域において
2本鎖を形成しうるものであれば、ヌクレオシド誘導体
でなくても良い。さらに言えば、Antisense
research and Development
(アンチセンス リサーチ ディベロップメント)、
、65−113、1991にChrisey,L A
によって紹介されたアンチセンスとして使われた総ての
アンチセンス化合物も、使用可能である。
【0014】また、ハイブリッド化合物としては、より
DNase抵抗性であることや、mRNAとハイブリッ
ドした時、細胞内のRNaseH活性で相補鎖のRNA
を分解できるものが望ましいことも容易に類推できる
(Tidd,D M、Anticancer Rese
arch(アンチキャンサー リサーチ)、10、11
69−1182、1990)。また、全てのホスホジエ
ステル結合部がホスホロチオエート型やメチルホスホネ
ート型であるハイブリッド化合物においては、IRES
領域とのハイブリッド形成能を上げながらもハイブリッ
ド化合物自体の分解活性をあまり下げない手段として、
5’末端側からと3’末端側からの数塩基のホスホジエ
ステル結合をホスホロチオエート型やメチルホスホネー
ト型にして内側の塩基のホスホジエステル結合は修飾し
ない方法等が挙げられる。
【0015】かかるハイブリッド化合物としては、IR
ES領域と相補的な配列を有するものであれば特に制限
はされないが、好ましくは前述したYn −Xm ユニット
に相補的な配列を有するもの、より好ましくはオリゴピ
リミジン領域であるYn に相補的な配列を有するもので
あることが望ましい。HCV遺伝子のIRES領域に
は、オリゴピリミジン領域と推定される部位として、シ
トシンリッチな領域が見出される(例えば、配列表の配
列番号1において33番目のシトシンから38番目のチ
ミンまでの6mer、67番目のシトシンから73番目
のチミンまでの7mer、138番目のシトシンから1
42番目のシトシンまでの5mer、147番目のシト
シンから157番目のシトシンまでの11mer、26
3番目のシトシンから267番目のシトシンまでの5m
erなど)。そこでHCVに対しては、ハイブリッド化
合物としてグアニンリッチな配列を有するものが特に好
ましい。具体的には、配列表の配列番号2〜17に示す
ようなものが挙げられる。
【0016】またかかるハイブリッド化合物は、塩基の
長さで表した場合、15merから30merの長さと
なるように設計することが望ましい。なお、本発明では
ハイブリッド化合物の構造を表すにあたり、便宜上「塩
基配列」の形式による配列表として表したが、前述した
ように、対象とした配列とハイブリッドを形成し、HC
V遺伝子のIRES領域において2本鎖を形成しうるも
のであるならば、必ずしもヌクレオシド誘導体である必
要はない。またハイブリッド形成能を損なわない範囲に
おいて、一部の配列を任意の塩基、好ましくはプリンに
置換しても差し支えない。
【0017】ハイブリッド化合物を培養細胞に取り込ま
せるには、例えば上記したハイブリッド化合物をそのま
ま培養液に含ませる等により可能であり、長さが15塩
基から28塩基ぐらいのホスホロチオエート型やメチル
ホスホネート型であればこの条件で容易に取り込ませる
ことができる。また、取り込みを積極的に行わせるため
に、動物細胞などで盛んに行われているトランスフェク
ション法(燐酸カルシウム法、エレクトロポーレーショ
ン法、リポソーム法など)を用いることも好ましい方法
の一つである。
【0018】また、人体に投与する場合も、上記ハイブ
リッド化合物をそのまま静脈に送り込めば、動物実験な
どからも容易に推測できるように肝臓に半分ぐらいは吸
収されると思われる。更に、ハイブリッド化合物の構造
や性質によっては、リポソームなどで保護したり、ハイ
ブリッド化合物に細胞を認識できる物質を付加するなど
して取り込み効率を上げることもできる。ハイブリッド
化合物の製造法およびその評価方法について以下にさら
に詳細に述べる。
【0019】(1)mRNA T7N1−19の取得 例えば、プラスミドpUCT71−19(欧州公開特許
公報第18313号)をアルカリ法、さらにはCsCl
を用いた密度勾配超遠心法で調整する。次に、該プラス
ミドをEcoRI等の制限酵素で完全に切断し、クロー
ンT7N1−19の3’側の1箇所で切断された線状D
NAを得る。この線状DNA1μg程度を用いて、イン
ビトロ トランスクリプションをT7RNAポリメラー
ゼを用いて行わせることにより、HCV mRNA T
7N1−19を約80から100μg得ることができ
る。この時の反応はストラテージーン(Stratag
ene)社製のRNA TRANSCRIPTION
Kitを用いてもよいが、T7RNAポリメラーゼの活
性条件であれば、別途、試薬を調整し反応させてもよ
い。得られたmRNAは、ノーザンハイブリダイゼーシ
ョンで確認できる。プローブはクローンT7N1−19
の3’末端領域のDNA断片を用いラベリング法で調整
できる。定量は、波長260nmでの吸光度により計算
できる。
【0020】(2)ハイブリッド化合物の合成 例えばアプライド バイオシステム社(Applied
Biosystems社)のDNAシンセサイザー3
94型を用いることにより、ホスホジエステル型のオリ
ゴヌクレオチドもホスホロチオエート型オリゴヌクレオ
チドも合成することができる。反応はジメトキシトリチ
ル基ONで行い、HPLCで精製し(目的産物のジアス
テレオマーは全て1つにまとめた)、その後、酢酸処理
で目的のハイブリッド化合物を調整できる。
【0021】(3)インビトロ トランスレーション法
を用いたハイブリッド化合物によるHCV由来蛋白合成
阻害効果 上記(1)で作成したmRNAを用いてインビトロ ト
ランスレーションを行い、該mRNAにコードされてい
るHCV由来蛋白のIRES活性のもとで発現させる。
【0022】インビトロ トランスレーションは、例え
ばプロメガ(Promega)社製のウサギ赤血球ライ
セート、イヌ マイクロゾーマル メンブランを用い
る。マイクロゾーマル メンブランはコア蛋白とエンベ
ローブ(E1)の間とエンベローブ(E1)とE2(N
S1)の間をシグナルペプチダーゼで切断させるのに必
要と考えられる。翻訳されたポリペプチドには[35S]
メチオニンが取り込まれる。抗HCVコア抗体によりH
CVコア蛋白質を含むポリペプチドを免疫沈降させ、こ
れをSDS−PAGE電気泳動させて、富士写真フィル
ム社製バイオイメージアナライザー BAS2000
(BIO−IMAGE ANALYZER)等を用いる
ことにより解析することができる。
【0023】ハイブリッド化合物は、mRNAとインビ
トロ トランスレーション用試薬が混ざる直前にインビ
トロ トランスレーション試薬に混ぜ、翻訳阻害効果を
見ることが好ましい。その結果、HCV遺伝子配列から
設計しうる長さ15塩基から30塩基以下のハイブリッ
ド化合物が阻害効果に深く関わっていることが確認され
る。
【0024】(4)組換えワクシニアウイルスを用いた
細胞評価系における、ハイブリッド化合物によるHCV
遺伝子の翻訳阻害効果 外来遺伝子の両端にワクシニアウイルス中の特定部位の
配列を連結したものは、かかる部位とワクシニアウイル
ス遺伝子中の対応配列との間に相同性組換えが起こるこ
とが知られている。この方法を用いてHCV遺伝子を導
入した組換えワクシニアウイルスを作製し、これを適当
な細胞に感染させることにより細胞中でHCV遺伝子を
発現させることができるので、翻訳されるHCVタンパ
クをアッセイする適当な評価系を構築することにより、
ハイブリッド化合物による翻訳阻害効果を測定すること
ができる。
【0025】具体的には、後述の実施例に示すように、
HCV由来の遺伝子をワクシニアウイルスのヘマグルチ
ニン(HA)遺伝子中に挿入する。HAはワクシニアウ
イルスの増殖に必須ではない。またHA遺伝子の機能が
失われた場合、そのようなワクシニアウイルスを血球凝
集機能の喪失として、ニワトリ赤血球によるウイルスプ
ラークの染色等により同定することができることから、
外来遺伝子の挿入部位として好適に使用される。しかし
かかる部位としては、外来遺伝子の挿入によりウイルス
の増殖が本質的な影響を受けず、しかも外来遺伝子が挿
入されたウイルスの簡単な同定を可能にする部位である
ならば、特に制限はされない。挿入するHCV由来の遺
伝子としては、HCV由来のものであり、5’側の非翻
訳領域にあるIRES領域を含む遺伝子であることが必
要である。前述したように、HCV遺伝子がコードする
ポリペプチドはまず約3,000アミノ酸からなる1本
のポリペプチド(前駆体タンパク質)として翻訳され、
これがプロセッシングを受けて各機能タンパクができる
とされている。前駆体タンパク質はN末端側からコア蛋
白、E1(エンベロープ)蛋白、E2(NS1あるいは
エンベロープ2)蛋白などがこの順で続いているので、
HCV遺伝子の構成も5’末端側から非翻訳領域、コア
蛋白をコードする遺伝子、E1蛋白をコードする遺伝子
等と続く。よってHCVポリペプチドの翻訳阻害効果を
測定するためには、正常にHCV由来ポリペプチドが産
生される必要があるので、挿入するHCV由来の遺伝子
は5’側非翻訳領域にあるIRES領域を含み、かつそ
の3’側に続くコア蛋白をコードする遺伝子を少なくと
も含む遺伝子でなければならない。具体的には、配列表
の配列番号1に記載の塩基配列において、5’末端の2
5〜30番目から910bp程度の長さの塩基配列で表
される遺伝子が挙げられる。この場合、コア蛋白が発現
されればウエスタンブロッティングにより約22KDa
の蛋白として確認することができる。
【0026】かかるHCV由来の遺伝子は、その5’上
流側にプロモーターを連結してpUC19等のベクター
に挿入される。プロモーターとしては、ワクシニアウイ
ルス内で機能するものであれば特に制限はされない。好
ましくは、ワクシニアウイルス由来のearlyプロモ
ーターで、高発現のプロモーターが使用される。具体的
には、ワクシニアウイルス由来の7.5kプロモーター
(Cell,125,805−813,1981)、も
しくはこれに点変異を導入して改変したもの(J.Mo
l.Biol.,210,749−769,1988)
等が挙げられる。また発現量を増強させる目的で、配列
表の配列番号27に示すような合成DNAを前記プロモ
ーターと組み合わせて使用することも好ましい態様の一
つである。また、HCV由来遺伝子の3’側にルシフェ
ラーゼ遺伝子等のレポーター遺伝子を挿入しておくと、
この融合遺伝子が翻訳されて融合蛋白が発現される。融
合蛋白はHCV由来ポリペプチドとレポーター遺伝子が
コードするポリペプチドとが融合されたものであること
から、適当な条件下でプロセッシングをかけてレポータ
ー遺伝子がコードするポリペプチドを測定することによ
り、間接的にHCV由来ポリペプチドを測定することが
できる。HCV遺伝子には、コア蛋白とE1蛋白とをプ
ロセッシングするシグナル配列が存在する。従って、H
CVコア蛋白の翻訳阻害効果を測定する場合は、このシ
グナル配列を利用してコア蛋白のC末端が切断されるよ
うに設計することが望ましい。ベクターの構築は、常法
に従って行うことができる。
【0027】かくして得られるトランスファーベクター
から、ベクターDNAを常法に従って調製し、このDN
Aとワクシニアウイルスの野生株とを混合することによ
って相同性組換えを行わせる。こうして得られた組換え
ワクシニアウイルスを、例えばヒト由来の細胞株に感染
させる。この感染細胞中に組換えタンパクが発現される
ので、感染細胞の培養物から常法に従ってタンパク成分
を得、ウエスタンブロッティング等によりHCV由来の
ポリペプチドを測定することができる。
【0028】ハイブリッド化合物は、組換えワクシニア
ウイルスを細胞株に感染させる前及び/又は後に添加さ
れる。対象としてハイブリッド化合物を加えないときの
組換えHCV由来ポリペプチドの産生量、又はIRES
領域の相補鎖とホモロジーの低い、すなわちハイブリッ
ドをほとんど形成しない化合物を加えたときの組換えH
CV由来ポリペプチドの産生量等と比較を行うことによ
り、ハイブリッド化合物の翻訳阻害効果を求めることが
できる。
【0029】かかるハイブリッド化合物を抗ウイルス剤
として使用する際には、当該化合物を経口により、また
は静脈内投与、筋肉内投与、皮下投与等の注射剤とし
て、さらには坐剤中に封入して用いることもできる。こ
のとき、必要に応じて薬学的に許容され得る担体を常法
に従って調製・含有させることもできる。ハイブリッド
化合物の投与量に関しては、アンチセンス化合物におい
てアメリカのバイオベンチャー会社をはじめ多くのグル
ープから論文や学会などで発表され、それらによると培
養細胞(動物細胞)などで10から100μMで効果を
示すアンチセンス化合物は、人体においてもある程度の
効果を示すという例がHIV患者などの難治病患者に対
して得られている。従って本発明においても、ハイブリ
ッド化合物を1日あたり100μM以下、好ましくは
0.1〜50μMの濃度となるように使用することが好
ましい。なお言うまでもないが、かかる投与量は患者の
年齢、病態、症状等により適宜増減される。
【0030】以上、対象とするウイルスがHCVの場合
を例にとり具体的に説明を行ってきたが、本発明の抗ウ
イルス剤はIRESと呼ばれる特殊な翻訳機構領域をそ
のウイルス遺伝子内に有するものであれば、いずれのウ
イルスにおいても抗ウイルス効果を発揮することができ
る。具体的には、HCVの他に小児麻痺の原因となるポ
リオウイルス(PV)、脳心筋炎の原因となる脳心筋炎
ウイルス(EMCV)、口腔(咽頭粘膜)に特有の水疱
や口内疹を作る口蹄疫病ウイルス(FMDV)、鼻かぜ
を引き起こしたり上部気道の粘膜などに自然感染するヒ
トライノウイルス(HRV)等のピコルナウイルスが関
与する各種の疾患に対する有効な予防、または治療薬と
なり得る。なおピコルナウイルス科に分類されるウイル
スにおいては、IRES領域のオリゴピリミジンとして
通常ポリUの存在が認められる。従ってピコルナウイル
ス科に属するウイルスを標的としたハイブリッド化合物
を提供する場合には、該ポリUとハイブリッド形成能の
高い化合物、具体的にはポリA等のアデニンリッチな配
列を有するものが好適に使用される。
【0031】
【発明の効果】本発明の抗ウイルス剤は、ウイルス遺伝
子の特殊な翻訳機構に着目した新規な思想に基づくもの
であり、HCV等のIRESを有するウイルスに起因す
るウイルス性疾患に対する予防または治療薬を提供する
ものである。IRESが関与する翻訳機構は、通常の真
核細胞の翻訳系にはほとんど見られない特殊なものであ
ることから、副作用の少ない、極めて選択的な抗ウイル
ス剤としての利用が期待される。
【0032】
【実施例】以下に実施例を挙げて本発明をより具体的に
説明するが、その要旨を越えない限り、以下の実施例に
限定されるものではない。
【0033】参考例1 mRNA T7N1−19の取
得 配列表の配列番号1に示すクローンT7N1−19を、
pUC19のクローニングサイトに持つpUCT711
9(欧州公開特許公報第518313号)をアルカリ
法、さらにはCsClを用いた密度勾配超遠心法(モレ
キュラー クローンニング、2nd edition、
1.33−1.52、1989)で該プラスミドDNA
を約100μg調整した。
【0034】この高純度に精製された該プラスミド10
μgを制限酵素EcoRIで完全に切断し、クローンT
7N1−19の3’側の1箇所で切断された線状DNA
を得た。該線状DNA1μgを40mM Tris−H
Cl(pH8.0)、5mMDTT、50μg/ml
BSA、2mM 各NTP、40mM MgCl2、 1
mM スペルミジン、RNase インヒビター 50
unitおよびT7RNAポリメラーゼ 1.42μg
からなる組成の反応溶液50μlで反応を開始した。3
7℃で20分後、T7RNAポリメラーゼ 10ユニッ
トを加え、さらに37℃で20分インキュベーションし
た。最後にDNaseI(Stratagene社製)
を10ユニット(1μl)加え、30℃で10分インキ
ュベーションし、この反応溶液にフェノール・クロロホ
ルム溶液(フェノール:クロロホルム=1:1)50μ
lを加え反応を止め、混和後、水相50μlを回収し、
いわゆるエタノール沈殿を行うため、3M酢酸ナトリウ
ム(pH5.5)を5.5μlを混和して、さらにエタ
ノール約150μlを混和して、15000rpm 1
5分間遠心し、得られたRNA(転写物)を乾燥させ
た。
【0035】得られたRNAは、30μlのDEPC処
理された滅菌水(モレキュラー クローンニング、2n
d edition、7.26、1989)に溶解さ
れ、そのうち3μlは、波長260nmの吸光度を測定
し、1OD=40μg/mlとして計算し、定量した。
この定量値より、得られたRNA量は約80μgであっ
た。また、転写物の長さを見るため、ホルムアミドを用
いたアガロース電気泳動(モレキュラー クローンニン
グ、2nd edition、7.43、1989)を
行った。その結果、得られたRNAは、シングルバンド
で、しかも長さも分子量マーカー(GIBCO BRL
社製:0.24−9.5Kb RNA Ladder)
と比較し妥当なものであった。また、この電気泳動後の
アガロースをメンブランに転写し、いわゆるノーザンハ
イブリダイゼーション(モレキュラー クローニング、
2nd edition、7.39−7.52、198
9)を行い、転写物のRNAが確かにクローンT7N1
−19由来であることも確認した。この時、用いたプロ
ーブはクローンT7N1−19の3’領域のクローンN
19の配列を持つDNA断片より、ラベリング法により
(モレキュラー クローンニング、2nd editi
on、10.13−10.17、1989)作成した。
【0036】参考例2 HCV由来蛋白質のインビトロ
での合成とその解析 参考例1で合成した転写物であるmRNA T7N1−
19は、1本鎖RNAであるHCVゲノム遺伝子(欧州
公開特許公報第518313号)の5’領域側、200
7塩基とほぼ同じ構造を持っている。異なるのは、HC
V遺伝子の5’側にT7RNAポリメラーゼに作用する
T7のプロモーター増強配列を5’末端に付加している
事である。
【0037】インビトロ トランスレーション反応は、
ウサギ赤血球ライセート(Promega社製)11.
375μl、イヌ マイクロゾーマル メンブラン(P
romega社製)1.17μl、アミノ酸ミックス
(Promega社製)5.2μl、L−[35S]−メ
チオニン(Amersham社製)1.3μl(729
KBq)およびRNase インヒビター(宝酒造社
製)0.2μlと混ぜ、最終量14.37μlとして、
該転写物 約3.5μgに加えて反応を開始した。基本
的には、プロメガ(Promega)社の「Trans
lation invitro Technical
Manual」のプロトコールに従って反応させた。
【0038】また、試薬のロットチェックを兼ねてRN
A(転写物)のみを除いた系で反応させ、何も合成され
ないことを確認した。また、コントロールとして、E.
coli β−lactamase mRNA(Pro
mega社製のイヌ マイクロゾーマル メンブランに
添付)0.5μgを、該転写物 約3.5μgの代わり
に用いた。
【0039】30℃で1時間15分インキュベーション
後、そのままSDS−PAGE電気泳動すると、1レー
ンあたりの蛋白量が多すぎて合成された蛋白質の解析が
困難となることが予想されたので、免疫沈降法でHCV
コア蛋白質を含むポリペプチドのみを分離させ、電気泳
動させた。すなわち、翻訳反応溶液全量に対して最終濃
度0.5%SDSになるように2.5%SDSを加え
た。さらに、4倍量のRIPAバッファー1(1%Tr
iton X−100、1%sodium deoxy
cholate、0.15MNaClおよび50mM
Tris−HCl(pH7.5))を加え、反応液を氷
上で冷やした後、抗HCVコア抗体(ラビット血清より
精製、ポリクローナル抗体、1μg/1μl)1μlを
加え、1時間、0℃で静置。さらにザイソルビン(ザイ
メット社製、10%W/V)3.125μlを加えて1
時間、0℃で静置。その後、3000rpm 3分で遠
心し、RIPAバッファー2(1%Triton X−
100、1%sodium deoxycholat
e、0.1%SDS、0.15M NaClおよび50
mM Tris−HCl(pH7.5))100μlを
加えて洗浄し、同じ操作をRIPAバッファー3(1%
Triton X−100、1%sodium deo
xycholate、0.1%SDS、0.15M N
aCl、50mM Tris−HCl(pH7.5)お
よび1mg/ml BSA)100μlで繰り返し、最
後にもう1度RIPAバッファー2で洗浄した。得られ
た沈殿をSDSローディングバッファー(9.1%Tr
is−HCl(pH6.8)、16.1%(v/v)グ
リセリン、4.2Mウレア、3.15%SDS、12.
7%(v/v)β−メルカプトエタノールおよび0.0
4%BPB)8μlでサスペンジョンした。
【0040】次に、これらの試料を95℃、5分間煮沸
した。このようにして得られた試料8μlを、0.1%
SDS−15.0%ポリアクリルアミドゲル(70×8
5×1mm)に添加した。その際、マーカータンパク質
としてAmersham社製「Rainbow[14C]
metylatedprotein molecula
r weight markers」(分子量レンジ1
4300から200000)を使用した。電極液として
トリス緩衝液(25mM トリス(pH8.3)、19
2mM グリシンおよび0.1%SDS)を用い、30
mAの定電流で45分間泳動後、ワットマン3MMの紙
の上にのせ、透明のラップフィルム(サランラップ)を
上からかぶせてゲルドライアーでゲルを乾燥させた。乾
燥されたゲルは富士写真フィルム社製イメージングプレ
ート(TYPE BAS−III)にはさんで、指定の
カセットに入れ(この操作は富士写真フィルム社製バイ
オイメージアナライザー BAS2000(BIO−I
MAGE ANALYZER)のプロトコールに従っ
た)、約12時間室温放置した。イメージングプレート
をバイオイメージアナライザーで解析することにより、
35SメチオニンにラベルされたHCV由来コア蛋白約2
2KDaとその前駆体蛋白質(555アミノ酸からなる
ポリペプチド)約61KDaがシャープなバンドとして
検出された。
【0041】参考例3 ハイブリッド化合物の合成 アプライド バイオシステム社(Applied Bi
osystems社)のDNAシンセサイザー394型
で、ホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチドを合成
した。添付のプロトコールに従って、合成中に付加され
た塩基の保護基をはずして、さらにHPLCによって目
的の長さのホスホロチオエート型のオリゴヌクレオチド
を精製した。これは、ホスホジエステル型と違い1ピー
クに分離されないが、目的とするホスホロチオエート型
ジアステレオマーは全てまとめて1ロットとした。その
後、5’末端の水酸基についている保護基(ジメトキシ
トリチル基)を常法により酢酸水溶液で脱保護し、さら
にフェノール処理をした後波長260nmでの吸光度に
より定量して調整して、目的のハイブリッド化合物を得
た(この時、1OD=35μg/mlとして換算され
た)。
【0042】実施例1 組換えワクシニアウイルスrV
V5CLの作製 〔1〕組換えワクシニアウイルス作製用トランスファー
ベクターの作製 特開昭63−63380号公報の実施例1に記載の方法
に従い、ワクシニアウイルスWR株よりHA蛋白遺伝子
を精製した。すなわち、ワクシニアウイルスWR株のウ
イルスを精製し、50mM Tris−HCl(pH
7.4)(1mM
【0043】EDTA及び0.5% ドデシル硫酸ナト
リウム含有)中に懸濁し、プロテイナーゼKを250〜
1000μg/mlに加えて37℃にて一夜インキュベ
ートした後、緩衝液で飽和されたフェノール:クロロホ
ルム(1:1)で3回抽出し、そしてエタノールにより
ウイルスDNAを沈殿させた(エタノール沈殿とは、水
相に10分の1量の3M酢酸ナトリウムもしくは等量の
4M酢酸アンモニウムと水相の2.5倍容のエタノール
を加え混和し、半径5cm程度のロータを用いて15,0
00rpm,4℃で15分間冷却遠心を行い、その沈殿
を乾燥させる処理。以下同様)。このDNAを10mM
Tris−HCl(pH8.0)(1mM EDTA
含有)に溶解し、HindIIIにより消化し、アガロ
ースゲル電気泳動により約50kbのHindIIIA
断片を単離した。このHindIIIA断片を、高塩濃
度緩衝液(50mM Tris−HCl,100mM
NaCl,10mM MgCl2 ,1mM DTT(p
H7.5))中でSalIにより消化し、HindII
IA断片の3’末端に存在する約1.8kbのHin
III−SalI断片を、アガロース電気泳動により単
離した。このDNAをT4 DNAポリメラーゼで平滑
末端とした。さらにこのDNAをライゲーションキット
(宝酒造社製)を用いて、マルチクローニングサイト内
にあるHindIII及びEcoRIで消化し、さらに
T4 DNAポリメラーゼで平滑末端としたpUC19
クローニングベクターに組み込んだ。
【0044】また、特開昭63−63380号公報の実
施例4に記載の方法に従いワクシニアウイルスWR株よ
り7.5k蛋白質プロモーター断片を精製した。すなわ
ち、上記のように調製したウイルスDNAを高塩濃度緩
衝液中でSalIにより消化し、アガロース電気泳動に
より分離することにより、約0.9kbのSalI断片
を得た。他方、プラスミドpUC18を高塩濃度緩衝液
中でSalIにより消化し、フェノール抽出及びエタノ
ール沈殿により分離することにより、線状プラスミドを
得た。次に、前記約0.9kbのSalI断片と線状プ
ラスミドとをライゲーション緩衝液(66mM Tri
s−HCl,1mM ATP,5mMMgCl2 ,5m
M DTT(pH7.6))中でT4DNAリガーゼに
より連結し、この反応混合物を用いて大腸菌JM103
株を形質転換した。形質転換クローンからのプラスミド
SalIにより消化することにより切り出した上記D
NA断片をRsaI、AluI、HapII及びDde
Iで消化してスクリーニングすることにより、プラスミ
ドp0901を得た。このプラスミドを中塩濃度緩衝液
(10mM Tris−HCl,50mM NaCl,
10mM MgCl2 ,1mM DTT(pH7.
5))中でRsaI及びHincIIで消化し、アガロ
ース電気泳動で分離することにより、0.26kbから
なる平滑末端のRsaI−HincII断片を得た。か
かる断片中に、7.5k蛋白質プロモーターが含まれ
る。このDNAをライゲーションキット(宝酒造社製)
を用いて、マルチクローニングサイト内にあるHin
IIで消化したpUC19クローニングベクターに組み
込んだ。
【0045】上記のライゲーションに用いたベクターD
NAとしては、次の様に用意されたものを5ng〜10
ng使用した。即ち、pUC19クローニングベクター
を制限酵素HindIII及びEcoRI、またはHi
cII(東洋紡績社製)で切断し、フェノール/クロ
ロホルム処理、エタノール沈殿させた後、さらにアルカ
リフォスファターゼ(ベーリンガーマンハイム社製)で
5′末端を脱リン酸化して〔モレキュラー・クローニン
グ(Molecular Cloning),1982,コールド・スプリン
グ・ハーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Har
bor Lab. Press) 〕、フェノール/クロロホルム処理
し、エタノール沈殿させた。
【0046】この様にして作成したDNAを用いて大腸
菌JM109を形質転換させた(この時、コンピテント
セルは東洋紡績社製のものを用いた)。形質転換させる
方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ(COMPETENT
HIGH)のプロトコールに従った。このようにして得られ
た組換え体から常法によりミニスクリーニングを行い
〔モレキュラー・クローニング(Molecular Cloning),1
982,コールド・スプリング・ハーバー・ラボラトリ
ー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press) 〕、pU
CのマルチクローニングサイトにあるEcoRI側にH
A蛋白遺伝子の5’側があるプラスミドを選択し、pU
CHAと命名した。また、7.5kプロモーターの5’
側がpUC19のマルチクローニングサイトにあるHi
dIII側にくるようなプラスミドを選択し、pUC
7.5と命名した。
【0047】このようにして得られた形質転換体pUC
HA及びpUC7.5からそれぞれプラスミドDNAを
調製し、デュポン社製蛍光シークエンサーGENESIS 20
00システムを用いて、配列を決定した。シークエンス
プライマーとして次の2種の合成プライマー5′d(G
TAAAACGACGGCCAGT)3′(配列表の配
列番号20)、5′d(CAGGAAACAGCTAT
GAC)3′(配列表の配列番号21)を用いた。
【0048】次に、pUC7.5プラスミド1μgを制
限酵素SmaIで切断し、フェノール/クロロホルム処
理、エタノール沈殿させ、さらにアルカリフォスファタ
ーゼ(ベーリンガーマンハイム社製)で5′末端を脱リ
ン酸化して〔モレキュラー・クローニング(Molecular C
loning),1982,コールド・スプリング・ハーバー・
ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Pres
s) 〕、フェノール/クロロホルム処理し、エタノール
沈殿させた。このようにして得たDNA10ngに、合
成リンカー5’d(pCAGATCTGCAAGCTT
G)3’(配列表の配列番号22)5ngをライゲーシ
ョンキット(宝酒造社製)を用い挿入した。この様にし
て作成したDNAを用いて大腸菌DH5を形質転換させ
た(この時、コンピテントセルは東洋紡績社製のものを
用いた)。形質転換させる方法は、東洋紡績社製のコン
ピテント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従っ
た。この様にして得た組換え体から、常法によりミニス
クリーニングを行い〔モレキュラー・クローニング(Mol
ecular Cloning),1982,コールド・スプリング・ハ
ーバー・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor La
b. Press) 〕、上記の合成リンカーが7.5kプロモー
ターと順方向にBglII、HindIIIとなるよう
に組み込まれたプラスミドpUC7.5GHを得た。
【0049】このプラスミドを用いてSaiki らの方法
〔ネーチャー(Nature), 324,126,(198
6)〕に準じて、いわゆるPCR法により特異的配列を
持つDNAを増幅し、7.5kプロモーターの改変を行
った。即ち、プラスミドpUC7.5GH10ng、1
0×PCR緩衝液(100mM Tris−HCl、p
H8.3、500mM KCl、15mM MgC
2 、1%ゼラチン) 10μl、1.25mM 4d
NTP 16μl、合成DNAプライマー5′d(CA
GGAAACAGCTATGAC)3′(配列表の配列
番号23)及び5’d(GAATAGTTTTTCAA
TTTTTACG)3’(配列表の配列番号24)各
(20μM)5μl、または5’d(CGTAAAAA
TTGAAAAACTATTC)3’(配列表の配列番
号25)及び5′d(GTAAAACGACGGCCA
GT)3′(配列表の配列番号26)各(20μM)5
μl、に水を加えて合計が100μlになるようにし
て、まず95℃に5分間保温後、0℃に急冷した。1分
後、Taq DNAポリメラーゼ(7ユニット/μl、
AmpliTaqTM宝酒造社製)0.5μlを加え混和後、ミネ
ラルオイルを重層した。このサンプルを、パーキン エ
ルマー シータス社製のDNA Thermal Cyclerで95
℃1分、48℃1分、72℃1分で30回処理した。最
後に72℃で7分保温した後、この反応水溶液をフェノ
ール/クロロホルム処理、エタノール沈殿を行い、それ
ぞれ250bpと110bpの2本の増幅DNA断片を
得、5%アクリルアミドゲルで精製した。次に、このよ
うにして得たDNA断片各5ng、10×PCR緩衝液
(100mM Tris−HCl、pH8.3、500
mM KCl、15mM MgCl2 、1%ゼラチン)
10μl、1.25mM 4dNTP 16μl、合
成DNA5′d(CAGGAAACAGCTATGA
C)3′(配列表の配列番号23)及び5′d(GTA
AAACGACGGCCAGT)3′(配列表の配列番
号26)各(20μM)5μl、に水を加えて合計が1
00μlになるようにして、まず95℃に5分間保温
後、0℃に急冷した。1分後、Taq DNAポリメラ
ーゼ(7ユニット/μl、AmpliTaqTM宝酒造社製)0.
5μlを加え混和後、ミネラルオイルで重層した。この
サンプルを、パーキン エルマー シータス社製のDN
A Thermal Cyclerで95℃1分、48℃1分、72℃
1分で30回処理した。最後に72℃で7分保温した
後、この反応水溶液をフェノール/クロロホルム処理、
エタノール沈殿を行い、330bpの増幅DNA断片を
得、制限酵素EcoRI及びPstIで消化し、5%ア
クリルアミドゲルで精製した。このようにして得られた
DNA断片5ngをライゲーションキット(宝酒造社
製)を用いマルチクローニングサイト内にあるEco
I及びPstIで消化したpUC19クローニングベク
ターに組み込み、大腸菌DH5を形質転換させた(この
時、コンピテントセルは東洋紡績社製のものを用い
た)。形質転換させる方法は、東洋紡績社製のコンピテ
ント ハイ(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従った。
この様にして得た組換え体から常法によりミニスクリー
ニングを行い〔モレキュラー・クローニング(Molecular
Cloning),1982,コールド・スプリング・ハーバー
・ラボラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Pre
ss) 〕、ワクシニアウイルスの強力プロモーターを持つ
プラスミドpUCSPを得た。該プラスミドのマルチク
ロニングサイトに挿入されたDNA断片はデュポン社製
蛍光シークエンサーGENESIS 2000システムを用い
て、配列を決定した。
【0050】このようにして得られたプラスミドpUC
SPのBamHI及びBglIIサイトに第40回日本
ウイルス学会総会演説抄録4075に記載のプロモータ
ーを両端がBamHI及びBglIIサイトとなるよう
にした合成DNA(配列表の配列番号27)
【0051】
【表1】 5’d(GATCCAAAAATTGAAAAACTAGTCTAATTTAT 3’(GTTTTTAACTTTTTGATCAGATTAAATA TGCACGGA)3’ ACGTGCCTCTAG)5’ を常法により挿入し(ライゲーションには、宝酒造社製
のライゲーションキットを用い、方法は宝酒造社のライ
ゲーションキット用のプロトコールに従った)、大腸菌
DH5を形質転換しミニスクリーニングにより順方向に
合成DNAが6個タンデムに挿入されたプラスミドpU
CSEを得た。
【0052】このようにして得られたプラスミドpUC
SEを制限酵素PstI及びEcoRIで切断し、フェ
ノール/クロロホルム処理、エタノール沈殿させ、さら
にT4 DNAポリメラーゼで平滑端とした後、550
bpの断片を5%アクリルアミドゲルで精製した。この
ようにして得られたDNA断片5ngを制限酵素Nru
Iで消化したプラスミドpUCHA10ngとライゲー
ションし、大腸菌DH5を形質転換させた(この時、コ
ンピテントセルは東洋紡績社製のものを用いた)。形質
転換させる方法は、東洋紡績社製のコンピテント ハイ
(COMPETENT HIGH)のプロトコールに従った。この様にし
て得た組換え体から、常法によりミニスクリーニングを
行い〔モレキュラー・クローニング(Molecular Clonin
g),1982,コールド・スプリング・ハーバー・ラボ
ラトリー・プレス(Cold Spring Harbor Lab. Press)
〕、HA遺伝子と順方向にワクシニアウイルスプロモ
ーターが挿入されたプラスミドpHASEを得た。該プ
ラスミドのマルチクローニングサイトに挿入されたDN
A断片はデュポン社製蛍光シークエンサーGENESIS 20
00システムを用いて、配列を決定した。決定されたD
NA配列は該プラスミドのマルチクローニングサイトの
SalIサイトからHindIIIまでを配列表の配列
番号30に示す。
【0053】次に、HCV遺伝子の5’端からコア蛋白
遺伝子までをPCR法で増幅した。即ち、欧州公開特許
公報第518313号に記載の実施例28の〔2〕、ク
ローンT7N119のDNA5ng、10×PCR緩衝
液(100mM Tris−HCl、pH8.3、50
0mM KCl、15mM MgCl2 、1%ゼラチ
ン) 10μl、1.25mM 4dNTP 16μ
l、合成DNA5’d(CGAAGCTTGCCAGC
CCCCTGATGGG)3′(配列表の配列番号2
8)及び5′d(CCGGATCCCGGAAGCTG
GGATGGTCAAC)3′(配列表の配列番号2
9)各(20μM)5μl、に水を加えて合計が100
μlになるようにして、まず95℃に5分間保温後、0
℃に急冷した。1分後、Taq DNAポリメラーゼ
(7ユニット/μl、AmpliTaqTM宝酒造社製)0.5μ
lを加え混和後、ミネラルオイルを重層した。このサン
プルを、パーキン エルマー シータス社製のDNA
Thermal Cyclerで95℃1分、58℃1分、72℃1分
で30回処理した。最後に72℃で7分保温した後、こ
の反応水溶液をフェノール/クロロホルム処理、エタノ
ール沈殿を行い、910bpの増幅DNA断片を得、制
限酵素HindIII及びBamHIで消化した後、5
%アクリルアミドゲルで精製し、ルシフェラーゼアッセ
イ用のピッカジーンTMカセットベクター(東洋インキ製
造株式会社)のHindIII及びBamHIサイトに
挿入した。ミニスクリーニングによりルシフェラーゼ遺
伝子の上流にC型肝炎ウイルス遺伝子の5’端からコア
蛋白遺伝子までが順方向に挿入されたプラスミドpCS
5CLを得た。
【0054】次に、プラスミドpCS5CLを制限酵素
EcoRIで部分消化後、制限酵素HindIIIで完
全消化し、2.6kbp断片をアガロースゲルより切り
出し精製した。この断片をプラスミドpHASEのHi
dIII及びEcoRIサイトに挿入し、ミニスクリ
ーニングによりワクシニアウイルスHA蛋白遺伝子中に
ワクシニアウイルスプロモーター、HCV遺伝子の5’
端からコア蛋白遺伝子、ルシフェラーゼ遺伝子の順に並
んだプラスミドpHA5CLを得た。
【0055】〔2〕組換えワクシニアウイルスrVV5
CLの作製 アフリカミドリザル腎由来細胞CV−1(理化学研究所
細胞開発銀行RCB0160)を3.5cmシャーレに
セミコンフルエントに培養したものに、ワクシニアウイ
ルスLC16m0株(臨床とウイルス,3(3),22
9−235,1975)をMOI(multiplic
ity of infection)=0.1PFU/
Cellで1時間室温で吸着させた。また、〔1〕で作
製したプラスミドpHA5CLを、Maniatisら
の方法(「モレキュラ・クローニング」、コールド・ス
プリング・ハーバー・ラボラトリー、86頁〜96頁
(1982))に従い組換え大腸菌から回収、精製しト
ランスファーベクターpHA5CLDNAを大量に得
た。このようにして得たpHA5CLDNA10μgを
リポフェクチン(Lipofectin、ライフテクノ
ロジー社製)30μlとOpti−MEM培地(ライフ
テクノロジー社製)170μl中で混合し、室温で10
分静置しトランスフェクション液とした。
【0056】次にシャーレからウイルス液を除き、Op
ti−MEM培地で細胞を2回洗浄した後、先述のDN
Aを混合したトランスフェクション液にOpti−ME
M800μlを加えたものをシャーレに入れ、37℃、
5%CO2 インキュベーターで培養した。4時間後培地
を除き10%ウシ胎児血清を含むMEM培地をシャーレ
に加えた。さらに、2日間37℃、5%CO2 インキュ
ベーターで培養した後、この感染細胞を3回凍結融解
し、ウイルスを回収した。
【0057】このウイルス液には1mlあたり約108
個のウイルスが含まれており、またそのうちの約0.1
%が組換え体である。組換えウイルスを単離するために
プラーク単離法を用いた。その方法は以下の通りであ
る。ウイルス液を105 倍に希釈した。予め10cmシ
ャーレに1枚当り2×106 個のウサギ腎由来細胞RK
−13(理化学研究所細胞開発銀行RCB0183)細
胞をまき、培養したものを用意し、培地を完全に除いた
後、105 倍に希釈した液を一枚のシャーレあたりそれ
ぞれ1mlずつ加えた。細胞の乾燥を防ぐため、シャー
レを15分おきに傾けてウイルス液が全面に行き渡るよ
うにした。このようにして室温で1時間ウイルスを吸着
させた後、2%ウシ胎児血清を含むMEM培地をシャー
レに加え、37℃、5%CO2 インキュベーターで培養
した。
【0058】2日後、培地を除きウイルス液を完全に吸
い取り、1%ニワトリ赤血球液をシャーレ1枚あたり3
mlずつ静かに加え室温で1時間吸着させた後、完全に
吸い取った。ニワトリ赤血球を吸着しないプラークをチ
ップで吸い取り、1mlPBS中でピペッテイングして
組換えウイルスを浮遊させた。これら一連の操作(感染
させてから、2日間培養し該組換えウイルスを単離する
操作)をプラーク純化法と呼ぶ。該ウイルス浮遊液2μ
lをとり同様のプラーク純化法を行った。これら一連の
操作を3回繰り返して野性株の混入のないHCV由来遺
伝子とルシフェラーゼ遺伝子を持つ組換えウイルスrV
V5CLを得た。
【0059】〔3〕組換えワクシニアウイルスrVV5
CLによるC型肝炎ウイルス遺伝子とルシフェラーゼ遺
伝子の発現 24wellプレートに約60%コンフレントにヒト肝
臓細胞由来WRL68(ヒト胎児肝細胞,ATCC C
L68)を10%ウシ胎児血清を含むTS−2培地で培
養したものに組換えワクシニアウイルスrVV5CLを
2%ウシ胎児血清含むPBSに均一に混和し、MOI=
4PFU/Cellで1時間室温で吸着させた。その
後、Opti−MEM培地500μlで2回洗浄し、O
pti−MEM培地500μlを加えて16時間、37
℃、5%CO2 インキュベーターで培養した。その後、
培地を除き、前述のSDSローディングバッファー10
0μlを加えて、感染細胞を溶解後、20μlを常法に
従い、煮沸し、12.5%SDS−PAGEで電気泳動
した。その後、常法に従い、ニトロセルロースフィルタ
ーにウェスタンブロッティングし、欧州公開特許公報第
518313号に記載の実施例と同様な方法で抗HCV
コア抗体を用いて発色させた。結果を図1に示す。この
結果からも分かるように、約22KDaのHCVコア蛋
白がメインのバンドとして検出され、感染細胞内では、
発現されたHCVコア蛋白とルシフェラーゼ蛋白の融合
蛋白が細胞内シグナルペプチダーゼによりHCVコア蛋
白のC末端に存在するシグナル配列を認識してプロセッ
シングを行ったことを示している。また、22KDaよ
り高分子量の蛋白として検出されたバンドは、該融合蛋
白遺伝子で組換わってない、ワイルドタイプのワクシニ
アウイルスで感染させた細胞を並べて電気泳動させ、同
じ抗体で同様に発色させているにもかかわらず何も検出
されないことから、プロセッシングが十分されていない
該融合蛋白であろうと予想される。すなわち、ここで検
出されたバンドは組換えワクシニアウイルスrVV5C
Lが細胞内で発現させたHCVコア蛋白とルシフェラー
ゼ蛋白の融合蛋白由来であろうと予想できる。
【0060】また、該感染細胞内でのルシフェラーゼ蛋
白の発現の検出として、東洋インキ製造株式会社より販
売されているピッカジーンキット付属の細胞溶解液と基
質発色液を使用した。即ち、前述のように、培養された
感染細胞へSDSローディングバッファーの代わりに該
細胞溶解液を500μl入れ、室温で30分放置後、該
基質発色液80μlへ5μlを混和し、10秒後に、ベ
ルトールドジャパン社製MULTI−BIOLUMAT
LB9505Cで測定した。その結果、感染させてな
い細胞(バックグラウンド)に比して細胞溶解液5μl
あたり約105以上の酵素量は発現していることが分か
った。
【0061】実施例2 ハイブリッド化合物による細胞
内でのHCV遺伝子の翻訳阻害効果 〔1〕ハイブリッド化合物の合成と調製 前述したように、HCV遺伝子のIRES領域は5’U
TR領域に存在する。そこで、配列表の配列番号1に記
載の塩基番号で27番目のチミンから始まり401番目
のシトシンまでの領域の中で、特にピリミジン(シトシ
ン)リッチな領域を対象として、ハイブリッド化合物で
ハイブリット形成させたい領域を指定し、指定された塩
基配列より決定される相補鎖の配列をハイブリッド オ
リゴヌクレオチドの配列とした。
【0062】ハイブリッド化合物は、前述の参考例3に
記載の方法に従って合成した。該ハイブリッド化合物
は、超純水(ミリポア社製のMilli−XQを使用。
約18.3MΩ・cmの水)をオートクレーブした滅菌
水に溶かした。濃度は、波長260nmでの吸光度によ
り得られた値をnearest−neighbor法
(Methods in Enzymology,19
89,ACADEMIC PRESS,vol.18
0,304−325)で定量した。更に、ミリポア社製
UFC3 OGVOSを用いて滅菌された。調製したハ
イブリッド化合物の配列は、以下の通りである。
【0063】
【表2】 名称 長さ(mer) 配列(左から順に5’末端から3’末端) SMS38 20 GGGGGGGGGGGGGGGGGGGG (配列表の配列番号7) また対照として、以下のハイブリッド化合物も調製し
た。
【0064】
【表3】 SMS39 20 AAAAAAAAAAAAAAAAAAAA (配列表の配列番号18) SMS41 20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT (配列表の配列番号19) なお、上記表2および表3に示した塩基間のリン酸ジエ
ステル結合は、すべてホスホロチオエート型で合成し
た。
【0065】〔2〕ハイブリッド化合物による細胞内で
のHCV由来蛋白の翻訳阻害測定系 24wellプレートに約60%コンフルエントのヒト
肝臓細胞由来WRL68を10%ウシ胎児血清を含むT
S−2培地で培養したものに組換えワクシニアウイルス
rVV5CLを2%ウシ胎児血清含むPBSに均一に混
和し、MOI=0.01PFU/Cellで1時間室温
で吸着させた。その後、すぐにOpti−MEM培地5
00μlで2回洗浄し、ハイブリッド化合物を添加した
Opti−MEM培地500μlを加えて16時間、3
7℃、5%CO2 インキュベーターで培養した。実施例
1の〔3〕で記述したように、感染細胞は培地を除いた
後、ピッカジーン細胞溶解液500μlを加え、室温で
30分放置され、よく混和された後、該基質発色液80
μlへ8μlを混和し、10秒後に、ベルトールドジャ
パン社製MULTI−BIOLUMAT LB9505
Cで27℃、2.5分間、測定した。検量線を書くため
に、1%BSAを含むPBSで希釈されたルシフェラー
ゼを10-15 、10-16 、10-17 、10-18 、10
-19 mol/μlに調製しスタンダード試薬として用い
た。このスタンダード試薬を上記のように該基質発色液
80μlへ8μlを混和し、測定した。
【0066】スタンダード試薬のルシフェラーゼ濃度の
常用対数とその測定値(蛍光の積算値)の常用対数が1
次関数として直線に乗るので、これを検量線とした。感
染細胞中に発現されたルシフェラーゼの量は、測定値
(蛍光の積算値)に対応する蛋白量を検量線から求め
た。このようにして得られたルシフェラーゼの量は、H
CV由来コア蛋白とルシフェラーゼの融合蛋白遺伝子か
らの該融合蛋白発現量として評価した。
【0067】該遺伝子のIRESの予測には、5’非翻
訳領域からHCV遺伝子のエンベローブ1領域付近(配
列表の配列番号1に示す塩基番号で1から1200番に
相当する)のRNAの配列から2次構造を解析プログラ
ムFOLD(UWGCG Software,Uni
v.Wisconsin)によって解析し、参考にし
た。
【0068】結果を図2に示す。これらのハイブリッド
化合物は、感染細胞の培地に最終濃度が5μM、1μ
M、0.5μM、0.25μMとなるような条件で添加
した。1回に全く同じ条件で細胞に感染させ、アッセイ
できる検体数には限りがあるので、1度に用意した24
wellプレートの枚数は、操作上、実験条件がずれな
い程度の範囲を考慮して、最大6プレートとした。ハイ
ブリッド化合物の濃度の種類数は、このことからも制限
されたので、毎回必ずハイブリッド化合物を入れないウ
ェル(標準は4ウェル)を作り、また効果のない対照の
化合物(前記表2)も対象として必ず入れて指標とし
た。細胞密度やインフェクション時間、インフェクショ
ン後の培養時間の条件において若干異なったが、5μM
で行った実験においては、SMS38についてのルシフ
ェラーゼの発現量が、効果の殆どない化合物(SMS3
9およびSMS41)に対して約5分の1にまで減少さ
せた。また、SMS38においては、用量依存的にルシ
フェラーゼの発現量を減少させることも確認された。
【0069】
【配列表】
配列番号:1 配列の長さ:2033 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 アンチセンス:No トポロジー:直鎖状 起源:Hepatitis C virus 直接の起源 クローン名:T7N1-19 配列 ACTAGTTAAT ACGACTCACT ATAGGGTGCC AGCCCCCTGA TGGGGGCGAC ACTCCACCAT 60 AGATCACTCC CCTGTGAGGA ACTACTGTCT TCACGCAGAA AGCGTCTAGC CATGGCGTTA 120 GTATGAGTGT CGTGCAGCCT CCAGGACCCC CCCTCCCGGG AGAGCCATAG TGGTCTGCGG 180 AACCGGTGAG TACACCGGAA TTGCCAGGAC GACCGGGTCC TTTCTTGGAT CAACCCGCTC 240 AATGCCTGGA GATTTGGGCG TGCCCCCGCG AGACTGCTAG CCGAGTAGTG TTGGGTCGCG 300 AAAGGCCTTG TGGTACTGCC TGATAGGGTG CTTGCGAGTG CCCCGGGAGG TCTCGTAGAC 360 CGTGCATC ATG AGC ACA AAT CCA AAA CCC CAA AGA AAA ATC AAA CGT AAC 410 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg Lys Ile Lys Arg Asn 1 5 10 ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG GGC GGT GGT CAG ATC 458 Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro Gly Gly Gly Gln Ile 15 20 25 30 GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC CCC AGG TTG GGT GTG 506 Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly Pro Arg Leu Gly Val 35 40 45 CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG CCG CAA CCT CGT GGA AGG CGA 554 Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Pro Gln Pro Arg Gly Arg Arg 50 55 60 CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAA CCC GAG GGT AGG GCC TGG GCT CAG 602 Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly Arg Ala Trp Ala Gln 65 70 75 CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG GGC TTG GGG TGG GCA 650 Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu Gly Leu Gly Trp Ala 80 85 90 GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT AGT TGG GGC CCC ACG 698 Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro Ser Trp Gly Pro Thr 95 100 105 110 GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG GTC ATC GAT ACC CTC 746 Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys Val Ile Asp Thr Leu 115 120 125 ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT CCG CTC GTC GGC GCC 794 Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile Pro Leu Val Gly Ala 130 135 140 CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCT CTA GCG CAT GGC GTC CGG GTT CTG 842 Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His Gly Val Arg Val Leu 145 150 155 GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT CTG CCT GGT TGC TCC TTT 890 Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu Pro Gly Cys Ser Phe 160 165 170 TCT ATC TTC CTT TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG ACC ATC CCA GCT TCC 938 Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu Thr Ile Pro Ala Ser 175 180 185 190 GCC TAC CAA GTG CGC AAC GCG TCC GGG GTG TAC CAT GTC ACG AAC GAC 986 Ala Tyr Gln Val Arg Asn Ala Ser Gly Val Tyr His Val Thr Asn Asp 195 200 205 TGC TCC AAC TCA AGT ATT GTG TAT GAG GCG GCG GAC GTG ATT ATG CAC 1034 Cys Ser Asn Ser Ser Ile Val Tyr Glu Ala Ala Asp Val Ile Met His 210 215 220 ACC CCC GGG TGC GTG CCC TGC GTC CGG GAG AAC AAT TCC TCC CGC TGC 1082 Thr Pro Gly Cys Val Pro Cys Val Arg Glu Asn Asn Ser Ser Arg Cys 225 230 235 TGG GTA GCG CTC ACT CCC ACG CTT GCG GCC AGG AAC AGC AGC ATC CCC 1130 Trp Val Ala Leu Thr Pro Thr Leu Ala Ala Arg Asn Ser Ser Ile Pro 240 245 250 ACT ACG ACA ATA CGG CGT CAT GTC GAC TTG CTC GTT GGG GCA GCT GCT 1178 Thr Thr Thr Ile Arg Arg His Val Asp Leu Leu Val Gly Ala Ala Ala 255 260 265 270 CTC TGT TCC GCT ATG TAT GTG GGG GAT TTT TGC GGA TCT GTT TTC CTC 1226 Leu Cys Ser Ala Met Tyr Val Gly Asp Phe Cys Gly Ser Val Phe Leu 275 280 285 GTC TCC CAG CTG TTC ACT TTC TCA CCT CGC CGG TAT GAG ACG GTG CAA 1274 Val Ser Gln Leu Phe Thr Phe Ser Pro Arg Arg Tyr Glu Thr Val Gln 290 295 300 GAC TGC AAT TGC TCA ATC TAT CCC GGC CAT GTA TCA GGC CAT CGC ATG 1322 Asp Cys Asn Cys Ser Ile Tyr Pro Gly His Val Ser Gly His Arg Met 305 310 315 GCT TGG GAT ATG ATA ATG AAT TGG TCA CCT ACA ACA GCC CTA GTG GTA 1370 Ala Trp Asp Met Ile Met Asn Trp Ser Pro Thr Thr Ala Leu Val Val 320 325 330 TCG CAG CTA CTC CGG ATC CCA CAA GCC GTG GTG GAT ATG GTG GCA GGG 1418 Ser Gln Leu Leu Arg Ile Pro Gln Ala Val Val Asp Met Val Ala Gly 335 340 345 350 GCC CAC TGG GGA GTC CTG GCG GGC CTT GCC TAC TAT TCC ATG GTG GGG 1466 Ala His Trp Gly Val Leu Ala Gly Leu Ala Tyr Tyr Ser Met Val Gly 355 360 365 AAC TGG GCT AAG GTC TTG GTT GTG ATG CTG CTC TTC GCC GGT GTT GAC 1514 Asn Trp Ala Lys Val Leu Val Val Met Leu Leu Phe Ala Gly Val Asp 370 375 380 GGG GGG ACC CAC GTG ACA GGG GGG AAG GTA GCC TAC ACC ACC CAG GGC 1562 Gly Gly Thr His Val Thr Gly Gly Lys Val Ala Tyr Thr Thr Gln Gly 385 390 395 TTT ACA TCC TTC TTT TCA CGA GGG CCG TCT CAG AAA ATC CAA CTT GTA 1610 Phe Thr Ser Phe Phe Ser Arg Gly Pro Ser Gln Lys Ile Gln Leu Val 400 405 410 AAC ACT AAC GGC AGC TGG CAC ATC AAT AGG ACT GCC CTC AAT TGC AAT 1658 Asn Thr Asn Gly Ser Trp His Ile Asn Arg Thr Ala Leu Asn Cys Asn 415 420 425 430 GAC TCC CTT AAC ACC GGG TTC CTT GCC GCG CTG TTC TAC ACC CAC AGC 1706 Asp Ser Leu Asn Thr Gly Phe Leu Ala Ala Leu Phe Tyr Thr His Ser 435 440 445 TTC AAC GCG TCC GGA TGT CCG GAG CGT ATG GCC GGT TGC CGC CCC ATT 1754 Phe Asn Ala Ser Gly Cys Pro Glu Arg Met Ala Gly Cys Arg Pro Ile 450 455 460 GAC GAG TTC GCT CAG GGG TGG GGT CCC ATC ACT CAT GTT GTG CCT AAC 1802 Asp Glu Phe Ala Gln Gly Trp Gly Pro Ile Thr His Val Val Pro Asn 465 470 475 ATC TCG GAC CAG AGG CCC TAT TGC TGG CAC TAC GCG CCT CGA CCG TGT 1850 Ile Ser Asp Gln Arg Pro Tyr Cys Trp His Tyr Ala Pro Arg Pro Cys 480 485 490 GGT ATC GTA CCC GCG TCG CAG GTG TGT GGT CCG GTG TAT TGC TTC ACC 1898 Gly Ile Val Pro Ala Ser Gln Val Cys Gly Pro Val Tyr Cys Phe Thr 495 500 505 510 CCA AGC CCT GTT GTG GTG GGG ACG ACC GAT CGT TTC GGC GCC CCC ACG 1946 Pro Ser Pro Val Val Val Gly Thr Thr Asp Arg Phe Gly Ala Pro Thr 515 520 525 TAC AAC TGG GGA AAC AAT GAG ACG GAT GTG CTA CTC CTC AAC AAC ACA 1994 Tyr Asn Trp Gly Asn Asn Glu Thr Asp Val Leu Leu Leu Asn Asn Thr 530 535 540 CGG CCG CCG CAG GGC AAC TGG TTC GGT TGT ACC TGG ATG 2033 Arg Pro Pro Gln Gly Asn Trp Phe Gly Cys Thr Trp Met 545 550 555
【0070】配列番号:2 配列の長さ:15 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGG 15
【0071】配列番号:3 配列の長さ:16 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGG 16
【0072】配列番号:4 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGG 17
【0073】配列番号:5 配列の長さ:18 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGG 18
【0074】配列番号:6 配列の長さ:19 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGG 19
【0075】配列番号:7 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG 20
【0076】配列番号:8 配列の長さ:21 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG G 21
【0077】配列番号:9 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GG 22
【0078】配列番号:10 配列の長さ:23 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGG 23
【0079】配列番号:11 配列の長さ:24 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGG 24
【0080】配列番号:12 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGG 25
【0081】配列番号:13 配列の長さ:26 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGG 26
【0082】配列番号:14 配列の長さ:27 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGG 27
【0083】配列番号:15 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGG 28
【0084】配列番号:16 配列の長さ:29 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGG 29
【0085】配列番号:17 配列の長さ:30 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG GGGGGGGGGG 30
【0086】配列番号:18 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA 20
【0087】配列番号:19 配列の長さ:20 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 アンチセンス:Yes トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 配列 TTTTTTTTTT TTTTTTTTTT 20
【0088】配列番号:20 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17
【0089】配列番号:21 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【0090】配列番号:22 配列の長さ:16 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CAGATCTGCA AGCTTG 16
【0091】配列番号:23 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CAGGAAACAG CTATGAC 17
【0092】配列番号:24 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GAATAGTTTT TCAATTTTTA CG 22
【0093】配列番号:25 配列の長さ:22 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CGTAAAAATT GAAAAACTAT TC 22
【0094】配列番号:26 配列の長さ:17 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GTAAAACGAC GGCCAGT 17
【0095】配列番号:27 配列の長さ:40 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 GATCCAAAAA TTGAAAAACT AGTCTAATTT ATTGCACGGA 40 GTTTTT AACTTTTTGA TCAGATTAAA TAACGTGCCT CTAG
【0096】配列番号:28 配列の長さ:25 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CGAAGCTTGC CAGCCCCCTG ATGGG 25
【0097】配列番号:29 配列の長さ:28 配列の型:核酸 鎖の数:一本鎖 トポロジー:直鎖状 配列の種類:他の核酸 合成DNA 配列 CCGGATCCCG GAAGCTGGGA TGGTCAAC 28
【0098】配列番号:30 配列の長さ:2360 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 起源:Vaccinia virus 直接の起源:pHASE 配列 TCGACGATTG TTCATGATGG CAAGATTTAT ATATCTGGAG GTTACAACAA TAGTAGTGTA 60 GTTAATGTAA TATCGAATCT AGTCCTTAGC TATAATCCGA TATATGATGA ATGGACCAAA 120 TTATCATCAT TAAACATTCC TAGAATTAAT CCCGCTCTAT GGTCAGCGCA TAATAAATTA 180 TATGTAGGAG GAGGAATATC TGATGATGTT CGAACTAATA CATCTGAAAC ATACGATAAA 240 GAAAAAGATT GTTGGACATT GGATAATGGT CACGTGTTAC CACGCAATTA TATAATGTAT 300 AAATGCGAAC CGATTAAACA TAAATATCCA TTGGAAAAAA CACAGTACAC GAATGATTTT 360 CTAAAGTATT TGGAAAGTTT TATAGGTAGT TGATAGAACA AAATACATAA TTTTGTAAAA 420 ATAAATCACT TTTTATACTA ATATGACACG ATTACCAATA CTTTTGTTAC TAATATCATT 480 AGTATACGCT ACACCTTTTC CTCAGACATC TAAAAAAATA GGTGATGATG CAACTCTATC 540 ATGTAATCGA AATAATACAA ATGACTACGT TGTTATGAGT GCTTGGTATA AGGAGCCCAA 600 TTCCATTATT CTTTTAGCTG CTAAAAGCGA CGTCTTGTAT TTTGATAATT ATACCAAGGA 660 TAAAATATCT TACGACTCTC CATACGATGA TCTAGTTACA ACTATCACAA TTAAATCATT 720 GACTGCTAGA GATGCCGGTA CTTATGTATG TGCATTCTTT ATGACATCAA CTACAAATGA 780 CACTGATAAA GTAGATTATG AAGAATACTC CACAGAGTTG ATTGTAAATA CAGATAGTGA 840 ATCGACTATA GACATAATAC TATCTGGATC TACACATTCA CCAGAAACTA GCTAGTTCTG 900 AGAAACCAGA GGATATAGAT AATTTTAATT GCTCGTCGGT ATTCGAAATC GGGTCGACAT 960 CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA ACTGATACAA TCTCTTATCA 1020 TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGATAGCCA TATGCCCGGT AGTTGCGATA TACATAAACT 1080 GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCACTTTTT ATAGTAAGTT TTTCACCCAT AAATAATAAA 1140 TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAATTGAA AAACTATTCT AATTTATTGC ACGGTAAGGA 1200 AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACTCTAGA GGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1260 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1320 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1380 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1440 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCTGCAA GCTTGGGGTA CCGAGCTCGA 1500 ATTCGACTCC GGAACCAATT ACTGATAATG TAGAAGATCA TACAGACACC GTCACATACA 1560 CTAGCTAGTG ATAGCATTAA TACAGTAAGT GCATCATCTG GAGAATCCAC AACAGACGAG 1620 ACTCCGGAAC CAATTACTGA TAAAGAAGAA GATCATACAG TCACAGACAC TGTCTCATAC 1680 ACTACAGTAA GTACATCATC TGGAATTGTC ACTACTAAAT CAACCACCGA TGATGCGGAT 1740 CTTTATGATA CGTACAATGA TAATGATACA GTACCACCAA CTACTGTAGG CGGTAGTACA 1800 ACCTCTATTA GCAATTATAA AACCAAGGAC TTTGTAGAAA TATTTGGTAT TACCGCATTA 1860 ATTATATTGT CGGCCGTGGC AATATTCTGT ATTACATATT ATATATATAA TAAACGTTCA 1920 CGTAAATACA AAACAGAGAA CAAAGTCTAG ATTTTTGACT TACATAAATG TCTGGGATAG 1980 TAAAATCTAT CATATTGAGC GGACCATCTG GTTCAGGAAA GACAGCCATA GCCAAAAGAC 2040 TATGGGAATA TATTTGGATT TGTGGTGTCC CATACCACTA GATTTCCTCG TCCTATGGAA 2100 CGAGAAGGTG TCGATTACCA TTACGTTAAC AGAGAGGCCA TCTGGAAGGG AATAGCCGCC 2160 GGAAACTTTC TAGAACATAC TGAGTTTTTA GGAAATATTT ACGGAACTTC TAAAACTGCT 2220 GTGAATACAG CGGCTATTAA TAATCGTATT TGTGTGATGG ATCTAAACAT CGATGGCGTT 2280 AGAAGTCTTA AAAATACGTA CCTAATGCCT TACTCGGTGT ATATAAGACC TACCTCTCTT 2340 AAAATGGTTG AGACCAAGCT 2360
【0099】配列番号:31 配列の長さ:4987 配列の型:核酸 鎖の数:二本鎖 トポロジー:直鎖状 起源:Vaccinia virus, Hepatitis C virus, Firefly
luciferase gene 直接の起源:pHA5CL 配列 TCGACGATTG TTCATGATGG CAAGATTTAT ATATCTGGAG GTTACAACAA TAGTAGTGTA 60 GTTAATGTAA TATCGAATCT AGTCCTTAGC TATAATCCGA TATATGATGA ATGGACCAAA 120 TTATCATCAT TAAACATTCC TAGAATTAAT CCCGCTCTAT GGTCAGCGCA TAATAAATTA 180 TATGTAGGAG GAGGAATATC TGATGATGTT CGAACTAATA CATCTGAAAC ATACGATAAA 240 GAAAAAGATT GTTGGACATT GGATAATGGT CACGTGTTAC CACGCAATTA TATAATGTAT 300 AAATGCGAAC CGATTAAACA TAAATATCCA TTGGAAAAAA CACAGTACAC GAATGATTTT 360 CTAAAGTATT TGGAAAGTTT TATAGGTAGT TGATAGAACA AAATACATAA TTTTGTAAAA 420 ATAAATCACT TTTTATACTA ATATGACACG ATTACCAATA CTTTTGTTAC TAATATCATT 480 AGTATACGCT ACACCTTTTC CTCAGACATC TAAAAAAATA GGTGATGATG CAACTCTATC 540 ATGTAATCGA AATAATACAA ATGACTACGT TGTTATGAGT GCTTGGTATA AGGAGCCCAA 600 TTCCATTATT CTTTTAGCTG CTAAAAGCGA CGTCTTGTAT TTTGATAATT ATACCAAGGA 660 TAAAATATCT TACGACTCTC CATACGATGA TCTAGTTACA ACTATCACAA TTAAATCATT 720 GACTGCTAGA GATGCCGGTA CTTATGTATG TGCATTCTTT ATGACATCAA CTACAAATGA 780 CACTGATAAA GTAGATTATG AAGAATACTC CACAGAGTTG ATTGTAAATA CAGATAGTGA 840 ATCGACTATA GACATAATAC TATCTGGATC TACACATTCA CCAGAAACTA GCTAGTTCTG 900 AGAAACCAGA GGATATAGAT AATTTTAATT GCTCGTCGGT ATTCGAAATC GGGTCGACAT 960 CTATATACTA TATAGTAATA CCAATACTCA AGACTACGAA ACTGATACAA TCTCTTATCA 1020 TGTGGGTAAT GTTCTCGATG TCGATAGCCA TATGCCCGGT AGTTGCGATA TACATAAACT 1080 GATCACTAAT TCCAAACCCA CCCACTTTTT ATAGTAAGTT TTTCACCCAT AAATAATAAA 1140 TACAATAATT AATTTCTCGT AAAAATTGAA AAACTATTCT AATTTATTGC ACGGTAAGGA 1200 AGTAGAATCA TAAAGAACAG TGACTCTAGA GGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1260 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1320 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT 1380 TATTGCACGG AGATCCAAAA ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCCAAAA 1440 ATTGAAAAAC TAGTCTAATT TATTGCACGG AGATCTGCAA GCTTGCCAGC CCCCTGATGG 1500 GGGCGACACT CCACCATAGA TCACTCCCCT GTGAGGAACT ACTGTCTTCA CGCAGAAAGC 1560 GTCTAGCCAT GGCGTTAGTA TGAGTGTCGT GCAGCCTCCA GGACCCCCCC TCCCGGGAGA 1620 GCCATAGTGG TCTGCGGAAC CGGTGAGTAC ACCGGAATTG CCAGGACGAC CGGGTCCTTT 1680 CTTGGATCAA CCCGCTCAAT GCCTGGAGAT TTGGGCGTGC CCCCGCGAGA CTGCTAGCCG 1740 AGTAGTGTTG GGTCGCGAAA GGCCTTGTGG TACTGCCTGA TAGGGTGCTT GCGAGTGCCC 1800 CGGGAGGTCT CGTAGACCGT GCATC ATG AGC ACA AAT CCA AAA CCC CAA AGA 1852 Met Ser Thr Asn Pro Lys Pro Gln Arg 1 5 AAA ATC AAA CGT AAC ACC AAC CGC CGC CCA CAG GAC GTT AAG TTC CCG 1900 Lys Ile Lys Arg Asn Thr Asn Arg Arg Pro Gln Asp Val Lys Phe Pro 10 15 20 25 GGC GGT GGT CAG ATC GTT GGT GGA GTT TAC CTG TTG CCG CGC AGG GGC 1948 Gly Gly Gly Gln Ile Val Gly Gly Val Tyr Leu Leu Pro Arg Arg Gly 30 35 40 CCC AGG TTG GGT GTG CGC GCG ACT AGG AAG ACT TCC GAG CGG CCG CAA 1996 Pro Arg Leu Gly Val Arg Ala Thr Arg Lys Thr Ser Glu Arg Pro Gln 45 50 55 CCT CGT GGA AGG CGA CAA CCT ATC CCC AAG GCT CGC CAA CCC GAG GGT 2044 Pro Arg Gly Arg Arg Gln Pro Ile Pro Lys Ala Arg Gln Pro Glu Gly 60 65 70 AGG GCC TGG GCT CAG CCC GGG TAC CCT TGG CCC CTC TAT GGC AAT GAG 2092 Arg Ala Trp Ala Gln Pro Gly Tyr Pro Trp Pro Leu Tyr Gly Asn Glu 75 80 85 GGC TTG GGG TGG GCA GGA TGG CTC CTG TCA CCC CGC GGC TCC CGG CCT 2140 Gly Leu Gly Trp Ala Gly Trp Leu Leu Ser Pro Arg Gly Ser Arg Pro 90 95 100 105 AGT TGG GGC CCC ACG GAC CCC CGG CGT AGG TCG CGT AAT TTG GGT AAG 2188 Ser Trp Gly Pro Thr Asp Pro Arg Arg Arg Ser Arg Asn Leu Gly Lys 110 115 120 GTC ATC GAT ACC CTC ACA TGC GGC TTC GCC GAC CTC ATG GGG TAC ATT 2236 Val Ile Asp Thr Leu Thr Cys Gly Phe Ala Asp Leu Met Gly Tyr Ile 125 130 135 CCG CTC GTC GGC GCC CCC CTA GGG GGC GCT GCC AGG GCT CTA GCG CAT 2284 Pro Leu Val Gly Ala Pro Leu Gly Gly Ala Ala Arg Ala Leu Ala His 140 145 150 GGC GTC CGG GTT CTG GAG GAC GGC GTG AAC TAT GCA ACA GGG AAT CTG 2332 Gly Val Arg Val Leu Glu Asp Gly Val Asn Tyr Ala Thr Gly Asn Leu 155 160 165 CCT GGT TGC TCC TTT TCT ATC TTC CTT TTG GCT TTG CTG TCC TGT TTG 2380 Pro Gly Cys Ser Phe Ser Ile Phe Leu Leu Ala Leu Leu Ser Cys Leu 170 175 180 185 ACC ATC CCA GCT TCC GGG ATC CAA ATG GAA GAC GCC AAA AAC ATA AAG 2428 Thr Ile Pro Ala Ser Gly Ile Gln Met Glu Asp Ala Lys Asn Ile Lys 190 195 200 AAA GGC CCG GCG CCA TTC TAT CCT CTA GAG GAT GGA ACC GCT GGA GAG 2476 Lys Gly Pro Ala Pro Phe Tyr Pro Leu Glu Asp Gly Thr Ala Gly Glu 205 210 215 CAA CTG CAT AAG GCT ATG AAG AGA TAC GCC CTG GTT CCT GGA ACA ATT 2524 Gln Leu His Lys Ala Met Lys Arg Tyr Ala Leu Val Pro Gly Thr Ile 220 225 230 GCT TTT ACA GAT GCA CAT ATC GAG GTG AAC ATC ACG TAC GCG GAA TAC 2572 Ala Phe Thr Asp Ala His Ile Glu Val Asn Ile Thr Tyr Ala Glu Tyr 235 240 245 TTC GAA ATG TCC GTT CGG TTG GCA GAA GCT ATG AAA CGA TAT GGG CTG 2620 Phe Glu Met Ser Val Arg Leu Ala Glu Ala Met Lys Arg Tyr Gly Leu 250 255 260 265 AAT ACA AAT CAC AGA ATC GTC GTA TGC AGT GAA AAC TCT CTT CAA TTC 2668 Asn Thr Asn His Arg Ile Val Val Cys Ser Glu Asn Ser Leu Gln Phe 270 275 280 TTT ATG CCG GTG TTG GGC GCG TTA TTT ATC GGA GTT GCA GTT GCG CCC 2716 Phe Met Pro Val Leu Gly Ala Leu Phe Ile Gly Val Ala Val Ala Pro 285 290 295 GCG AAC GAC ATT TAT AAT GAA CGT GAA TTG CTC AAC AGT ATG AAC ATT 2764 Ala Asn Asp Ile Tyr Asn Glu Arg Glu Leu Leu Asn Ser Met Asn Ile 300 305 310 TCG CAG CCT ACC GTA GTG TTT GTT TCC AAA AAG GGG TTG CAA AAA ATT 2812 Ser Gln Pro Thr Val Val Phe Val Ser Lys Lys Gly Leu Gln Lys Ile 315 320 325 TTG AAC GTG CAA AAA AAA TTA CCA ATA ATC CAG AAA ATT ATT ATC ATG 2860 Leu Asn Val Gln Lys Lys Leu Pro Ile Ile Gln Lys Ile Ile Ile Met 330 335 340 345 GAT TCT AAA ACG GAT TAC CAG GGA TTT CAG TCG ATG TAC ACG TTC GTC 2908 Asp Ser Lys Thr Asp Tyr Gln Gly Phe Gln Ser Met Tyr Thr Phe Val 350 355 360 ACA TCT CAT CTA CCT CCC GGT TTT AAT GAA TAC GAT TTT GTA CCA GAG 2956 Thr Ser His Leu Pro Pro Gly Phe Asn Glu Tyr Asp Phe Val Pro Glu 365 370 375 TCC TTT GAT CGT GAC AAA ACA ATT GCA CTG ATA ATG AAT TCC TCT GGA 3004 Ser Phe Asp Arg Asp Lys Thr Ile Ala Leu Ile Met Asn Ser Ser Gly 380 385 390 TCT ACT GGG TTA CCT AAG GGT GTG GCC CTT CCG CAT AGA ACT GCC TGC 3052 Ser Thr Gly Leu Pro Lys Gly Val Ala Leu Pro His Arg Thr Ala Cys 395 400 405 GTC AGA TTC TCG CAT GCC AGA GAT CCT ATT TTT GGC AAT CAA ATC ATT 3100 Val Arg Phe Ser His Ala Arg Asp Pro Ile Phe Gly Asn Gln Ile Ile 410 415 420 425 Pro Asp Thr Ala Ile Leu Ser Val Val
Pro Phe His His Gly Phe Gly 430 435 440 ATG TTT ACT ACA CTC GGA TAT TTG ATA TGT GGA TTT CGA GTC GTC TTA 3196 Met Phe Thr Thr Leu Gly Tyr Leu Ile Cys Gly Phe Arg Val Val Leu 445 450 455 ATG TAT AGA TTT GAA GAA GAG CTG TTT TTA CGA TCC CTT CAG GAT TAC 3244 Met Tyr Arg Phe Glu Glu Glu Leu Phe Leu Arg Ser Leu Gln Asp Tyr 460 465 470 AAA ATT CAA AGT GCG TTG CTA GTA CCA ACC CTA TTT TCA TTC TTC GCC 3292 Lys Ile Gln Ser Ala Leu Leu Val Pro Thr Leu Phe Ser Phe Phe Ala 475 480 485 AAA AGC ACT CTG ATT GAC AAA TAC GAT TTA TCT AAT TTA CAC GAA ATT 3340 Lys Ser Thr Leu Ile Asp Lys Tyr Asp Leu Ser Asn Leu His Glu Ile 490 495 500 505 GCT TCT GGG GGC GCA CCT CTT TCG AAA GAA GTC GGG GAA GCG GTT GCA 3388 Ala Ser Gly Gly Ala Pro Leu Ser Lys Glu Val Gly Glu Ala Val Ala 510 515 520 AAA CGC TTC CAT CTT CCA GGG ATA CGA CAA GGA TAT GGG CTC ACT GAG 3436 Lys Arg Phe His Leu Pro Gly Ile Arg Gln Gly Tyr Gly Leu Thr Glu 525 530 535 ACT ACA TCA GCT ATT CTG ATT ACA CCC GAG GGG GAT GAT AAA CCG GGC 3484 Thr Thr Ser Ala Ile Leu Ile Thr Pro Glu Gly Asp Asp Lys Pro Gly 540 545 550 GCG GTC GGT AAA GTT GTT CCA TTT TTT GAA GCG AAG GTT GTG GAT CTG 3532 Ala Val Gly Lys Val Val Pro Phe Phe Glu Ala Lys Val Val Asp Leu 555 560 565 GAT ACC GGG AAA ACG CTG GGC GTT AAT CAG AGA GGC GAA TTA TGT GTC 3580 Asp Thr Gly Lys Thr Leu Gly Val Asn Gln Arg Gly Glu Leu Cys Val 570 575 580 585 AGA GGA CCT ATG ATT ATG TCC GGT TAT GTA AAC AAT CCG GAA GCG ACC 3628 Arg Gly Pro Met Ile Met Ser Gly Tyr Val Asn Asn Pro Glu Ala Thr 590 595 600 AAC GCC TTG ATT GAC AAG GAT GGA TGG CTA CAT TCT GGA GAC ATA GCT 3676 Asn Ala Leu Ile Asp Lys Asp Gly Trp Leu His Ser Gly Asp Ile Ala 605 610 615 TAC TGG GAC GAA GAC GAA CAC TTC TTC ATA GTT GAC CTC TTG AAG TCT 3724 Tyr Trp Asp Glu Asp Glu His Phe Phe Ile Val Asp Leu Leu Lys Ser 620 625 630 TTA ATT AAA TAC AAA GGA TAT CAG GTG GCC CCC GCT GAA TTG GAA TCG 3772 Leu Ile Lys Tyr Lys Gly Tyr Gln Val Ala Pro Ala Glu Leu Glu Ser 635 640 645 ATA TTG TTA CAA CAC CCC AAC ATC TTC GAC GCG GGC GTG GCA GGT CTT 3820 Ile Leu Leu Gln His Pro Asn Ile Phe Asp Ala Gly Val Ala Gly Leu 650 655 660 665 CCC GAC GAT GAC GCC GGT GAA CTT CCC GCC GCC GTT GTT GTT TTG GAG 3868 Pro Asp Asp Asp Ala Gly Glu Leu Pro Ala Ala Val Val Val Leu Glu 670 675 680 CAC GGA AAG ACG ATG ACG GAA AAA GAG ATC GTG GAT TAC GTG GCC AGT 3916 His Gly Lys Thr Met Thr Glu Lys Glu Ile Val Asp Tyr Val Ala Ser 685 690 695 CAA GTA ACA ACC GCG AAA AAG TTG CGC GGA GGA GTT GTG TTT GTG GAC 3964 Gln Val Thr Thr Ala Lys Lys Leu Arg Gly Gly Val Val Phe Val Asp 700 705 710 GAA GTA CCG AAA GGT CTT ACC GGA AAA CTC GAC GCA AGA AAA ATC AGA 4012 Glu Val Pro Lys Gly Leu Thr Gly Lys Leu Asp Ala Arg Lys Ile Arg 715 720 725 GAG ATC CTC ATA AAG GCC AAG AAG GGC GGA AAG TCC AAA TTG TAA AAT 4060 Glu Ile Leu Ile Lys Ala Lys Lys Gly Gly Lys Ser Lys Leu Stop 730 735 740 GTAACTGTAT TCAGCGATGA CGAAATTCTT AGCTATTGTA ATCCTCCGAG GCCTCGAGGT 4120 CGACGAATTC CGACTCCGGA ACCAATTACT GATAATGTAG AAGATCATAC AGACACCGTC 4180 ACATACACTA GCTAGTGATA GCATTAATAC AGTAAGTGCA TCATCTGGAG AATCCACAAC 4240 AGACGAGACT CCGGAACCAA TTACTGATAA AGAAGAAGAT CATACAGTCA CAGACACTGT 4300 CTCATACACT ACAGTAAGTA CATCATCTGG AATTGTCACT ACTAAATCAA CCACCGATGA 4360 TGCGGATCTT TATGATACGT ACAATGATAA TGATACAGTA CCACCAACTA CTGTAGGCGG 4420 TAGTACAACC TCTATTAGCA ATTATAAAAC CAAGGACTTT GTAGAAATAT TTGGTATTAC 4480 CGCATTAATT ATATTGTCGG CCGTGGCAAT ATTCTGTATT ACATATTATA TATATAATAA 4540 ACGTTCACGT AAATACAAAA CAGAGAACAA AGTCTAGATT TTTGACTTAC ATAAATGTCT 4600 GGGATAGTAA AATCTATCAT ATTGAGCGGA CCATCTGGTT CAGGAAAGAC AGCCATAGCC 4660 AAAAGACTAT GGGAATATAT TTGGATTTGT GGTGTCCCAT ACCACTAGAT TTCCTCGTCC 4720 TATGGAACGA GAAGGTGTCG ATTACCATTA CGTTAACAGA GAGGCCATCT GGAAGGGAAT 4780 AGCCGCCGGA AACTTTCTAG AACATACTGA GTTTTTAGGA AATATTTACG GAACTTCTAA 4840 AACTGCTGTG AATACAGCGG CTATTAATAA TCGTATTTGT GTGATGGATC TAAACATCGA 4900 TGGCGTTAGA AGTCTTAAAA ATACGTACCT AATGCCTTAC TCGGTGTATA TAAGACCTAC 4960 CTCTCTTAAA ATGGTTGAGA CCAAGCT 4987
【図面の簡単な説明】
【図1】組換えワクシニアウイルスにより発現されたH
CVコア蛋白をウエスタンブロッティングにて検出した
結果を表す電気泳動パターンの図面である。図中、レー
ン1は組換えワクシニアウイルスrVV5CLを、レー
ン2および3はワイルドタイプのワクシニアウイルスの
結果をそれぞれ表す。
【図2】組換えワクシニアウイルスrVV5CLをWR
L68株に感染させた後に本発明の抗ウイルス剤を0.
25、0.5、1、5μMとなるように添加したとき
の、発現されたルシフェラーゼの酵素量を測定して表し
た図面である。図中、(−)とは抗ウイルス剤無添加の
場合の結果を表し、縦軸は(−)のルシフェラーゼ酵素
量(×10-20 mol/8μM)の平均値を100とし
たときの相対値を表す。
─────────────────────────────────────────────────────
【手続補正書】
【提出日】平成6年6月3日
【手続補正1】
【補正対象書類名】明細書
【補正対象項目名】図1
【補正方法】変更
【補正内容】
【図1】組換えワクシニアウイルスにより発現されたH
CVコア蛋白をウエスタンブロッティングにて検出した
結果を電気泳動パターンで表した図面に代わる写真であ
る。図中、レーン1は組換えワクシニアウイルスrVV
5CLを、レーン2および3はワイルドタイプのワクシ
ニアウイルスの結果をそれぞれ表す。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.6 識別記号 庁内整理番号 FI 技術表示箇所 // C07H 21/04 Z

Claims (5)

    【特許請求の範囲】
  1. 【請求項1】 ウイルス遺伝子のIRES領域に結合し
    て該ウイルス遺伝子の翻訳に関与するタンパク質と該ウ
    イルス遺伝子のIRES領域との結合を阻害する物質を
    有効成分とする抗ウイルス剤。
  2. 【請求項2】 IRES領域のYn −Xm ユニット(Y
    n はオリゴピリミジンを表し、Xm はランダムヌクレオ
    チドを表す)に結合してウイルス遺伝子の翻訳に関与す
    るタンパク質と該ウイルス遺伝子のIRES領域との結
    合を阻害する物質を有効成分とする、請求項1記載の抗
    ウイルス剤。
  3. 【請求項3】 Yn −Xm ユニットまたはその部分配列
    とハイブリッドを形成する化合物を有効成分とする請求
    項2に記載の抗ウイルス剤。
  4. 【請求項4】 オリゴピリミジンとハイブリッドを形成
    する化合物を有効成分とする請求項2または3に記載の
    抗ウイルス剤。
  5. 【請求項5】 ウイルス遺伝子がC型肝炎ウイルス遺伝
    子であることを特徴とする請求項1〜4のいずれかに記
    載の抗ウイルス剤。
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