JP3330595B2 - ウィルス（ｈｉｖ）増殖抑制 - Google Patents

ウィルス（ｈｉｖ）増殖抑制

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Description

【発明の詳細な説明】 発明の分野 この発明は細胞内のウィルス増殖の抑制の方法および
それにおける使用のための組成物に関するものである。
特定的には、この発明はヒト免疫不全ウィルス（HIV）
の増殖抑制に関するものである。
発明の背景 ウィルス複製中のHIVゲノムの転写は明瞭な動力学的
状態を示す（参考文献53、59、60、79を参照）。HIV遺
伝子発現の初期生産物は短く、長さ約1.8ないし2.0kbの
スプライシングされたmRNAを増殖し、これはトランス作
用性調節タンパク質tat、rev（およびおそらくnef）を
コードする。ウィルスによる感染が進み、tatおよびrev
タンパク質のレベルが感染された細胞において上昇する
に伴い、mRNA生産はenvやvifおよびvprのような他のHIV
遺伝子生産物をコードする単独にスプライシングされた
4.3kb mRNAの系統群の生産へ徐々に移行する。最後に
感染過程の末期において生産は全長のスプライシングさ
れていない転写へ切換わり、これはウィルス粒子RNAと
しても、gag−polポリプロテインのためのmRNAとしても
作用する。
この遺伝子発現制御を達成するために、HIVウィルス
は細胞性でかつウィルスによりコードされたトランス作
用性因子とシス作用性ウィルス調節配列（cis−acting
viral regulatory sequences）との相互作用に依存する
（１、３、53）。転写の開始はウィルスのLTR（long te
rminal repeat）における細胞性転写因子のための結合
部の存在に大きく依存する（28）。一方、ウィルスによ
りコードされた調節タンパク質tatおよびrevはHIVメッ
センジャーRNA内のコードされたシス作用性配列によっ
てそれらの活性を働かせる。トランス活性化応答領域
（TAR）はtat活性に必要とされ、ウィルスのLTRにおい
て残基＋１および＋79の間に位置付けられる（５、９、
10、11、12、13、14、16、27、38）。rev応答エレメン
ト（RRE）はenv遺伝子内において234ヌクレオチド長配
列へ局在されている（47、51、54、65、67、68、77）。
類似の調節タンパク質および標的配列がHIV−２およびS
IVによって使用される（８、66）。HTLV−ウィルスrex
遺伝子生産物はrevに類似して機能すると思われ、かつr
evと機能的に置換してウィルス遺伝子発現を促進し得る
（76）。
HIV転写の明瞭な動力学的状態は調整タンパク質tatお
よびrevの細胞内レベルを反映すると現在考えられてい
る。まず、宿主転写因子のLTRへの結合はtatを含む初期
mRNAの基底レベル転写を誘導する。tatレベルが上昇す
るに伴い、LTRからの増加された転写はトランス活性化
機構によって刺激される。これによってtatレベルはさ
らに上昇し、revの生産もまた刺激される。ウィルス構
造タンパク質の生産は、revレベルがひとたびrev応答エ
レメント（RRE）配列を運ぶメッセンジャーRNAの移出を
促進するのに十分に高いレベルに達すると始まる。HIV
増殖周期は、ウィルスLTRからの転写が溶菌増殖サイク
ルを開始するのに不十分な量の調節タンパク質しか生産
しないためにウィルス増殖発現が活動していない潜伏段
階も含むかもしれない。
HIV遺伝子発現の著しいレベルはtatタンパク質の存在
においてのみ達成される。まず、tat活性がウィルスLTR
における配列への宿主転写因子の結合を刺激するか、ま
たは転写因子そのものとして作用するかのいずれかによ
って転写開始速度を増加したことが最も起こり得ると思
われた（１、３、53）。しかし、いくつかの実験はtat
活性がDNA標的配列よりむしろRNA標的配列を必要とする
ことを強く示唆する。
ウィルスLTRの欠失分析は、tat活性がトランス活性化
応答領域（TAR）と呼ばれる、残基＋１と＋79との間の
すべてのmRNA転写物の５′末端において転写の開始部位
の下流に位置決めされる調節エレメントを必要とするこ
とを示した（５、10、11、27、28）。転写された領域に
おけるTARの配置は意外なものであった、それはこの配
置がそれがDNAエレメントよりむしろRNAとして機能し得
ることを示唆したからである。この考えは、エンハンサ
エレメントとは異なりTARエレメントがHIVプロモータへ
の３′に、かつ正しい配向および位置に位置付けられて
いるときのみ機能的であるという観察によって支持され
た（５、12−15）。さらに、TAR RNA配列は高度に安定
したヌクレアーゼ抵抗性のステム−ループ構造を形成
し、塩基対合を分断することによってTARステムを脱安
定化する点変異が通常tatによって刺激された転写を終
らせる（88）。
バークハウト（Berkhout）ら（16）は、TAR RNA配列
がトランス活性化が生じるために核内で転写され、かつ
正しく折り畳まれねばならないという説得力のある証拠
を与えた。彼らはTARの上流または下流のいずれかのTAR
RNAヘアピンループ構造の形成を脱安定化するように
デザインされたアンチセンス配列を導入した。TARの正
しい折り畳みおよびトランス活性化はいずれも、この脱
安定化配列がTARの５′側に位置付けられたとき遮断さ
れたが、TARの３′側における同一配列の位置付けは正
常なトランス活性化を許容した。このことはTARヘアピ
ンループ構造が未完成の転写物上で折り畳み、かつ活性
になり得ることを強く示唆した。
トランス活性化は上流のプロモータエレメントへのDN
A結合タンパク質のtat調節によるものではないと思われ
る（17）、それはSpl部位の上流で切って軽くされたか
（18）、または異種構造のプロモータへ融合された
（５、19、20）ウィルスLTRがトランス活性化されるで
あろうからである。
tat発現細胞において、ハイブリッド形成によって測
定されたようなmRNAレベルと、一連の実験によって測定
されたような核転写速度とはいずれも７ないし40倍に増
加される（88、89）。tatがTARを運ぶmRNAの翻訳効率も
増加し得るかどうかに関してはかなりの論争があった
が、tatによって促進されたmRNA合成の増加はトランス
活性化の理由を説明するのに十分であるということが現
在は明らかであるように思われる。形質移入された細胞
におけるCAT mRNAおよびCATタンパク質レベルの双方の
的確な測定は、タンパク質が広範囲にわたってmRNAに並
行して蓄積したことを示す。CAT mRNAの極めて低いレ
ベルでは、メッセージの高いレベルにおけるよりも転写
効率が低い。しかしRNA使用におけるこの増加はtat特異
的ではない、それはアデノウィルスElAタンパク質によ
る転写の刺激後のようなmRNAレベルのいかなる上昇も翻
訳に対応の影響を生ずるからである（89）。
tatによるTAR含有mRNAの翻訳制御が活性であると報告
された事例はアフリカツメガエルの卵母細胞における場
合である。TAR配列を運ぶCAT mRNAはアフリカツメガエ
ルの卵母細胞の細胞質に注入されるときは翻訳されない
が、tatプロテインとともに核内にmRNAを同時注入した
後に翻訳は回復される（90）。この現象はアフリカツメ
ガエルにおける特殊機構の反映であり得た、すなわちta
tによる翻訳制御はHIV増殖を許容する哺乳類細胞におい
て平行マイクロインジェクション実験が行なわれたとき
証明されることができなかった（91）。アフリカツメガ
エルの実験において観察された翻訳遮断が細菌性RNAポ
リメラーゼによる生体外の転写中に生産された二重鎖RN
AフラグメントによるmRNA調製物の混入によるものであ
ることもあり得る。哺乳類細胞の遊離の翻訳系におい
て、TAR含有mRNAはTAR配列が二重鎖RNA依存性キナーゼ
を活性化したと思われるためにうまく翻訳されなかった
ことが報告された（92）。しかしセルロースカラムにお
けるクロマトグラフィーによるTAR含有RNA調製物の再精
製後、混入二重鎖RNAは除去され、TAR含有mRNA調製物は
正常に翻訳された（93）。
TAR配列を運ぶプロモータからの転写を刺激するtatの
能力に関する最も簡単な説明は、tatが直接結合によっ
てTAR RNAを認識するということであるが、この相互作
用の証明は困難であると判明した。TAR RNAへのtatの
特異的結合を証明する初期の試みは、おそらくうまく行
なわれなかった、なぜならば、RNA混入物がなく、かつ
凝集物がその７つのシステイン残基の酸化のため形成さ
れない条件下にあるE.coliにおいて発現されたtatを精
製することが困難であるからである。しかし改良された
方法を使用して我々はtatがTAR RNAを特異的に認識で
きるということを証明できた。結合は高い親和力（Kd＝
12nM）を示し、tatはTAR RNAとの１対１複合体を形成
する（94）。
TARのtat認識は緊密なフランキング塩基対と同様TAR
RNAステムの頂端近くのＵの豊富なバルジの存在のみ
を必要とする。Ｕの豊富なバルジの配列を変える変異、
またはTARステム−ループ構造の近くの残基における塩
基対合を分断することによってＵの豊富なバルジの構造
に影響を与える変異は、tat結合およびトランス活性化
をいずれも終らせる（10、11、27、28）。対照すると、
TARステム全体の塩基対の多くのものの同一性はワトソ
ン−クリック塩基対合が維持される限り、トランス活性
化、またはtat結合のための重要な必要条件であるとは
思われない。tatによるRNA結合はtatにおけるアルギニ
ン残基とTAR RNAにおけるリン酸塩との間の特異的な塩
橋の形成を必然的に伴う。tatからアルギニンの多い配
列を運ぶＣ末端ペプチドは、無傷タンパク質より低い特
異性および親和力で結合するが、Ｕの豊富なバルジでTA
R RNAへ結合することもできる（95、96）。
tatおよび外因性RNA結合ドメインを含有するハイブリ
ッドタンパク質を使用する実験は、tatがTAR RNAエレ
メントを運ぶ未完成転写物へ直接結合した後に転写機構
へ与えられるという生化学的証拠を支持する興味深い遺
伝的証拠を提示した（97、98）。たとえば、tatからの
配列を含む融合タンパク質およびバクテリオファージR1
7コートタンパク質は、TAR RNA配列がR17オペレータ配
列を運ぶRNAステム−ループ構造によって完全に置換え
られるとき、HIV LTRからの転写を刺激し得る。TAR R
NAのtat認識の場合におけるように、コートタンパク質
に関してその親和力を低下するR17 RNAオペレータ配列
の変異が生体内のtatR17融合プロテインによるトランス
活性化を対応して低下させるため、結合は直接であると
思われる（98）。
TAR RNAへの結合後tatはいかにして遺伝子発現を調
節するのであろうか。１つの初期の示唆は、TARが転写
因子のための付加的積載部位として作用することによっ
て転写開始速度を刺激するように作用するということで
あった。除外することは難しいが、このモデルはますま
すあり得ないものに思われる、それは酵母GAL−４結合
ドメインを含む融合タンパク質のための結合部位のみを
含むプロモータを含むハイブリッドプロモータがtatに
対して高い応答性があるからである。転写開始に影響を
与えるRNA結合タンパク質の既知の例はないが、一方転
写伸長を制御するバクテリオファージ・ラムダＮタンパ
ク質のようなRNA結合タンパク質の原核生物系には多く
の良い例があることも注目されるべきである。
ピーターリン（Petrlin）らはtatがTAR部位またはそ
の近くにおける伸長に対する阻止の克服を助ける抗ター
ミネータとして作用するという重要な示唆を与えた（3
8、40、98）。彼らの提案は短い、早期に終了したRNA転
写物がtatが存在しないと蓄積するという観察に基づ
く。しかしTARは単に抗終結部位ではない、それはトラ
ンス活性化またはTARの欠失を終了させるTARの変異の結
果、LTR発現は構造的に高いレベルにならず、短いRNA転
写物を「追跡」して、全長のmRNAにすることが困難であ
るからである。
TARの下流における特異的ターミネータ配列の同定の
失敗によって、tatがRNAポリメラーゼIIのためのより一
般的な伸長因子として作用し、単に部位特異的抗終結因
子としては作用しないという第３の提案が行なわれた。
TARを含有する不完全な転写物上に存在するタンパク質
結合部位によって媒介された反応における転写開始直後
に、tatおよび細胞の補助因子がRNAポリメラーゼIIとと
もに集まることがあり得るように思われる。この修飾さ
れた転写複合体は次にTARを含む様々な遠位部位におい
て伸長への付加的阻止を克服することによってウィルス
mRNA生産を刺激する。
伸長因子モデルのための強い支持が核の追加実験から
得られる。tatが存在しない場合、RNAポリメラーゼはウ
ィルスLTRまたはその近くにおいてのみ見出され得る。
しかし、プロモータの下流のRNAポリメラーゼの密度はt
atが存在する場合、劇的に増加する（89）。しかし、伸
長依存性機構の厳密な論証にはtatに応答する有効な細
胞遊離転写系の発達が必要とされるであろう。これらが
間もなく利用可能になるであろうという励みになる徴候
がある。HIV感染された細胞からの抽出物の添加はウィ
ルスLTRからの転写を刺激する（100）。細菌により合成
されたtatが生体外で転写を刺激し得るという最近の報
告もあった。不運にも組換tatによる転写の刺激は高濃
度の添加タンパク質でインキュベーションを引伸ばした
後にのみ最もよく観察される（101）。したがって真性
のトランス活性化が生体外で再生されたかどうかは不明
瞭なままであり、細胞遊離系の付加的発達は機構的研究
が開始し得る前に必要とされるであろう。
この発明の目的は、ウィルス増殖サイクルにおいて調
節タンパク質tatの活性を修飾することを伴う、細胞内
のHIVウィルス増殖の抑制のための有効な方法、および
そこにおいて使用するための組成物、ならびに潜在する
抗ウィルス因子をスクリーニングするための検定を提供
することである。
発明の説明 この発明の第１の局面に従って、HIVタンパク質tatに
よって結合される部位に対応する１つのまたは複数のRN
A結合配列を含み、かつ細胞内のtatへ結合することが可
能な少なくとも１つのオリゴヌクレオチドを含む合成分
子が提供される。
細胞内でtatを結合することによって、１つまたは複
数の結合配列は細胞内に存在するいかなるHIVの増殖も
抑制するように作用し得、HIVに感染した患者の処置に
おける潜在的治療にも使用される。
この発明の第２の局面に従って、この発明の第１の局
面によって提供されるような分子を含む薬学的組成物が
提供される。薬学的組成物は細胞内のHIVの増殖抑制因
子として便宜的に使用される。
この発明の第３の局面に従って、HIVに感染した患者
の治療における使用のための合成分子が提供され、この
分子はHIVタンパク質tatによって結合される部位に対応
する、１つまたは複数のRNA結合配列を含み、かつ細胞
内でtatに結合することが可能な少なくとも１つのオリ
ゴヌクレオチドを含む。
この発明の第４の局面にしたがって、細胞内のHIVの
増殖を抑制するための薬剤の製造において、この発明の
第１の局面によって提供されるような分子の使用が提供
される。
この発明は、TAR配列の極めて小さく、かつ特異的な
領域のみがtatプロテインを結合するために決定的であ
るという予期せざる発見に基づく。したがって細胞内へ
の同化が可能なだけ十分に小さい、この特定的結合部位
の薬学的に許容可能な核酸、または他の類似体を（化学
的、または酵素的に）合成することが合理的に実用性が
ある。
これらの類似体は次に細胞内のtatプロテイン活性の
競合抑制因子として使用され得る、すなわちTAR類似体
とのその反応を介して細胞中に存在するtatを除去する
ことによって、それらの細胞におけるウィルス増殖が効
果的に抑制され得る。
tat結合は、HIVのTAR RNA構造におけるステムの頂端
の近くにバルジを形成する、１つのウリジン（Ｕ）残基
を含む３つの不対残基の存在に依存するようであること
がわかっている。tat結合はtat結合部位の一部も形成す
るフランキング塩基対の存在にも依存する。この結合部
位におけるある変異体は生体外においてtatを結合する
ことも、生体内においてトランス活性化することもでき
ない。それゆえこの小領域（高親和性結合部位であるこ
とがわかっている）を含む核酸、または他の類似体はTA
R配列において見出される構成をまね、tatプロテインへ
結合することができる。
したがって、この発明のオリゴヌクレオチドにおける
結合配列は好ましくは、tatプロテインの認識部位をと
もに形成するHIVのTAR RNAの配列におけるG26−C39に
対応するフランキング塩基対と共に、HIVのTAR RNAの
配列におけるU23に対応するウリジン残基を含む３つの
不対残基を含む。
このようなTARの小領域が実際にtatを結合するために
必要とされるので、好ましくは（しかしこれに限定され
ない）20個以下の残基の、治療的に有効な長さのオリゴ
ヌクレオチドからなる結合部位の類似体が構成され得
る。このような分子は感染された細胞に入り得る可能性
が高く、それゆえより長さの長いものよりもHIV感染の
生体内治療のための製薬に使用され得る。この発明に従
った分子は、HIVウィルスに感染された細胞内への組換
えを容易にするために、好ましくは長さにおいて20個以
下の残基のオリゴヌクレオチドの形である。
RNAそれ自体が細胞内で代謝的に不安定なため、この
発明に使用されるオリゴヌクレオチドは好ましくは細胞
内におけるその安定性を増加させるようにある程度修飾
される。必然的にRNA配列である結合配列はたとえばDNA
塩基配列か、または他の構造的に関連した種々のオリゴ
ヌクレオチドに組込まれてもよく、この塩基配列は全体
としてオリゴヌクレオチドへ必要な代謝的安定性を与え
る。
したがって細胞内に導入されるとき、tatによって結
合される部位に対応するRNA配列を含むいかなるオリゴ
ヌクレオチド（またはオリゴヌクレオチドの組合わせ）
も、tatを結合することが可能であり、したがってそれ
らの細胞内におけるウィルス増殖の競合抑制因子として
作用することが可能であるべきである。実際に、TAR R
NA結合部位におけるtatへの結合が可能ないかなる小分
子も、抗ウィルス因子として使用され得、この発明は抗
HIV因子としての使用のためのこのような分子をその範
囲内に含む。このような分子はTAR RNAのRNA構造の形
状をまねし得るか、またはTAR RNAのRNA構造と等価の
官能基を含み得る。
オリゴヌクレオチドは細胞のリボヌクレアーゼによる
開裂に対して感受性であるため、RNA結合配列の作用を
まねるがヌクレアーゼ開裂に対して感受性の低い化学的
に修飾されたオリゴヌクレオチド（またはオリゴヌクレ
オチドの組合わせ）を競合抑制因子として使用すること
が好ましいであろう。他の修飾、たとえば結合を高める
こと、細胞の摂取を高めること、薬理学もしくは薬物動
態学を改良すること、または他の薬学的に所望の特性を
改良することが要求されてもよい。
オリゴヌクレオチドは天然に存在するオリゴヌクレオ
チドであるか、修飾された塩基および／もしくは糖なら
びに／または結合を有するオリゴヌクレオチドのような
構造的に関連した変形物であってもよい。この中で使用
される用語「オリゴヌクレオチド」はこのような変形物
のすべてを包含すると意図される。
結合部位それ自体か、結合に関与しないオリゴヌクレ
オチドの一部のいずれかへ行なわれるであろう修飾は以
下の型を含むであろう（しかしそれらに限定されな
い）。
ａ）骨格の修飾（後の図５を参照） ｉ）ホスホロチオエート（ＸもしくはＹもしくはＷも
しくはＺ＝ＳまたはＯとして残基を含む２つ以上の組合
わせ） たとえば、Ｙ＝Ｓ（81）、Ｘ＝Ｓ（49）、ＹおよびＺ
＝Ｓ（45） ii）メチルホスホネート（たとえばＺ＝メチル（6
9）） iii）ホスホルアミデート（Ｚ＝Ｎ−（アルキル）２
たとえば、アルキル＝メチル、エチル、ブチル） （Ｚ＝モルホリンまたはピペラジン）（44） （ＸまたはＷ＝NH）（64） iv）ホスホトリエステル（Ｚ＝Ｏ−アルキル たとえ
ばメチル、エチルなど）（70） ｖ）リンの存在しない結合（たとえばカルバメート、
アセトアミデート、アセテート）（55、56） ｂ）糖の修飾 ｉ）２′−デオキシヌクレオシド（Ｒ＝Ｈ） ii）２′−Ｏ−メチル化ヌクレオシド（Ｒ＝OMe）（8
0） iii）２′−フロオロ−２′−デオキシヌクレオシド
（Ｒ＝Ｆ）（61） ｃ）塩基の修飾−（検討のため58を参照） ｉ）５の位置で置換された（たとえばメチル、ブロ
ム、フルオロなど）か、またはアミノ基でカルボニル基
を置換したピリミジン誘導体（75） ii）特定の窒素原子が欠如した（たとえば７−デアザ
アデニン，ヒポキサンチン）か、または８の位置で官能
基が設けられた（たとえば８−アジドアデニン,8−ブロ
ムアデニン）プリン誘導体 ｄ）反応性官能基に共有結合されたオリゴヌクレオチド たとえば ｉ）ソラレン（71）、フェナントロリン（82）、マス
タード（83）（共同試薬の必要性を有する、または有さ
ない不可逆性の架橋結合剤） ii）アクリジン（挿入剤）（75） iii）チオール誘導体（タンパク質を含む可逆性ジス
ルフィド形成）（48） iv）アルデヒド（シッフ塩基形成） ｖ）アジド、ブロモ基（UV架橋結合） vi）エリプチセン（ellipticene）（光分解架橋結
合）（74） ｅ）親油基または細胞による摂取の改良が可能な他の試
薬に共有結合されたオリゴヌクレオチド たとえば ｉ）コレステロール（63）、ポリアミン（62）、他の
可溶性ポリマー（たとえばポリエチレングリコール） ｆ）アルファ−ヌクレオシドを含むオリゴヌクレオチド
（72） ｇ）修飾ａ）−ｆ）の組合わせ ４−チオ−２′−デオキシチミジンと置換された残基
を含む修飾されたオリゴヌクレオチドを使用する実験
は、同等の修飾されないオリゴリボヌクレオチドよりta
tへうまく結合した。したがって１つまたはそれより多
い４−チオ−２′−デオキシチミジン残基の包含によっ
てその、または各オリゴリボヌクレオチドを修飾するこ
とが好ましい。
このような修飾されたオリゴヌクレオチドは「アンチ
センス」抑制因子としてデザインされたオリゴヌクレオ
チドと特徴を共有するが、化合物がセンス鎖配列に対応
し、かつ作用機構がタンパク質−核酸相互作用に依存
し、核酸配列との相互作用には依存しないという点にお
いて全く異なることに注目すべきである。
この発明の分子および薬学的組成物は生体内における
ウィルス増殖の抑制のために使用されるとき、経口的
に、静脈経路で、または他の任意の適切な方法によって
投与されてもよい。これらは生体外、たとえば生体から
取出され、輸血の目的で後に必要とされる血液中の細胞
におけるウィルス増殖の抑制に使用されてもよい。
この発明はさらに細胞内のHIVウィルスの増殖を抑制
する方法を提供し、この方法はこの発明に従った分子ま
たは薬学的組成物を細胞へ投与するステップを含む。
この発明はHIVに感染した患者の治療方法も提供し、
この方法はこの発明に従った分子または薬学的組成物を
患者へ投与するステップを含む。
この発明はTAR RNAまたはその合成類似体へのtatプ
ロテインの結合を抑制し、抗ウィルス因子としての潜在
的用法も有する化合物を同定するための検定の基礎とし
ても使用され得る。
したがってさらなる局面においてこの発明はTAR RNA
へのtatプロテインの結合を抑制する化合物を識別する
ための検定法を提供し、この検定法は化合物をtatプロ
テインおよびこの発明に従った分子と反応させること
と、その分子へのtatの結合度を測定することとを含
む。
分子へのtatの結合度を測定し、これを既知の基準に
ついての結果と比較することによって、その化合物によ
って生じたtat/TAR結合の抑制の程度（競合的または非
競合的）が示され得る。
この検定法は好ましくはフィルタ結合検定法の形式で
あるが、ゲル移動度−シフト検定、分光検定、捕捉検定
などのような別の型の検定法であってもよい。
TARへの結合に対して競合する競合分子または非競合
的にTARへのtat結合を抑制する分子のような阻害分子が
存在する場合のTAR RNAに対するtatの親和力の正確な
測定は、tatプロテインとTAR RNAとの間の化学量論的
複合体の形成なしには達成され得ず、これはE.coliから
のtatプロテインの精製の、および結合検定を行なうた
めの方法の改良結果として生体外において現在可能であ
る。
tat/TAR結合における抑制効果を有すると同定された
化合物は抗ウィルス因子としての可能な使用についてさ
らに研究され得る。この発明はしたがって潜在的抗ウィ
ルス化合物のスクリーニングを可能にし得る。
この発明は添付の図面を参照して例示によってこれよ
りより詳細に説明されるであろう。
図１はHIV−１遺伝子発現を制御する遺伝子要素およ
び細胞因子を示す。
図２はRNA結合タンパク質tatおよびrevがいかにしてH
IV−１遺伝子発現を制御するかを示す。
図３はtatの生体内活性および生体外結合のために必
要とされるHIV−１ TAR RNAにおけるそれらの配列を
示す。
図４はtat濃度（x10-8M）に対するフラクション範囲
のグラフであり、TAR RNA中のウリジンの豊富なバルジ
（「Ｕの豊富な泡」）がtat結合に必須であることを示
す。
図５は潜在的抗ウィルス活性を示すであろう修飾され
たオリゴヌクレオチドの構造を示す。
図６は様々な変異体のTAR RNA配列を使用するゲル遅
延tat結合検定の結果を示す。
図７はRNA競合濃度（uM）に対する32P標識HIV−１ T
AR RNAのフラクション範囲のグラフの形式で様々な変
異体のTAR RNA配列を使用するフィルタ結合検定の結果
を示す。
図８はtatについて既知の親和力を有する変異体TAR配
列を使用する形質移入実験の結果を示し、プラスミドDN
A（ug）に対するCAT活性（％アセチル化/10ul抽出物）
のグラフの形式で生体内のトランス活性化におけるTAR
変異の影響を示す。
図9aはタンパク質濃度（nM）に対するフラクションRN
A範囲の飽和結合曲線を示し、図9bはtat/TAR相互作用の
化学量論を決定するために使用されるTARへのtat結合の
スキャッチャード分析である。
図10は競合RNA（nM）に対するフラクション32P標識TA
R RNA範囲のグラフであり、TAR RNAと、バルジにおい
て配列CUUを運ぶ変異体との間のtat結合のための競合を
示す。
図11は図10に類似のグラフであり、TAR RNAとバルジ
において配列CCCを運ぶ変異体との間のtat結合のための
競合を示す。
図12は図10と類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおける位置40でＡ残基を運ぶ変異体との間の
tat結合のための競合を示す。
図13は図10と類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおいて位置22でＵ残基を運び、位置40でＡ残
基を運ぶ変異体との間のtat結合のための競合を示す。
図14は図10に類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおける位置22でＧ残基を運ぶ変異体との間の
tat結合のための競合を示す。
図15は図10に類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおける位置39でＧ残基を運ぶ変異体との間の
tat結合のための競合を示す。
図16は図10に類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおける位置26でＣ残基を運び、位置39でＧ残
基を運ぶ変異体との間のtat結合のための競合を示す。
図17は図10に類似のグラフであり、TAR RNAとTAR R
NAステムにおける位置26でＡ残基を運び、位置39でＵ残
基を運ぶ変異体との間のtat結合のための競合を示す。
図18はａ）全長59mer TAR転写物のRNA配列、ｂ）TAR
の頂部に対応する化学的に合成された29merのRNA配列、
ｃ）アニーリングされたときtat結合部位を表わすＵの
豊富なバルジおよびフランキング塩基対を形成する14お
よび17長の化学的に合成されたオリゴヌクレオチドのRN
A配列を示す。
図19は競合フィルタ結合検定の結果を示す、競合RNA
（nM）に対する保持される％計数のグラフであり、化学
的に合成された29merまたは化学的に合成された17mer＋
14merから形成された二重鎖（二本鎖）のRNAが各場合に
おいて酵素的に合成された59merのRNA転写物とほとんど
同じようにtatへの結合に対して競合することを証明す
る。
図20はａ）U23が２′−デオキシウリジン（dU）また
は２′−２′−Ｏ−メチルウリジン（２′−Ｏ−MeU）
のいずれかによって置換された場合の化学的に合成され
た29merのRNA配列、およびｂ）U23またはU24またはU25
が２′−デオキシチミジン（dT）または５−ブロモ−
２′−デオキシウリジン（BrdU）によって置換された場
合の、14merにアニーリングされて二重鎖のRNAを形成す
る化学的に合成された17merのRNA配列を示す。
図21は競合フィルタ結合検定の結果を示す図19に類似
のグラフであり、dUまたは２′−Ｏ−MeUのいずれかに
よってU23で置換された化学的に合成された29merが各場
合において修飾されない29merと同様にtat結合に対して
競合することを証明する。
図22は競合フィルタ結合検定の結果を示す図19に類似
のグラフであり、dTによってU23またはU24で置換された
17merにアニーリングされた14merからなる二重鎖RNAは
各場合において修飾されない二重鎖と同様tat結合に対
して競合するが、dTによってU25で置換された二重鎖は
修飾されない二重鎖に比べるとうまく競合しないという
ことを証明する。
図23は競合フィルタ結合検定の結果を示す図19に類似
のグラフであり、BrdUによってU23で置換された17merに
アニーリングされた14merからなる二重鎖RNAはtat結合
に対してうまく競合しないが、U24で置換されたものは
置換されない二重鎖と比べると同じように競合すること
を証明する。
図24は競合フィルタ結合検定の結果を示す図19に類似
のグラフであり、BrdUによってU25で置換された17merヘ
アニーリングされた14merからなる二重鎖RNAが置換され
ない二重鎖と比べると同様にtat結合に対して競合する
ことを証明する。
図25は15および18長の化学的に合成されたオリゴヌク
レオチドを示し、これはアニーリングされたときＵの豊
富なバルジを含む二重鎖RNAを形成するが、そこでU23、
U24またはU25は各場合において４−チオ−２′−デオキ
シチミジンによって置換される。
図26は競合フィルタ結合検定の結果を示す図19に類似
のグラフであり、４−チオdTによってU23、U24またはU
25のいずれかで置換された18merヘアニーリングされた1
5merからなる二重鎖RNAが各場合において置換されない
二重鎖よりうまく結合に対して競合することを証明す
る。４−チオdTによって置換されたU25類似体は修飾さ
れない59merと同様に競合する。
図面の詳細な説明 図１ HIV−１遺伝子発現の機構が概略的に示される。新た
に感染した細胞において、LTRへの細胞転写因子の結合
は（１）で示されるtat、revおよびnefをコードする初
期のmRNAの転写の基底レベルを刺激する。tatレベルが
細胞中で上昇するにとなもい、転写はトランス活性化機
構によって刺激される。この結果初期のmRNAの生産は増
加され、核内に部分的にスプライシングされた、または
スプライシングされないRNA転写物が蓄積される
（２）。細胞内におけるrevレベルの上昇に伴い、rev応
答性エレメントを運ぶRNAは核から移出される。これら
はgag、polおよびenvによってコードされた構造タンパ
ク質のためにmRNAとして作用する。全長のHIV転写物はg
ag−polのためのmRNAとしても、かつウィルス粒子RNAと
しても作用する（３）。
図２ 調節RNA tat（TAR、トランス活性化応答領域）
およびrev（RRE、rev応答領域）の位置および配列がHIV
遺伝地図の下に示される。
図３ TAR領域の構造を変える変異体の最近の研究は、T
AR RNA配列が生じるべきトランス活性化のために核内
で転写され、正しく折り畳まれねばならないということ
を強く示唆する。TAR RNA配列は安定したヌクレアーゼ
抵抗性ステム−ループ構造を取入れる（５）。この構造
の２つの顕著な特徴はループ配列（残基30−35）および
二重螺旋ステムの先端近くに位置決めされた３つの塩基
対を形成しない残基（残基23−25）によって作り出され
た「バルジ」である。TARにおけるバルジおよびループ
配列はいずれもHIV−１とHIV−２との間に保存され
（８、９）いずれの領域もヌクレオチド＋19および＋42
の間に位置決めされた官能基が活性の最小のTAR配列に
存在する（５、10−14）。
TARにおけるtatのための認識部位を正確に位置付ける
ために、E.coli（６、94）において発現された精製され
たtatプロテインのHIV−１ TAR変異を含む転写物を結
合する能力が研究された。前の実験はアンチセンスTAR
RNA配列が15の位置でしかTARと異ならなかったにもか
かわらず、tatを結合できないこと（６）を示した（図
３を参照）。TARへのtat結合へのこれらの配列の変化の
各々の寄与を査定するために、一連のTAR分子が構成さ
れ、これはステムまたはループ構造における一連の変異
と同様、ループ、上部ステムまたは下部ステムのいずれ
かのセンスまたはアンチセンス配列を有する（図３）。
HIV−１ tatはHIV−２ TARの第１のステム−ループを
運ぶLTRをトランス活性化することができる（20、2
5）。２つのTAR配列が緊密に相関せず（８、９）、かつ
ループおよびバルジ領域における残基のみが保持される
ため、この配列がHIV−1tatを結合することができるか
否かを決定することも興味深かった。
図３において、TAR RNA配列および提案された二次構
造が示され、番号付けは位置＋１におけるキャップされ
たＧ残基に関連する。提案された二次構造はTAR RNAの
前の分析に基づく（５）。HIV−1BRU TARおよびHIV−2
R0D TARのいずれにも存在する保持された配列の特徴は
ボックスに入れられ、かつ影を付けられる。センス配列
と異なるHIV−１ TARへのアンチセンス配列における配
列はボックスに入れられる。矢印はRNA構造の下部ステ
ム、上部ステム（Ｕの豊富な泡を含む）およびループへ
の分割点を示す。SSA:センスステム、アンチセンスルー
プ配列。ASS:アンチセンス下部ステム、センス上部ステ
ムおよびループ配列。SAS:センス下部ステムおよびルー
プ配列によってフランキングされたアンチセンス上部ス
テム。アンチセンス:HIV−1BRU TARへのアンチセンス
配列。G3からU3へ（ループ）：残基32−34がウリジン
（Ｕ）へ転換される。デルタU3（バルジ）：残基23−25
が欠失される。U3からG3へ（バルジ）：残基23−25がグ
アニン（Ｇ）に転換される。G28からC28へ:TARステム／
ループ構造の頂部を分断することが予想された点変異。
G28からC28へ＋C37からG37へ：正常なTARステム／ルー
プ構造を有することが予想された対の点変異。
図４ ラボラトリ・オブ・モレキュラ・バイオロジ（La
boratory of Molecular Biology）（ケンブリッジ（Cam
bridge））における研究は、HIV−1tatプロテインが見
かけの解離定数12nMを有するゲル遅延、フィルタ結合お
よびイムノプレシピテーション検定においてHIV−１ T
AR RNAに特異的に結合することを示した（６、94）。
HIV−１ tatはHIV−２ TAR配列にも特異的に結合す
る（以下、ならびに図６および７を参照）。HIV−１お
よびHIV−２ TAR配列間で共有される相同の唯一の領域
がループ領域およびＵの豊富な泡を含むステムの短い領
域における残基であるため、tat結合部位はこれらの領
域の１つの中に位置決めされることになる。
これらの配列の各々における残基を変える一連の変異
が調製される。生体外におけるtat結合は無傷のＵの豊
富な領域配列の存在に依存するが、ループからは大きく
独立している。
図４にグラフで示される結果は、結合反応物（500u
l）が100,000Ci/モルの比活性において40nモルの32Pで
均一に放射性標識付けされたTAR RNAと、0.5ug子ウシ
胸腺DNAと、0.2ug酵母tRNAと、40単位RNAsin（プロメ
ガ）と、50mM Tris−HCl pH7.9および20mM KClを含
んだ実験からのものである。反応混合物は氷の上に据え
られ、増加する量のHIV−1tatタンパク質が加えられ、
その反応混合物は予め洗浄されたニトロセルロースフィ
ルタ（ミリポア（Millipore）0.45uM孔径サイズ）を介
して濾過された。フィルタは乾燥され、液体シンチレー
ション計数によって数えられた。放射性標識付けされた
RNAのフラクション限界はHIV−１ tat濃度に対してプ
ロットされた。
TAR:野生型TAR RNA（HIVBRU配列）。
U3欠失:3つのウリジン（Ｕ）塩基（残基23−25）が欠
失されたTAR RNA配列。
U3からG3へ:3つのウリジン（Ｕ）塩基（残基23−25）
がグアニン（Ｇ）へ転換されたTAR RNA配列。
図５はこのようなRNAフラグメントの合成における使
用が可能なオリゴヌクレオチドの構造を示す。ヌクレア
ーゼ開裂に対するその感受性を低下するか、さもなけれ
ばその安定性を向上するために、オリゴヌクレオチドへ
の修飾は前述のように塩基B1およびB2の構造、糖骨格Ｒ
またはリン酸結合Ｗ、Ｘ、ＹおよびＺへの変更を含んで
もよい。
図６および７はゲル遅延およびフィルタ結合検定実験
の結果をそれぞれ示し、HIV−２ TAR RNAにおける第
１のステム−ループ構造へのHIV−１ tatの結合を証明
する。使用される方法および得られた結果は以下に概説
される。
ｉ）ゲル遅延検定（図６） 方法 RNA転写物はTAR領域残基＋１ないし＋57のT3またはT7
RNAポリメラーゼのいずれかでの転写によって調製さ
れ、ブルースクライブ（Bluescribe）M13+発現ベクター
（Stratagene）のHind IIIとEcoR I部位の間でクローン
化された。HIV−１ TAR、SSA、SAAおよびSASに対応す
るRNA転写物はEcoR Iで線状にされ、かつT3 RNAポリメ
ラーゼで転写されたクローンから合成された。アンチセ
ンスHIV−１ TAR、AAS、ASSおよびASA（図示せず）配
列に対応するRNA転写物はHind IIIで線状にされ、かつT
7 RNAポリメラーゼを使って転写された同一のプラスミ
ドから調製された。すべての他のRNA分子はプラスミド
ベクターのEcoR I開裂に続くT3 RNAポリメラーゼを使
用して合成された。RNA生産物は各々その５′末端でベ
クター配列の13のヌクレオチドおよびその３′末端で４
つのヌクレオチドを運ぶ。これらの配列はtatのTAR
（６）への結合に影響を及ぼさない。転写混合物は30ul
の最終容量において、1ugの線状にされたプラスミド、4
0mMのトリス（Tris）−HCl pH8.0、10mMのMgCl2、2mM
のスペルミジン（Spermidine）−HCl、50mMのNaCl、各
々100uMのリボヌクレオチド三リン酸、40uCi（アルファ
−32P）UTP（410Ci/m mol）および10ユニットのRNAポ
リメラーゼを含み、37℃で30分間インキュベートされ
た。エタノールからのフェノール抽出および沈殿後、RN
Aは９％ポリアクリルアミド変性ゲルから精製された。R
NA生産物の比活性が決定され、適切な量が結合検定で使
用された。結合反応混合物（15ul）は1ngの均一に標識
したRNAプローブ、0.5ugの子ウシ胸腺DNA、0.2ugの酵母
tRNA、40ユニットのRNAsin（プロメガ（Promega））、5
0mMのトリス−HClおよび20mMのKClおよび０ないし600ng
のtatプロテインを含み、以前（６）に説明されたよう
にE.coliベータ−ガラクトシダーゼ−tat融合タンパク
質から調製された。10ないし20分間30℃か４℃のいずれ
かでインキュベーションした後、反応混合物は3.3mM酢
酸ナトリウム、6.7mMトリス（HClでpH7.9に調整され
た）中６％の非変性ポリアクリルアミドゲル（アクリル
アミド（Acrylamide）：ビス（Bis）、40:0.5）に与え
られた。ゲル緩衝液は室温で約２時間35mAでの電気泳動
の間再循環された。ゲルは乾燥され、強調スクリーンを
使用して−80℃でＸ線フィルムに写された。
結果 図６のオートラジオグラフはtatとHIV−１ TAR,HIV
−２ TAR、SSA、ASS、およびＧからＵへ（ループ）の
32P標識したRNA転写物との間での分離した複合体形成を
示す。複合体は、SAS、AAS、デルタU3（バルジ）、Ｕか
らＧへ（バルジ）またはアンチセンス配列とは何も形成
されなかった。各ゲルレーンの上の数字は各反応混合物
に加えられた200ng/ulでのHIV−１ tatプロテインのul
を示す。RNA配列は図３に示されるとおりである。
ゲル遅延（図６）およびセンス／アンチセンスキメラ
を使用するフィルタ結合検定（データは図示せず）もま
た、TARへのtat結合は常にステムの上部領域にあるがル
ープにはないセンス配列の存在に依存することを示し
た。このように変異体ASS、SSAおよびASAの各々が野生
型の親和力でtatを結合し、一方変異体SAS、AASおよびS
AAの各々は大幅に低減された親和力でtatを結合し、ゲ
ル遅延検定（図６）で複合体を形成できない。これはta
t結合部位はTARの上部ステム領域に置かれなければなら
ないという仮定のさらなる証拠である（図３）。
ii）フィルタ結合検定（図７） 結合検定における改良点は、ほぼ等モル濃度のタンパ
ク質およびRNAを使用してtatとTAR RNAとの間の複合体
の形成を考慮した。これらの検定において、tatへの低
減された結合を示すTAR変異体もまた、野生型のRNA配列
に結合するtatの弱い競合阻害剤である。たとえば、競
合結合検定において、Ｕの豊富な泡の３つのＵ残基の各
々がＧ残基によって置換されるTAR変異体は240nMの見か
けのKdを有する。
方法 競合RNAは40mMのトリス−HCl pH7.6、25mMのNaCl、1
6mMのMgCl2、10mMのジチオトレイトールおよび100ugの
純粋なT3 RNAポリメラーゼを含む2.5mlの反応混合物中
100ugの適切なDNA鋳型の転写によって生産された。ポリ
メラーゼ酵素はプラスミド（pCM56）（26）を使用する
E.coli BL21における過発現によって生産された。結合
反応物（500ul）は氷上で生じ、80pMの32P標識したTAR
RNA（17,600dpm、200uCi/n モル）および標識してい
ないTAR RNAを含み、20nMの最終濃度、0.5ugの子ウシ
胸腺DNA、0.2ugの酵母tRNA、40ユニットのRNAsin（プロ
メガ）、50mMのトリスHClおよび20mMのKClを与えた。競
合RNAを加えた後、結合は400ng/ml（40nM）の最終濃度
までHIV−１ tatプロテインを添加することによって開
始された。結合反応混合物はそれから予め水洗されたニ
トロセルロースフィルタ（ミリポア0.45uM孔サイズ）を
介して減圧下で濾過され、フィルタは乾燥され、液体シ
ンチレーション計数によってカウントされた。
結果 図７に示されるグラフはTAR RNAと様々な変異体TAR
配列との間のtat結合に対する競合を例示する。数値デ
ータは表１に与えられる。32P標識したTAR RNA範囲の
フラクションは、競合RNAの最終濃度に対してプロット
された。この実験で使用されたTARの配列および様々なT
AR変異体は図３に示されるとおりである。これらの実験
において、反応物は20nMのTARおよび40nMのtatプロテイ
ンおよび40nMから6uMの増大する量の標識していない競
合RNAを含んだ。このグラフは2uMより大きい競合RNA濃
度で得られたデータを含んでいない。直接フィルタ結合
検定で測定されるように、複合体におけるtatとTARとの
等モル比およびKd＝12nMを仮定すると、入れたTAR RNA
の70％は競合RNAがない場合にフィルタ上で保持される
ことが予期される。理論上、40nMのtatは総TAR RNA濃
度が56nMである場合に入れたTAR RNAの50％（Ｄ1/2）
を結合するであろう。この値は64nMのTARのＤ1/2に対す
る測定値とよく一致する（パネルａ）。低い親和力でta
tを結合するTAR変異体は弱いコンペチターであり、Ｄ
1/2に対してより高い値を与える。
tatによって弱く結合されるTAR RNA配列もまた、し
たがって、溶液中の結合の弱い競合阻害剤である。直接
結合検定（Kd＝30nM−表１）、または競合結合検定（図
7aおよび表１、Ｄ1/2＝160nM）において測定されるHIV
−２ TARに対するtatの親和力は、HIV−１ TARに対す
るものよりほぼ2.5倍低かった。バルジＵ残基のＧ残基
との置換はゲル遅延検定におけるTARへのtat結合を終ら
せ（図６）、tat親和力の劇的な低減、Ｄ1/2＝400nM、1
00nMより大きいKdを生じた（図7cおよび表１）。Ｕの豊
富なバルジの遺伝子欠失もまたゲル遅延検定においてTA
Rへのtat結合を終らせ（図６）、Ｄ1/2を290nM、70nMよ
り大きいKdまで増大させた。対照的に、ループ配列の３
つのＧ残基のＵ残基との置換はほぼ野生型の親和力、Ｄ
1/2＝66nM、Kd＝25nMでtatを結合することが可能なRNA
分子を生じた（図６および図7cならびに表１）。G28の
Ｃ残基との置換はＵの豊富なバルジとループとの間のス
テムを脱安定化させることが予期される（図３）。この
変異体はゲル遅延検定においてtatに結合すること（図
６）、または効率的に競合すること（図7bおよび表１、
Ｄ1/2＝680nM、Kd 100nM）ができなかったが、結合はC
37のG37への第２の変異より大きい補償によって回復さ
れた（図7bおよび表１、Ｄ1/2＝76nM、Kd＝24nM）。
TARセンス／アンチセンスキメラを使用する競合実験
は行なわれなかった、なぜならTAR RNAは室温でアンチ
センスRNAと容易にアニールし、tat/TAR複合体（データ
は図示せず）のそれに類似のポリアクリルアミドゲル中
で移動性を有する安定した二重鎖を生じるからである。
このハイブリッド形成反応はTARへのタンパク質結合に
干渉することが予期される。
図８ もしTARへのtat結合がトランス活性化に必要であれ
ば、tatに対する低親和力を有するTAR配列を運ぶウィル
スLTRは、生体内のtat依存プロモータ活性を常に低減し
たはずである。TAR上での部位定方向突然変異実験は、
トランス活性化はＵの豊富なバルジ（10、11）およびル
ープ配列（12、27、28）の双方における配列を必要とす
ることを示した。これらの観察はトランスフェクション
実験においてtatに対して既知の親和力を有するTAR変異
を使用して拡大され、その結果は図８に示される。これ
らの実験はHeLa細胞（図8a−ｄ）かまたはtatの構造性
生産体、HeLa/C63/tat細胞（図8e−ｆ）のいずれかを使
用した。
図３に描かれるTAR配列は、LTRおよび感染性プロウィ
ルスクローンNL4（29）に由来する５′フランキング配
列のほぼ300の塩基を運ぶテストプラスミド、pD5−３−
３に導入された。細菌性クロラムフェニコールアセチル
トランスフェラーゼ（CAT）遺伝子およびSV40イントロ
ンおよびpSV2−CAT（30）からのターミネーター配列
は、＋77でHind III部位にクローン化することによって
TARの下流に挿入された。トランス活性化はHeLa細胞の
テストプラスミドおよびtat発現プラスミドpC63−４−
１（６）（図10のパネルａ−ｄ）との同時トランスフェ
クションか、またはHeLa/C63/tat（クローン９）細胞
（パネルｅ−ｈ）へのテストプラスミド単独のトランス
フェクションのいずれかによって測定された。
これらの実験において、細胞はT25フラスコの中で３
×105の密度でプレート培養され、リン酸カルシウム法
（31）によってトランスフェクトされた。HeLa細胞中の
トランスフェクションは、8.0ugのテストプラスミド、
1.0ないし10ugのpC63−４−１プラスミド、および10ug
の子ウシ胸腺担体DNAを使用した。HeLa/C63/tat（クロ
ーン９）細胞のトランスフェクションは、0.5ないし10u
gのテストプラスミドおよび10ugの子ウシ胸腺担体DNAを
使用した。HeLa/C63/tat（クローン９）細胞は、HeLa細
胞のヘルパーフリーの両栄養性C63−４−1MoMuLV−tat
ウィルスでの感染によって調製された。2mg/ml G418に
おける選択の後、個々のクローンは伸長され、tatプロ
テインの発現はtatへのモノクローナル抗体を用いるイ
ムノプレシピテーションによって確認された（６）。細
胞抽出物は150ulの溶解緩衝液（0.2％のNP40、20mMのト
リスpH8.0、4mMのMgCl2）中でのトランスフェクション
後48時間で調製され、65℃で10分間熱不活化され、−20
℃で保存された。CAT活性が検定（30）の直線の範囲で
測定されたことを確実にするために、そのアセチル化さ
れた形でのクロラムフェニコールの50％未満の転換にお
いて、各トランスフェクションに対して、５から70ulの
抽出物を含む３つの異なったアリコートがCAT活性につ
いて検定された。反応物は70ul、10ulのAcCoA（溶解緩
衝液中の2.5mg/ml）、0.5ul（14C）−クロラムフェニコ
ール（60mCi/mmol）の最終容量まで溶解緩衝液で希釈さ
れた抽出物を含み、45分間37℃でインキュベートされ
た。反応生産物は酢酸エチルで抽出され、シリカプレー
ト上の薄層クロマトグラフィーによって分離され、バン
ドは抽出物の10ul当りのクロラムフェニコール転換効率
を計算するためにシンチレーション流体中でカウントさ
れた。
HIV−１ TAR領域を運ぶウィルスLTRは、tatプラスミ
ドの最適レベルが存在するところでは40倍と150倍との
間のCAT活性の基底レベルを越える上昇を示した。バル
ジ領域（デルタＵ、ＵからＧへ、SAS、AAS）かまたはル
ープ領域（SSA、ASA）のいずれかにおける変異は、トラ
ンス活性化において４ないし20分の１の低減を生じた。
バルジまたはループ領域における変化を有するすべての
LTRは無傷のTAR領域を有するLTRより際立って活性的で
はなかったが、上部ステムおよびループ領域の双方に対
して変化を有する変異体SAAのみが、高いtatプラスミド
濃度で基底レベルを越えるLTR活性の実質的な上昇を示
さなかった。G28のC28への点変異もまた欠陥表現型を生
じ、それはC37のG37への補償突然変異によって野生型レ
ベルに回復された（図8a）。
HeLa/C63/tat細胞において、HIV−１ LTRによって促
進された最高のCAT発現は、HeLa細胞の最適tatプラスミ
ド濃度でのCAT発現より２ないし３倍低かった。これはH
eLa/C63/tat細胞におけるtat発現のレベルがトランスフ
ェクトされたHeLa細胞で達成されたtat発現の最高レベ
ルより幾分低かったことを示す（図8e−ｈ）。HeLa/C63
/tat細胞においては、変異体SSA、SAA、ASA、SASまたは
AASに対して観察されたCAT発現の基底レベルを越える十
分な上昇がなかった（図8gないしｈ）。Ｕの豊富なバル
ジ（デルタＵ、図8f）の遺伝子欠失またはG28のC28への
点変異（図8e）もまたヌル表現型を生じた。対照的に、
ASSプラスミドは野生型発現レベルを示した（図8g）。
しかしながら、バルジにおいてＵ残基がＧ残基に置換さ
れた場合（ＵからＧへ、図8f）、またはＧ残基がループ
においてＵ残基に置換された場合（ＧからＵへ、図8
f）、高いプラスミド濃度で著しいCAT活性が観察され
た。
TAR RNAへのtat結合の化学量論（図９） ケンブリッジ（Cambridge）の分子生物学研究所（the
Laboratory of Molecular Biology）での初期研究は、
tatプロテインとTAR RNAとの間の配列特異的相互作用
を示した（６）。しかしながら、tatの重要なフラクシ
ョンは適切に折り畳まれなかったかもしれず、かつ解離
定数から出された推定値（30nMより小さいKd）はむしろ
概算であるという懸念があった、なぜなら測定はタンパ
ク質の高いモル過剰（1,000ないし10,000倍）で行なわ
れたからである。結合検定におけるtatプロテインの調
製およびRNAの高濃度の用途の双方における改良点
（“方法”以下および引用文献94を見られたい）は、タ
ンパク質およびRNAの等濃度を使用する複合体形成の証
明、およびTAR RNAへのtat結合に対する配列要求の詳
細な研究を考慮に入れた。
図9aは飽和結合実験の結果を示し、その実験において
一定濃度の標識したRNA（10nM）は上昇する濃度のtatプ
ロテインでインキュベートされ、ニトロセルロースフィ
ルタ上に保持されたRNAのフラクションが測定された。
結合は“方法”で以下に説明されるようにフィルタ結合
検定によって測定され、E.coliにおいて発現されたヒト
成長ホルモン−tat融合タンパク質のCNBr開裂によって
調製された単量体のtatプロテインを使用した。飽和結
合に対する反応物は10nMで標識したTAR RNAまたはアン
チセンスTAR RNAを含み、０ないし300nMの間で精製さ
れたtatタンパク質を含んだ。アンチセンスTAR RNAは
対照として使用された、なぜならアンチセンスTARはゲ
ル遅延検定においてtatとともに安定した複合体を形成
することができないからである（ディングウォール（Di
ngwall）他、1989年）。
tatはKd＝12nMの見かけの解離定数でHIV−１ TAR R
NAに結合したが、アンチセンスRNAへの結合は大幅に低
減された（140nMより大きいKd）。判然としない結果が
感染分子クローンで発見されたUUUかまたはUCUかのいず
れかのバルジ配列を有するHIV−１ TAR配列を使用して
得られた（表１）。
tat/TAR相互作用の化学量論は広い範囲にわたってTAR
RNA濃度を変える一方で、tatプロテイン濃度をKd近く
で一定に保つことによって決定された。データのスキャ
ッチャードプロットは図9bに示される。このスキャッチ
ャード分析のために、tatプロテイン濃度は40nMで一定
に保持され、RNA濃度は7nMと320nMとの間で変化した。
標識したRNAの総量は結合反応物において一定に保たれ
たが、RNAの比活性は変化した。縦座標は化学量論、
ｖ、タンパク質のモル当り結合されたRNAのモル数であ
る。横座標はｖの遊離RNA濃度に対する比である。切片
は約１の化学量論、ｖに対する値を与え、線の傾きは最
小自乗法によってデータに当てはめられ、11.8nMのKdを
示し、飽和結合実験から得られた値と非常によく一致し
た。これらの結果はtatはTARと１対１の複合体を形成
し、かつ新しい調製物における本質的にすべてのtatモ
ノマーはRNA結合において活性であることを示す。
方法 ａ）tatプロテインの調製 tatプロテインはベータ−ガラクトシダーゼ−tat融合
タンパク質（６）かまたはヒト成長ホルモン−tat融合
タンパク質（85）かのいずれかから改良された方法を使
用して調製された。要するに、融合タンパク質を含む封
入体ペレットは7MのGdHCl、50mMのトリス−HCl pH8.
0、2mMのEDTA、2mMのDTT中で可溶化され、融合タンパク
質は6Mの尿素、50mMのトリス−HCl pH8.0、2mMのEDT
A、2mMのDTTを含む緩衝液中のＱ−セファロースおよび
Ｓ−セフアロース（ファーマシア（Pharmacia））上の
イオン交換クロマトグラフィーによってほぼ均質になる
まで精製された。システィン残基は20mM ２−ヒドロキ
シエチルジスルフィドとのジスルフィド交換によって保
護され（86）、かつタンパク質は臭化シアンによって開
裂された（６）。塩基性tatプロテインはそれから6Mの
尿素中のＱ−セファロースおよびＳ−セファロース上の
イオン交換クロマトグラフィーによって酸性ヒト成長ホ
ルモンペプチドから分離された。保護基はそれから10mM
のDTTを加えることによってタンパク質から除去され、
タンパク質は50mMのトリス−HCl pH8.0、100uMのDTT、
10uMのZnCl2を含む緩衝液中で、6Mの尿素、5Mの尿素、3
Mの尿素、1Mの尿素および0Mの尿素に対する段階的な透
析によって再生された。この態様で再生されたtatプロ
テインはセファロース12カラム（ファーマシア）からモ
ノマーとして溶出し、単一バンドとしてポリアクリルア
ミドゲル上で移動する。双方の方法によって調製された
タンパク質は結合検定において共通した挙動を示した。
ｂ）TAR RNAの調製 RNA転写物はTAR領域残基＋１ないし＋57のT3かまたは
T7のいずれかのRNAポリメラーゼでの転写によって調製
され、ブルースクライブM13+発現ベクター（Stratagen
e）のHind IIIとEcoR I部位との間でクローン化され
た。HIV−１ TAR、SSA、SAAおよびSASに対応するRNA転
写物は、EcoR Iで線状にされT3 RNAポリメラーゼで転
写されたクローンから合成された。アンチセンスHIV−
１ TAR、AAS、ASSおよびASA（図示せず）配列に対応す
るRNA転写物は、Hind IIIで線状にされ、かつT7 RNAポ
リメラーゼを使用して転写された同一のプラスミドから
調製された。すべての他のRNA分子はプラスミドベクタ
ーのEcoR I開裂の後、T3 RNAポリメラーゼを使用して
合成された。RNA生産物は各々その５′末端でベクター
配列の13のヌクレオチドを運び、その３′末端で４つの
ヌクレオチドを運ぶ。転写混合物は30ulの最終容量中に
1ugの線状にされたプラスミド、40mMのトリス（Tris）
−HCl pH8.0、10mMのMgCl2、2mMのスペルミジン（Sper
midine）−HCl、50mMのNaCl、各100uMのリボヌクレオチ
ド三リン酸、40uCi（アルファ−32P）UTP（410Ci/m モ
ル）および10ユニットのRNAポリメラーゼを含み、37℃
で30分間インキュベートされた。エタノールからのフェ
ノール抽出および沈殿後、RNAは９％のポリアクリルア
ミド変性ゲルから精製された。RNA生産物の特異的な活
性が決定され、適切な量が結合検定で使用された。
競合検定のための大量のRNAが40mMのトリス−HCl pH
7.6、25mMのNaCl、16mMのMgCl2、10mMのDTT、各3mMのリ
ボヌクレオチド三リン酸および100ugの純粋なT3 RNAポ
リメラーゼを含む2.5mlの反応混合物中の100ugの適切な
線状DNA鋳型の転写によって生産された。ポリメラーゼ
酵素はプラスミドpCM56（モリス（Morris）他、1986
年）を使用してE.coli BL21における過発現によって生
産された。RNAは予備的な変性ゲル電気泳動によって精
製され、0.5ないし1mgの純粋なRNAはこの方法によって
ルーチン的に生産された。
ヌクレアーゼ消化実験（データは図示せず）はTAR R
NAの３′および５′側の短い伸張の存在は、ミューシン
グ（Muesing）他（５）によって説明された型のRNAヘア
ピンループを形成するためのこれらの配列の能力に影響
を及ぼさないことを示した。T7かまたはT3のいずれかの
転写反応物から調製されたTAR RNA、またはオリゴヌク
レオチド鋳型（６）から調製されたTAR RNAは区別でき
ないほどにtatを結合する。さらに、HIV転写物の第一の
110ヌクレオチドを介してTAR配列を伸張するより長いRN
A分子は、行なわれた実験の大半で使用された59ヌクレ
オチド長の転写物と同等にtatを結合する（データは図
示せず）。
ｃ）フィルタ結合検定 tatプロテインのTAR RNAへの結合に影響を及ぼす様
々なパラメータが研究され、結合条件が最適化された。
tatのTARへの結合はpH8.0ではっきりしたpH最適条件を
有するが、良好な結合はpH7.5とpH8.5との間で観察され
る。tat/TAR複合体はイオン強度に非常に影響されやす
い。複合体形成は100mMより多いNaClまたは100mMより多
いKClによって強く抑制され、最適の全体のイオン強度
は0.08u+である。Zn+2、Cd+2、Ca+2、Mg+2、Fe+2または
Fe+3イオンの反応混合物への添加は複合体形成に影響を
及ぼさない。しかしながら、結合反応物は0.1mMより多
いEDTAでEDTAに影響されやすい。複合体形成はまた幾分
温度にも影響されやすい。最適の結合は0.℃で観察され
る。15℃と30℃との間で、複合体形成に30％の低減があ
る。参考文献110の図２を見られたい。
競合実験のために、結合反応物（500ul）は氷上で生
じ、80pM32P標識したTAR RNA（17,600dpm、200uCi/n
モル）および標識していない最終濃度が20nMのTAR RN
A、0.5ugの子ウシ胸腺DNA、0.2ugの酵母tRNA、40ユニッ
トのRNAsin（プロメガ）、50mMのトリス−HCl pH7.9お
よび20mMのKClを含有した。０ないし6uMの競合RNAを添
加した後、結合はHIV−ｌ tatプロテインを400ng/ml
（40nM）の最終濃度まで添加することによって開始され
た。結合反応混合物はそれから予め洗浄されたニトロセ
ルロースフィルタ（ミリポア0.45u 孔サイズ）を介し
て減圧下で濾過され、フィルタは乾燥され、液体シンチ
レーション計数によってカウントされた。
tatプロテインによる変異体TAR RNAの低減された結合
（10、11、12、13、14、15、16、17） 図10ないし図17に示されるグラフは、TAR RNAと様々
な変異体TAR RNA配列との間のtat結合に対する競合を
例示する。数値データは表２および表３に与えられる。
図10および図11において、残基23がＵである状態で、位
置23、24、25で３つの対になっていない残基を含む領域
は、tat結合にとって極めて重要であることが示され
る。図12、13、14、15、16および図17において、Ｕの豊
富なバルジにすぐ隣接するステムの塩基対は効率的なta
t結合に必要とされることが示され、バルジの一方側で
の残基22および40での結合対、およびバルジの他方側で
の塩基対G26−C39に対する要求が存在する。
表２および表３において、様々な変異体TAR RNA配列
に対するＤ1/2値は、変化したTAR RNA配列がCATレポー
タプラスミドD5−３−３に導入されたトランス活性化実
験の結果とともに与えられる。弱く結合するTAR RNA配
列は弱いコンペチターであり、Ｄ1/2に対して増大され
た値を示す。すべての場合に、弱くtatを結合する変異
体は効率的にトランス活性化しない。
方法 競合RNAは図７に対する方法で説明されるように転写
によって生産された。結合反応物（500ul）は500ulの最
終容量中に20nMのTAR RNA、20,000dpm32P標識したTAR
RNA、0.5ugの子ウシ胸腺DNA、0.2ugの酵母tRNA、40ユ
ニットのRNasin（プロメガ）、50mMのトリス−HCI pH
7.5、20mMのKClを含んだ。０から1000nMの様々な濃度で
冷たい競合RNAを添加した後、結合は2ulのtatプロテイ
ン（220ug/ml）を添加することによって開始された。結
合反応混合物はそれから予め洗浄されたニトロセルロー
スフィルタ（ミリポア0.45u孔サイズ）を通して濾過さ
れ、フィルタ上に保持された放射能は乾燥されたフィル
タの液体シンチレーション計数によって検定された。
tatプロテインによる化学的に合成されたRNAの結合（図
18および図19） 図18aは本発明者らが上に示した59残基の全長TAR RN
Aの構造がtatプロテインによって結合されることを示
す。ボックス化された残基は特異的な認識において明ら
かに特に重要であるものである。59−merは上述のよう
に転写によって調製される（図６）。より短いRNAフラ
グメントがtatプロテインによって結合され得るかどう
かを決定するために、29残基の合成オリゴリボヌクレオ
チド（図18b）は折り畳んでループおよびＵの豊富なバ
ルジを含むTARの頂上部分を発生することが可能な配列
ｒ（GCCAGAUUUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGC）（29−mer）から
化学的に合成された。このオリゴヌクレオチドは市販で
入手可能な材料および試薬を使用して、前に述べられた
ように（102）標準的な固相合成方法によって調製され
た。２つの他のオリゴリボヌクレオチドもまた標準的な
方法（102）を使用して化学的に合成された。これらは1
7−mer ｒ（AGCCAGAUUUGAGCAGC）および14−mer ｒ
（GCUGCUCUCUGGCU）である。アニールされた場合、これ
らのオリゴリボヌクレオチドはtatプロテインに対する
既知の認識配列に対応するＵの豊富なバルジおよびフラ
ンキング塩基対を含むが、頂ループ（103）に欠ける二
重鎖RNA（図18c）を形成することが可能である。
図19および表４は59−mer転写物のtatへの結合を化学
的に合成された29−merのそれおよび化学的に合成され
た二重鎖14−mer＋17−merのそれと比較するための競合
フィルタ結合検定の結果を示す。これらの実験におい
て、均一的に32P標識した転写物（10nM）は０−300nMの
標識していない競合RNAに対して競合された。その結果
は双方の化学的に合成された種（29−merおよび14−mer
＋17−mer）はtatへの結合については59−merと満足に
競合したが、各場合に0.4のKrelを与えるＤ1/2が２−３
倍だけ増大したことを示す。これは化学的に合成された
RNAはtatプロテインに結合可能であり、タンパク質の抑
制因子として作用し得ることを示す。
方法 ａ）59−mer転写物の調製 これはミリガン（Milligan）他（104）の方法によっ
て本質的に実行された。転写反応物（放射性標識したも
のについては0.12ml、標識していないものについては0.
9ml）は、0.5mMaのアニールした合成オリゴデオキシリ
ボヌクレオチド鋳型およびT7 プライマー、40mMのトリ
スHCl（37℃でpH8.2）、10mMのMgCl2、5mMのDTT、1mMの
スペルミジン、0.01％のトリトン（Triton）X100、50ug
/mlのアセチル化されたBSA（アングリアン・バイオテッ
ク（Anglian Biotech））、0.6％のポリエチレングリコ
ール6000（コッチ・ライト（Koch Ligh））、各2mMのAT
P、GTP、CTP、およびUTP、3.3ユニット/mlのRNasin（プ
ロメガ）ならびにT7 RNAポリメラーゼ（10−30ユニッ
ト/ul）を含んだ。放射性標識付けのために、100uCiの
アルファ32P−UTPが添加された。反応は37℃で２時間続
くようにされ、25mMまでのEDTAの添加によってストップ
され、フェノール抽出され、水相はブタノール抽出（10
5）によってペレットにとられ、所望の59−merは10％ゲ
ル上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって精製さ
れ、その後前のように（105）0.5Mの酢酸アンモニウ
ム、1mMのEDTA、0.5％のドデシル硫酸ナトリウムおよび
ブタノール抽出でゲルから溶出された。転写物は1mMのE
DTA（pH7.4）中で保存された。
ｂ）オリゴリボヌクレオチドの化学合成 これはアプライド・バイオシステムズ380B DNAシン
セサイザーおよび試薬を使用して前述（102）のように
本質的に行なわれ、リボヌクレオシドホスホルアミダイ
ト（Ｕ、bzA、bzCおよびibG）はミリゲン（Milligen）
から得られた。脱保護の後、オリゴリボヌクレオチドは
説明されたように（102）イオン交換h.p.l.c.によっ
て、または説明されたように（102）ポリアクリルアミ
ドゲル電気泳動によって精製され、滅菌水中で保存され
た。
ｃ）競合結合検定 TK緩衝液（50mMのトリスHCl（0.5Mおよび22℃でpH7.
9）、20mMのKCl）中の競合検定反応物（0.5ml）は、10n
M32P標識した59−mer（約20,000cpm）、40nMのtatプロ
テイン、5ug/mlの子ウシ胸腺DNA、2ug/mlの酵母tRNA、4
0ユニットのRNasin（プロメガ）および様々な濃度（０
−300nM）の標識していない競合RNA（59−mer、29−mer
または予めアニールした（90℃からゆっくり冷却され
た）14−merおよび17−mer）を含んだ。結合は氷上で２
−15分間起こるようにされ、各反応物は二度予め洗浄さ
れた（0.6mlの氷のように冷たいTK緩衝液）ミリポアGS
フィルタ（2.5cmディスク、0.22um孔）を通して濾過さ
れ、フィルタはTK緩衝液（0.6ml）で洗浄された。乾燥
されたフィルタは液体シンチレーションによってカウン
トされた。結果は添加された競合RNAの濃度に対するフ
ィルタ上に保持されたカウントを示すグラフ（図19）上
にプロットされた。
単一のヌクレオシド残基が修飾ヌクレオシドと置換され
る合成TAR類似体（図20、21、22、23および24） tatによる認識に直接含まれるTAR上の官能基をさらに
規定するために、かつまた修飾されたTAR構造がtatプロ
テインを結合することが可能であるかどうかを決定する
ために、TAR類似体は化学的に合成され、そのtat結合特
性を修飾されていないTAR RNAと比較された。
図20aはTAR配列におけるU23に対応する残基が２′−
デオキシウリジン（dU）か２′−Ｏ−メチルウリジン
（２′−OMeU）のいずれかによって置換された化学的に
合成された29−merの構造を示す。図20bは化学的に合成
された14−merオリゴリボヌクレオチドおよび化学的に
合成されたれ17−merオリゴリボヌクレオチドから形成
されたRNA二重鎖の構造を示し、そこではU23、U24また
はU25のいずれかに対応する残基は、２′−デオキシチ
ミジンかまたは５−ブロモ−２′−デオキシウリジンか
のいずれかによって単独に置換される。
図21および表４は合成29−merのtatへの結合をU23で
修飾された化学的に合成された29−merのそれと比較す
るための競合フィルタ結合検定の結果を示す。これらの
実験において、32P−末端標識した29−mer（10nM）は０
−120nMの標識していない競合RNAに対して競合された。
その結果はdUか２′−OMeUのいずれかを含む双方の化学
的に合成された29merは、tatへの結合に対して修飾され
ていない29−merと同様に競合したことを示す。これは
糖残基で修飾を有する化学的に合成されたオリゴリボヌ
クレオチドはtatプロテインに結合し、tatプロテインの
阻害剤として作用し得ることを示す。またU23での２′
−ヒドロキシル基はtatによる認識に含まれないようで
あることも明らかである。
図22および表４は17−mer＋14−merの合成二重鎖のta
tへの結合を、U23またはU24またはU25が２−デオキシチ
ミジンによって置換された17−mer＋14−merの合成二重
鎖のそれと比較するための競合フィルタ結合検定の結果
を示す。これらの実験において、標識していない14−me
rにアニールされた32P−末端標識した17−mer（10nm）
は、修飾された17−merおよび修飾されていない14−mer
から形成された０−120nMの標識していない競合RNAに対
して競合された。
図23および24ならびに表４は、17−mer＋14−merの合
成二重鎖のtatへの結合を、U23またはU24、またはU25が
５−ブロモ−２′−デオキシウリジンによって置換され
た修飾17−mer＋14−merの合成二重鎖のそれと比較する
ための競合フィルタ結合検定の結果を示す。これらの実
験において、32P−末端標識した29−mer（10nM）は、修
飾された17−merおよび修飾されていない14−merから形
成された０−120nMの標識していない競合RNAに対して競
合された。
結果は位置23または24での２′−デオキシチミジンに
よる置換は競合に何の影響も及ぼさなかったが、位置25
での置換はＤ1/2の２−３分の１の低下を生じたことを
示す。また位置24または25での５−ブロモ−２′デオキ
シウリジンによる置換は競合に何の影響も及ぼさなかっ
たが、位置23での置換はＤ1/2における２分の１の低下
を生じた。これは同時に修飾された糖および塩基残基を
含む化学的に合成されたオリゴリボヌクレオチドはtat
プロテインを結合可能であり、tatプロテインの阻害剤
として作用し得ることを示す。
方法 ａ）29−merまたは17−merの32P末端標識付け 50ulの標識付け反応物は、約200−300pモルの29−mer
または17−mer、500pモルのATPおよび40uCのガンマ−32
P−ATP、50nMのトリスHCl（pH7.4）、10mMのMgCl2、10m
MのDTT、0.77％のスペルミジンおよび５ユニットのT4ポ
リヌクレオチドキナーゼ（NEB）を含み、37℃で20−30
分間実行された。90℃で２分間加熱した後、第２の反応
がさらに５ユニットのT4ポリヌクレオチドキナーゼを使
用して37℃で20−30分間実行された。標識した29−mer
または17merは15％ゲル（29−mer）または20％ゲル（17
−mer）上のポリアクリルアミドゲル電気泳動によって
精製され、59−mer転写物に対して上で説明したように
溶出され、ブタノール抽出され、1mM EDTA中で保存さ
れた。
ｂ）修飾された29−merの合成 適切な位置で２′−デオキシウリジン（グレン・リサ
ーチ（Glen Research））、または２′−Ｏ−メチルウ
リジン（グレン・リサーチ）のホスホルアミダイト（ph
osphoramidite）が結合反応において添加されたことを
除いて、各修飾された29−merの化学合成は修飾されて
いない29−merについて上述したように実行された。精
製は前に述べられたように（102）ポリアクリルアミド
ゲル電気泳動によって行なわれた。
ｃ）修飾された17−merの合成 適切な位置で５−ブロモ−２′−デオキシウリジン
（グレン・リサーチ）のホスホルアミダイトが結合反応
において添加されたことを除いて、５−ブロモ−２′−
デオキシウリジン修飾を行なう17−merの化学合成は、
修飾されていない17−merについて上に述べられたよう
に実行された。２′−デオキシチミジン修飾を行なう17
−merの化学合成は前に述べられた方法（102）によって
実行されたが、フェノキシアセチル（ABNから得られ
る）によって保護されたグアノシンおよびアデノシンの
リボホスホルアミダイトを使用し、かつ適切な位置でチ
ミジンホスホルアミダイト（アプライド・バイオシステ
ムズ）が結合反応において添加された。これらのオリゴ
ヌクレオチドのアンモニア脱保護は、修飾された条件下
（室温で20−24時間飽和されたメタノール性アンモニ
ア）実行された。すべての修飾された17−merは前に説
明されたように（102）イオン交換h.p.l.c.によって精
製された。
ｃ）競合結合検定 TK緩衝液中の競合結合反応物（0.5ml）は、32P−標識
したおよび標識していない29−mer（約20,000cpm）から
形成された10nMの二重鎖、または32P−標識したおよび
標識していない14−merにアニールされた標識していな
い17−merから形成された10nMの二重鎖、40nMのtatプロ
テイン、5ug/mlの子ウシ胸腺DNA、2ug/mlの酵母tRNA、
および様々な濃度（０−120nM）の標識していない競合R
NA（29−merまたは修飾された29−mer（図21）、または
17−mer＋14−mer二重鎖または修飾された17−mer＋14
−mer二重鎖（22、23および24）を含み、上述のように
実行された。
化学的に合成された修飾されたTARのtatプロテインに対
する増強された結合 図25は化学的に合成された15−merオリゴリボヌクレ
オチド、およびU23、U24またはU25のいずれかに対応す
る残基が４−チオ−２′−デオキシチミジンによって単
に置換される化学的に合成された18−merオリゴリボヌ
クレオチドから形成されたRNA二重鎖の構造を示す。
図26および表４は18−mer＋15−merの合成二重鎖の結
合tatを、U23またはU24またはU25が４−チオ−２′−デ
オキシチミジンによって置換された修飾18−mer＋15−m
erの合成二重鎖のそれと比較するための競合フィルタ結
合検定の結果を示す。これらの実験において、標識して
いない15−merにアニールされた32P末端標識した18−me
r（10nM）は、０−120nMの標識していない競合RNAに対
して競合された（修飾されていない18−merおよび15−m
erから形成された二重鎖、修飾された18−merおよび修
飾されていない14−merまたは59−merから形成された二
重鎖）。同じ実験において、15−merおよび18−mer二重
鎖は17−merおよび14−mer（図示せず）と同様に競合し
た。結果は各場合に４−チオ−２′−デオキシチミジン
置換を含む二重鎖は、修飾されていない15−mer＋18−m
er二重鎖よりよく競合したことを示す。これは化学的に
修飾されたオリゴリボヌクレオチドは修飾されていない
オリゴリボヌクレオチドよりよくtatに結合可能であ
り、かつゆえにtatプロテインのよりよい阻害剤として
作用し得ることを示す。
方法 ａ）４−チオ−２′−デオキシチミジンを含むオリゴリ
ボヌクレオチドの合成 ４−チオ−２′−デオキシチミジンを含む18−merオ
リゴリボヌクレオチドは前に説明されたように（102）
合成されたが、リボホスホルアミダイトが以下のとおり
であったことを除く、つまりアデノシンおよびシチジン
はｔ−ブチルフェノキシアセチル（Dr.エヌ・シンハ
（N.Sinha）、ミリゲンからの提供）によって、グアノ
シンはフェノキシアセチル（ABN）によって保護され、
かつ４−チオＴアミダイト（amidite）は５′−Ｏ−ジ
メトキシトリチルＳ−（ｐ−ニトロフェニル）−４−チ
オチミジン２−シアノエチル−N,N−ジイソプロピルホ
スホロアミダイト（106、107）（Dr.ビィ・コノリー
（B.Connolly）、サウザンプトン（Southampton）大学
からの提供）であった。このアミダイト（無水アセトニ
トリル中100mg、0.75ml）は、合成サイクルにおける適
切な点で使用された。アンモニア脱保護が16−24時間室
温で水酸化アンモニウム／エタノール（3:1）を使用し
たことを除いて、合成の終りでのｐ−ニトロフェニル基
および塩基保護基の除去は説明されたように（107）実
行された。オリゴヌクレオチドは前に説明されたように
イオン交換h.p.l.c.によって精製され、滅菌水中で保存
された。ヘビ毒ホスホジエステラーゼおよびアルカリホ
スファターゼでの消化によるオリゴヌクレオチドの分析
は、５−メチル−２′−デオキシシチジンが４−チオＴ
誘導体のアンモニア脱保護の間何も形成されなかったこ
とを示した。
ｂ）修飾されていない18−merおよび15−merの合成 これらは上に説明されたように（102）化学的に合成
された。
ｃ）競合結合検定 TK緩衝液中の競合結合反応（0.5ml）は32P標識した
（約20,000cpm）および標識していない15−merにアニー
ルされた標識していない18−merから形成された10nM二
重鎖、40nMのtatプロテイン、5ug/mlの子ウシ胸腺DNA、
2ug/mlの酵母tRNA、および様々な濃度（０−120nM）の
標識していない競合RNA（59−merまたは18−mer＋15−m
er二重鎖、または修飾された18−mer＋15−mer二重鎖、
または修飾された18−mer二重鎖）を含み、説明された
ように実行された。
議論 tatによって示されたTARの配列特異的認識はHIVトラ
ンス活性化におけるtatに対する要求を説明する。HIV−
２ LTRの第１のステムループに由来するTAR RNAはHIV
−１ tatを結合することが可能であり、HIV−１ tat
（８、９、20、25）によってトランス活性化される。Ｕ
の豊富な泡配列を変更するか、またはTARステムループ
構造を崩壊させるTAR RNA変異はtat結合を終らせ、か
つまたトランス活性化することができない。
TARのtat認識は二重螺旋セグメントおよびG26−C39塩
基対の状況において突出したＵ残基の存在を必要とす
る。ワトソン−クリック（Watson−Crick）塩基対合が
維持される限り、TARステム全体の他の塩基対の同一性
は、トランス活性化（10、12、27）またはtat結合
（６、94）に必要とされるRNA構造への貢献は相対的に
小さい。RNAステム−ループのバルジ残基を含む配列へ
のタンパク質の結合は前例がない訳ではない。R17コー
トタンパク質結合はR17パッケージング配列におけるバ
ルジされたＡ残基（32）の存在に決定的に依存する。ta
tのTAR（12nM）に対する解離定数はRNA結合タンパク質
に対して典型的である。たとえば、3nMのKdはRev−RRE
複合体（33、34）および鉄応答エレメントRNAステム−
ループ（35）に結合する因子の双方に対して測定され
た。
さらに、バルジ領域はtatを結合するために、または
ウィルスLTRをトランス活性化するためにウリジン残基
のみを含む必要がない。感染HIV−１クローンで発見さ
れるUCUかUUUかのいずれかのバルジ配列を有するHIV−
１ TAR配列は、等価の親和力でtatを結合することが可
能であり、これらの配列の双方は効率的にトランス活性
化される。生体内データはバルジに関連して、残基U23
のみがTAR（11）のtat認識にとって重要であることを示
す。U23のＡへの変異はトランス活性化を野生型レベル
の18％まで低減することが報告されているが、U24のＡ
への変異およびU25のＧへの変異はそれぞれ（11）42％
および49％だけトランス活性化を低減するだけである。
さらに、ここに示されるように、U24のＣへの変異また
はU25のＣへの変異はトランス活性化およびtat結合にわ
ずかな影響しか及ぼさないが、U23のＣへの変異はTAR
RNAへのtat結合およびトランス活性化を激的に低減す
る。これはtatはU23を認識することを示すが、TARの構
造もまた重要であるかもしれない。RNAステムループ構
造において、バルジされた残基はバルジの塩基の数およ
び型ならびにステム（87）におけるその位置に依存して
変化する曲りまたはよじれを導入する。HIV−２ TARの
第１のステム−ループはU23に等価の塩基を含むバルジ
を有するが、この配列においてバルジは２つのウリジン
残基しか含まないので、HIV−１ tatに対するその親和
力は2.5分の１に低減される。
tat結合に必要とされないTAR RNAループにおける配
列はそれにもかかわらずトランス活性化にとって重要で
ある。バルジかまたはループかいずれかの領域における
残基の置換を有するTAR配列は、低減されているが測定
可能なトランス活性化を示す。宿主RNA結合タンパク質
はループ配列（36、37）に結合することによってトラン
ス活性化に参加するように見える。高いプラスミドレベ
ルで観察されるTAR置換変異のいくつかの部分活性化
は、tatかまたは宿主タンパク質のいずれかに対するTAR
上の弱い結合部位が制限された因子結合を考慮し得るこ
とを示す。Ｕの豊富なバルジおよびループの双方が変更
される二重変異は、単一領域における等価の変異より実
質的に低いレベルのトランス活性化を示す。
カオ（Kao）他（38）およびセルビー（Selby）他（1
2）はtatは抗ターミネータとして間接的に作用し、TAR
部位でまたはその近くでの伸張への障害を克服するのを
助けることを提案した。そのモデルは短い早期に終結さ
れたRNA転写物がtatのない場合（12、38、39）において
蓄積するという観察に基づく。このモデルに対する付加
的な支持は核追加実験に由来し、その実験はHIV−１転
写開始複合体はtat（40）が存在する場合に安定化され
ることを示し、かつTARは新生鎖（16）上で機能し得る
証拠を示す。しかしながら、抗終結はTARそれ自体では
発生しそうにない、なぜならトランス活性化を終らせる
TARでの変異またはTARの遺伝質欠失は、構造的に高いレ
ベルのLTR発現（５、12、19、27、28）を結果としても
たらさないし、tat（40）が存在する場合に全長mRNAへ
短いRNA転写物を「追跡する」ことは困難であるからで
ある。カオおよびセルビーモデルの修飾されたバージョ
ンは、そこではバクテリオファージ頭部（12）に類似の
態様で、TAR部位はRNAポリメラーゼ共同因子のための積
載部位として機能し、かつゆえにより適切であるように
思われる。転写を通じて、頭部領域はＮタンパク質とと
もに宿主タンパク質nusAおよびnusBのためのRNA結合部
位を生じ、RNAポリメラーゼおよびこれらの共同因子（4
1、42）から構成される、遠位のターミネータ（43）で
の活性を克服することが可能な、転写複合体のアセンブ
リを可能にする。tat/TAR系において、tatおよび宿主共
同因子は新生転写物上に存在するタンパク質結合部位に
よって媒介される反応においてRNAポリメラーゼと会合
することが示される。修飾されたポリメラーゼは様々な
遠位部位で伸張に対する障害を克服することによってウ
ィルスmRNA生産を刺激することが可能である。
tatはTAR上の特異的結合部位に対する高い親和力を有
するので、生体外でTARへのtat結合に干渉することが可
能な化合物は効果的な抗HIV剤であることが証明される
可能性が高いことが上から明らかであろう。
この特許の最初の出願に続いて、合成遺伝子からのTA
R RNAの生体内の過発現が結果としてHIV増殖または遺
伝子活性化（108、109）の抑制をもたらし得ることを示
す２つの報告があった。TAR RNA配列の過発現はおとり
または競合抑制因子として作用し、tatプロテインのHIV
コード化されたTAR RNA配列への結合を妨げる。結果と
して、ウィルス性遺伝子発現の活性化および後代ウィル
スの発生はない。
HIV−１ TARに対する解離定数は図９に示されるスキ
ャッチャードプロットから計算された。TAR変異株に対
する解離定数（Kd）はフィルタ結合検定で観察された半
極大結合によって見積られたものであり、これらはHIV
−１ TARに対するものほど幾分信頼性がない、なぜな
らより少ないデータが決定において使用されたからであ
り、飽和条件が常に得られたわけではないからである。
変異体配列に対するtat親和力のよりよい測定値はＤ1/2
であり、HIV−１ tatのHIV−１ TAR RNAへの結合を5
0％に低減する競合RNAの濃度である。KRelはHIV−１ T
ARおよび競合RNAに対するＤ1/2値の比率である。
表4:D1/2（tatが存在する場合の32P RNAのフィルタへ
の結合を半分に低減するために必要とされる競合RNAの
濃度）、および転写59−merまたは化学的に合成された2
9−merもしくは14＋17二重鎖と比較される様々な化学的
に合成されたRNAに対するKrel（Ｄ1/2の相対値）。Ｄ
1/2のすべての値は競合曲線から見積られ、20％のずれ
を受ける。下線は32P RNAの同一性を示す。
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NA局在化に影響を及ぼす）。
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・エフ、アルドビニ，エイ、ガロ，アール・シィおよび
ウォング−スタール，エフ（1986）。Cell 46、807−8
17）。（HTLV−III発現および生産はウィルスRNAのスプ
ライシングおよび翻訳のレベルでの複合体調節を含
む）。
54.フェルバー，ビィ・ケイ、ハドゾポウロウ−クラダ
ラス，エム、クラダラス，シィ、コウプランド，ティお
よびパブラキス，ジィ・エヌ（1989）。Proc.Natl,Aca
d.Sci.（USA）86、1495−1499）。（ヒト免疫不全ウィ
ルス型１のrevタンパク質は、ウィルスmRNAの安定性お
よび輸送に影響を及ぼす）。
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よびウォーカー，アール・ティ（1974）J.Chem.Soc.Per
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ス・−ワイ、メーゼル，ジェイ・ブイおよびカリン，ビ
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7。（HIV−１ revトランスアクチベータは構成された
標的配列を介してスプライシングされないウィルスmRNA
の核移出を活性化するように作用する）。
66.マリム，エム・エイチ、ボーンライン，エス、フェ
ンリック，アール、リ，エス・−ワイ、メーゼル，ジェ
イ・ブイおよびカリン，ビー・アール（1989b）Proc.Na
tl.Acad.Sci.（USA）86、8222−8226。（異なる霊長類
免疫不全ウィルス種によってコードされたrevトランス
アクチベータの機能的比較）。
67.マリム，エム・エイチ、ボーンライン，エス、ホー
バー、ジェイおよびカリン，ビー・アール（1989c）Cel
l 58、205−214。（HIV−１ revトランスアクチベー
タの機能的解剖:rev機能のトランス優勢抑制因子の誘
導）。
68.マリム，エム・エイチ、ティリー，エル・エス、マ
ッカーン，ディ・エフ、ルッシュ，ジェイ・アール、ホ
ーバー，ジェイおよびカリン，ビー・アール（1990）Ce
ll 60、675−683。（HIV−１構造的遺伝子発現はそのR
NA標的配列へのrevトランスアクチベータの結合を必要
とする）。
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ド，エス・エムおよびマクパーランド，ケイ・ビー（19
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ッシュマン，シー・ディ、キーン，ジェイ・エム、リ
ー，ビー・エル、リン，エス−ビー、およびムラカミ，
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ユ，シー、テュオング，エヌ・ティ、ビサーニ，イー、
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モロニー，エス・イーおよびベナー，エス・エイ（199
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チ，エム、マリム，エム・エイチ、ラングルワ，エイ、
カリン，ビー・アールおよびグリーン，ダブリュー・シ
ー（1988）Nature（ロンドン）335、738−740。（HIV−
１ revタンパク質のHTLV−１ rexタンパク質による機
能的置換）。
77.ローゼン，シー・アール、ターウィリンガー，イ
ー、デイトン，エイ・アイ、ソドロウスキー，ジェイ・
ジーおよびヘイゼルティン，ダブリュー・エイ（1988）
Proc.Natl.Acad.Sci.（USA）85、2071−2075。（ヒト免
疫不全ウィルスの遺伝子内シス作用性応答性配列）。
78 サデイエ，エム・アール、ベンター，ティおよびウ
ォン−スタール，エフ（1988）Science 239、910−91
3。（HIV−１の２つのトランス調節遺伝子（tat−III、
trs）の部位特異的突然変異誘発）。
79、ソドロウスキー，ジェイ、ゴー，ダブリュー・シ
ー、ローゼン，シー・エイ，デイトン，エイ、ターウィ
リンガー，イーおよびヘイゼルティン，ダブリュー・エ
イ（1986）Nature（ロンドン）321、412−417（HTLV−I
II複製に必要とされる第２の転写後のアクチベータ遺伝
子）。
80.スプロート，ビー・エス、レイモンド，エイ・ア
イ、ベイジャー，ビー、ニューナー，ピーおよびライダ
ー，ユー（1989）Nucleic Acids Res.、17、3373−338
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カ，ケイおよびコーエン，ジェイ・エス（1988）Nuclei
c Acids Res.、15、3209−3221。
82.サン，ジェイ−エス、フランソワ，ジェイ−シー、
レイバリ，アール、セゾン−ベイモアラ，ティ、モンテ
ネー−ガレスティア，ティ、テュオング，エヌ・ティお
よびヘレン，シー（1988）バイオケミストリ（Biochemi
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83.ブラッソフ，ブイ・ブイ、ゲイダマコフ，エス・エ
イ、ザリトバ，ブイ・エフ、クノール，ディ・ジー、ル
ビナ，エイ・エス、ニコナバ，エイ・エイ、ポダスト，
エル・エムおよびフェドロバ，オー・エス（1988）Gen
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84.ザップ，エム・エルおよびグリーン，エム・アール
（1989）Nature（ロンドン）342、714−716。（HIV−１
revタンパク質による配列特異的結合）。
85.イケハラ，エム、オオツカ，イー、トクンガ，テ
ィ、タニヤマ，ワイ、イワイ，エス、キタノ，ケイ、ミ
ヤモト，ティ、オウギ，ティ、サクラガワ，ワイ、フジ
ヤマ，ケイ、イカリ，ティ、コバヤシ，エム、ミヤケ，
ティ、シバハラ，エス、オノ，エス、ウエダ，ティ、タ
ナカ，ティ、ババ，エイチ、ミキ，エイチ、サクライ，
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ケイ（1984）Proc.Natl.Acad.Sci.USA、81、5956−596
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チ、およびリリー，ディ・エム（1990）Nature、343、4
84−487。
88.セルビー エムジェー、ベイン イーエス、ルシュ
ー ピー、ピーターリン ビーエム。TARにおけるステ
ムーループの構造、配列および位置はHIV−１ LTRによ
ってtatによる転写伸長を決定する。Genes ＆ Dev.198
9、3:547−558。
89.ラスピア エムエフ、ライス エイピー、マシュー
ズ エムビー。HIV−１ tatおよびアデノウィルスEla
の間の相乗作用は主に転写伸長の安定化による。ジェー
ンズ・アンド・ディベロップメント（Genes ＆ Develop
ment）1990、4:2397−2408。
90.ブラッドック エム、ソーバーン エイエム、チャ
ンバ エイ、エリオット ジーディ、アンダーソン ジ
ージェイ、キングスマン エイジェイ、キングスマン
エスエム。HIV−１ U3領域によって課された各翻訳遮
断はtat−TAR相互作用によってリリーフされる。Cell 1
990,62:1123−1133。
91.チン ディジェイ、セルビー エムジェイ、ピータ
ーリン ビーエム。ヒト免疫不全ウィルス型1tatは核も
しくは細胞質または霊長類細胞において成熟したトラン
ス作用性応答領域RNA種をトランス活性化しない。J.Vir
ol.1991、65:1758−1764。
92.ロイ エス、エイジー エム、ホバネシアン エイ
ジー、ゾーネンバーグ エヌ、カッツェ エムジー。ヒ
ト免疫不全ウィルス型1tat応答性構造RNAのステム構造
の完全性はインターフェロン誘導された68,000−M4プロ
ティンキナーゼとの相互作用に必要とされる。1991、6
5:632−640。
93.ガネリー エス、ライス エイピー、ロバートソン
エイチディ、マシューズ エムビー。HIV−１ TAR
RNAはプロティンキナーゼDAIの活性化を防ぐことができ
る。Proc.Natl.Acad.Sci.USA 1990、87:8686−8691。
94.ディングウォール シー、エルンバーグ アイ、ゲ
イト エムジェイ、グリーン エスエム、ヒーフィ エ
ス、カーン ジェイ、ローベ エイディ、シン エム、
スキナ エムエイ。HIV−１ tatタンパク質はTAR RNA
構造のステムにおいてＵの豊富なバルジへの結合によっ
て転写を刺激する。EMBO J.1990、9:4145−4153。
95.コーディングリー エムジー、ラフェミア アール
エル、キャラハン ピーエル、コンドラ ジェイエイ
チ、サルダナ ブイブイ、グラハム ディジェイ、ニュ
イアン ティエム、ルグローク ケイ、ゴットリブ エ
ル、シュラバック エイジェイ、コロンノ アールジェ
イ。生体外のHIV−１のTAR配列とのtatおよびtatペプチ
ドの配列特異的相互作用。Proc.Natl.Acad Sci.USA 19
90、87,8985−8989。
96.ウィークス ケイエム、アンペ シー、シュルツ
エスシー、スタイツ ティエイ、クローザーズ ディエ
ム。HIV−１ tatタンパク質のフラグメントはTAR RNA
を特異的に結合する。Science 1990、249:1282−1285。
97.サウスゲート シー、ザップ エムエル、グリーン
エムアール。不完全な84へつながれたHIV−１ tatタ
ンパク質による転写の活性化。ザップ，エム・エルおよ
びグリーン，エム・アール（1989）Nature（ロンドン）
342、714−716。（HIV−１ revタンパク質による配列
特異的結合）。
別のタンパク質を介するRNA。Nature 1990、345:640−
642。
98.セルビー エムジェイ、ピーターリン ビーエム。
異種RNA結合タンパク質を介するHIV−１ tatによるト
ランス活性化。Cell.1990、62:769−776。
99.バークハウト ビー、ガティニョール エイ、ラブ
ソン エイビー、ジーング ケイ−ティ。HIV−１ LTR
のTAR−独立的活性化:tatがプロモータの特定領域を必
要とする証拠。Cell 1990、62:757−767。
100.オカモト ティ、ベンター ティ、ジョセフス エ
スジー、サデイエ ジェイアール、ウォン−スタール
エフ。生体外のヒト免疫不全ウィルスのLTRからの転写
活性化。Virology 1990、177:606−614。
101.マーシニャック アールエイ、カルナン ビージェ
イ、フランケル エイディ、シャープ ピーエイ。HIV
−１ tatタンパク質は生体外における転写をトランス
活性化する。Cell 1990、63:791−802。
102.「オリゴヌクレオチドおよびそれらの類似体：実用
的アプローチ」におけるゲート，エムジェイ、プリッチ
ャード，シーおよびスリム，ジー（1991）、エフ・エッ
クスタイン（ed.）、オックスフォード・ユニバーシテ
ィ・プレス（Oxford University Press）、25−48。
103.サムナー−スミス，エム、ロイ，エス、バーネッ
ト，アール・ダブリュー、クーパーマン・アール、ライ
ド，エル・エスおよびゾーネンバーグ・エヌ（1991）ア
ブストラクツ・オブ・IUB・カンファレンス・オン・ヌ
クレイック・アシッズ・セラピューティックス（Abstra
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チ、フロリダ、p94。
104.ミリガン，ジェイ・エフ、グローブ，ディ・アー
ル、ウィザレル，ジー・ダブリュー、およびユーランベ
ック，オー・シー（1987）Nucleic Acids Res.、15、87
84−8799。
105.カターラ，ジーおよびブルーネル，シー（1990）Nu
cleic Acids Res.、18、201。
106.ニコホロフ，ティ・ティ、コネリー，ビー・エイ
（1991）Tetrahedron Letts.、32、2505−2508。
107.ニコホロフ，ティ・ティ、コネリー，ビー・エイ
（1991）Tetrahedron Letts.、印刷中。
108.サリンジャー，ビー・エイ、ガラルド，エイチ・エ
フ、ウンガース、ジー・イーおよびギルボア，イー（19
90）Cell 63、601−608。
109.グラハム，ジー・ジェイ、マイヨ，ジェイ・ジェイ
（1990）Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87、5817−5821。
110.ディングウォール シー、エルンバーグ アイ、ゲ
イト エムジェイ、ヒーフィー エス、カーン ジェ
イ、およびスキナー エム。トランス活性化はTAR RNA
へのHIV−１ tatタンパク質の結合を必要とする。アド
バンシィズ・フォー・AIDS（Advances for AIDS）、199
1、133−143。
───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.7 識別記号 ＦＩ Ａ６１Ｋ 48/00 Ａ６１Ｐ 31/18 Ａ６１Ｐ 31/18 Ｃ１２Ｎ 15/00 ＺＮＡＡ (72)発明者 ヒーフィイ，シャウン イギリス、シィ・ビィ・１ ３・アー ル・エス、ケンブリッジ、レイドガン ド・ロード、76 (72)発明者 ディングウォール，コリン イギリス、シィ・ビィ・１ ４・エル・ ワイ、ケンブリッジ、チェリー・ヒント ン、コンウェイ・クロース、５ 審査官 六笠 紀子 (56)参考文献 特開 平２−276577（ＪＰ，Ａ) Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ ｉ．ＵＳＡ（1989）Ｖｏｌ．86 ｐ. 6925−6929 (58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名) C12N 15/00 - 15/90 C12Q 1/68 ＣＡ（ＳＴＮ) ＲＥＧＩＳＴＲＹ（ＳＴＮ) ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)

Claims (8)

    (57)【特許請求の範囲】
  1. 【請求項１】２つの一本鎖RNAオリゴヌクレオチドによ
    って形成されるRNA二本鎖分子であって、 tatタンパク質に結合することができるものであり、か
    つ （ｉ）ｒ（AGCCAGAUUUGAGCAGC）およびｒ（GCUGCUCUCUG
    GCU）、 （ii）ｒ（AGCCAGA−dT−UUGAGCAGC）およびｒ（GCUGCU
    CUCUGGCU）、 （iii）ｒ（AGCCAGAU−dT−UGAGCAGC）および（GCUGCUC
    UCUGGCU）、 （iv）ｒ（AGCCAGAUU−dT−GAGCAGC）およびｒ（GCUGCU
    CUCUGGCU）、 （ｖ）ｒ（AGCCAGA−BrdU−UUGAGCAGC）およびｒ（GCUG
    CUCUCUGGCU）、 （vi）ｒ（AGCCAGAU−BrdU−UGAGCAGC）およびｒ（GCUG
    CUCUCUGGCU）、または （vii）ｒ（AGCCAGAUU−BrdU−GAGCAGC）およびｒ（GCU
    GCUCUCUGGCU） からなる群より選ばれるヌクレオチド配列の組合せから
    なるRNA二本鎖分子。
  2. 【請求項２】一本鎖RNAオリゴヌクレオチドであって、 tatタンパク質に結合することができるものであり、か
    つ ｒ（GCCAGAUUUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGC）、 ｒ（GCCAGA−dU−UUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGC）または ｒ（GCCAGA−2'−OmeU−UUGAGCCUGGGAGCUCUCUGGC） からなる群より選ばれるヌクレオチド配列からなる、RN
    Aオリゴヌクレオチド。
  3. 【請求項３】前記ヌクレオチド配列中の少なくとも１つ
    のホスホジエステル結合が、ホスホロチオエート、メチ
    ルホスホネート、ホスホルアミデート、ホスホトリエス
    テル、カルバメート、アセトアミデートまたはアセテー
    トで置換されている、請求項１に記載のRNA二本鎖分
    子。
  4. 【請求項４】前記ヌクレオチド配列に、反応性のチオー
    ル、アルデヒド、アジドもしくはブロモ基を有する化合
    物、またはソラレン、フェナントロリン、マスタード、
    アクリジンもしくはエリプチセンが共有結合している、
    請求項１に記載のRNA二本鎖分子。
  5. 【請求項５】前記ヌクレオチド配列に、コレステロー
    ル、ポリアミンおよびポリエチレングリコールよりなる
    群から選ばれた親油基が共有結合している、請求項１に
    記載のRNA二本鎖分子。
  6. 【請求項６】前記ヌクレオチド配列は、少なくとも１つ
    のアルファーヌクレオシドを含む請求項１に記載のRNA
    二本鎖分子。
  7. 【請求項７】tatタンパク質のTAR RNAへの結合を阻害
    する化合物を識別するための検定法であって、 試験阻害化合物の存在下で、請求項１に記載のRNA二本
    鎖分子とともにtatタンパク質をインキュベートするこ
    とと、 前記RNA二本鎖分子に結合されるtatタンパク質の量を測
    定することとを含み、 前記試験阻害化合物の存在下で前記tatタンパク質の前
    記RNA二本鎖分子への結合が前記試験阻害化合物の不在
    下での結合に対して減少することが、阻害を示すもので
    ある、検定法。
  8. 【請求項８】tatタンパク質のTAR RNAへの結合を阻害
    する化合物を識別するための検定法であって、 試験阻害化合物の存在下で、請求項２に記載のRNAオリ
    ゴヌクレオチドとともにtatタンパク質をインキュベー
    トすることと、 前記RNAオリゴヌクレオチドに結合されるtatタンパク質
    の量を測定することとを含み、 前記試験阻害化合物の存在下で前記tatタンパク質の前
    記RNAオリゴヌクレオチドへの結合が前記試験阻害化合
    物の不在下での結合に対して減少することが、阻害を示
    すものである、検定法。
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