JP3476509B2 - 熱力学的に安定なループを有するヘアピン型リボザイム - Google Patents
熱力学的に安定なループを有するヘアピン型リボザイムInfo
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Description
【０００１】
【産業上の利用分野】本発明は、熱力学的に安定なルー
プ構造を有しリボザイム活性を有するポリリボヌクレオ
チド、該ポリリボヌクレオチドをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含むことからなる発現ベクター、該発現ベクタ
ーをトランスフェクトした宿主細胞、及び、該リボザイ
ム活性を有するポリリボヌクレオチドによる基質ポリリ
ボヌクレオチドの特定部位の切断方法に関する。
プ構造を有しリボザイム活性を有するポリリボヌクレオ
チド、該ポリリボヌクレオチドをコードするＤＮＡ、該
ＤＮＡを含むことからなる発現ベクター、該発現ベクタ
ーをトランスフェクトした宿主細胞、及び、該リボザイ
ム活性を有するポリリボヌクレオチドによる基質ポリリ
ボヌクレオチドの特定部位の切断方法に関する。
【０００２】
【従来の技術】タバコリングスポットウイルスのサテラ
イトＲＮＡの＋鎖やアボカドサンブロッチウイロイドの
＋鎖や−鎖は、Mg2+存在下自分自身の触媒活性で切断さ
れる(Science 231,1577-1580(1986)) 。この切断活性に
必要なＲＮＡの構造が明らかにされ、ハンマーヘッド型
リボザイムと名付けられた。(Nucleic Acids Res. 14,3
627-3640(1986))。 このリボザイムを用いた標的ＲＮＡ
の配列特異的切断法も開発された(Nucleic Acids Res.,
17, 7059-7071(1989)) 。
イトＲＮＡの＋鎖やアボカドサンブロッチウイロイドの
＋鎖や−鎖は、Mg2+存在下自分自身の触媒活性で切断さ
れる(Science 231,1577-1580(1986)) 。この切断活性に
必要なＲＮＡの構造が明らかにされ、ハンマーヘッド型
リボザイムと名付けられた。(Nucleic Acids Res. 14,3
627-3640(1986))。 このリボザイムを用いた標的ＲＮＡ
の配列特異的切断法も開発された(Nucleic Acids Res.,
17, 7059-7071(1989)) 。
【０００３】一方、タバコリングスポットウイルスのサ
テライトＲＮＡの−鎖も切断反応を起こし、特定部位で
の切断が明らかにされた(Nature 323, 349-353(1986))
。又、近年この切断に必要なＲＮＡの最小領域が明ら
かにされた。(Biochemistry,28,4929-4933(1989)) 。こ
の触媒活性を持つＲＮＡは５０ヌクレオチドから成り、
このＲＮＡ内にヘアピンループ構造を有するモデルが提
唱され、ヘアピン型リボザイムと名付けられた。本発明
者らや他の研究グループは、このヘアピン型リボザイム
のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、切断反応
に重要ないくつかのヌクレオチドを明らかにしている。
(Nature 354,320-322(1991),Nucleic Acids Res. 19,68
33-6838(1991))。また、最近Burke らのグループでは、
ランダムな変異をもつＤＮＡとＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）法を用いたin vitro selectionによってヘアピ
ン型リボザイムの切断反応と連結反応に重要な塩基配列
を明らかにしている。(Gene & Development 6, 129-134
(1992)) 。本発明者らは、ヘアピンループ部分を欠失し
たＲＮＡでも触媒反応が進行することも明らかにしてい
る(Nuceic Acids Res. 19, 6833-6838(1991)) 。
テライトＲＮＡの−鎖も切断反応を起こし、特定部位で
の切断が明らかにされた(Nature 323, 349-353(1986))
。又、近年この切断に必要なＲＮＡの最小領域が明ら
かにされた。(Biochemistry,28,4929-4933(1989)) 。こ
の触媒活性を持つＲＮＡは５０ヌクレオチドから成り、
このＲＮＡ内にヘアピンループ構造を有するモデルが提
唱され、ヘアピン型リボザイムと名付けられた。本発明
者らや他の研究グループは、このヘアピン型リボザイム
のヌクレオチドを他のヌクレオチドに変換し、切断反応
に重要ないくつかのヌクレオチドを明らかにしている。
(Nature 354,320-322(1991),Nucleic Acids Res. 19,68
33-6838(1991))。また、最近Burke らのグループでは、
ランダムな変異をもつＤＮＡとＰＣＲ（ポリメラーゼ連
鎖反応）法を用いたin vitro selectionによってヘアピ
ン型リボザイムの切断反応と連結反応に重要な塩基配列
を明らかにしている。(Gene & Development 6, 129-134
(1992)) 。本発明者らは、ヘアピンループ部分を欠失し
たＲＮＡでも触媒反応が進行することも明らかにしてい
る(Nuceic Acids Res. 19, 6833-6838(1991)) 。
【０００４】一方、近年のＲＮＡの合成法の発展により
ＲＮＡを大量に得ることが可能になり、ＲＮＡの高次構
造や物理化学的性質に関する研究が活発になってきた。
バクテリオファージＴ4 のｍＲＮＡや、大腸菌の１６Ｓ
リボゾームＲＮＡでは、高頻度に5'CUUCGG3'配列が存在
し、この配列が形成するヘアピンループ構造が熱力学的
に安定であることが明らかにされた(Pro.Nat. Acad. Sc
i. USA, 85, 1364-1368,(1988):Nature, 346,680-682,
(1990))。
ＲＮＡを大量に得ることが可能になり、ＲＮＡの高次構
造や物理化学的性質に関する研究が活発になってきた。
バクテリオファージＴ4 のｍＲＮＡや、大腸菌の１６Ｓ
リボゾームＲＮＡでは、高頻度に5'CUUCGG3'配列が存在
し、この配列が形成するヘアピンループ構造が熱力学的
に安定であることが明らかにされた(Pro.Nat. Acad. Sc
i. USA, 85, 1364-1368,(1988):Nature, 346,680-682,
(1990))。
【０００５】
【発明が解決しようとする課題】本発明者らは、リボザ
イム内に１か所存在するヘアピンループのヌクレオチド
配列が上記の熱力学的に安定な5'CUUCGG3'配列であるポ
リリボヌクレオチドを調製し、このポリリボヌクレオチ
ドが高いリボザイム切断活性を有することを見出し、本
発明を完成した。本発明におけるリボザイムは熱力学的
に安定なヘアピンループ構造を有していることより、生
体内で目的のポリリボヌクレオチドを効率よく切断する
ことが期待される。
イム内に１か所存在するヘアピンループのヌクレオチド
配列が上記の熱力学的に安定な5'CUUCGG3'配列であるポ
リリボヌクレオチドを調製し、このポリリボヌクレオチ
ドが高いリボザイム切断活性を有することを見出し、本
発明を完成した。本発明におけるリボザイムは熱力学的
に安定なヘアピンループ構造を有していることより、生
体内で目的のポリリボヌクレオチドを効率よく切断する
ことが期待される。
【０００６】
【課題を解決するための手段】本発明は、
（１）分子中に、以下の一般式（Ｉ）：
【０００７】
【化３】
【０００８】で示されるヌクレオチド配列を含むポリリ
ボヌクレオチド（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃ
は、シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチ
ド、Ｇは、グアニンヌクレオチドを表し、Ｓはアデニン
ヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｑ1 〜Ｑn は同一又は異なってウラシルヌクレオチ
ド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又は
グアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn は
Ｑ1 〜Ｑn にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ
1 〜Ｗ4 は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、ア
デニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニ
ンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチドの
いずれかを表し、ｍ，ｎは同一又は異なって１〜１０の
整数を表す。）に関し、好適には、 （２）（１）記載の一般式（Ｉ）において、Ｓがアデニ
ンヌクレオチドであり、ｎが３であるポリリボヌクレオ
チドである。
ボヌクレオチド（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃ
は、シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチ
ド、Ｇは、グアニンヌクレオチドを表し、Ｓはアデニン
ヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表
し、Ｑ1 〜Ｑn は同一又は異なってウラシルヌクレオチ
ド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又は
グアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn は
Ｑ1 〜Ｑn にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ
1 〜Ｗ4 は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、ア
デニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニ
ンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又
は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチ
ド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチドの
いずれかを表し、ｍ，ｎは同一又は異なって１〜１０の
整数を表す。）に関し、好適には、 （２）（１）記載の一般式（Ｉ）において、Ｓがアデニ
ンヌクレオチドであり、ｎが３であるポリリボヌクレオ
チドである。
【０００９】最適には、以下の化合物及びである。
【００１０】
【化４】
【００１１】
【化５】
【００１２】また、本発明は、
（３）以下の一般式(II)で示されるヌクレオチド配列を
含むポリリボヌクレオチドαを用いて、一般式(II)で示
されるヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチドβ
を式中の矢印の部位において切断する方法：
含むポリリボヌクレオチドαを用いて、一般式(II)で示
されるヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチドβ
を式中の矢印の部位において切断する方法：
【００１３】
【化６】
【００１４】（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｓはアデニンヌクレオ
チド又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｑ1
〜Ｑn は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn はＱ1 〜Ｑ
n にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ1 〜Ｗ4
は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌ
クレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又は異なっ
てウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シト
シンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオ
チド、シトシンヌクレオチド又は、グアニンヌクレオチ
ドのいずれかを表し、Ｌはウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｖは、Ｓがシトシンヌクレオチドの場合にはア
デニンヌクレオチドを表し、Ｓがアデニンヌクレオチド
の場合には、ウラシルヌクレオチド又はシトシンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｙ1 〜Ｙ4 はＷ1 〜Ｗ4 にそ
れぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｚ1 〜Ｚm はＸ1
〜Ｘm にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、ｍ，ｎ
は同一又は異なって１〜１０の整数を表す。）に関し、
好適には、 （４）（３）記載の一般式(II)において、Ｓがアデニン
ヌクレオチドでｎが３であるポリリボヌクレオチドαを
用いて、ＬがウラシルヌクレオチドでＶがシトシンヌク
レオチドであるポリリボヌクレオチドβを切断する方法
である。
シトシンヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇ
はグアニンヌクレオチドを表し、Ｓはアデニンヌクレオ
チド又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｑ1
〜Ｑn は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニン
ヌクレオチドのいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn はＱ1 〜Ｑ
n にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ1 〜Ｗ4
は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌ
クレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又は異なっ
てウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シト
シンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｐはウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオ
チド、シトシンヌクレオチド又は、グアニンヌクレオチ
ドのいずれかを表し、Ｌはウラシルヌクレオチド、アデ
ニンヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｖは、Ｓがシトシンヌクレオチドの場合にはア
デニンヌクレオチドを表し、Ｓがアデニンヌクレオチド
の場合には、ウラシルヌクレオチド又はシトシンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｙ1 〜Ｙ4 はＷ1 〜Ｗ4 にそ
れぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｚ1 〜Ｚm はＸ1
〜Ｘm にそれぞれ相補的なヌクレオチドを表し、ｍ，ｎ
は同一又は異なって１〜１０の整数を表す。）に関し、
好適には、 （４）（３）記載の一般式(II)において、Ｓがアデニン
ヌクレオチドでｎが３であるポリリボヌクレオチドαを
用いて、ＬがウラシルヌクレオチドでＶがシトシンヌク
レオチドであるポリリボヌクレオチドβを切断する方法
である。
【００１５】本発明のポリリボヌクレオチドは高いリボ
ザイム活性を有し（以下、「リボザイム・ポリリボヌク
レオチド」という。）、細胞中で一定の配列を有するポ
リリボヌクレオチドを特異的に切断する能力を有する。
したがって、植物・動物又は人体を問わずこれらの生体
に悪影響をもたらすポリリボヌクレオチドが存在する場
合には、リボザイム・ポリリボヌクレオチドを用いた生
体内にて特異的に該ポリリボヌクレオチドを切断するこ
とが可能である。
ザイム活性を有し（以下、「リボザイム・ポリリボヌク
レオチド」という。）、細胞中で一定の配列を有するポ
リリボヌクレオチドを特異的に切断する能力を有する。
したがって、植物・動物又は人体を問わずこれらの生体
に悪影響をもたらすポリリボヌクレオチドが存在する場
合には、リボザイム・ポリリボヌクレオチドを用いた生
体内にて特異的に該ポリリボヌクレオチドを切断するこ
とが可能である。
【００１６】本発明のＤＮＡは、本発明のリボザイム・
ポリリボヌクレオチドをコードするものであり、好適な
ベクターを用いて細胞内に取り込ませることにより所望
のポリリボヌクレオチドを特異的に切断する能力を有す
る。対象とする細胞は、植物・動物又は人体を問わな
い。
ポリリボヌクレオチドをコードするものであり、好適な
ベクターを用いて細胞内に取り込ませることにより所望
のポリリボヌクレオチドを特異的に切断する能力を有す
る。対象とする細胞は、植物・動物又は人体を問わな
い。
【００１７】また、本発明の切断方法のうち、好適には
（４）記載の切断方法である。 本発明の前記一般式
（Ｉ）又は(II)で示される化合物は、塩の形で使用する
ことができる。そのような塩としては、例えばナトリウ
ム、カリウムのようなアルカリ金属；カルシウムのよう
なアルカリ土類金属；アンモニア；リジン、アルギニン
のような塩基性アミノ酸；トリエチルアミンのようなア
ルキルアミン類；などの無機塩又は有機塩を挙げること
ができる。
（４）記載の切断方法である。 本発明の前記一般式
（Ｉ）又は(II)で示される化合物は、塩の形で使用する
ことができる。そのような塩としては、例えばナトリウ
ム、カリウムのようなアルカリ金属；カルシウムのよう
なアルカリ土類金属；アンモニア；リジン、アルギニン
のような塩基性アミノ酸；トリエチルアミンのようなア
ルキルアミン類；などの無機塩又は有機塩を挙げること
ができる。
【００１８】本発明のポリリボヌクレオチドは、Americ
an Bionetics社より購入した、２´−水酸基をtert−ブ
チルジメチルシリル基、５´−水酸基をジトメキシトリ
チル基で保護したヌクレオシド３´−Ｏ−ホスホロアミ
ダイト体を用いて、AppliedBiosystem社のＤＮＡ／ＲＮ
Ａ自動合成機により所望の配列のものを合成することが
できる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5764-5768,
(1988))。
an Bionetics社より購入した、２´−水酸基をtert−ブ
チルジメチルシリル基、５´−水酸基をジトメキシトリ
チル基で保護したヌクレオシド３´−Ｏ−ホスホロアミ
ダイト体を用いて、AppliedBiosystem社のＤＮＡ／ＲＮ
Ａ自動合成機により所望の配列のものを合成することが
できる(Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 85, 5764-5768,
(1988))。
【００１９】リン酸基についたβ−シアノエチル基の除
去、ポリリボヌクレオチド鎖の担体からの切り出し及び
塩基部のアシル基の除去をアルカリ処理により行い、テ
トラブチルアンモニウムフルオリド処理により２´−水
酸基の保護基を除去し、酸処理を行って５´−水酸基の
保護基を除去する。これに続く脱塩処理、逆相およびイ
オン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフ
ィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常
の核酸精製に用いられる精製操作で精製することによ
り、前記一般式（Ｉ）又は(II)に示される化合物を得る
ことができる。
去、ポリリボヌクレオチド鎖の担体からの切り出し及び
塩基部のアシル基の除去をアルカリ処理により行い、テ
トラブチルアンモニウムフルオリド処理により２´−水
酸基の保護基を除去し、酸処理を行って５´−水酸基の
保護基を除去する。これに続く脱塩処理、逆相およびイ
オン交換クロマトグラフィー（高速液体クロマトグラフ
ィーを含む。）等の各種クロマトグラフィーなど、通常
の核酸精製に用いられる精製操作で精製することによ
り、前記一般式（Ｉ）又は(II)に示される化合物を得る
ことができる。
【００２０】リボザイム・ポリリボヌクレオチドによる
基質ポリリボヌクレオチド鎖のinvitro 切断反応は、以
下の操作により行うことができる。
基質ポリリボヌクレオチド鎖のinvitro 切断反応は、以
下の操作により行うことができる。
【００２１】基質として用いるポリリボヌクレオチドの
５´末端をラジオアイソトープ等で標識する。この標識
ポリリボヌクレオチドに対し、塩化マグネシウム含有緩
衝液中にてリボザイム・ポリリボヌクレオチドを加え加
温する。
５´末端をラジオアイソトープ等で標識する。この標識
ポリリボヌクレオチドに対し、塩化マグネシウム含有緩
衝液中にてリボザイム・ポリリボヌクレオチドを加え加
温する。
【００２２】反応温度は、０〜１００℃が好適であり、
さらに好適には３０〜５０℃である。
さらに好適には３０〜５０℃である。
【００２３】一定時間後、反応液中にEDTAを加えること
により反応を停止させ、この溶液についてホモクロマト
グラフィーを行う。切断生成物をFujiバイオイメージア
ナライザーBAS 2000システムで定量することにより切断
率を算出することができる。
により反応を停止させ、この溶液についてホモクロマト
グラフィーを行う。切断生成物をFujiバイオイメージア
ナライザーBAS 2000システムで定量することにより切断
率を算出することができる。
【００２４】リボザイム・ポリリボヌクレオチドをコー
ドするＤＮＡ鎖は、Applied Biosystems 社ＤＮＡ自動
合成機により合成することができる。得られたＤＮＡの
配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法
(Maxam,A.M.and Gilbert,W.(1980):“Methods in Enzym
ology ”65,499-559) やＭ１３ファージを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法(Messing,J.and Vieira,J.(1
982)Gene 19,269-276)等により行なうことができる。
ドするＤＮＡ鎖は、Applied Biosystems 社ＤＮＡ自動
合成機により合成することができる。得られたＤＮＡの
配列決定は、例えばマキサム−ギルバートの化学修飾法
(Maxam,A.M.and Gilbert,W.(1980):“Methods in Enzym
ology ”65,499-559) やＭ１３ファージを用いるジデオ
キシヌクレオチド鎖終結法(Messing,J.and Vieira,J.(1
982)Gene 19,269-276)等により行なうことができる。
【００２５】また、このＤＮＡ鎖をアニーリングするこ
とにより二本鎖とし、ＤＮＡリガーゼを用いて細胞内で
作用するプロモーターの支配下に該二本鎖ＤＮＡを連結
し、発現ベクターを構築することができる。
とにより二本鎖とし、ＤＮＡリガーゼを用いて細胞内で
作用するプロモーターの支配下に該二本鎖ＤＮＡを連結
し、発現ベクターを構築することができる。
【００２６】この発現ベクターを宿主細胞へ導入するこ
とにより、本発明の宿主細胞を得ることができ、また、
同時に本発明の発現ベクターを量産することができる。
とにより、本発明の宿主細胞を得ることができ、また、
同時に本発明の発現ベクターを量産することができる。
【００２７】宿主細胞としては以下のものが例示され
る。
る。
【００２８】原核細胞の宿主細胞としては、例えば大腸
菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis) 等
が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形
質発現させるには、宿主細胞と適合し得る種由来のレプ
リコン、すなわち複製起点及び調節配列を含んでいるプ
ラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクトさせれ
ばよい。また、ベクターはトランスフェクトされた細胞
に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる
配列を持つものが好ましい。
菌(Escherichia coli)や枯草菌(Bacillus subtilis) 等
が挙げられる。目的の遺伝子をこれらの宿主細胞内で形
質発現させるには、宿主細胞と適合し得る種由来のレプ
リコン、すなわち複製起点及び調節配列を含んでいるプ
ラスミドベクターで宿主細胞をトランスフェクトさせれ
ばよい。また、ベクターはトランスフェクトされた細胞
に表現形質（表現型）の選択性を付与することができる
配列を持つものが好ましい。
【００２９】例えば、大腸菌としては、E.coli K12株等
がよく用いられ、ベクターとしては一般にpBR322やpUC
系のプラスミドがよく用いられるが、本発明ではこれら
に限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれ
も利用できる。
がよく用いられ、ベクターとしては一般にpBR322やpUC
系のプラスミドがよく用いられるが、本発明ではこれら
に限定されず、公知の各種の菌株及びベクターがいずれ
も利用できる。
【００３０】プロモーターとしては、大腸菌においては
トリプトファン(trp) プロモーター、ラクトース(lac)
プロモーター、トリプトファン・ラクトース(tac) プロ
モーター、リポプロテイン(lpp) プロモーター、バクテ
リオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポ
リペプチド鎖伸長因子Tu(tufB)プロモーター等が挙げら
れ、いずれのプロモーターも本発明のリボザイム・ポリ
リボヌクレオチドの産生に使用することができる。
トリプトファン(trp) プロモーター、ラクトース(lac)
プロモーター、トリプトファン・ラクトース(tac) プロ
モーター、リポプロテイン(lpp) プロモーター、バクテ
リオファージ由来のラムダ（λ）ＰＬプロモーター、ポ
リペプチド鎖伸長因子Tu(tufB)プロモーター等が挙げら
れ、いずれのプロモーターも本発明のリボザイム・ポリ
リボヌクレオチドの産生に使用することができる。
【００３１】枯草菌としては、例えば、207-25株が好ま
しく、ベクターとしてはpTUB28(Ohmura K.,et al.,(198
4),J.Biochem.,95,87-93) 等が用いられるが、本発明は
これらに限定されない。
しく、ベクターとしてはpTUB28(Ohmura K.,et al.,(198
4),J.Biochem.,95,87-93) 等が用いられるが、本発明は
これらに限定されない。
【００３２】プロモーターとしては、枯草菌のα−アミ
ラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられる。
ラーゼ遺伝子の調節配列がよく用いられる。
【００３３】真核生物の宿主細胞には、脊椎動物、昆
虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例
えば、マウスの細胞であるNIH-3T3 細胞(J.Virol.,4,54
9-553,(1969)) 、サルの細胞であるCOS 細胞(Gluzman
Y.,(1981),Cell,23,175-182) やチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞(CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
(Urlaub G.and Chasin,L.A.,(1980),Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,77,4216-4220) 等がよく用いられているが、本発
明は、これらに限定されない。
虫、酵母等の細胞が含まれ、脊椎動物細胞としては、例
えば、マウスの細胞であるNIH-3T3 細胞(J.Virol.,4,54
9-553,(1969)) 、サルの細胞であるCOS 細胞(Gluzman
Y.,(1981),Cell,23,175-182) やチャイニーズ・ハムス
ター卵巣細胞(CHO) のジヒドロ葉酸レダクターゼ欠損株
(Urlaub G.and Chasin,L.A.,(1980),Proc.Natl.Acad.Sc
i.USA,77,4216-4220) 等がよく用いられているが、本発
明は、これらに限定されない。
【００３４】脊椎動物細胞の発現ベクターとしては、通
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライシング部位、ポリアデニル化部位
及び転写終結配列等を有するものを使用でき、これらは
さらに必要に応じて複製起点を有してもよい。該発現ベ
クターの例としては、SV40の初期プロモーターを有する
pSV2dhfr(Subramani S.et al.(1981),Mol.Cell,Biol.,
1,854-864) 等を例示できるが、本発明はこれらに限定
されない。
常発現しようとする遺伝子の上流に位置するプロモータ
ー、ＲＮＡのスプライシング部位、ポリアデニル化部位
及び転写終結配列等を有するものを使用でき、これらは
さらに必要に応じて複製起点を有してもよい。該発現ベ
クターの例としては、SV40の初期プロモーターを有する
pSV2dhfr(Subramani S.et al.(1981),Mol.Cell,Biol.,
1,854-864) 等を例示できるが、本発明はこれらに限定
されない。
【００３５】また、真核微生物としては酵母も使用し得
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Ben
netzen J.and Hall B.D.,(1982),J.Biol.Chem.,257,301
8-3025) や酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター(M
iyanohara A.et al.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0,1-5) 等を使用できる。
る。該酵母等の真核微生物の発現ベクターとしては、例
えば、アルコール脱水素酵素遺伝子のプロモーター(Ben
netzen J.and Hall B.D.,(1982),J.Biol.Chem.,257,301
8-3025) や酸性ホスファターゼ遺伝子のプロモーター(M
iyanohara A.et al.(1983),Proc.Natl.Acad.Sci.USA,8
0,1-5) 等を使用できる。
【００３６】このようにして得られたベクターを導入さ
せることにより他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を
形質転換させることができる。さらに、これらのベクタ
ーに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を
導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝
子を発現させることが可能である。
せることにより他の原核生物又は真核生物の宿主細胞を
形質転換させることができる。さらに、これらのベクタ
ーに適当なプロモーター及び形質発現にかかわる配列を
導入することにより、それぞれの宿主細胞において遺伝
子を発現させることが可能である。
【００３７】宿主細胞として大腸菌を用いる場合を例に
挙げると、発現ベクターとしては、pBR322複製起点を有
し、大腸菌において自律増殖が可能であり、さらに転写
プロモーター、翻訳開始シグナルを備えたものを用いる
ことができる。該発現ベクターはカルシウム−クロライ
ド法(Mandel M.and A.Higa J.Mol.Biol.53,154,(197
0))、Hanahan の方法(Hanahan D.and M.Meselson,Gene,
10,63,(1980))及び電気パルス穿孔法(Neumann E.et a
l.,(1982)EMBO J.1,841-845) 等により大腸菌に取り込
ませることができ、かくして所望のベクターがトランス
フェクトされた細胞を得ることができる。
挙げると、発現ベクターとしては、pBR322複製起点を有
し、大腸菌において自律増殖が可能であり、さらに転写
プロモーター、翻訳開始シグナルを備えたものを用いる
ことができる。該発現ベクターはカルシウム−クロライ
ド法(Mandel M.and A.Higa J.Mol.Biol.53,154,(197
0))、Hanahan の方法(Hanahan D.and M.Meselson,Gene,
10,63,(1980))及び電気パルス穿孔法(Neumann E.et a
l.,(1982)EMBO J.1,841-845) 等により大腸菌に取り込
ませることができ、かくして所望のベクターがトランス
フェクトされた細胞を得ることができる。
【００３８】上記で得られる所望のベクターがトランス
フェクトされた細胞は、常法に従い培養することがで
き、該培養により細胞内に所望のリボザイム・ポリリボ
ヌクレオチドが産生される。該培養に用いられる培地と
しては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のも
のが適宜選択でき、例えば、上記大腸菌であればトリプ
トン−イースト培地（バクトトリプトン1.6 ％、イース
トエキストラクト1.0 ％、NaCl 10.5 ％、(pH7.0))やペ
プトン培地(DIFCO社) 等を使用できる。
フェクトされた細胞は、常法に従い培養することがで
き、該培養により細胞内に所望のリボザイム・ポリリボ
ヌクレオチドが産生される。該培養に用いられる培地と
しては、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のも
のが適宜選択でき、例えば、上記大腸菌であればトリプ
トン−イースト培地（バクトトリプトン1.6 ％、イース
トエキストラクト1.0 ％、NaCl 10.5 ％、(pH7.0))やペ
プトン培地(DIFCO社) 等を使用できる。
【００３９】また、COS 細胞を用いる場合を例に挙げる
と、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、COS
細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモ
ーター、転写終結シグナル及びＲＮＡスプライス部位を
備えたものを用いることができる。該発現ベクターはDE
AE−デキストラン法(Luthman,H.and Magnusson,G.(198
3)Nucleic Acids Res.11,1295-1308)、リン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham,F.L.and van der Ed,A.J.
(1973)Virology 52,456-457) 及び電気パルス穿孔法(Ne
umann,E.et al.(1982)EMBO J.1,841-845)等によりCOS
細胞に取込ませることができ、かくして所望のベクター
がトランスフェクトされた細胞を得ることができる。
と、発現ベクターとしては、SV40複製起点を有し、COS
細胞において自律増殖が可能であり、さらに転写プロモ
ーター、転写終結シグナル及びＲＮＡスプライス部位を
備えたものを用いることができる。該発現ベクターはDE
AE−デキストラン法(Luthman,H.and Magnusson,G.(198
3)Nucleic Acids Res.11,1295-1308)、リン酸カルシウ
ム−ＤＮＡ共沈殿法(Graham,F.L.and van der Ed,A.J.
(1973)Virology 52,456-457) 及び電気パルス穿孔法(Ne
umann,E.et al.(1982)EMBO J.1,841-845)等によりCOS
細胞に取込ませることができ、かくして所望のベクター
がトランスフェクトされた細胞を得ることができる。
【００４０】また、宿主細胞としてCHO 細胞を用いる場
合には、発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして
機能するneo 遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSV
neo(Sambrook,J.et al.(1989):“Molecular Cloning-A
Laboratory Manual ”Cold Spring Harbor Laboratory,
NY) やpSV2-neo(Southern,P.J.and Berg,P.(1982)J.Mo
l.Appl.Genet.1,327-341)等をコ・トランスフェクト
し、G418耐性のコロニーを選択することにより本発明の
リボザイム・ポリリボヌクレオチドを安定に産生するト
ランスフェクト細胞を得ることができる。
合には、発現ベクターと共に、G418耐性マーカーとして
機能するneo 遺伝子を発現し得るベクター、例えばpRSV
neo(Sambrook,J.et al.(1989):“Molecular Cloning-A
Laboratory Manual ”Cold Spring Harbor Laboratory,
NY) やpSV2-neo(Southern,P.J.and Berg,P.(1982)J.Mo
l.Appl.Genet.1,327-341)等をコ・トランスフェクト
し、G418耐性のコロニーを選択することにより本発明の
リボザイム・ポリリボヌクレオチドを安定に産生するト
ランスフェクト細胞を得ることができる。
【００４１】上記で得られる所望のベクターがトランス
フェクトされた細胞は、常法に従い培養することがで
き、該培養により細胞内にリボザイム・ポリリボヌクレ
オチドが産生される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記COS 細胞であればRPMI-1640
培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の
培地に必要に応じ牛胎児血清(FBS) 等の血清成分を添加
したものを使用できる。
フェクトされた細胞は、常法に従い培養することがで
き、該培養により細胞内にリボザイム・ポリリボヌクレ
オチドが産生される。該培養に用いられる培地として
は、採用した宿主細胞に応じて慣用される各種のものを
適宜選択でき、例えば上記COS 細胞であればRPMI-1640
培地やダルベッコ修正イーグル最小必須培地(DMEM)等の
培地に必要に応じ牛胎児血清(FBS) 等の血清成分を添加
したものを使用できる。
【００４２】本発明は、また、リボザイム・ポリリボヌ
クレオチドを用いて、基質ポリリボヌクレオチドを特異
的に切断する方法に関する。本発明の方法を生体内で実
施することにより、生体に悪影響をもたらすポリリボヌ
クレオチドを特異的に切断することが可能になる。
クレオチドを用いて、基質ポリリボヌクレオチドを特異
的に切断する方法に関する。本発明の方法を生体内で実
施することにより、生体に悪影響をもたらすポリリボヌ
クレオチドを特異的に切断することが可能になる。
【００４３】
【作用】本発明のリボザイム・ポリリボヌクレオチド
は、動物や植物、又は人体に薬理上使用できる担体とと
もに直接投与することが可能である。それらの投与形態
としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ
剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬など
による非経口投与をあげることができる。
は、動物や植物、又は人体に薬理上使用できる担体とと
もに直接投与することが可能である。それらの投与形態
としては、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ
剤等による経口投与、又は、注射剤、点滴剤、坐薬など
による非経口投与をあげることができる。
【００４４】また、本発明のリボザイム・ポリリボヌク
レオチドはリポソーム等の運搬体中に封入し投与するこ
とも可能である。
レオチドはリポソーム等の運搬体中に封入し投与するこ
とも可能である。
【００４５】その投与量は、症状、年令、体重などによ
って異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１
日約0.1mg ないし1000mgであり、これらを１回、又は数
回に分けて投与することができる。また、非経口投与で
は、１回0.1mg ないし1000mgを皮下注射、筋肉注射、又
は静脈注射によって投与することができる。
って異なるが、通常、経口投与では、成人に対して、１
日約0.1mg ないし1000mgであり、これらを１回、又は数
回に分けて投与することができる。また、非経口投与で
は、１回0.1mg ないし1000mgを皮下注射、筋肉注射、又
は静脈注射によって投与することができる。
【００４６】また、本発明のＤＮＡを好適なベクターに
組み込み該ベクターを生体に投与することにより、細胞
内でリボザイム・ポリリボヌクレオチドを発現せしめ本
発明の効果を得ることも可能である。そのようなベクタ
ーとして、レトロ・ウイルスやワクシニア・ウイルスが
例示できる。
組み込み該ベクターを生体に投与することにより、細胞
内でリボザイム・ポリリボヌクレオチドを発現せしめ本
発明の効果を得ることも可能である。そのようなベクタ
ーとして、レトロ・ウイルスやワクシニア・ウイルスが
例示できる。
【００４７】さらに、植物・動物やヒトの生体より細胞
を摘出し、該細胞に本発明の発現ベクターをトランスフ
ェクトして培養し、細胞内にて所望のリボザイム・ポリ
リボヌクレオチドを産生する能力を賦与した後に、この
トランスフェクトされた細胞を元の生体に移植して、特
定のポリリボヌクレオチドに対する耐性を該生体にもた
らすことも可能である。この方法を利用することによ
り、例えば、ヒト生体を、エイズ等の特定の疾患に関連
するポリリボヌクレオチドや、癌遺伝子に関連するポリ
リボヌクレオチドに対して耐性にすることが可能であ
る。
を摘出し、該細胞に本発明の発現ベクターをトランスフ
ェクトして培養し、細胞内にて所望のリボザイム・ポリ
リボヌクレオチドを産生する能力を賦与した後に、この
トランスフェクトされた細胞を元の生体に移植して、特
定のポリリボヌクレオチドに対する耐性を該生体にもた
らすことも可能である。この方法を利用することによ
り、例えば、ヒト生体を、エイズ等の特定の疾患に関連
するポリリボヌクレオチドや、癌遺伝子に関連するポリ
リボヌクレオチドに対して耐性にすることが可能であ
る。
【００４８】
【実施例】以下、実施例により本発明をさらに詳細に説
明するが、本発明はこれらに限定されない。
明するが、本発明はこれらに限定されない。
【００４９】実施例１ポリリボヌクレオチドの合成
５´−水酸基がジメトキシトリチル基、２´−水酸基が
tert−ブチルジメチルシリル基で保護されたヌクレオシ
ド３´−ホスホロアミダイト（アメリカン・バイオティ
ック社より購入）を用いて、ＤＮＡ自動合成機(Applied
Biosystems社製 394 DNA/RNA synthesizer) で以下の
ポリリボヌクレオチドを合成した。
tert−ブチルジメチルシリル基で保護されたヌクレオシ
ド３´−ホスホロアミダイト（アメリカン・バイオティ
ック社より購入）を用いて、ＤＮＡ自動合成機(Applied
Biosystems社製 394 DNA/RNA synthesizer) で以下の
ポリリボヌクレオチドを合成した。
【００５０】
【化７】
【００５１】ＲＮＡ断片は１μmol スケールで合成し
た。
た。
【００５２】合成終了後、合成したオリゴヌクレオチド
が結合したＣＰＧ(Controlled PoreGlass) を濃アンモ
ニア水：エタノール（３：１v/v ）混液で室温１時間処
理をし、溶媒を留去後、５mlのエタノール性飽和アンモ
ニアを加え、５５℃で１６時間加温した。溶媒を留去
し、残った溶液に１mlの１Ｍ TBAF(Tetrabutylammoniu
m fluoride)/THF(Tetrahydrofuran)溶液を加え、室温で
２４時間撹拌した。これに５mlの0.1 Ｍ Triethylammo
nium acetate(pH7.0) を加えた後、Ｃ１８シリカゲル
（ウォーターズ社製）カラムクロマトグラフィーを行な
った（カラムサイズ0.7 ×１５cm：５−４０％CH3CN,５
０mM Triethylammonium bicarbonate の溶媒をもちいた
濃度勾配により溶出）。約３０％濃度のCH3CN で溶出さ
れるジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを
集め、５mlの0.01Ｎ HCl を加え、１時間撹拌した。0.
1 Ｎアンモニア水で中和後、水層を酢酸エチルで洗浄
し、溶媒留去後滅菌水1.2ml に溶解した。この画分中の
ポリリボヌクレオチドを逆相HPLC、イオン交換HPLCで分
取し精製した。
が結合したＣＰＧ(Controlled PoreGlass) を濃アンモ
ニア水：エタノール（３：１v/v ）混液で室温１時間処
理をし、溶媒を留去後、５mlのエタノール性飽和アンモ
ニアを加え、５５℃で１６時間加温した。溶媒を留去
し、残った溶液に１mlの１Ｍ TBAF(Tetrabutylammoniu
m fluoride)/THF(Tetrahydrofuran)溶液を加え、室温で
２４時間撹拌した。これに５mlの0.1 Ｍ Triethylammo
nium acetate(pH7.0) を加えた後、Ｃ１８シリカゲル
（ウォーターズ社製）カラムクロマトグラフィーを行な
った（カラムサイズ0.7 ×１５cm：５−４０％CH3CN,５
０mM Triethylammonium bicarbonate の溶媒をもちいた
濃度勾配により溶出）。約３０％濃度のCH3CN で溶出さ
れるジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを
集め、５mlの0.01Ｎ HCl を加え、１時間撹拌した。0.
1 Ｎアンモニア水で中和後、水層を酢酸エチルで洗浄
し、溶媒留去後滅菌水1.2ml に溶解した。この画分中の
ポリリボヌクレオチドを逆相HPLC、イオン交換HPLCで分
取し精製した。
【００５３】逆相HPLCは、Inertsil ODS-2( φ１０×２
５０mm ＧＬサイエンス社製）カラムを用い、Ａ溶液と
して５％CH3CN を含む0.1 Ｍ Triethylammonium aceta
te(pH7.0) 、Ｂ溶液として２５％CH3CN を含む0.1 Ｍ
Triethylammonium acetate(pH7.0) を用い、直線濃度勾
配法により行った。
５０mm ＧＬサイエンス社製）カラムを用い、Ａ溶液と
して５％CH3CN を含む0.1 Ｍ Triethylammonium aceta
te(pH7.0) 、Ｂ溶液として２５％CH3CN を含む0.1 Ｍ
Triethylammonium acetate(pH7.0) を用い、直線濃度勾
配法により行った。
【００５４】また、イオン交換HPLCはTSKgel DEAE 2SW
(φ4.6 ×２５０mm 東ソー（株）製）カラムを用い、
Ａ溶液として２０％CH3CN/H2O 、Ｂ溶液として２０％CH
3CN を含む２Ｍ HCOONH4 溶液を用い、直線濃度勾配法
により行った。ポリリボヌクレオチドについての逆相
HPLC及びイオン交換HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセン
トと保持時間を以下の表１に示す。
(φ4.6 ×２５０mm 東ソー（株）製）カラムを用い、
Ａ溶液として２０％CH3CN/H2O 、Ｂ溶液として２０％CH
3CN を含む２Ｍ HCOONH4 溶液を用い、直線濃度勾配法
により行った。ポリリボヌクレオチドについての逆相
HPLC及びイオン交換HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセン
トと保持時間を以下の表１に示す。
【００５５】
【表１】
【００５６】また以下のポリリボヌクレオチド，は
すでにSekiguchi らによって報告されているもの(Nucle
ic Acids Res 19,6833-6838(1991))である。
すでにSekiguchi らによって報告されているもの(Nucle
ic Acids Res 19,6833-6838(1991))である。
【００５７】
【化８】
【００５８】
【化９】
【００５９】実施例２基質ポリリボヌクレオチドの５´末端標識
前述のポリリボヌクレオチド(100pmol) に［γ−
32Ｐ］ＡＴＰ(0.5μ1,5 μCi) 、緩衝液(1μl,２５０mM
Tris-HCl (pH7.6),５０mM塩化マグネシウム５０mM２−
メルカプトエタノール) 、Ｔ４ポリリボヌクレオチドキ
ナーゼ(0.5μ1,１単位 宝酒造（株））、滅菌水（３μ
l ）を加え、３７℃１時間保温した。NENSORB20(Dupont
社) を用いて、未反応の［γ−32Ｐ］ＡＴＰと塩を除い
た。これを滅菌水に溶解し、５´標識オリゴヌクレオチ
ドを得た。
32Ｐ］ＡＴＰ(0.5μ1,5 μCi) 、緩衝液(1μl,２５０mM
Tris-HCl (pH7.6),５０mM塩化マグネシウム５０mM２−
メルカプトエタノール) 、Ｔ４ポリリボヌクレオチドキ
ナーゼ(0.5μ1,１単位 宝酒造（株））、滅菌水（３μ
l ）を加え、３７℃１時間保温した。NENSORB20(Dupont
社) を用いて、未反応の［γ−32Ｐ］ＡＴＰと塩を除い
た。これを滅菌水に溶解し、５´標識オリゴヌクレオチ
ドを得た。
【００６０】実施例３基質ポリリボヌクレオチドの切断
基質ポリリボヌクレオチドに対するポリリボヌクレオ
チド又はの切断反応は次のように行った。
チド又はの切断反応は次のように行った。
【００６１】５´末端を標識した(1.62 pmol) を１０
μl の緩衝液( ４０mM Tris-HCl (pH7.5) １２mM MgCl
2,２mM スペルミジン ３HCl)に溶解し、またリボザイ
ム側のポリリボヌクレオチド又は(0.64 pmol) も１
０μl 同緩衝液に溶解後それぞれを６５℃で２分間加温
後水冷した。そしてリボザイム側の溶液を基質側に加え
ることで反応を開始した。
μl の緩衝液( ４０mM Tris-HCl (pH7.5) １２mM MgCl
2,２mM スペルミジン ３HCl)に溶解し、またリボザイ
ム側のポリリボヌクレオチド又は(0.64 pmol) も１
０μl 同緩衝液に溶解後それぞれを６５℃で２分間加温
後水冷した。そしてリボザイム側の溶液を基質側に加え
ることで反応を開始した。
【００６２】一定時間経過時に５０mM EDTAが２μl 入
った溶液中に反応液を２μl サンプリングし反応を停止
させ、基質分解の経時変化を観察した。ホモクロマトグ
ラフィーで切断生成物を分離し、切断率をバイオイメー
ジアナライザーBAS2000 システム（フジフィルム社
（株）製）を用いて求めた。それぞれの反応様式を以下
に示す。
った溶液中に反応液を２μl サンプリングし反応を停止
させ、基質分解の経時変化を観察した。ホモクロマトグ
ラフィーで切断生成物を分離し、切断率をバイオイメー
ジアナライザーBAS2000 システム（フジフィルム社
（株）製）を用いて求めた。それぞれの反応様式を以下
に示す。
【００６３】
【化１０】
【００６４】
【化１１】
【００６５】反応温度が４２℃の場合の結果を図１に示
した。
した。
【００６６】のポリリボヌクレオチドは天然型の塩基
配列をもつによって切断されることはすでに報告され
ている(Nucleic Acids Res.19,6833-6838(1991))。
配列をもつによって切断されることはすでに報告され
ている(Nucleic Acids Res.19,6833-6838(1991))。
【００６７】図１においてレーン６は反応前のであ
る。レーン１−５は、によってを切断したものであ
り、レーン７−１１はによってを切断したもので、
それぞれ３，９，１２，１５，１８分後の切断生成物を
示している。
る。レーン１−５は、によってを切断したものであ
り、レーン７−１１はによってを切断したもので、
それぞれ３，９，１２，１５，１８分後の切断生成物を
示している。
【００６８】切断された断片は鎖長が短くなるため、未
切断のよりもホモクロマトグラフィーにおいて早く展
開され、図１では、未切断のの位置よりも上の位置に
示される。
切断のよりもホモクロマトグラフィーにおいて早く展
開され、図１では、未切断のの位置よりも上の位置に
示される。
【００６９】また、の基質の半分がまたはによっ
て切断される時間(t1/2)を求めた。３２，３７，４７℃
においても切断反応を用い、これらの結果をあわせて表
２に示した。
て切断される時間(t1/2)を求めた。３２，３７，４７℃
においても切断反応を用い、これらの結果をあわせて表
２に示した。
【００７０】
【表２】
【００７１】表２に示したようにリボザイム・ポリリボ
ヌクレオチドの配列内に5'CUUCGG3'の熱力学的に安定な
ループを導入したもの（）は天然型（）のものに比
べ３２℃〜４７℃の温度において切断活性が上昇した。
ヌクレオチドの配列内に5'CUUCGG3'の熱力学的に安定な
ループを導入したもの（）は天然型（）のものに比
べ３２℃〜４７℃の温度において切断活性が上昇した。
【００７２】実施例４．Human immunodeficiency virus(HIV)RNAの塩基配列を持
つ基質ポリリボヌクレオチドを切断するポリリボヌクレ
オチドの合成 ５´−水酸基がジメトキシトリチル基、２´−水酸基が
tert−ブチルジメチルシリル基で保護されたヌクレオシ
ド３´−ホスホロアミダイト（日本ミリポア・リミテッ
ド）を用いて、DNA 自動合成機（日本ミリポア・リミテ
ッドCyclone Plvs DNA/RNA syuthesizer) で以下のHIV
RNA の塩基配列を持つ基質ポリリボヌクレオチドを切断
するポリリボヌクレオチドを合成した。
つ基質ポリリボヌクレオチドを切断するポリリボヌクレ
オチドの合成 ５´−水酸基がジメトキシトリチル基、２´−水酸基が
tert−ブチルジメチルシリル基で保護されたヌクレオシ
ド３´−ホスホロアミダイト（日本ミリポア・リミテッ
ド）を用いて、DNA 自動合成機（日本ミリポア・リミテ
ッドCyclone Plvs DNA/RNA syuthesizer) で以下のHIV
RNA の塩基配列を持つ基質ポリリボヌクレオチドを切断
するポリリボヌクレオチドを合成した。
【００７３】RNA 断片は１μmol スケールで合成した。
【００７４】合成終了後、合成したオリゴヌクレオチド
が結合したCPG (Controlled Pore Glass) を濃アンモニ
ア水：エタノール（３：１v/v)混液で室温２時間処理を
し、更に５５℃で１６時間加温した。溶媒を留去し、残
渣に１mlの１Ｍ TBAF(Tetrabutylammonium fluoride)／
THF(Tetrahydrofuran)溶液を加え、室温で２４時間攪拌
した。これに５mlの０．１Ｍ triethylammonium acetat
e(pH 7.0）を加えた後、Ｃ１８シリカゲル（ウォーター
ズ社製）カラムクロマトグラフィーを行なった（カラム
サイズ１．５×１２cm：２０−４０％CH3CN,５０mM Tri
ethylammoniumbicarbonate 水溶液の溶媒を用いた濃度
勾配により溶出）。約３０％濃度のCH3CN で溶出される
ジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集
め、５mlの０．０１Ｎ HClを加え、１時間攪拌した。
０．１Ｎアンモニア水で中和後、水層を酢酸エチルで洗
浄し、溶媒留去後滅菌水３mlに溶解した。この画分中の
ポリリボヌクレオチドをイオン交換HPLCで分取後、さら
に逆相HPLCで分取し、精製した。
が結合したCPG (Controlled Pore Glass) を濃アンモニ
ア水：エタノール（３：１v/v)混液で室温２時間処理を
し、更に５５℃で１６時間加温した。溶媒を留去し、残
渣に１mlの１Ｍ TBAF(Tetrabutylammonium fluoride)／
THF(Tetrahydrofuran)溶液を加え、室温で２４時間攪拌
した。これに５mlの０．１Ｍ triethylammonium acetat
e(pH 7.0）を加えた後、Ｃ１８シリカゲル（ウォーター
ズ社製）カラムクロマトグラフィーを行なった（カラム
サイズ１．５×１２cm：２０−４０％CH3CN,５０mM Tri
ethylammoniumbicarbonate 水溶液の溶媒を用いた濃度
勾配により溶出）。約３０％濃度のCH3CN で溶出される
ジメトキシトリチルの発色を有するフラクションを集
め、５mlの０．０１Ｎ HClを加え、１時間攪拌した。
０．１Ｎアンモニア水で中和後、水層を酢酸エチルで洗
浄し、溶媒留去後滅菌水３mlに溶解した。この画分中の
ポリリボヌクレオチドをイオン交換HPLCで分取後、さら
に逆相HPLCで分取し、精製した。
【００７５】イオン交換HPLCはTSKgel DEAE 2SW (4.6×
250mm,東ソー（株）製）カラムを用い、Ａ溶液として２
０％CH3CN/H2O 、Ｂ溶液として２０％CH3CN を含む２Ｍ
HCOONH4 水溶液を用い直線濃度勾配法により行なった
（Ｂ％２０→６０％（２０分）) 。ポリリボヌクレオチ
ドは２０．６３分に溶出された。
250mm,東ソー（株）製）カラムを用い、Ａ溶液として２
０％CH3CN/H2O 、Ｂ溶液として２０％CH3CN を含む２Ｍ
HCOONH4 水溶液を用い直線濃度勾配法により行なった
（Ｂ％２０→６０％（２０分）) 。ポリリボヌクレオチ
ドは２０．６３分に溶出された。
【００７６】逆相HPLCはInerTsil ODS(6.0×150 mm,GL
サイエンス社製）カラムを用い、Ａ溶液として５％CH3C
N を含む０．１Ｍ Triethylammonium acetate(TEAA,pH
7.0)、Ｂ溶液として２５％CH3CN を含む０．１Ｍ TEAA
(pH7.0)を用い、直線濃度勾配法により行なった（Ｂ％
２０→６０％（２０分））。ポリリボヌクレオチドは１
８．２３分に溶出された。
サイエンス社製）カラムを用い、Ａ溶液として５％CH3C
N を含む０．１Ｍ Triethylammonium acetate(TEAA,pH
7.0)、Ｂ溶液として２５％CH3CN を含む０．１Ｍ TEAA
(pH7.0)を用い、直線濃度勾配法により行なった（Ｂ％
２０→６０％（２０分））。ポリリボヌクレオチドは１
８．２３分に溶出された。
【００７７】参考例１．HIV RNA の塩基配列を持つポリリボヌクレオチドの合成
HIV RNA の塩基配列を持つポリリボヌクレオチド（文
献Nature 313,450-458(1985)記載のヌクレオチド番号10
6 から124 までの19量体）、（上記文献記載のヌクレ
オチド番号112 から124 までの13量体）を実施例４記載
の方法に従い合成し分取、精製した。
献Nature 313,450-458(1985)記載のヌクレオチド番号10
6 から124 までの19量体）、（上記文献記載のヌクレ
オチド番号112 から124 までの13量体）を実施例４記載
の方法に従い合成し分取、精製した。
【００７８】
【化１２】
【００７９】
【化１３】
【００８０】のポリリボヌクレオチドはヘアピン型リ
ボザイムの切断反応の基質として後述の実験に供した。
またのポリリボヌクレオチドは、リボザイム切断反応
で生成する化合物として後述の実験に供した。
ボザイムの切断反応の基質として後述の実験に供した。
またのポリリボヌクレオチドは、リボザイム切断反応
で生成する化合物として後述の実験に供した。
【００８１】，のポリリボヌクレオチドについての
イオン交換HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセントと保持
時間と逆相HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセントと保持
時間を以下の表３に示す。
イオン交換HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセントと保持
時間と逆相HPLC溶出に用いたＢ溶液のパーセントと保持
時間を以下の表３に示す。
【００８２】
【表３】
───────────────────────────────────
種類 Ｂ％ 直線濃度勾配の全時間 保持時間
───────────────────────────────────
逆相HPLC 10%→50% 20 分 14.8 分
イオン交換HPLC 10%→60% 20 分 19.1 分
逆相HPLC 10%→50% 20 分 12.2 分
イオン交換HPLC イオン交換HPLCは行なわなかった。
───────────────────────────────────
実施例５．リボザイム活性を有するポリリボヌクレオチドによるHI
V RNA の塩基配列を持つポリリボヌクレオチドの切断 ポリリボヌクレオチドに対するポリリボヌクレオチド
の切断反応は次のように行なった。
V RNA の塩基配列を持つポリリボヌクレオチドの切断 ポリリボヌクレオチドに対するポリリボヌクレオチド
の切断反応は次のように行なった。
【００８３】基質ポリリボヌクレオチド（２５０pmo
l) を１００μl の緩衝液（４０mM Tris-HCl(pH 7.5),
１２mM MgCl2, ２mMスペルミジン・３HCl)に溶解し、 ま
た、リボザイム側のポリリボヌクレオチド（１２．５
pmol) を１００μl の同緩衝液に溶解した。それぞれを
６５℃で２分間加温後氷冷した。そして、リボザイム側
の溶液を基質側に加えることで反応を開始した。３７℃
で１時間加温し、５０mMEDTA を５０μl 加えて停止
後、逆相HPLC(Inertsil ODS,６．０×１５０mm, Ａ溶
液；５％CH3CN,０．１Ｍ TEAA(pH7.0)Ｂ溶液；２５％CH
3CN,０．１Ｍ TEAA(pH7.0), Ｂ％；１０％→５０％／２
０分，直線濃度勾配，流速１ml/min) で切断反応に関し
て分析した。それぞれの反応様式について以下に示す。
l) を１００μl の緩衝液（４０mM Tris-HCl(pH 7.5),
１２mM MgCl2, ２mMスペルミジン・３HCl)に溶解し、 ま
た、リボザイム側のポリリボヌクレオチド（１２．５
pmol) を１００μl の同緩衝液に溶解した。それぞれを
６５℃で２分間加温後氷冷した。そして、リボザイム側
の溶液を基質側に加えることで反応を開始した。３７℃
で１時間加温し、５０mMEDTA を５０μl 加えて停止
後、逆相HPLC(Inertsil ODS,６．０×１５０mm, Ａ溶
液；５％CH3CN,０．１Ｍ TEAA(pH7.0)Ｂ溶液；２５％CH
3CN,０．１Ｍ TEAA(pH7.0), Ｂ％；１０％→５０％／２
０分，直線濃度勾配，流速１ml/min) で切断反応に関し
て分析した。それぞれの反応様式について以下に示す。
【００８４】
【化１４】
【００８５】ポリリボヌクレオチドに対してポリリボ
ヌクレオチドを上記の条件で反応させた場合、逆相HP
LCにおいてポリリボヌクレオチドのピークの減少が観
測された。これに対して１２．２分のピークが出現し
た。このピークは、ポリリボヌクレオチドと保持時間
が一致したことから目的の位置で切断されたことを確認
した。また切断反応後のポリリボヌクレオチド及び出
現した１２．２分のピークのHPLCから得られた面積値よ
り９７％が切断された。
ヌクレオチドを上記の条件で反応させた場合、逆相HP
LCにおいてポリリボヌクレオチドのピークの減少が観
測された。これに対して１２．２分のピークが出現し
た。このピークは、ポリリボヌクレオチドと保持時間
が一致したことから目的の位置で切断されたことを確認
した。また切断反応後のポリリボヌクレオチド及び出
現した１２．２分のピークのHPLCから得られた面積値よ
り９７％が切断された。
【００８６】
【発明の効果】本発明のリボザイム・ポリヌクレオチド
を直接体内に投与することにより、あるいは、これをコ
ードするＤＮＡを好適なベクタ−に組込み生体内に投与
することにより、生体に悪影響をもたらす天然のポリリ
ボヌクレオチド又はＲＮＡを特異的に切断することが可
能になる。したがって、本発明により、ＲＮＡに由来す
るエイズや各種腫瘍等の疾患についての予防・治療効果
が期待される。
を直接体内に投与することにより、あるいは、これをコ
ードするＤＮＡを好適なベクタ−に組込み生体内に投与
することにより、生体に悪影響をもたらす天然のポリリ
ボヌクレオチド又はＲＮＡを特異的に切断することが可
能になる。したがって、本発明により、ＲＮＡに由来す
るエイズや各種腫瘍等の疾患についての予防・治療効果
が期待される。
【図１】ホモクロマトグラフィーによる基質ポリリボヌ
クレオチドの解析図
クレオチドの解析図
─────────────────────────────────────────────────────
フロントページの続き
(56)参考文献 Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，1989，
Ｖｏｌ．28， Ｎｏ．12， ｐｐ．4929
−4933
Ｎａｔｕｒｅ，1991， Ｖｏｌ．354,
Ｎｏ．6351， ｐｐ．320−322
Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｖｉｄｓ Ｒｅｓ
ｅａｒｃｈ，1991， Ｖｏｌ．19， Ｎ
ｏ．24， ｐｐ．6833−6838
Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅ
ｎｔ，1992， Ｖｏｌ．６， Ｎｏ.
１， ｐｐ．129−134
Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃ
ｉ．ＵＳＡ，1988， Ｖｏｌ．85， Ｎ
ｏ．５， ｐｐ．1364−1368
Ｎａｔｕｒｅ，1990， Ｖｏｌ．346,
Ｎｏ．6285， ｐｐ．680−682
(58)調査した分野(Int.Cl.7，ＤＢ名)
C12N 9/00
C07H 21/02
C12N 15/09 - 15/11
ＢＩＯＳＩＳ／ＷＰＩ（ＤＩＡＬＯＧ)
ＰｕｂＭｅｄ
Claims (4)
- 【請求項１】 分子中に、以下の一般式（Ｉ）： 【化１】 で示されるヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオチ
ド（式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃは、シトシン
ヌクレオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇは、グア
ニンヌクレオチドを表し、Ｓはアデニンヌクレオチド又
はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｑ1 〜Ｑn
は同一又は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌ
クレオチド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレ
オチドのいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn はＱ1 〜Ｑn にそ
れぞれ相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ1 〜Ｗ4 は同一
又は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオ
チド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又は異なってウラ
シルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌ
クレオチド又はグアニンヌクレオチドのいずれかを表
し、ｍ，ｎは同一又は異なって１〜１０の整数を表
す。）。 - 【請求項２】請求項１記載の一般式（Ｉ）において、Ｓ
がアデニンヌクレオチドであり、ｎが３であるポリリボ
ヌクレオチド。 - 【請求項３】以下の一般式(II)で示されるヌクレオチド
配列を含むポリリボヌクレオチドαを用いて、一般式(I
I)で示されるヌクレオチド配列を含むポリリボヌクレオ
チドβを式中の矢印の部位において切断する方法： 【化２】 （式中、Ｕはウラシルヌクレオチド、Ｃはシトシンヌク
レオチド、Ａはアデニンヌクレオチド、Ｇはグアニンヌ
クレオチドを表し、Ｓはアデニンヌクレオチド又はシト
シンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｑ1 〜Ｑn は同一
又は異なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオ
チド、シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチド
のいずれかを表し、Ｒ1 〜Ｒn はＱ1 〜Ｑn にそれぞれ
相補的なヌクレオチドを表し、Ｗ1 〜Ｗ4 は同一又は異
なってウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、
シトシンヌクレオチド又はグアニンヌクレオチドのいず
れかを表し、Ｘ1 〜Ｘm は同一又は異なってウラシルヌ
クレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシンヌクレオ
チド又はグアニンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｐは
ウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオチド、シトシ
ンヌクレオチド又は、グアニンヌクレオチドのいずれか
を表し、Ｌはウラシルヌクレオチド、アデニンヌクレオ
チド又はシトシンヌクレオチドのいずれかを表し、Ｖ
は、Ｓがシトシンヌクレオチドの場合にはアデニンヌク
レオチドを表し、Ｓがアデニンヌクレオチドの場合に
は、ウラシルヌクレオチド又はシトシンヌクレオチドの
いずれかを表し、Ｙ1 〜Ｙ4 はＷ1 〜Ｗ4 にそれぞれ相
補的なヌクレオチドを表し、Ｚ1 〜Ｚm はＸ1 〜Ｘm に
それぞれ相補的なヌクレオチドを表し、ｍ，ｎは同一又
は異なって１〜１０の整数を表す。）。 - 【請求項４】請求項３記載の一般式(II)において、Ｓが
アデニンヌクレオチドでｎが３であるポリリボヌクレオ
チドαを用いて、ＬがウラシルヌクレオチドでＶがシト
シンヌクレオチドであるポリリボヌクレオチドβを切断
する方法。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP21713793A JP3476509B2 (ja) | 1992-09-04 | 1993-09-01 | 熱力学的に安定なループを有するヘアピン型リボザイム |
Applications Claiming Priority (3)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| JP23691692 | 1992-09-04 | ||
| JP4-236916 | 1992-09-04 | ||
| JP21713793A JP3476509B2 (ja) | 1992-09-04 | 1993-09-01 | 熱力学的に安定なループを有するヘアピン型リボザイム |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| JPH06181758A JPH06181758A (ja) | 1994-07-05 |
| JP3476509B2 true JP3476509B2 (ja) | 2003-12-10 |
Family
ID=26521836
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| JP21713793A Expired - Fee Related JP3476509B2 (ja) | 1992-09-04 | 1993-09-01 | 熱力学的に安定なループを有するヘアピン型リボザイム |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| JP (1) | JP3476509B2 (ja) |
-
1993
- 1993-09-01 JP JP21713793A patent/JP3476509B2/ja not_active Expired - Fee Related
Non-Patent Citations (6)
| Title |
|---|
| Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，１９８９， Ｖｏｌ．２８， Ｎｏ．１２， ｐｐ．４９２９−４９３３ |
| Ｇｅｎｅｓ ＆ Ｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔ，１９９２， Ｖｏｌ．６， Ｎｏ．１， ｐｐ．１２９−１３４ |
| Ｎａｔｕｒｅ，１９９０， Ｖｏｌ．３４６， Ｎｏ．６２８５， ｐｐ．６８０−６８２ |
| Ｎａｔｕｒｅ，１９９１， Ｖｏｌ．３５４， Ｎｏ．６３５１， ｐｐ．３２０−３２２ |
| Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｖｉｄｓ Ｒｅｓｅａｒｃｈ，１９９１， Ｖｏｌ．１９， Ｎｏ．２４， ｐｐ．６８３３−６８３８ |
| Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，１９８８， Ｖｏｌ．８５， Ｎｏ．５， ｐｐ．１３６４−１３６８ |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| JPH06181758A (ja) | 1994-07-05 |
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