JPH10510435A

JPH10510435A - Ｂ型肝炎ウイルス複製のアンチセンス阻害

Info

Publication number: JPH10510435A
Application number: JP9505848A
Authority: JP
Inventors: アンダーソン，ケヴィン・ピー; カウサート，レックス・エム
Original assignee: Isis Pharmaceuticals Inc
Current assignee: Ionis Pharmaceuticals Inc
Priority date: 1995-07-13
Filing date: 1996-06-26
Publication date: 1998-10-13
Also published as: WO1997003211A1; EP0837951A1; EP0837951A4; AU6479696A; CA2223645A1; US5985662A

Abstract

(57)【要約】ＨＢＶの複製を阻害する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドが提供される。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、またはＨＢＶＲＮＡの５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位と、特異的にハイブリダイズできる。本発明のオリゴヌクレオチドを用いて、ＨＢＶの感染を診断する方法、ＨＢＶの複製を阻害する方法、ＨＢＶの感染を治療する方法、およびＨＢＶに関連する疾病を治療または予防する方法もまた提供される。そのような疾病には、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、または肝細胞癌が含まれるであろう。

Description

【発明の詳細な説明】Ｂ型肝炎ウイルス複製のアンチセンス阻害発明の背景Ｂ型肝炎ウイルス（ｈｅｐａｔｉｔｉｓＢｖｉｒｕｓ）（ＨＢＶ）は、広範囲の臨床異常の病因作因であり、世界的に主要な公衆衛生問題である。ＨＢＶに関連する疾病の範囲には、急性の自己限定性感染、生命を脅かす危険性のある劇症肝炎、並びに肝硬変に進行し肝不全を導く可能性のある慢性肝炎が含まれる。さらに、慢性の感染は、疫学的に、肝細胞癌の進行にも関連している。ＨＢＶ感染が風土病である、東南アジア、中国およびサハラ砂漠下のアフリカのような地域で慢性的に感染している個体の割合は、成人人口の５−２０％の範囲であろう。慢性感染のＨＢＶキャリアーの人数は、世界中に２億人いると見積もられている。これらの人々が肝臓癌になる危険性は、１５％ほどの高さであると概算されている。長期間のＨＢＶ感染の結果、いくつかの集団では、感染した個体の６０％が死に至る可能性がある。急性または慢性のＨＢＶ感染症の治療法は、現在のところ不充分であり、主に患者の体力を保たせるのに有効な治療法に限られている。アデノシンアラビノシド（ａｒａＡ）およびインターフェロン−αのような抗ウイルス剤を用いた実験的治療では、慢性感染個体においてＨＢＶ複製を抑制する効果が証明されている。しかしながら、抗ウイルス治療中止後の永続的抑制は、治療した患者の内のわずかなパーセントのみにしか起こらない。有意の医療効果を得るためには、副作用なしに持続して投与できるか、または一連の治療に続いて永続的にＨＢＶの複製を停止させることのできる抗ＨＢＶ剤が必要とされる。急性および慢性のＨＢＶ感染症のための医療的に有効な抗ウイルス療法が、明らかに必要である。また、そのような抗ウイルス剤は、感染性ＨＢＶを含む臨床標本または血液製剤に偶然晒された個体を治療し、ＨＢＶ関連疾病の進行を防ぐためにも有用であろう。また、肝炎の原因となるその他の作因からＨＢＶを識別でき、適当な治療療法計画の設計に有用な、研究用および診断用試薬も必要である。アンチセンスオリゴヌクレオチドオリゴヌクレオチドは、研究用および診断用試薬として一般に用いられている。例えば、アンチセンスオリゴヌクレオチドは、生来、精巧な特異性で遺伝子発現を阻害することができ、当業者らが特定の遺伝子の機能を明確にさせるために、例えば、どのウイルス遺伝子が複製に重要であるかを決定するために、または多くの生物学的経路の役割を識別するために、しばしば用いられている。それ故、この特異的な阻害効果は、研究用途に利用されている。また、この特異性および感受性は、当業者らによって診断用途に利用される。類似した肝炎症状を引き起こす可能性のあるウイルスを、患者のサンプルから容易に且つ迅速に識別し、適切な治療を行うことができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドによるインビトロでのウイルス複製の阻害は、適切な治療方針を決定するための手段として有用である。例えば、ＨＢＶ感染が疑われる患者を本発明のオリゴヌクレオチド組成物で治療する前に、患者の細胞、組織または体液をオリゴヌクレオチドと接触させ、ウイルス複製の阻害をアッセイすることができる。インビトロでのＨＢＶ複製の効果的阻害は、その感染がオリゴヌクレオチド処理に敏感であろうことを示唆している。オリゴヌクレオチドは、動物およびヒトの疾病状態を治療する薬剤として用いられている。例えば、当業者らはこれまでに、ウイルス、真菌および代謝疾病にかかわる遺伝子の発現を調節する能力を持つ、アンチセンス、トリプレックスおよびその他のオリゴヌクレオチド組成物を同定した。例として、米国特許第５，１６６，１９５号（１９９２年１１月２４日発行）は、ＨＢＶのオリゴヌクレオチド阻害剤を提供する。米国特許第５，００４，８１０号（１９９１年４月２日発行）は、単純ヘルペスウイルスＶｍｗ６５ｍＲＮＡとハイブリダイズし、複製を阻害する能力を持つオリゴマーを提供する。米国特許第５，１９４，４２８号（１９９３年３月１６日発行）は、インフルエンザウイルスに対して抗ウイルス活性を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。米国特許第４，８０６，４６３号（１９８９年２月２１日発行）は、アンチセンスオリゴヌクレオチドおよびそれらを用いてＨＴＬＶ−IIIの複製を阻害する方法を提供する。米国特許第５，２７６，０１９号および米国特許第５，２６４，４２３号（Ｃｏｈｅｎら）は、細胞内における外来核酸の複製を防御するために用いられるホスホロチオエートオリゴヌクレオチド類似体に関する。アンチセンスオリゴヌクレオチドは、ヒトに安全に投与され、さまざまなアンチセンスオリゴヌクレオチド薬剤の臨床試験が現在実施されている。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチド（ＩＳＩＳ２９２２）は、ＡＩＤＳ患者のサイトメガロウイルス網膜炎に対して有効であることが示された（ＢｉｏＷｏｒｌｄＴｏｄａｙ、１９９４年４月２９日、３頁）。このように、オリゴヌクレオチドは、細胞および罹患動物、特にヒトの治療に有効な薬剤になりうることが確認されている。Ｂｌｕｍら（Ｌａｎｃｅｔ，１９９１，３３７，１２３０）は、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇの合成ならびにＨＢＶの複製をブロックする非開示のアンチセンスオリゴデオキシヌクレオチドによって感染肝細胞内のＢ型肝炎ウイルス抗原が阻害されることを示した。続いて、Ｂｌｕｍら（ＰＣＴ出願ＷＯ９４／２４８６４）は、ウイルスポリメラーゼのタンパク質末端領域をコードするウイルスゲノムのマイナス鎖の一部分に相補的であるｍＲＮＡに相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドによって、Ｂ型肝炎の複製が終結することを開示した。Ｇｏｏｄａｒｚｉら（Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．，１９９０，７１，３０２１ −３０２５）は、ＨＢＶに感染したヒト細胞系ＨＢＶＨｂｓＡｇ表面抗原の発現に及ぼす１２マーから１５マーのホスホジエステルオリゴヌクレオチドの影響について、数多く試験した。キャップ部位および開始部位の周辺領域に向けられたオリゴヌクレオチドが最も有効であり、１７．４μＭ濃度のオリゴヌクレオチドで最大９６％を阻害することが分かった。また、最も活性な配列の一つのホスホロチオエート類似体についても試験し、その結果、５．８μＭ濃度でＨＢｓＡｇ発現の９０％が阻害された。ＷｕおよびＷｕ（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．，１９９２，２６７，１２４３６ −１２４３９）は、ＨＢＶのポリアデニル化シグナルに相補的な２１マーのオリゴデオキシヌクレオチドをアシアログリコプロテイン標的化成分に結合させて用いた。感染細胞系ＨｅｐＧ２では、オリゴヌクレオチド濃度５０μＭのオリゴヌクレオチド−アシアログリコプロテイン複合体で処理すると、結果として１日後にはＨＢｓＡｇ発現の８０％が阻害され、ＨＢＶＤＮＡが８０％減少した。５０μＭ濃度の複合していないアンチセンスオリゴヌクレオチド存在下では、ＨＢｓＡｇの濃度は、処理した７日間を通して定常的に上がり続けたが、処理３日後、処理された細胞では抗原が対照より３０％少なかった。Ｙａｏらは、ＨＢｓＡｇおよびＨＢｅＡｇ生成へのアンチセンスホスホロチオエートオリゴデオキシヌクレオチドの影響について試験した（Ｙａｏら、ＣｈｕｎｇＨｕａＩＨｓｕｅｈＴｓａＣｈｉｈ，１９９４，７４，７４−７６）。Ｏｆｆｅｎｓｐｅｒｇｅｒら（ＥＭＢＯＪ．，１９９３，１２，１２５７− １２６２）は、培養したカモ肝細胞内のカモＢ型肝炎ウイルス（ＤＨＢＶ）を阻害するためにホスホロチオエートアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いた。９つのオリゴヌクレオチドについて試験したが、そのうち４つは、ｐｒｅ−Ｓ／Ｓ領域を標的とし、１つはポリメラーゼ領域の開始を、また、４つはｐｒｅ−Ｃ／Ｃ領域を標的としている。すべてのオリゴヌクレオチドがある程度の活性を示し、ｐｒｅ−Ｓ領域の開始およびダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａｔ）（ＤＲ）II領域に向けられた２つのオリゴヌクレオチドは特に活性であった。Ｐｒｅ−Ｓ領域の開始に向けられた活性なオリゴヌクレオチドは、ＤＨＢＶに感染した子ガモでインビボで試験した。オリゴヌクレオチドを１０日間毎日静脈内注射した後、肝臓をＤＨＢＶについて分析した。すべての子ガモは、オリゴヌクレオチド処理後、ウイルス複製がほぼ完全に阻害され、肝臓毒性は検出されなかった。また、２羽のＤＨＢＶ−陰性の子ガモを同一のオリゴヌクレオチドで処理し、その後、ＤＨＢＶを注射してＤＨＢＶに感染させた。これらのカモは、１２日後ＤＨＢＶに感染していないことが分かり、オリゴヌクレオチド処理が感染を予防できることを示した。発明の概要本発明は、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを提供する。これらのオリゴヌクレオチドは、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡの部分、またはＨＢＶＲＮＡの５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位と特異的にハイブリダイズできる。ＨＢＶ複製を阻害する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、細胞、組織または体液内のＨＢＶ感染を診断する方法を提供する。そのような方法は、他の型の肝炎からＢ型肝炎を識別するために用いることができ、適当な治療法計画の設計に有用である。また、本発明は、ＨＢＶ、またはＨＢＶを含むと疑われる細胞、組織あるいは体液を、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることによる、ＨＢＶ複製を阻害する方法を含む。また、治療上有効な量の本発明のアンチセンスオリゴヌクレオチドを動物に投与することによって、前記動物のＨＢＶ感染を治療する方法を提供する。さらに、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎、または肝細胞癌のようなＨＢＶ関連疾病の治療方法、およびＨＢＶ関連疾病を予防する方法もまた、提供される。発明の詳細な説明ＨＢＶ複製ＨＢＶは、ヘパドナウイルス（Ｈｅｐａｄｎａｖｉｒｕｓ）と呼ばれる、小分子量のＤＮＡを含む新種のウイルスのプロトタイプメンバー（ｐｒｏｔｏｔｙｐｅｍｅｎｂｅｒ）である。感染性粒子は、ウイルスＤＮＡゲノムを含む球形のインナーコア、コア構造ポリペプチド（ＨＢｃＡｇ）、ならびにＤＮＡポリメラーゼおよびプロテインキナーゼの活性を含む。コアは、中和抗体が向けられるウイルス表面抗原（ＨＢｓＡｇ）を持つ脂質含有エンベロープによって取り囲まれている。ＨＢＶが、非Ａ・非Ｂ型肝炎の原因であるＣ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ）と無関係であることは、特記されるべきである。ＨＣＶは、フラビウイルス（ｆｌａｖｉｖｉｒｕｓ）およびペスチウイルス（ｐｅｓｔｉｖｉｒｕｓ）と最も密接な関係にあり、おおよそ９．４ｋｂの大きさのＲＮＡゲノムを持つ。ＨＢＶおよびＨＣＶは、両方が肝臓疾患の原因である点を除いて、ほとんど共通点を持たない。ＨＢＶのゲノムは、そのサイズの小ささ（３．２ｋｂ）および珍しい特徴で注目に値する。ビリオンＤＮＡは、環状であるが、そのユニークな複製ストラテジーの結果として部分的に二本鎖である。より長いマイナス鎖ＤＮＡは、ウイルス遺伝子（プラス鎖）のｍＲＮＡと同じ極性を持つより短いＤＮＡ鎖と塩基対合する。感染しやすい細胞に感染した後、鋳型としてのマイナス鎖およびビリオン関連ＤＮＡポリメラーゼを用いて、より短いプラス鎖が伸長される。共有結合で閉環した環状分子に転換の後、ＨＢＶＤＮＡは、サブゲノムｍＲＮＡおよび全長のｍＲＮＡならびにその５’および３’末端に末端重複を持つ全長のゲノム前駆体ＲＮＡ（ｐｒｅ−ｇｅｎｏｍｉｃＲＮＡ）に転写される。一連の複合反応を通して、全長のゲノム前駆体ＲＮＡは、半保存性複製ストラテジーおよびウイルスがコードする逆転写酵素を用いて、ゲノムＤＮＡにコピーされる。非常に小さいＨＢＶゲノムは、非常に有効な方法で系統だてられている。ゲノムの多くの領域は、明らかに多様な機能を満たしている。ＨＢＶゲノム上に４つの遺伝子（Ｃ、Ｓ、ＰおよびＸ）が同定されたが、コードされるタンパク質のオープンリーディングフレームは、互いに重なり合っている。重なり合うリーディングフレームは、余分でない遺伝子発現の理論的可能性を越えてコードする可能性を５０％まで与える。ＨＢＶゲノムの構成は効率が良いが、感染細胞内で合成されるＨＢＶ遺伝子生成物の少なさは、ウイルスタンパク質機能を阻害しようとする伝統的な抗ウイルス剤の開発を制限してきた。これに対して、ＨＢＶゲノムの性質は、アンチセンスオリゴヌクレオチド治療を基本にした抗ウイルス剤の開発にユニークな機会を提供する。さらに、一本鎖ＲＮＡ複製中間体を含むＨＢＶのユニークな複製ストラテジーは、ＨＢＶゲノム前駆体ＲＮＡ内の機能的に重要な成分を標的とすることによって、ゲノムの複製過程に直接介在する可能性を提供する。アンチセンス治療のためのＨＢＶ標的の同定ＨＢＶゲノム上に存在するすべての遺伝子は、ウイルスの複製に重要であると考えられており、それ故、アンチセンス治療の有効な標的として働きうる。しかしながら、いくつかのものの触媒機能が限定されているため、それらはアンチセンス治療の望ましい標的になる。Ｐ遺伝子生成物は、ウイルスのＤＮＡポリメラーゼであると考えられている。いくつかのレトロウイルスの逆転写酵素との広範囲の相同性は注目に値する。また、このタンパク質のＮ末端ドメインは、ゲノム複製中、マイナス鎖ＤＮＡ合成のプライマーとしても機能するらしい。それ故、この遺伝子の合成を阻害することは、ＨＢＶの複製を有意に妨害するであろう。ＨＢＶのＳ遺伝子は、ＨＳＶビリオンのエンベロープ内に存在する表面抗原タンパク質をコードする。Ｓ遺伝子は、３つのポリペプチド変種をコードしている。これらのポリペプチドは、それらのＣ末端が同一であるが、Ｓ遺伝子内の異なるフレーム内メチオニン（ＡＵＧ）コドンで始まる。Ｓドメインに相補的なオリゴヌクレオチドは、３つのＳポリペプチド（Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、およびｐｒｅ− Ｓ２）すべての合成を妨害するはずであるが、ｐｒｅ−Ｓ１ポリペプチドがウイルスの複製には最も重要であろう。ｐｒｅ−Ｓ１タンパク質は、完全なビリオンにのみ認められるため、このポリペプチドは、ビリオンの構築にかかわると考えられる。また、ｐｒｅ−Ｓ１タンパク質は、ビリオンの標的細胞レセプターとの結合にもかかわっていると考えられている。Ｓ遺伝子のコード配列がＰ遺伝子のコード配列内に完全に含まれていることは注目に値する。タンパク質は異なるメッセージから翻訳され、同一配列内の異なるリーディングフレームが用いられるが、単一のオリゴヌクレオチドが両タンバク質の合成を妨害するであろう。Ｃ遺伝子は、ビリオンコアの主要な構造ポリペプチドをコードするが、細胞膜においてコアタンパク質を蓄積するのに必要なｐｒｅ−Ｃタンバク質もまたコードしている。ｐｒｅ−Ｃドメインは、トリプシン様プロテアーゼ触媒部位と相同なアミノ酸を含み、プロテアーゼ活性を持つであろう。Ｃ遺伝子の３’末端は、Ｐ遺伝子の５’末端と重なり合い、重なり領域内のオリゴは、両遺伝子生成物の合成に影響を与えるであろう。さらに、ｐｒｅ−ＣおよびＣポリペプチドは、ゲノム複製の鋳型として用いられる全長のゲノム前駆体ＲＮＡと識別できないｍＲＮＡから翻訳される。Ｘ遺伝子生成物の機能は重要であると考えられるが、ウイルスの複製におけるＸ−遺伝子の役割ははっきりとは解明されていない。Ｘタンパク質は、異種ウイルスおよび細胞内プロモーターからの転写を活性化することができるが、ＨＢＶプロモータからの転写を活性化することはできない。Ｘ−遺伝子リーディングフレームは、Ｐ遺伝子の３’末端およびＣ遺伝子の５’末端と重なり合い、それ故、２つ以上の遺伝子を妨害するオリゴヌクレオチドを設計することができる。ウイルスの遺伝子生成物の発現を直接阻害することに加えて、アンチセンスオリゴヌクレオチドを用いて、一本鎖ＲＮＡゲノム前駆体内の機能的に重要な成分と結合させることによって、ウイルスゲノムの複製を妨害することもできる。標的となりうるいくつかの重要成分の例としては、１１ｂｐのダイレクトリピート（ｄｉｒｅｃｔｒｅｐｅａｔ）（ＤＲ１およびＤＲ２）、および、ある種のレトロウイルスのＵ５−ＬＴＲ配列と相同な、保存性の高い６０−７０ｂｐの配列であるＵ５配列が含まれる（ＭｉｌｌｅｒおよびＲｏｂｉｎｓｏｎ、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．，１９８６，８３，２５３１−２５３５）。この保存領域は、ＨＢＶのカプシド化シグナルとして働き、ウイルスのＲＮＡカプシド化に必要且つ充分である、ε領域として知られるステムループ構造と同一の広がりを持つ（Ｊｕｎｋｅｒ−Ｎｉｅｐｍａｎｎら、ＥＭＢＯＪ．，１９９０，１０，３３８９−３３９６）。上に列挙した任意のメッセンジャーＲＮＡ分子と相補的なアンチセンスオリゴヌクレオチドもまた、ゲノム前駆体ＲＮＡと相補的であろう。それ故、２つの無関係の遺伝子の発現を阻害することによって、ならびにゲノム前駆体ＲＮＡと結合してゲノムの複製プロセスを妨害することによって、ウイルスの複製を阻害するであろう、三つの機能を持つオリゴヌクレオチドを設計することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチド本発明は、Ｂ型肝炎ウイルスＲＮＡと特異的にハイブリダイズする能力を持ち、さらにＨＢＶの複製を阻害する能力を持つ、８から５０ヌクレオチドの長さのオリゴヌクレオチドを用いる。望ましい実施態様では、オリゴヌクレオチドは、ＨＳＶＲＮＡの翻訳開始部位、５’キャップ領域、Ｕ５領域およびε領域、ならびにＨＢＶのＰ、ＳおよびＣ遺伝子生成物をコードするＲＮＡ配列を標的とする。オリゴヌクレオチドとそれが標的とする核酸配列の間のこの関係は、一般的に、「アンチセンス」と呼ばれる。本発明の文脈においては、選ばれた核酸標的へのオリゴヌクレオチドの「標的化（ｔａｒｇｅｔｉｎｇ）」は、多段階のプロセスである。プロセスは、通常、その機能を調節すべき核酸配列の同定で始まる。この核酸配列は、例としては、その発現が特定の疾病状態と関係する細胞性遺伝子（あるいはその遺伝子から作られたｍＲＮＡ）、または感染作因からの外来核酸（ＲＮＡあるいはＤＮＡ）であろう。本発明では、標的は、ＨＢＶＲＮＡの翻訳開始部位、ε、Ｕ５あるいは５’キャップ領域、またはＰ、ＳあるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡ配列であり；後者の生成物には、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、ｐｒｅ−Ｓ２、ＣおよびＰｒｅ−Ｃが含まれる。標的化プロセスには、結果として所望の効果、即ち遺伝子発現の調節、を生じるようなオリゴヌクレオチドの相互作用を起こす核酸配列内の一つまたは複数の部位の決定もまた含まれる。ひとたび、標的の一つまたは複数の部位が同定されたならば、所望の調節が得られるように、標的に充分に相補的である、即ち充分に良く且つ充分な特異性をもってハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを選択する。本発明の文脈においては、「調節（ｍｏｄｕｌａｔｉｏｎ）」は、阻害または刺激のいずれかを意味する。標的遺伝子の発現の阻害は、現在のところ、調節の望ましい型である。この調節は、インビトロシステムまたはインビボ（動物）システムのいずれかから誘導したサンプルを用い、この技術分野では日常的に行われている方法、例えば、本明細書の実施例に教示されているような、ＰＣＲ、ＨＢＶＤＮＡレベル測定用のサザンブロットあるいはスロットブロットアッセイ、ＨＢＶＲＮＡレベル測定用のノーザンブロットアッセイ、またはタンパク質発現測定用のウエスタンブロットあるいはＥＬＩＳＡアッセイにより測定することができる。本発明の文脈においては、「ハイブリダイゼーション」は、Ｗａｔｓｏｎ−Ｃｒｉｃｋの塩基対合としても知られる、相補塩基間、通常は向かい合う核酸鎖または核酸鎖の２つの領域間の水素結合を意味する。グアニンとシトシンは、それらの間で３つの水素結合を形成することが知られている相補塩基の例である。アデニンとチミンは、それらの間で２つの水素結合を形成する相補塩基の例である。「特異的にハイブリダイズできる」および「相補性」は、安定且つ特異的な結合がＤＮＡまたはＲＮＡ標的とオリゴヌクレオチドの間で起こるような充分な相補性の程度を示すために用いられる用語である。オリゴヌクレオチドは、特異的にハイブリダイズできるためにはその標的核酸配列と１００％相補的である必要はないことが分かる。オリゴヌクレオチドは、標的へのオリゴヌクレオチドの結合が標的分子の正常な機能を妨害して有効性の損失を引き起こし、かつ、特異的結合が所望される条件下、即ちインビボアッセイあるいは治療処置の場合には生理条件下、またはインビトロアッセイの場合にはアッセイを行う条件下で、オリゴヌクレオチドの非標的配列への非特異的結合を排除するに充分な程度の相補性がある場合、特異的にハイブリダイズできる。本発明の文脈においては、用語「オリゴヌクレオチド」とは、天然発生の塩基、糖および糖間（骨格）結合よりなるヌクレオチドのオリゴマーあるいはポリマー、またはヌクレオシドモノマーを指す。用語「オリゴヌクレオチド」は、また、同様に機能する、天然発生でないモノマーあるいはその部分を含むオリゴマーまたはポリマーをも含む。そのように修飾されたまたは置換されたオリゴヌクレオチドは、例えば、細胞摂取が強化される、ヌクレアーゼ存在下での安定性が増加する、または標的親和性が強化されるといったような性質のために、時として天然型より望ましいこともある。数多くのヌクレオチドおよびヌクレオシドの修飾物は、それらが取り込まれたオリゴヌクレチドを天然型のオリゴヌクレオチドよりヌクレアーゼ消化に対してより耐性にすることが示されている。ヌクレアーゼ耐性は、オリゴヌクレオチドを細胞抽出物または単離されたヌクレアーゼ溶液と共にインキュベートし、さらに時間経過後も残る完全なオリゴヌクレオチドの含有量を通常はゲル電気泳動で測定することによって、日常の仕事として測定される。ヌクレアーゼ耐性を強化するように修飾されたオリゴヌクレオチドは、未修飾のオリゴヌクレオチドより長い時間、完全に生き残る。また、数多くの修飾物は、標的へのオリゴヌクレオチドの結合性（親和性）を増加させることが示されている。標的へのオリゴヌクレオチドの親和性は、オリゴヌクレオチド／標的対合のＴｍ、すなわちオリゴヌクレオチドと標的が解離する温度を測定することによって、日常の仕事として測定される。解離は、分光光度計で検出される。Ｔｍが高くなる程、標的へのオリゴヌクレオチドの親和性は大きくなる。いくつかの例では、標的結合親和性を強化するオリゴヌクレオチド修飾はまた、独立的に、ヌクレアーゼ耐性を強化することができる。本発明について意図されるいくつかの望ましいオリゴヌクレオチドの具体的な例は、ホスホロチオエート、ホスホトリエステル、メチルホスホネート、短鎖のアルキルあるいはシクロアルキル糖間結合、または短鎖のヘテロ原子あるいは複素環式糖間（「骨格」）結合を含むことができる。ホスホロチオエートならびにＣＨ₂−ＮＨ−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｏ−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｏ−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂、ＣＨ₂−Ｎ（ＣＨ₃）−Ｎ（ＣＨ₃）−ＣＨ₂およびＯ−Ｎ（ＣＨ₃ ）−ＣＨ₂−ＣＨ₂骨格を持つ（ホスホジエステルがＯ−Ｐ−Ｏ−ＣＨ₂である）ものが最も望ましい。モルホリノ骨格構造を持つオリゴヌクレオチドもまた、望ましい（Ｓｕｍｍｅｒｔｏｎ，Ｊ．Ｅ．およびＷｅｌｌｅｒ，Ｄ．Ｄ．、米国特許第５，０３４，５０６号）。その他の望ましい実施態様では、タンパク質−核酸またはペプチド−核酸（ＰＮＡ）骨格のように、オリゴヌクレオチドのホスホジエステル骨格を、塩基がポリアミド骨格のアザ窒素原子と直接的にまたは間接的に結合しているポリアミド骨格で置換しても良い（Ｐ．Ｅ．Ｎｉｅｌｓｅｎ、Ｍ．Ｅｇｈｏｌｍ、Ｒ．Ｈ．Ｂｅｒｇ、Ｏ．Ｂｕｃｈａｒｄｔ、Ｓｃｉｅｎｃｅ，１９９１，２５４，１４９７）。その他の望ましいオリゴヌクレオチドは、２ ’位に次の基の一つ：ＯＨ、ＳＨ、ＳＣＨ₃、Ｆ、ＯＣＮ、ＯＣＨ₃ＯＣＨ₃、ＯＣＨ₃Ｏ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃、Ｏ（ＣＨ₂）_nＮＨ₂またはＯ（ＣＨ₂）_nＣＨ₃（式中、ｎは１から約１０である）；Ｃ₁からＣ₁₀の低級アルキル、置換低級アルキル、アルカリールまたはアラルキル；Ｃｌ：Ｂｒ；ＣＮ；ＣＦ₃；ＯＣＦ₃；Ｏ−、Ｓ −、またはＮ−アルキル；Ｏ−、Ｓ−、またはＮ−アルケニル；ＳＯＣＨ₃；ＳＯ₂ＣＨ₃；ＯＮＯ₂；ＮＯ₂；Ｎ₃；ＮＨ₂；ヘテロシクロアルキル；ヘテロシクロアルカリール；アミノアルキルアミノ；ポリアルキルアミノ；置換シリル；ＲＮＡ切断基；コレステリル基；ホレート基；レポーター基；インターカレーター；オリゴヌクレオチドの薬物動態学的性質を改良する基；または、オリゴヌクレオチドの薬力学的性質を改良する基、および同様の性質を持つその他の置換基：を含むアルキルおよびハロゲンで置換された糖部分を含んでいて良い。ホレート、コレステロール、または脂質類似体のようなオリゴヌクレオチドの取り込みを促進するその他の基は、直接またはリンカーを通して、任意のヌクレオシドの２’ 位、または３’−末端のヌクレオシドの３’位あるいは５’−末端のヌクレオシドの５’位とそれぞれ結合させることができる。一つまたはそれ以上のそのような複合体を用いることもできる。また、オリゴヌクレオチドは、ペントフラノシル基の代わりにシクロブチルのような糖擬似体を持つこともできる。その他の望ましい実施態様には、少なくとも一つの修飾された塩基の型またはイノシンのような「ユニバーサル塩基」を含むこともできる。本発明によるオリゴヌクレオチドは、約８から約５０ヌクレオチドの長さが望ましい。本発明の文脈においては、オリゴヌクレオチドは、８から５０のモノマーを持つ、上記のような非天然型オリゴマーを包含することが理解される。本発明で用いられるオリゴヌクレオチドは、熟知された固相合成技術で、都合良く日常的に作り出すことができる。そのような合成用装置は、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓを含む数社で販売されている。そのような合成のための任意のその他の手段もまた用いることができる；実際のオリゴヌクレオチドの合成は、機械的に仕事を処理する人の才能の範囲内で充分である。また、ホスホロチオエートおよびアルキル化誘導体のようなその他のオリゴヌクレオチドを合成するためにも、同様の技術が用いられることも良く知られている。コレステロール修飾オリゴヌクレオチドのような修飾オリゴヌクレオチドを合成するために、同様の技術ならびに市販されている修飾アミダイトおよびＧｌｅｎＲｅｓｅａｒｃｈ，ＳｔｅｒｌｉｎｇＶＡから入手できるような、調節多孔ガラス（ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ−ｐｏｒｅｇｌａｓｓ）（ＣＰＧ）製品を用いることもまた良く知られている。ウイルス、またはウイルスを含むことが疑われる細胞、組織あるいは体液を、本発明のオリゴヌクレオチドと接触させる、ＨＢＶの複製を阻害する方法が提供される。本発明の文脈においては、「接触させる」とは、オリゴヌクレオチドをウイルス調製物に加えることあるいはその逆、またはオリゴヌクレオチドを生体サンプルに加えることあるいはその逆、またはオリゴヌクレオチドをインサイチオで、即ち動物内でウイルス、細胞組織あるいは体液に加えることを意味している。本発明の文脈においては、「生体サンプル」とは、細胞あるいは組織の調製物または単離物（生検サンプルのような）、または体液、例えば血液、尿、痰あるいは糞便である。予防および治療のために、ＨＢＶ関連疾病を予防する方法ならびにＨＢＶ感染およびＨＢＶ関連疾病を治療する方法が提供される。治療組成物の調合およびそれに続くそれらの投与は、当業者の技術の範囲内であると考えられる。オリゴヌクレオチドは、オリゴヌクレオチドに加えて、キャリヤー、増粘剤、希釈剤、バッファー、保存剤、表面活性剤、リポソームまたは脂質調合剤ならびにその類似物を含んでいて良い、医薬組成物内で調合することができる。医薬組成物はまた、抗菌剤、抗炎症剤、麻酔薬およびその類似薬剤のような、一つあるいはそれ以上の活性成分を含んでいても良い。非経口投与用の調合物は、バッファー、リポソーム、希釈剤およびその他の適当な添加剤をも含む無菌水溶液を含むことができる。医薬組成物は、局所または全身治療のいずれを所望するか、及び治療される領域によって、数多くの方法で投与することができる。投与は、局所（目、膣、直腸、鼻腔内）、経口で、吸入により、または非経口で、例えば静脈内滴注、皮下、腹膜内または筋肉内注射によって行われる。投与量は、数日から数ヶ月続く、または（例えば、ＥＬＩＳＡ、ＰＣＲ、、またはＤＮＡブロットによって日常的に測定される）ウイルス滴定値が減少するまで、または病状が縮小するまでの治療の経過と共に、治療される病状の重さおよび感受性に依存する。最適な投与スケジュールは、体内の薬剤蓄積の測定から日常的に計算される。熟練者らは、最適投与量、投与方法論および繰り返し速度を簡単に且つ日常の仕事として決定することができる。治療的または予防的に有効な量（投与量）は、個々の組成物の相対的効能に依存して変わり、一般的には、分子量およびインビトロでのＥＣ５０および／または動物実験を基にして日常的に計算することができる。例えば、（オリゴヌクレオチド配列および化学構造から誘導された）化合物の分子量およびＩＣ５０のような有効投与量を与えることにより、例えば（実験的に誘導して）、投与量（ｍｇ／ｋｇ）を日常的に計算する。一般的には、投与量は、０．００１μｇから１００ｇであり、毎日、毎週、毎月または毎年、または２から２０年ごとに、一回または数回、投与することができる。アンチセンスオリゴヌクレオチドの薬物動態学ＨＢＶの複製に関連する一次病理（ｐｒｉｍａｒｙｐａｔｈｏｌｏｇｙ）は、感染した個体の肝臓に起こるので、肝臓内で有意の濃度に達する潜在的抗−ＨＢＶ化合物の能力が有効である。数多くのオリゴヌクレオチド、主にホスホロチオエートオリゴヌクレオチドの薬物動態学的プロフィールを決定した。ホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、配列に関係なく、非常によく似た薬物動態学および組織分配を持つことが分かった。血漿内では、急速分配期（ａｒａｐｉｄｄｉｓｔｒｉｂｕｔｉｏｎｐｈａｓｅ）（おおよそ３０分間）および長期の排除期（ａｐｒｏｌｏｎｇｅｄｅｌｉｍｉｎａｔｉｏｎｐｈａｓｅ）（おおよそ４０時間）として認められる。ホスホロチオエートは、末梢組織（即ち、脳を除き、例えば薬物静脈内投与によって直接到達可能な組織）に幅広く分配され、肝臓、腎皮質および骨髄内に最も高い濃度で見いだされることが分かっている。完全な化合物が、大部分の組織、特に肝臓、腎臓および骨髄内に蓄積され、組織内では化合物の半減期が長くなっていることが示された。２７塩基のホスホロチオエートオリゴヌクレオチドを用いたマウスの研究から、一回の静脈投与の結果生ずる生物利用可能な化合物の４０％以上が、注射後１２時間で肝臓から分離できることが示された。オリゴヌクレオチドを静脈内に投与してもまた皮下に投与しても、同様の分配プロフィールが認められる。さらに、薬物動態学および組織分配プロフィールは、齧歯動物、サルおよびヒトを含む動物の種間でも非常に良く一致する。ＨＢＶアンチセンスオリゴヌクレオチドのインビトロ評価標準化ヒト肝芽腫細胞培養アッセイを用い、ＨＢＶ複製の阻害について化合物を評価した。化合物の毒性もまた、同一の培養および処理条件下で評価することができる（ＫｏｒｂａおよびＧｅｒｉｎ、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．，１９９２，１９，５５−７０；ＫｏｒｂａおよびＭｉｌｍａｎ、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．，１９９１，１５，２１７−２２８）。このアッセイは、Ｂ型肝炎感染を治療するための薬剤候補をスクリーニングするために、アレルギー感染症国立研究所（ｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＡｌｌｅｒｇｙａｎｄＩｎｆｅｃｔｉｏｕｓＤｉｓｅａｓｅ）（ＮＩＡＩＤ）で用いられている。表１に示したオリゴヌクレオチドは、ホスホロチオエートとして設計され合成された。これらのオリゴヌクレオチドのいくつかは、このインビトロアッセイで試験し、ＥＣ９０［ＨＢＶＤＮＡレベルを９０％減少させるオリゴヌクレオチド濃度（μＭ）］を、試験したそれぞれのオリゴヌクレオチドについて計算した。一つのオリゴヌクレオチドに付き２回試験を行った場合には、両方のＥＣ９０の値を示している。試験したオリゴヌクレオチドの内、オリゴヌクレオチド番号５８０８、９５８８、９５８９、９５９１、９５９２、９５９３、９５９４、１０６０２、１０６０３、１０６０４、１０６０５、１０６０７、１０６０８および１０６０９は、１０μＭ以下のＥＣ９０値を示しており、目下のところ好ましい。これらの内、オリゴヌクレオチド９５８９、９５９１、９５９３および９５９４（配列番号１５、１７、１９および２０）が、目下のところ、より好ましい。ＨＢＶの動物モデルウッドチャックモデル：ウッドチャックモデルは、１０年以上にわたり、肝炎の研究に用いられてきた（Ｇｅｒｉｎ，Ｊ．Ｌ．，１９９４，ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＨｅｐａｔｉｔｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ．，Ｆ．Ｃｈｉｓａｒｉ編、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＵＳＡ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ）４０−４８頁；Ｇｅｒｉｎら、１９８６、Ｖａｃｃｉｎｅｓ，８６：ＮｅｗＡｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ，Ｆ．Ｂｒｏｗｎら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、３８３−３８６頁）。ウッドチャック肝炎ウイルス（ＷＨＶ）は、免疫学的および配列相同性の点の両方で、ＨＢＶと密接な関係にある。ウッドチャックは、今や肝炎の実験研究のために育てられ飼育されている。ＷＨＶを限定接種で若齢動物に感染させると、薬剤試験および研究用の慢性キャリヤーが得られる。少なくとも一つの商品試験設備を、ウッドチャックの化合物試験専用に用いている（Ｔｅｎｎａｎｔ，Ｂ．Ｃ．およびＪ．Ｌ．Ｇｅｒｉｎ、１９９４、ＴｈｅＬｉｖｅｒ：ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、第３版、Ｉ．Ｍ．Ａｒｉａｓら編、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，ＬＴＤ．，Ｎ．Ｙ．１４５５−１４６６頁）。ＨＢＶおよびＷＨＶ間の配列相同性のため、設計され表１に示されたオリゴヌクレオチドの効果は、ウッドチャックモデルで評価することができ、さらに、このモデルで化合物の効能を証明することは、当業者らに具体的な薬物動態学的効果を明らかに示すことになる。チンパンジーモデル：チンパンジーは、ＨＢＶの宿主であり、それ故、ＨＢＶ誘導疾病の動物モデルとなる。チンバンジーへの感染に続いて起こる血清学的変化は、ヒトに認められるそれと同じである。ＨＢＶにチンパンジーを晒した結果、急性および慢性両方の感染が得られる。しかしながら、チンパンジーでは、肝炎の臨床徴候が認められない（Ｃｏｒｎｅｌｉｕｓ，Ｃ．Ｅ．、１９８８、ＴｈｅＬｉｖｅｒ：ＢｉｏｌｏｇｙａｎｄＰａｔｈｏｂｉｏｌｏｇｙ、第二版、Ｉ．Ｍ．Ａｒｉａｓら編、ＲａｖｅｎＰｒｅｓｓ，Ｌｔｄ．，Ｎ．Ｙ．１３１５−１３３６頁）。ヒトに感染させるのと同一のウイルスを動物に感染させたこのモデルで、活性が証明されたことは、当業者らにヒトでの治療効果の可能性を示す。トランスジェニックラットモデル：ヒトＢ型肝炎ウイルス遺伝子を発現するトランスジェニックラットを用いるモデルは、最近開発されたばかりである（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５，９２，１４７０−１４７４）。これらの動物は、急性肝炎を発症し、感染後３日から７日の間、ウイルス粒子およびＨＢｅＡｇが血液内に認められる。ＨＢＶは肝臓内で発現し、その結果肝細胞を死に至らしめる。これらの影響およびその後に起こる血液からのビリオンの除去は、ヒトの急性ＨＢＶ感染の影響に似ている。それ故、このモデルでの化合物の活性は、当業者らにヒトの治療活性を示す。以下の実施例は、説明する目的のみに提供されたものであり、本発明を制限するためのものではない。実施例実施例１：オリゴヌクレオチドの合成および特徴決定標準ホスホルアミダイト化学を用いて、自動ＤＮＡ合成装置（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓｍｏｄｅｌ３８０Ｂ）で、ホスホロチオエートデオキシオリゴヌクレオチドを合成した。標準酸化瓶は、ホスファイト結合を段階的にチオ化（ｔｈｉａｔｉｏｎ）するために、０．２Ｍの３Ｈ−１，２−ベンゾジチオール−３−オン１，１−ジオキシド／アセトニトリル溶液に取り替えた。チオ化サイクル待機段階を６８秒に増やし、その後キャップ化段階を行った。β− シアノエチルジイソプロピル−ホスホルアミダイトは、ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ（ＦｏｓｔｅｒＣｉｔｙ，ＣＡ）より購入した。調節多孔ガラスカラム（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍｓ）から切断し、濃縮した水酸化アンモニウム中、５５°Ｃで１８時間、脱ブロックした後、０．５ＭＮａＣｌ／２．５倍量エタノールから二回沈殿させることによって、オリゴヌクレオチドを精製した。分析用のゲル電気泳動は、２０％アクリルアミド、８Ｍ尿素、４５ｍＭトリス−ホウ酸バッファー、ｐＨ７．０で行った。オリゴデオキシヌクレオチドおよびホスホロチオエートオリゴヌクレオチドは、全長の物質の８０％以上であることが電気泳動から判定された。実験例２：ＨＢＶ複製のオリゴヌクレオチド阻害のインビトロ分析オリゴヌクレオチドは、標準化細胞培養アッセイで評価した（ＫｏｒｂａおよびＧｅｒｉｎ、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．，１９９２、１９，５５−７０；ＫｏｒｂａおよびＭｉｌｍａｎ、ＡｎｔｉｖｉｒａｌＲｅｓ．，１９９１，１５，２１７−２２８）。簡単に言えば、ヒト肝芽腫２．２．１５細胞を、ＫｏｒｂａおよびＭｉｌｍａｎ（上記）に記載の方法に従って、増殖させた。０．３μ Ｍ、１μＭ、３μＭおよび１０μＭの用量のオリゴヌクレオチド（２％の子牛血清を含むＲＰＭＩ１６４０中）で１０日間毎日、２４穴プレート内の集密培地を処理した。処理前および処理中周期的に、ＨＢＶビリオンＤＮＡについて、培地をアッセイした。細胞内のＨＢＶＤＮＡは、処理１０日後に分析した。ＨＢＶＤＮＡを培地より抽出し、スロットブロット分析で分析した。細胞内ＤＮＡを調製し、プローブとして³²Ｐで標識した３．２ｋｂのＥｃｏＲＩＨＢＶＤＮＡフラグメントを用いて、サザンブロット分析で分析した（ＫｏｒｂａおよびＭｉｌｍａｎ、上記）。定量は、それぞれのゲル上に負荷したＨＢＶ標準との比較によった。毒性は、９６穴プレート内で増殖させ上記の方法に従って処理した細胞内へのニュートラルレッド染料の取り込みの阻害によって測定した。化合物の最終添加の１日後、培地を取り除き、０．０１％のニュートラルレッド染料（Ｓｉｇｍａ，Ｉｎｃ．）を含む０．２ｍｌのＤＰＢＳをそれぞれの穴に加えた。細胞を２時間回復させた。染料を取り除き、細胞をＤＰＢＳで洗浄し、その後０．２ｍｌの５０％ＥｔＯＨ／１％氷酢酸をそれぞれの穴に加えた。３０分間、穏やかに攪拌した後、５１０ｎｍの吸光度を測定し、未処理の対照培養と比較した。ＣＣ₅₀（５０％の細胞毒性濃度）値を計算した。実施例３：ウッドチャックでのオリゴヌクレオチド試験オリゴヌクレオチドは、ウッドチェック肝炎モデルにおいて抗ＨＢＶ剤および肝細胞癌抗癌剤の候補を日常の仕事としてスクリーニングする、Ｍａｒｍｏｔｅｃｈ，Ｉｎｃ．（Ｉｔｈａｃａ，Ｎ．Ｙ．）の商業設備で評価される（Ｇｅｒｉｎ．Ｊ．Ｌ．、１９８４、ＡｄｖａｎｃｅｓｉｎＨｅｐａｔｉｔｉｓＲｅｓｅａｒｃｈ．、Ｆ．Ｃｈｉｓａｒｉ編、ＭａｓｓｏｎＰｕｂｌｉｓｈｉｎｇＵＳＡ，Ｉｎｃ．ＮｅｗＹｏｒｋ、４０−４８頁；Ｇｅｒｉｎら、１９８６、Ｖａｃｃｉｎｅｓ８６：ＮｅｗａｐｐｒｏａｃｈｅｓｔｏＩｍｍｕｎｉｚａｔｉｏｎ、Ｆ．Ｂｒｏｗｎら編、ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒＬａｂｏｒａｔｏｒｙＰｒｅｓｓ，Ｎ．Ｙ．、３８３−３８６頁）。２０ｍｇ／ｋｇおよび２ｍｇ／ｋｇの二種類の投与量のオリゴヌクレオチドを、それぞれの投与量を３匹の動物に与えて試験した。０．１ｍｌのＰＢＳ内のオリゴヌクレオチドを、一日おきに３０日間（全体で１５回投与）、静脈内投与する。アッセイの第一次の終了点は、循環するウイルスのレベルである。０日（薬剤処理前）、処理１、２、４、８、１５、２２および３０日の血液サンプルを集める。標準的方法を用いてドットブロットまたはサザンブロット分析によって、ウイルスを定量する（Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＣｌｏｎｉｎｇ：ＡＬａｂｏｒａｔｏｒｙＭａｎｕａｌ，ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇＨａｒｂｏｒ，ＮＹ）。実施例４：トランスジェニックラットでのオリゴヌクレオチドの試験クローン化したＨＢＶホモダイマー構築物を調製し、Ｔａｋａｈａｓｈｉら、Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．Ａ．，１９９５，９２，１４７０−１４７４に記載の方法に従って、部分的に肝切除したＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット内に送達する。ＨＢＶ構築物をカチオン脂質ジオクタデシルアミドグリシルスペルミンと複合し、門脈を一時的に縛って、混合物を肝臓の右中葉内に注射することによって、肝臓内にＨＢＶ構築物を直接送達する（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、上記）。トランスフェクションが起こったことを確認するために、ＲＴ−ＰＣＲによってラット組織内のＨＢＶＲＮＡを検出し、免疫沈降およびＰＣＲによってラットの血清中のＨＢＶビリオンを検出し、サザンブロッティングによってラット肝臓内のＨＢＶＤＮＡを検出し、そして、ＥＬＩＳＡによってラット血清中のＨｂｅＡｇおよび抗−ＨＢｅ抗体を検出することができる（Ｔａｋａｈａｓｈｉら、上記）。オリゴヌクレオチド（０．１ｍｌのＰＢＳ中）は、３０日間１日おきに、尾静脈内に静脈注射することによって投与する。２ｍｇ／ｋｇおよび２０ｍｇ／ｋｇの投与量を用いる。ＨＢＶのアンチセンス阻害の影響は、上記のＨＢＶＲＮＡ、ＤＮＡ、ビリオン、ＨＢｅＡｇおよび抗ＨＢｅ抗体を検出することによって測定する。実施例５：ＨＢＶ複製を阻害するオリゴヌクレオチドの診断への使用ＨＢＶを原因とする肝炎の診断確定は、ＨＢＶ複製を阻害するアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いることにより容易に行うことができる。ＤＮＡは、血液サンプルまたは針生検によって得られた肝臓組織サンプルから抽出し、電気泳動し、そしてサザンブロッティングを行うためにニトロセルロースに移すか、あるいは標準法に従ってドットブロット分析を行うためにニトロセルロースに直接移す（ＣｕｒｒｅｎｔＰｒｏｔｏｃｏｌｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＢｉｏｌｏｇｙ，ＦｒｅｄｅｒｉｃｋＭ．Ａｕｓｕｂｅｌら編、ＪｏｈｎＷｉｌｅｙ＆ＳｏｎｓＩｎｃ．，１９９４、２．９Ｂ節）。ＨＢＶＤＮＡは、ＨＢＶＤＮＡとハイブリダイズする適当なＤＮＡプローブを用いて定量される。血液および組織の同一サンプルを、ＤＮＡの抽出およびブロッティングの前に、（上記したようにＥＣ₉₀から決定された）適当濃度のアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理してＨＢＶ複製を阻害する。次いで、２つのブロットの推定されるＨＢＶシグナルの強度を比較する。複製されたＨＢＶが存在し、（かつ、おそらく疾病の原因になって）いるならば、オリゴヌクレオチドによってＨＢＶ複製が阻害されることにより、ＨＢＶシグナルは、未処理のサンプルと比較してオリゴヌクレオチド処理サンプル中では減少するであろう。ＨＢＶ感染（複製ＨＢＶ）が存在しないならば、２つのサンプルは同一のシグナルを持つであろう。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングのようなその他の方法を用いて、同様のアッセイを設計することもでき、それらの方法のすべてを当業者は日常の仕事として行う。また、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持つアンチセンスオリゴヌクレオチドを用いる診断法は、肝炎患者から分離されたあるウイルスが処理に応答するか否かを、そのような処理を開始する以前に決定するためにも有用である。ＤＮＡを患者の血液または肝臓組織サンプルから分離し、上記の方法に従ってブロットする。ＤＮＡの抽出およびブロッティング前にＨＢＶ複製を阻害するために血液または組織の同一サンプルをアンチセンスオリゴヌクレオチドで処理する。次いで、２つのブロットの推定されるＨＢＶシグナルの強度を比較する。オリゴヌクレオチドが患者より得られたウイルスの複製を阻害する能力を持つならば、ＨＢＶシグナルは、未処理のサンプルと比較してオリゴヌクレオチド処理サンプルで減少するであろう。このことは、患者のＨＢＶ感染がアンチセンスオリゴヌクレオチド治療に応答することを示しており、一連の治療を開始することができる。２つのサンプルが同じシグナルを持っていれば、オリゴヌクレオチドはウイルスの複製を阻害することができず、その他の治療方法が必要である。ＰＣＲ、ＲＴ−ＰＣＲまたはノーザンブロッティングのようなその他の方法を用いる同様のアッセイを設計することができ、それらのすべてを当業者らは日常の仕事として行う。

【手続補正書】【提出日】１９９８年１月２３日【補正内容】請求の範囲１．ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記オリゴヌクレオチド。２．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。３．Ｃ遺伝子生成物がＣまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。５．ＨＢＶの感染を診断する方法であって、ＨＢＶの複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドと生物サンプルを接触させ、ここで前記オリゴヌクレオチドは、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持ち、そしてＨＢＶ複製が阻害されるか否かを決定することを含む、前記ＨＢＶ感染診断法。６．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項５記載の方法。７．Ｃ遺伝子生成物がＣまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項５記載の方法。８．オリゴヌクレオチドが、配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項５記載の方法。９．ＨＢＶの複製を阻害するための組成物であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記組成物。１０．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項９記載の組成物。１１．Ｃ遺伝子生成物が、Ｃまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項９記載の組成物。１２．オリゴヌクレオチドが、配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項９記載の組成物。１３．ＨＢＶに感染していると疑われる動物においてＨＢＶ感染を治療するための組成物であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記組成物。１４．ＨＢＶに関連する疾病にかかっていると疑われる動物においてＨＢＶに関連する疾病を治療するための組成物であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記組成物。１５．ＨＢＶに関連する疾病が、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎または肝細胞癌である、請求項１４記載の組成物。１６．ＨＢＶに晒されたかまたは晒されたと疑われる動物においてＨＢＶ関連疾病を予防するための組成物であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記組成物。１７．ＨＢＶ関連疾病が、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎または肝細胞癌である、請求項１６記載の組成物。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＳ，ＦＩ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，ＭＣ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ，ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＬＳ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)，ＵＡ(ＡＭ，ＡＺ，ＢＹ，ＫＧ，ＫＺ，ＭＤ，ＲＵ，ＴＪ，ＴＭ)，ＡＬ，ＡＭ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＣＡ，ＣＮ，ＣＺ，ＥＥ，ＦＩ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＬ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，ＭＫ，ＭＮ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＲＯ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＲ，ＴＴ，ＵＡ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (72)発明者カウサート，レックス・エムアメリカ合衆国カリフォルニア州92008, カールズバッド，ニューシェアー・ストリート 3008

Claims

【特許請求の範囲】１．ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドであって、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記オリゴヌクレオチド。２．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。３．Ｃ遺伝子生成物がＣまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。４．配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項１記載のオリゴヌクレオチド。５．ＨＢＶの感染を診断する方法であって、ＨＢＶの複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドと生物サンプルを接触させ、ここで前記オリゴヌクレオチドは、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’ キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持ち、そしてＨＢＶ複製が阻害されるか否かを決定することを含む、前記ＨＢＶ感染診断法。６．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項５記載の方法。７．Ｃ遺伝子生成物がＣまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項５記載の方法。８．オリゴヌクレオチドが、配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項５記載の方法。９．ＨＢＶの複製を阻害する方法であって、ＨＢＶまたはＨＢＶを含むと疑われる細胞、組織あるいは体液を、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドと接触させることを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記ＨＢＶ複製阻害法。１０．Ｓ遺伝子生成物が、Ｓ、ｐｒｅ−Ｓ１、またはｐｒｅ−Ｓ２である、請求項９記載の方法。１１．Ｃ遺伝子生成物が、Ｃまたはｐｒｅ−Ｃである、請求項９記載の方法。１２．オリゴヌクレオチドが、配列番号１、１４、１５、１７、１８、１９、２０、２１、２２、２３、２４、２６、２７または２８を含む、請求項９記載の方法。１３．ＨＢＶに感染していると疑われる動物のＨＢＶ感染を治療する方法であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療に有効な量を前記動物に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、 ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記ＨＢＶ感染の治療方法。１４．ＨＢＶに関連する疾病にかかっていると疑われる動物においてＨＢＶに関連する疾病を治療する方法であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドの治療に有効な量を前記動物に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記ＨＢＶ関連疾病の治療方法。１５．ＨＢＶに関連する疾病が、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎または肝細胞癌である、請求項１４記載の方法。１６．ＨＢＶに晒されたかまたは晒されたと疑われる動物においてＨＢＶ関連疾病を予防する方法であって、ＨＢＶ複製を阻害する能力を持ち８から５０ヌクレオチドの長さのアンチセンスオリゴヌクレオチドの予防に有効な量を前記動物に投与することを含み、前記オリゴヌクレオチドが、Ｐ遺伝子生成物、Ｓ遺伝子生成物あるいはＣ遺伝子生成物をコードするＨＢＶＲＮＡと、または５’キャップ領域、Ｕ５領域、ε領域あるいは翻訳開始部位を含むＨＢＶＲＮＡと、特異的にハイブリダイズする能力を持つ、前記ＨＢＶ関連疾病の予防方法。１７．ＨＢＶ関連疾病が、急性肝炎、慢性肝炎、劇症肝炎または肝細胞癌である、請求項１６記載の方法。