JPH05507481A

JPH05507481A - ウイルス性肝炎の診断及び治療

Info

Publication number: JPH05507481A
Application number: JP91509852A
Authority: JP
Inventors: カーター，ウイリアム・エイ
Original assignee: エイチ・イー・エム・リサーチ・インコーポレイテツド
Priority date: 1990-05-25
Filing date: 1991-05-08
Publication date: 1993-10-28
Anticipated expiration: 2016-09-10
Also published as: CN1059659A; ZA913949B; JP3208138B2; US5132292A; FI925261A0; PT97749B; PT97749A; IE911782A1; HUT65385A; HU9203682D0; CA2083603A1; FI925261A; WO1991018611A1; AU646050B2; AU7879691A; EP0531365A4; EP0531365A1; NZ238169A

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】ウィルス　＝の誇　び′、。

ウィルス性肝炎の特徴は、特定分子配置の細胞内ｄｓＲＮＡの欠失にあることが新たに知見された。このｄｓＲＮＡは、ある種の宿主の防御経路を「推進する（ｄｒｉｖｅ）」ために必要である。生化学的欠失は、肝臓の肝細胞及びリンパ球様系列のある種の末梢血球中に表れる。この欠失は、同一個体でしばしば観察される肝炎ウィルス、レトロウィルス及びヘルペスウィルスのような異種ウィルスの同時的増殖と関連している。外因的に供給された特定配置のｄｓＲＮＡはこの欠失箇所に挿入され（ａｄｄｒｅｓｓ）　、その結果として臨床症状を好転させる８本発明の開示は、Ａ型肝炎、Ｂ型肝炎及び非Ａ非Ｂ型肝炎のような肝障害に関連する種々の型のウィルスに対する治療計画に関係する。

先ｉへ１１慢性肝炎Ｂ型ウィルス（ＨＢＶ）の感染は世界的に極めて重要な健康にかかわる問題である。全世界で約２００万人が慢性的にＨＢＶに感染している。これらの感染者は、各人の健康が危機に陥るおそれがあるだけでなく、この世界的な流行病を伝染且つ拡大させるという重大な脅威を与える。米国では、健康な正常供血者の０．１〜０．５％が肝炎Ｂ型表面抗原（ＨＢ　ｓ　Ａ、　ｇ　）陽性である１、感染の危険度が高い個人（医療従事者、血友病患者、血液透析患者、及び注射針を使用する薬剤の常用者）の集団を選択したとき、この集団におけるＨＢｓＡｇ陽性のパーセンテージは３０％という高い値である。慢性ＨＢＶキャリアは血液接触または性的接触によって感染を伝播させ得る。ある種のＨＢＶキャリア、特に歯科医、外科医、またはその他の医療従事者は特に問題であり、彼等が多数の患者に接触して感染を拡大した実例が記録されている。

典型的には自己限定性の肝炎Ｂ型ウィルス感染は慢性感染状態を生じさせる。ＨＢＶ感染症全体の１０％は、（１）慢性持続性感染症、及び（２）慢性活動性感染症を含む慢性ウィルス感染症である。前者（慢性持続性感染症）では、患者はしばしば無症状であるかまたは軽い症状であるが、感染状態に維持されている。

後者（慢性活動性感染症）は重症の衰弱を示すばかりでなく、肝硬変、門脈圧充進のような生命分脅かす症状を生じ、死亡の危険性も大きい、肝細胞性癌も慢性ＨＢＶ感染と強力な相関関係を有してし）るト４．慢性ＨＢＶ感染患者の示す症状は、無症状または軽度の疲労、倦怠感、筋肉痛、関節痛、掻痒症などの軽症力）ら、肝機能不全（出血障害、腹水、脳障害（エンセファロバシー））のような重症まで多様である。慢性ＨＢＶに関連した生化学異常は、血清中の肝臓トランスアミラーゼの増加、血清アルブミンの減少、血清ビリルビンの増加、プロトロンビン時間の延長（進行肝臓病の末期）などである。

肝炎ウィルスは、ヒトの体液、糞便、性的接触などＧこよって伝播される。

Ｆ（ＢｓＡｇの持続的増加は歴史的に、別の関連する血清学的マーカーと共に慢性ＨＢＶ惑染感染−カーとして使用されてきた。伝統的な血清学的試験は定性的である。ＨＢｓＡｇ力価は、感染の重度と相関せず、必ずしも伝染性を意味しない、近年、ＨＢｓＡｇ−ＤＮＡ　（ＨＢＶ−ＤＮＡ）に対する放射性標識ｃＤＮＡによるハイブリダイゼーションアッセイが設計された。ＨＢＶ−ＤＮＡの直接ア・ンセイは、ＨＢＶ感染の検出において特異性の向上（縦隔性ＨＢｓＡｇの減少）及び感度の念著な向上を果たし得る。伝統的なＨＢＶ−ＤＮＡアッセイは重電量的である。感染宿主の血清サンプルに対する放射性標識１０−ブｃＤＮＡ４こよるスロット−プロットハイブリダイゼーションによってオートラジオグラムを作成し、これをデンシトメトリー法（こよってスキャンしてサンプルの信号強度を推定し、得られた推定値をＨＢＶ　ＤＮＡの近似量と相関させる。または、消化したサンプルのｌＩ２５Ｎ識ｃＤＮＡプローブ念用いる溶液ハイブリダイゼーションアッセイがＡｂｂｏｔｔＬａｂ、、Ｃｈ　ｉｃ　ａｇｏ、ＩＬによって設計されている５゜このアッセイは、流体相ハイブリダイゼーション、単段カラムクロマトグラフィー及びγ線放出によるＨＢＶ−ＤＮＡの直接定量を使用する。検出限度は血清１ｍｌあたりＨＢＶ−ＤＮＡ１．５ピコグラムであると言われている。

ＨＢＶ感染の有効な治療方法は少なくとも３つの理由から重要である。

１、慢性活動性肝炎の患者の肝臓病の好転、抗ウィルス薬による治療に伴う肝炎Ｂ型ウィルス粒子（ＨＢｅＡｇ及びＨＢＶ−ＤＮＡ）の減少は組織学的肝臓病の好転及び肝臓炎症の血清マーカーのレベル低下に関連することが判明した６゜２、慢性持続性肝炎及び慢性活動性肝炎の患者の伝染性の低下、血清のＨＢｅＡｇ及びＤＮＡポリメラーゼの減少に伴って感受性チンパンジーに対する患者血清の伝染性が低下することが判明した。

３、肝細胞性癌の罹患率の減少、これは本発明者が行なった実験Ｉによって初めて確認された。

本発明よりも前には慢性ＨＢＶ感染症及びその関連疾患に対する治療法は知られていなかった。最近の報告では、ある種の患者の治療にはインターフェロンが一時的効果を示すことが示唆されている。しかしながら、慢性ＨＢＶ惑染感染者の７５％以上はインターフェロンに応答せず、また、インターフェロン治療の停止後に応答が持続する患者の割合は更に少ない、別の形態の治療方法は効果も低く、また、好ましくない毒性作用（即ちアデノシンアラビノシド）がしばしば付随する。

・・　の　ｔＩ図１は、ウィルス１０−ブハイブリダイゼーシヨンによって得られた血清アヒル肝炎Ｂ型ウィルス（ＤＨＢＶ）ＤＮＡのドツトプロット分析である。

図２は、２種類の薬用量のｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ及びブラシーボを用いた血清ＤＨＢＶ　ＤＮＡのドツトプロットハイブリダイゼーションである。

図３は、種々の産生物及び対照に対する血清ＤＨＢＶＤＮＡポリメラーゼ活性を８週間にわたってプロットしたグラフである。

図４は、第１列から第８列まで倍加希釈した種々の治療または対照に対するハイブリダイゼーション分析による肝ＭＤＨＢＶ　ＤＮＡレベルのドツトプロットである。

児ｊヱと乳朋＝肝炎ウィルス単独によるウィルス性肝炎またはレトロウィルス及びヘルペスウィルスのような別のウィルスが共存したウィルス性肝炎は、肝細胞またはリンパ球様系列のある種の末梢血球のような生物サンプル中で特定の分子配置の細胞内ｄｓＲＮＡが欠失していることによって判定される。ウィルス性肝炎感染症は、１種または複数のｄｓＲＮＡを１種または複数の抗ウイルス薬と組み合わせて外部から投与することによって治療される。

本発明によれば、まず健康人の細胞内２′−５”　Ａオリゴアデニレートシンテターゼのレベルを評価し、健康人に比較して異常な２’　−５’　Ａシンテターゼレベルによって肝炎ウィルス感染の存在を判定し、必要ならばその後に２′− ５’−オリゴアデニレート濃度を健康人の該濃度に調整するべく十分な量のｄ　５ＲＮＡを投与する段階を含む被験者の肝炎ウィルス、特に肝炎Ｂ型ウィルスの感染を診断する方法が開示される。

また、不適正（ｍｉ　５ｎａｔｃｈｅｄ）ｄｓＲＮＡと、ｇａｎｃ　ｉｃ　Ｉ　ｏｖｉ　ｒ、ｆｏｓｃａｒｎｅｔ＋ｃｏｕ−ｍｅｒａｃｙｃｉｎ　Ａ＋またはヌクレオシド同族体の少なくとも１種との組み合わせを有効量で投与する段階から成る患者の肝炎Ｂ型つィルス感染症の治療方法も開示される。レトロウィルス、ヘルペスウィルスまたは双方が患者に存在していてもよい。

好ましくは、不適正ｄｓＲＮＡは１１５〜１／３０のウラシルグアニジン塩基を含むポリシチジレートとポリイノシレートとの複合体である。より特定的には、ｄ　ｓ　ＲＮＡはｒ　Ｉ　ｎ−ｒ　（Ｃ１１−１４、Ｕ）ｎであるか、または、不適正ｄｓＲＮＡは結合開裂領域を含みｒ　Ｉ　・ｒ　（ＣＩ＋−１４、Ｕ）ｎの好ましい治療係数特性を示す。

不適正ｄｓＲＮＡの投与量は、患者の全身循環血液１ｍ１あたり不適正ｄｓＲＮＡレベル２〜１，０００μｇとなる量である。別の１種または複数の抗ウィルス薬を使用するときは、これらは、製造業者の指示した常用量以内の量で投与する。

Ａｍ　ｌｉ　ｅｎ　標　ノパＡｍｐ　ｌ　ｉ　ｇｅｎ　（ポリＩ−ポリＣＩ　２　Ｕ　−ＨＥ　ＭＲｅｓｅａｒｃｈ　Ｉｎｃ、、Ｒｏｃｋｖｉｔｌｅ、ＭＤ）は、二重ＩＮ（ｄｓ）ＲＮＡと総称され、後でより詳細に説明及び図示するように本文中では基本型ｄｓＲＮＡと呼ばれる分子のクラスに所属する。二重鎖ＲＮＡはリンホカイン、即ち、細胞性免疫活性及び抗ウィルス活性を媒介する分子として作用する。Ａｍｐｌｉｇｅｎ活性は、ナチュラルキラー細胞の調節、マクロファージの調節、Ｂ−リンパ球の調節、腫瘍壊死因子の調節、（α、β及びγ型を含む）インターフェロンの調節、インターフェロン誘発細胞内酵素（：２−５Ａシンテターゼ及びプロティンキナーゼ）の調節を含む、臨床的にはＡｍｐｌｉｇｅｎは、エイズ関連症候群の患者のＴ４細胞数を安定させ、遅延型の過敏反応を増進させる。ｉｎ　ｖｉｔｒｏ及び臨床研究の双方で抗腫瘍効果が証明された。

これまで・は、抗成長ゑ、坑つィルス薬及び免疫調節薬としてのＡｍｐｌｉｇｅｎ誘発効果は、Ａｍｐｌｉｇｅｎがインターフェロンカスケードに影響を与えるためであると推測されていた。即ち、Ａｍｐｌｉｇｅｎは、インターフェロンの産生を刺激し、同時に、抗ウイルス状態及び抗成長状態を発現させるために必要な細胞内環境をインターフェロンが誘発するための必要な因子として作用すると推測されていた。しかしながら本発明者は、Ａｍｐｌｉｇｅｎの生物学的抗ウィルス活性が、インターフェロンの誘発であると考えることはできないことを報告する。実際、いくつかの系においては、Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療の直後に抗ウィルス活性を検出し得る。

１９７０年代の末期には、二重鎖ＲＮＡ、（即ちポリＩ；ポリＣ）が抗腫瘍剤として臨床使用されたが、許容できないほど重い毒性を有するので使用されなくなっている。

Ａｍｐｌｉｇｅｎは、ポリシチジル酸の１本の鎖にアニーリングされるポリシチジル酸の１本の鎖中の１２個毎のシチジル酸がウリジル酸（Ｕ）によって置換された特定形態の不適正ｄｓＲＮＡである。ヌクレオチド塩基対のこの「不適正」が、Ａｍｐｌｉｇｅｎの全体的分子配置中に特別な嚢状突起を生じさせる。分子のこの嚢状突起によってＡｍｐｌｉｇｅｎの生物学的活性は維持されるがＡｍｐ −１ｉｇｅｎの毒性は消滅する。より詳細に説明すると、分子はこの嚢状突起の存在によって、肝炎感染によって生じ罹病率に直接寄与するｄｓＲＮＡの細胞内欠失箇所に代償療法として直接挿入され得る。

ごく最近発表された比較的新しいクラスのヘルペスウィルスであるヘルペスウィルス−６にも何人かの患者が感染した。このウィルスは、）（ＢＬＶ（ヒトＢ細胞リンパ球ウィルス）またはＨＨＶ−６（ヒトヘルペスウィルス−６）などの種マの名前で呼ばれている。このウィルスの主な特徴は、約１６２個のキャプソメアと脂質膜とを有する正二十面体対称を示すことである。感染した細胞は大きい非感受性細胞に発展し、ある種の患者では循環リンパ球（骨髄または胸腺系統のある種のリンパ球）の２０〜３０％またはそれ以上が感染される。特異的ｄｓＲＮＡ療法を数箇月継続した後では、感染細胞のパーセンテージが激減する。

ｄｓＲＮＡは、ウラシル塩基またはグアニジン塩基をある割合、例えば１１５〜１／３０の割合で含むポリシチジル酸トとポリイノシネートとの複合体であろう（ポリ１）・ポリ（Ｃ４−２ｓＸ　＞　ＴＪまたはＧ））。

本発明で使用されるｄｓＲＮＡは、一般式ｒＩｎ・ｒ　（Ｃ、、、、、Ｕ）ｎまたはｒ　Ｉ　ｎ−ｒ　（ＣＩ２、Ｕ）ｎで示される。

その他の適当なｄｓＲＮＡの例について以下に検討する。

「不適正ｄｓＲＮＡ」なる用語は、対合する鋼量の水素結合（塩基の積み重ね）が比較的無傷（ｉｎｔａｃｔ）なこと、即ち、塩基対の平均割込み数が、連続する塩基対残基２９個あたり１つ未満であることを意味する。「不適正ｄ　５ＲＮＡＪなる用語をこのように理解されたい。

本発明での使用が好ましい不適正ｄｓＲＮＡは、ポリ（Ｃｎ、Ｕ）及びポリ（Ｃｒ＋、Ｇ）ｌ：式中、ｎは４〜２９の整数を示す〕から選択されるコポリヌクレオチドを基材とし、ポリリボシチジレート＜ｒＣｎ＞Ｈに沿って不対合塩基（ウラシルまたはグアニジン）が組込まれるようにｒＩｎ・ｒＣｎを修飾することによって形成されたポリリボイノシン酸及びポリシチジル酸の複合体の不適正同族体を意味する。または、ｄ’５ＲＮＡは、ポリ（Ｉ）・ポリ（Ｃ）ｄｓＲＮＡから、ポリリボイノシン酸（ｒＩｎ＞のリボシル主鎖を、例えば２′−０−メチルリボシル残基を含ませるように修飾することによって得られてもよい、不適正複合体は、リシンセルロースのようなＲＮＡ安定用ポリマーとの複合体を形成してもよい。

好ましくは、一般式ｒ　Ｉ　ａ・（Ｃｘ−＋＜、Ｕ）ｎまたはｒＩｎｌ・ｒ（Ｃｚｓ、Ｇ）ｎで示されるこれらのｒＥｎ−ｒｃｎの不適正同族体は米国特許第４，１３０，６４１号及び第４，０２４゜２２２号にＣａｒｔｅｒ及びＴｓ’ｏによって記載されている。これらの特許の記載内容は本発明に含まれるものとする。該特許に記載されたｄｓＲＮＡは概して本発明での使用に適している。

本発明で使用するためのその他の不適正ｄｓＲＮＡの例は。

くポリ■）・ポリ　（Ｃ４、Ｕ）（ポリＩ）　・ポリ（Ｃ７、Ｕ）（ポリＩ）・ポリ（Ｃ１３、Ｕ）くポリ■）・ポリ　（Ｃ２２、Ｕ）（ポリＩ）・ポリ　（Ｃ２゜、Ｇ）（ボリエ）・ポリ（Ｃ７９、Ｇ）、及び、（ポリエ）・ポリ（Ｃｐ２３、ＧＡＰ）である。

本発明での実用に適したｄｓＲＮＡの別のクラスは、規定された構造の短いｄ　５ＲＮＡ、例えば、式・５′ロック−（Ｉ）ｎ−ロック３′ ３′口・ンクー（Ｃ）−一ロツク５′ 〔式中、ｍ及びｎの各々は、５よりも大きく１００よりも小さい整数を示し、■ はイノシンモノホスフェートを示し、Ｃはシチジンモノホスフェートを示し、一方の鎖のロックは他方の鎖のロックに相補的である〕で示されるオリゴヌクレオチド、または、式：％式％３′ロック−Ｃ（Ｃ）ｙＵ　）ｋ−ロック３′〔式中、Ｘ及びｙの各々は５よりも大きく２５よりも小さい整数であり、ｊ及びｋの各々は１以上で１０未満の整数であり、■及びＣは前記と同義、ＡはＩでないヌクレオチドを示し、ＵはＡと塩基対を成すヌクレオチドを示す〕で示される構造を有するオリゴヌクレオチドである。

または、思いオリゴヌクレオチドが式：％式％）〔式中、ｎ、ｍ、Ｔ及びＣは前記と同義〕で示される構造を有していてもよい。

これらのオリゴヌクレオチドの一方の鎖は、他方の鎖中のヌクレオチドに相補的でない置換を有していてもよい。

好ましくはこれらのオリゴヌクレオチドは、相補的ヘテロポリマーの内部位置合わせ（ｉｎｔｅｒｎａｌ　ｒｅｇｉｓｔｅｒｓ）によって安定にされ、好ましくはロックまたはヒンジまたは双方が相補的ヘテロポリマーの領域を含む。

これらのオリゴヌクレオチドが一本鎖テールを有しているのが望ましい。これらのオリゴヌクレオチドは、１９８８年４月１４日出願のＧｉ　Ｉ　Ｉｅｓｐｉｅ　＆　Ｃａｒｔｅｒの米国特許出願第０７／１８１．３８５号及びその対応国際出願ＰＣＴ／ＵＳ８９１０２１７２により詳細に記載されている。該特許出願の記載内容は本発明に含まれるものとする。オリゴヌクレオチドは、適当な担体を用いて種々の経路、例えば経口的に投与され得る。

アヒル肝炎Ｂ型ウィルスは、ヒト肝炎Ｂ型ウィルス（ｈｅｐａｄｎａｖｉ　ｒｕｓｅｓ）と同様にユニークな複製経路を有しており、ヒトＨＢＶに対する抗ウィルス薬を評価するための理想的モデルであると考えられる。肝炎Ｂ型ウィルスは、ユニークな複製経路及び極めてユニークなゲノムコンホーメーション、即ちｄｓ／ｓｓ　ＤＮＡ分子にハイブリダイズする一本頭ゲツムを有している。これはヒトゲノムに組込まれ、Ｂ型肝炎陽性個体の肝臓癌は数百倍も多い、慢性ＨＢＶの研究に使用できる２つの動物系、アヒルとマーモットのうちでは、かみ付くおそれがないのでアヒルを最初に選択した。従って、アヒルは、薬剤試験用の合理的なｉｎ　ｖｔｖｏ系を表す。

これらの動物試験で使用される全体プロトコルは以下の通りである。ＤＨＢＶのキャリアになっている先天性感染アヒルをＡｍｐｌｉｇｅｎ単独、Ａｍｐ　Ｉ　ｉ　ｇｅ　ｎ＋ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ（抗ウィルス薬）、Ａｍｐｌｉｇｅｎ＋ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ＋ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎＡｌ（ＤＮＡジャイレースインヒビター）で治療した。ナリジキシン酸（毒性が少なく経口投与できる）も使用できる。血清ウィルスレベルをＤＮＡハイブリダイゼーション及びＤＨＢＶ　ＤＮＡポリメラーゼ活性によって定量した。

肝臓のウィルス負荷をＤＮＡハイブリダイゼーションによって決定した。

ＤＨＢＶのキャリアとなっている先天性感染アヒルを治療するために不適正ｄｓＲＮＡを使用しな、安定な均等レベルの血清ＤＨＢＶ　ＤＮＡを有するＰｅｋｉｎ−ＡｙＩｅｓｂｕｒｙ交雑アヒル系を、Ａｍｐ　Ｉ　ｉ　ｇｅｎ単独、または、ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒとの組み合わせ、またはｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ及びｃｏｕｍｅｒｍｙｃｔｎＡｌとの組み合わせによって治療した。　Ａｍｐ　１　ｉ　ｇｅｎ（７，５ｍｇ／ｋｇ）単独を腹腔内（ｉ　、ｐ　、）注射によって２８日間継続して毎日投与した。　Ａｍｐ　ｌ　ｉ　ｇｃ！ｎに添加した別の抗ウィルス薬が意外な相乗効果を与えるが否かを判断するために、Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療の最後の１４日間は、ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ　（Ｌｏｍｇ／ｋｇ／日）、ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ　Ａｌ（Ｌｏｎｇ／ｋｇ／日）、ｆｏｓｃａｒｎｅｔ、またはジデオキシイノシン（ＤＤ　Ｉ　）のようなヌクレオシド同族体をｉ、ｐ、注射または内服（ｐ。

ｏ、）で分割薬用量ずつ毎日投与した。この治療計画で治療した全部のアヒルが薬剤投与に耐えた。体重減少またはその他の好ましくない血液学的な肝機能、腎機能の悪化は全く観察されなかった。これはｄｓＲＮＡ代償療法の特異性を示す。

以下のデータは、いくつかの重要な事実を示す。Ａｍｐｌｉｇｅｎで治療した次世代アヒルは、治療の最初の２週間で血清ＤＨＢＶ　ＤＮＡレベルの有意な低下を示した。

この低下はその後の２週間の治療期間も続いた。治療中止の４週間後に、血清ウィルスＤＮＡレベルがゆっくりと戻り始めた。しかながら、Ａｍｐｌｉｇｅｎをｇａｎｃ　ｉ　ｃｌｏｖｉｒのような他の薬剤と併用したときは、治療中の血清ＤＨＢＶの阻害は完全であった。　Ａｍｐ　ｌ　ｉ　ｇｅ　ｎ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ／ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ　Ａｌのような別のＡｍｐｌｉｇｅｎ組み合わせで治療した次世代アヒルでも同様のパターンが観察された。ウィルスＤＮＡポリメラーゼレベルもまた、すべての組み合わせ治療グループで阻害を示した。

肝臓サンプルの定量的ドットブロッ）　ト分析によれば、未治療対照次世代アヒルは肝細胞あたり３６０のウィルスゲノム当量（ｖｇｅ）を示した。Ａｍｐ１ｉｇｅｎ単独による治療後の肝細胞あたりのＤＨＢＶは６０ｖｇｅになり８３％の減少を示した。治療の４週間後に、Ｄ　ｌ（Ｂ　Ｖは細胞あたり３６０ｖｇｅの治療前レベルに戻った。Ａｍｐｌｉｇｅｎとｇａｎｃ　ｉｃ　１ｏｖｉ　ｒとの組み合わせによる治療後の次世代アヒルは、細胞あたりく２０ｖｇｅ（＞９４％阻害）を示した。Ａｍｐｌｉｇｅｎ／ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ／ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ　Ａｌで治療した次世代アヒルは、Ａｍｐ　ｌ　ｉ　ｇｎｅ／ｇａｎ− ｃｉｃｌｏｖｉｒ治療グループと実質的に同等の結果を示した。

これらの結果は、単独使用されるかまたはその他の抗ウィルス薬と併用されたＡｍｐｌｉｇｅｎが、感染次世代アヒルから採取した血清中で間接的に観察したときも肝臓中で直接観察したときも、ＤＨＢＶ　ＤＮＡ複製の有意な阻害を生じることを示す。

ｚ里！Ｊ１（４脱ｊ− 図１は、Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療アヒルの血清ＤＨＢＶＤＮＡにハイブリダイズするウィルスプローブのド・ントプロットを示す、横の行は種々の試験アヒル個体を示し、縦の列は連続する週の数を示す。１は処理前、２〜５の４週間はＡｍｐｌｉｇｅｎ治療期間、６〜９は治療後の４週間を示す０種々の動物において観察されたウィルスレベルは、はぼ同様の時開的変化を示した。

レーンＡ及びＢはＡｍｐｌｉｇｅｎ単独投与、レーンＣ及びＤは最初の２遇闇のＡｍｐｌｉｇｅｎ投与と３通口及び４遠目（４列、５列〉のＡｍｐ　ｌ　ｉｇｅｎ＋ｇａｎｃ　１ｃｌｏｖｉｒ投与、レーンＥ及びＦは最初の２週間のＡｍｐｌｉｇｅｎ投与と３週及び５週のＡｍｐＬｉｇｅｎ＋ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ＋ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ　Ａｌ投与、レーンＧ及びＨはウィルス陰性対照を示す。

種々のアッセイ系及び単数または複数の治療薬（文字で指定）を用い数週間（数字で指定〉を要して行なった試験を図２及び図３に示す。

Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療（１０ｍｇ／ｋｇ／日の用量を２凹に分けて投与ンした慢性感染アヒルの同様のドットブロツ図４は肝臓ウィルスゲノムレベルを肝１１ＤＨＢＶ　ＤＮＡとして報告している。横の行の１から８の数値は、１２８倍に希釈した１、５μｇのアヒルＤＮＡの倍加希釈を示している６レーンＡ−Ｃは夫々、非治療感染アヒルから採取した５週、９週及び１３週目の肝臓サンプルである。レーンＤ及びＥはＡｍｐｌｉｇｅｎ単独治療サンプルの治療終了時点の細胞あたりのウィルスゲノム数（Ｄ＝６０＞及び治療終了の４週間後の８胞あたりのウィルスゲノム数（Ｅ＝３６０＞を示す、レーンＦ及びＧＧ、ｔＡｍｐ　Ｉ　Ｌ　ｇｅ　ｎ＋ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ治療サンプルの治療終了時点の細胞あたりのウィルスゲノム数（Ｆ＝２０＞及び治療終了の４週間後の細胞あたりのウィルスゲノム数（Ｇ＝４９０）を示す。レーンＨ及び工はＡｍｐ　Ｉ　ｉ　ｇｅｎ＋ｇａｎｃ　１ｃｌｏｖｉｒ＋ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｆｎ　Ａｌ治療サンプルの治療終了時点の細胞あたりのウィルスゲノム数（Ｈ＝２０）及び治療終了の４週間後の細胞あたりのウィルスゲノム数（１＝４９０＞を示す、レーンＪ、Ｋ及びＬはウィルス陰性対照を示す。レーンＭはウィルスＤＮＡを計算するためのウィルス標準を示す。

ヒトにおＧる　床オーアンラベル試験で、Ａｍｐ　ｌ　ｉ　ｇｅｎ治療（２００ｍ、　ｇ、週２回、静注）したＨ　Ｉ　Ｖ陽性の４人の免疫不全患者は、血清中のＨＩＶ　ＤＮＡの高レベル測定値によって肝炎Ｂ型ウィルス感染症の併発を示し、また、ヘルペス（ＨＨＶ６）感染症の併発を示した。４人の患者のうちの３人は、Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療中に血清ＨＢＶ　ＤＮＡレベルの減少を示した０例えば、１人の患者は、治療開始の３箇月以内に力価が２＋から１／２＋まで減少した。同様に第２の患者は、Ａｍｐｌｉｇｅｎ治療の４．５箇月後に血清ＨＢＶレベルが最初の３＋から減少を始め２＋まで続いた。

これらの結果は、確認済みの多発性免疫機能不全を伴うＨ丁ｖ疾患が併発している場合であっても、ＨＢＶに対する治療応答が生じることを示している。

肝炎病原体によって生起された細胞内ｄｓＲＮＡの特異的欠失及びその結果として生じた２′−５′Ａ経路挙動をモニターすることによって、２種以上のく同時〉ウィルス病原体を同時に治療する外因性ｄｓＲＮＡの特定構造を設計することが可能であった。

Ｘ上Ｊ」す１平行実験室試験では、適当な抗ウィルス性／免疫性防御を開始させるために必要な所要の天然ｄｓＲＮＡが肝細胞及び末梢リンパ球の双方に存在しないことを証明した。この細胞内ｄｓＲＮＡ欠失は、慢性ウィルス感染症によって適宜上方調節されるべきなのにされなかった２′−５′ＡオリゴＡ経路の異常として表れた。適宜配置した不適正ｄｓＲＮＡの投与後に、上記のごとき種々のヒト及び動物系において、宿主防御経路の正常化及びこれに付随した血漿中のウィルス（肝炎、ＨＩＶ及びヘルペス）の減少が観察された。

末梢血液リンパ球中の２′−５′オリゴアデニレートシンテターゼ／ＲＮアーゼＬ経路も試験した。ＣａｒｔｅｒらがＴｈｅ　Ｌａｎｃｅｔ、１９８７年６月６日、１２８６〜１２９２に記載した手順を用い、末梢血球における２′−５′オリゴアデニレート＜２’　−５”　Ａ）の＃素的欠失を分析するために患者の血液サンプルを診断した。異常が観察されると、この異常を性別及び年齢が同等の健康者の試験結果と比較し、患者の病状を好転させるためにｄｓＲＮＡ、好ましくは不適正ｄ　ｓ　ＲＮＡの外的投与によって修正した。治療中及び治Ｗｉ後に患者を追跡し、通常は病状の好転よりも数週間早い細胞レベルの好転を確認し、必要な場合には、正常な２−５′Ａシンテターゼ／ＲＮアーゼＬ経路を維持し且つ患者の肝炎Ｂ型つィルスレベル念維持または更に減少させるために必要なｄ　ｓ　Ｒ，ＮＡの量を決定した。

健康者及び肝炎Ｂ型ウィルス感染患者の２’　−５’　Ａ分子のｉｎ　ｖｉｖｏ濃度を以下のごとく評価する。ポリＵ−（”Ｐ）−ｐＣｐを用いた２′−５′Ａコアーセルロースアツセイ（アフイニテイクロマトグラフイー）によって、患者サンプルのエタノール可溶性分画（ＦＬｃｏｌｌ−ＨｙｐａｑｕｅＮ製した末梢血液リンパ球）中の２′−５’Ａの含量を分析した。

肝損傷、発熱などがなく、体質的症状、発疹などもないことから最近のウィルス感染履歴のないことが証明された１５人の＃康被験者の試験によって基準値を設定した。これらの被験者のリンパ球２′−５’　Ａレベルの濃度を、２’−５′ Ａ分子原品で得られた校正曲線を用いて決定した。

更に、２′−５’　Ａ濃度及び分子サイズを高圧液体クロマトグラフィー（ＨＰｉＣ）によって定量し得る。また、患者によってｉｎ　ｖｉｖｏ合成された２′ −５’　Ａの生物学的官能性く活性）を評価し、または患者のサンプル中の活性化ＲＮアーゼＬのレベルを測定するためにリポソームＲＮＡ開裂アッセイも使用し得る。末梢単核血球は好ましい分析用細胞である。

参考文献１．Ｍｏｒｂｉｄｉｔｙ　ａｎｄ　ＭｏｒｔａｌｉｔｙＲ，ｅｐｏｒｔ　３１（２４）：３１７２、Ｂｅａｓ　ｌ　ｅｙ、Ｒ，Ｐ、、Ｈｗ　ａ　ｎ　ｇ　、Ｌ、Ｙ、、Ｌ　ｉ　ｎ、Ｃ、Ｃ、ら：肝細胞性癌及び肝炎Ｂ型つイルス二台湾２２゜７０７人の予測試験（Ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｎａ　ａｎｄ　ｈｅ−ｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ：ａ　ｐｒｏｓｐｅｃｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　２２，７０７　ｍｅｎ　ｉｎＴａｉｗａｎ）、Ｌａｎｃｅｔ　２：１１２９．１９８１３．５ｈａｆ　ｒ　ｉ　ｔｚ、Ｄ、Ａ、、５ｈｏｕｖａｌ、Ｄ、、Ｓｈｅｒｍａｎ、Ｉ（，１，ら：慢性肝臓病及び肝細胞性癌の肝細胞のゲノムへの肝炎Ｂ型ウィルスＤＮＡの取込み：経皮的肝生検及び死後組織標本における研究（Ｉｎｔｅｇｒａｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒｕｓ　ＤＮＡ　１ｎｔｏ　ｔｈｅ　ｇｅｎｏｍｅ　ｏｆ　１ｉｖｅｒｃｅｌｌｓ　ｉｎ　ｃｈｒｏｎｉｃ　１ｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅ　ａｎｄ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕｌａｒｃａｒｃｉｎｏｍａ：５ｔｕｄｉｅｓ　ｉｎ　ｐｅｒｃｕｔａｎｅｏｕｓ　１ｉｖｅｒ　ｂｉｏｐｓｉｅｓ　ａｎｄｐｏｓｔ−ｍａｒｔｅｎ　ｔｉＳｓｕｅ　ｓｐｅｃｉｍｅｎｓ）　、Ｎ　ｅ　ｗ　Ｅ　ｎ　ｇ　Ｉ　ａ　ｎｄ　Ｊｏｕｒｒ＋ａｌ　ｏｆ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　３０５：１０６７．１９８１４、Ｚａｍａｎ、、Ｓ、Ｎ、、Ｍｅ　ｌ　ｉ　ａ、Ｗ、Ｍ、、Ｊｏｈｎｓｏｎ、Ｒ，Ｓ　ら・肝硬変における肝細胞性癌の増殖危険因子：患者６１６人の予測試験（Ｒｉｓｋ　ｆａｃｔｏｒｓ　ｉｎ　ｄｅｖｅｌｏｐＩＩｅｎｔ　ｏｒ　ｈｅｐａｔｏｃｅｌｌｕ！ａｒ　ｃａｒｃｉｎｏｍａ　ｉｎ　ｃｉｒｒｂｏｓｉｓ：ｐｒｏｓ−ｐｅｃｔｉｖｅ　５ｔｕｄｙ　ｏｆ　６１６　ｐａｔｉｅｎｔｓ）　、Ｌａｎｃｅ　ｔ　１　：１３５７、１９８５５、Ｋｕｈｎｓ、Ｍ、Ｓ、、ＭｃＮａｍａｒａ、Ａ、Ｌ、、Ｃａｂａ　１．Ｃ，Ｍ、ら：ヒト血清中の肝炎Ｂ型ウィルスＤＮＡの新規な定量的検出用アッセイ、ウィルス性肝炎及び肝臓病（＾ｎｅｗ　ａｓｓａｙ　ｆｏｒ　ｔｈｅ　ｑｕａｎｔｉｔａｔｉｖｅ　ｄｅｔｅｃｔｉｏｎｏｆ　ｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　ｖｉｒａｌ　ＤＮＡ　ｉｎ　ｈｕｍａｎ　ｓｅｒｕｍ）　、　Ｚ　ｕ　ｃ−ｋｅｒｍａｎ　４５ｔｈ　ｅｄ、Ａｌａｎ　Ｒ，Ｌｉ５ｓ、Ｎｅｗ　Ｙｏｒｋ、１９８８６、Ｓｃｕ　ｌ　１ａｒｄ−Ｇ、Ｈ，、Ａｎｄｒｅｓ、Ｌ、Ｌ、、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、Ｈ，Ｂ、ら：慢性Ｂ型肝炎感染の抗ウイルス治療：インターフェロン及びアデニンアラビノシドによる肝臓病の好転（＾ｎｔｉｖｉｒａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈｒｏｎｉｃｈｅｐａｔｉｔｉｓ　Ｂ　１ｎｆｅｃｔｉｏｎ：ｉ＠ｐｒｏｖｅｍｅｎｔ　ｉｎ　１ｉｖｅｒ　ｄｉｓｅａｓｅｗｉｔｈ　１ｎｔｅｒｆｅｒｏｎ　ａｎｄ　ａｄｅｎｉｎｅ　ａｒａｂｉｎｏｓｉｄｅ）　、Ｈｅ　ｐ　ａｔｏｌｏｇｙ　２：３９〜４９．１９８１７、Ｓｃｕ　１１　ａｒｄ、Ｇ、Ｈ，、Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ＋Ｈ。

Ｂ８、Ｓｍ１ｔｈ、Ｊ、Ｌ、ら：慢性Ｂ型肝炎感染の抗ウィルス治Ｖ：感染性ウィルスは治療に対する永久的応答後に患者血清中で検出できない（＾ｎｔｉｖｉｒａｌ　ｔｒｅａｔｍｅｎｔ　ｏｆ　ｃｈ−ｒｏｎｉｃ　ｈｅｐａＬ己ｉｓ　Ｂ　１ｎｒｅｃとｉｏｎ：１ｎｆｅｃｔｉｏｕｓ　ｖｉｒｕｓ　ｃａｎｎｏｔｂｅ　ｄｅｔｅｃｔｅｄ　ｉｎ　ｐａｔｉｅｎｔ　ｓｅｒｕｍ　ａｆｔｅｒ　ｐｅｒｍａｎｅｎｔ　ｒｅｓｐｏｎ−ｓｅｓｔｏｔｒｅａｔｍｅｎｔ）、Ｈｅｐａｔｏｌｏｇｙ　２：３９＋＋４９．１９８２％ｃｆ　ＯＴＣＲｅｍａｉｎｉｎｇＢｆｏｏｄ　［ＯＴＣ］　（ｕｇ／ｍｌ＞Ｂｆｏｏｄ　［ＯＴＣ］　（ｕｇ／ｍｌ）％ＩｎｈｉｂｉｔｉｏｎＶｏｃａｌｉｚａｔｉｏｎ　Ｔｈｒｅｓｈｏｌｄ　（ｍＡ）Ｄｅｇｒｅｅ　ｏｆ　ＡｎｅｓｔｈｅｓｉａＤｅｇｒｅｅ　ｏｆ　Ａｎｅｓｔｈｅｓｉａ要約肝炎ウィルス感染症は、不適正ｄｓＲＮＡ、特にｒＩ。

ｒ（Ｃ＋＋−ｚ、Ｕ）ｎを単独使用するが、またはｇａｎｃ　ｆ　ｃｌｏｖｉｒ、ｃｏｕｍｅｒｍｙｃｉｎ　Ａｌ、ジデオキシイノシンまたはそのヌクレオチド同族体の１種以上と組み合わせて使用することによって効果的に治療される。

国際調査報告

Claims

【特許請求の範囲】

１．（ａ）健康人め細胞内２′−５′Ａオリゴアデニレートシンテターゼのレベルを評価し、健康人のレベルに比較して異常な２′−５′Ａシンテターゼレベルによって肝炎ウイルス感染の存在を検出し、（ｂ）２′−５′−オリゴアデニレート濃度を健康人の値に調整するべく十分な量のｄｓＲＮＡを投与する段階から成る被験者の肝炎ウイルス感染の診断方法。
２．不適正ｄｓＲＮＡと、ｇａｎｃｉｃｌｏｖｉｒ、ｃｏｕｍｅｒａｃｙｃｉｎ　Ａｌ．ｆｏｓｃａｒｎｅｔまたはヌクレオシド同族体の少なくとも１つとの組み合わせを有効量で投与する段階から成る肝炎ウイルス感染患者の肝炎ウイルス感染症の治療方法。
３．患者が肝炎Ａ型、Ｂ型または非Ａ非Ｂ型ウイルスに感染していることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
４．患者に更に、レトロウイルス、ヘルペスウイルスまたは双方が存在することを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
５．ｄｓＲＮＡが不適正であることを特徴とする請求項１に記載の方法。
６．不適正ｄｓＲＮＡが、ポリウリジル酸と複合体化したポリアデニル酸であることを特徴とする請求項２または５に記載の方法。
７．不適正ｄｓＲＮＡが、１／５〜１／３０のウラシルグアニジン塩基を含むポリシチジレートとポリイノシネートとの複合体であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
８．不適正ｄｓＲＮＡが、ｒＩｎ・ｒ（Ｃ１１−１４、Ｕ）ｎであるか、または不適正ｄｓＲＮＡが、結合開裂領域を含みｒＩ・ｒ（Ｃ１１−１４、Ｕ）ｎの好ましい治療係数特性を示すことを特徴とする請求項７に記載の方法。
９．不適正ｄｓＲＮＡの投与量が、患者の全身循環血液１ｍ１あたり２〜１，０００μｇの不適正ｄｓＲＮＡのレベルとなる量であることを特徴とする請求項６に記載の方法。
１０．ｄｓＲＮＡが、式：５′ロック−（Ｉ）ｎ−ロック３′ ３′ロック−（Ｃ）ｍ−ロック５′ 〔式中、ｍ及びｎの各々は、５よりも大きく１００よりも小さい整数を示し、Ｉはイノシンモノホスフェートを示し、Ｃはシチジンモノホスフェートを示す〕、または、式：５′ロックー〔（Ｉ）ｘＡ〕ｊ−ロック３′３′ロック−〔（Ｃ）ｙＵ〕ｋ−ロック３′〔式中、ｘ及びｙの各々は５よりも大きく２５よりも小さい整数であり、ｊ及びｋの各々は１以上で１０未満の整数であり、Ｉ及びＣは前記と同義、ＡはＩでないヌクレオチドを永し、ＵはＡと塩基対を成すヌクレオチドを示す〕、または、式：５′（Ｉ）ｎ−ヒンジ−（Ｃ）ｍ３′ 〔式中、ｎ、ｍ、Ｉ及びＣは前記と同義〕で示される構造を有する短いオリゴヌクレオチドであり、１つの鎖のロックが対向鎖のロックに相補的であることを特徴とする請求項１または２に記載の方法。
１１．オリゴヌクレオチドが、相補的ヘテロポリマーの内部位置合わせによって安定化され、ロックまたはヒンジまたは双方が相補的ヘテロポリマーの領域を含むことを特徴とする請求項１０に記載の方法。