TWI798578B

TWI798578B - 棘白菌素類化合物於治療黃病毒感染症的用途

Info

Publication number: TWI798578B
Application number: TW109128671A
Authority: TW
Inventors: 何宜蓉; 盧正偉
Original assignee: 國防醫學院
Priority date: 2020-08-21
Filing date: 2020-08-21
Publication date: 2023-04-11
Also published as: TW202207968A

Abstract

本揭示內容是關於一種棘白菌素類化合物於治療一個體之黃病毒感染症的用途，特別是由登革病毒或茲卡病毒所引發的感染症，其中所述棘白菌素類化合物是阿尼芬淨、卡泊芬淨、棘白菌素B，或米卡芬淨。

Description

棘白菌素類化合物於治療黃病毒感染症的用途

本發明是有關於一種棘白菌素類化合物(Echinocandins)的新穎用途，且特別是有關於棘白菌素類化合物於治療黃病毒感染症(Flavivirus infection)的新穎用途。

黃病毒(Flavivirus)是泛指黃病毒科(Flaviviridae )下屬的各種病毒種類，該些病毒皆具有單股正鏈RNA、對稱性二十面體、有包膜等的共通特徵。由於其中一些黃病毒會引發人類疾病，進而造成全球嚴重的公共健康威脅，因此對於預防或治療與該些黃病毒相關的感染症一直是重要的公共衛生議題。最明顯的例子，可以拿蚊蟲所媒介的登革熱(Dengue fever)或茲卡病毒感染症(Zika virus infection)作為代表。

登革熱主要的病原體是登革病毒(Dengue virus，DENV)是由埃及斑蚊或白線斑蚊所傳播，在過去數十年間，登革熱在熱帶地區的國家已變成普遍的流行病，每年約有3.9億人感染登革熱，儘管大部分的感染者並未具有明顯的感染症狀，然而其中約有四分之一的感染者會表現出發燒不適(febrile illness)等臨床症狀。並且，由於登革病毒具有四種不同的血清型，分別為第一型(DENV-1)、第二型(DENV-2)、第三型(DENV-3)及第四型(DENV-4)，當感染者重複感染不同血清型的登革病毒以後，有極大可能性會衍變成嚴重的登革出血熱(dengue hemorrhagic fever，DHF)，或甚至是造成登革休克症候群(dengue shock syndrome，DSS)，其死亡率可高達44％，使得位於登革熱流行地區的國家有迫切需要來解決有關登革熱的問題。

另外，以茲卡病毒(Zika virus，ZIKV)感染症來說，自1954年首次有奈及利亞的人類感染病例開始，及至2007年在密克羅尼西亞爆發群聚感染以前，大多數的人類病例僅在非洲及亞洲有零星發現，但在此之後疫情則急遽蔓延，於2015至2016年間，茲卡病毒傳染已橫跨美洲、大洋洲、東南亞地區及非洲，影響全球逾80國，儘管茲卡病毒疫情於2017年初有趨緩的趨勢，但各國仍必須對其採取長期的應變措施。在茲卡病毒的感染者中，約有20％會出現臨床症狀，包括發燒、紅疹、關節炎、結膜炎等，嚴重時會影響經系統(如急性多發性神經炎)，或免疫系統(如特異性血小板低下性紫斑症)，值得注意的是，懷孕婦女如感染茲卡病毒，則可能產下小頭畸形等神經異常的新生兒。

儘管上述的病毒感染會引發嚴重的症狀，然而及至目前為止，人類尚未發展出任何有效的抗病毒藥物來治療上述的病毒感染症。有鑑於此，相關領域亟需一種新穎的抗病毒藥物，以治療該些病毒所引起的感染症，進而解除該些病毒對人類所造成的健康威脅。

下文呈現本揭示內容的簡單概要，以利讀者對本揭示內容有基本的理解。本概要並非對本揭示內容的廣泛性概觀，也非用以鑑別本揭示內容的關鍵性/決定性元件，或勾勒本揭示內容的範圍。它唯一的目的在於以一種簡化的形式呈現本揭示內容某些概念，作為後續呈現更多詳細說明的序幕。

本揭示內容是關於一種棘白菌素類化合物於製備一藥物的用途，其中該藥物係用以治療一個體之黃病毒感染症。

依據本揭示內容的某些實施方式，該黃病毒可以是登革病毒、C型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、庫京病毒(Kunjin virus)、蘭加特病毒(Langat virus)、墨累山谷腦炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、玻瓦散病毒(Powasan virus)、聖·路易腦炎病毒(Saint Louis encephalitis virus)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、黃熱病毒(Yellow fever virus)，或茲卡病毒。在某些具體實施例中，該黃病毒為登革病毒。在某些具體實施例中，該黃病毒為茲卡病毒。

依據本揭示內容的某些實施方式，該棘白菌素類化合物為阿尼芬淨(Anidulafungin)、卡泊芬淨(Caspofungin)、棘白菌素B(Echinocandin B)，或米卡芬淨(Micafungin)。依據一特定實施例，該棘白菌素類化合物為阿尼芬淨。依據另一特定實施例，該棘白菌素類化合物為米卡芬淨。

依據本揭示內容的某些進一步的實施方式，該藥物更包含一抗病毒劑。所述抗病毒劑可以是一種抗病毒穿入和脫殼的抑制劑、病毒蛋白酶抑制劑、干擾素、廣效的抗病毒製劑，或RNA聚合酶抑制劑。

依據本揭示內容的特定實施方式，該抗病毒劑為一種RNA聚合酶抑制劑，包括，但不限於，貝拉布韋(Beclabuvir)、達塞布韋(Dasabuvir)、德勒布韋(Deleobuvir)、法匹拉韋(Favipiravir)、非利布韋(Filibuvir)、拉達布韋(Radalbuvir)、塞托布韋(Setrobuvir)、索非布韋(Sofosbuvir)、3-羥基吡嗪-2-羧醯胺(3-Hydroxypyrazine-2-carboxamide，T-1105)，或優匹伏布韋(Uprifosbuvir)。依據本揭示內容的一較佳實施例，所述RNA聚合酶抑制劑為3-羥基吡嗪-2-羧醯胺(T-1105)。

依據本揭示內容的某些實施方式，該個體為人類。

本揭示內容的一或多個具體實例的細節係在下文附隨的說明中闡述。根據詳細說明和申請專利範圍，本發明的其他特徵和優點將顯而易見。在參閱下文實施方式後，本發明所屬技術領域中具有通常知識者當可輕易瞭解本發明之基本精神及其他發明目的，以及本發明所採用之技術手段與實施態樣。

為了使本揭示內容的敘述更加詳盡與完備，下文針對了本發明的實施態樣與具體實施例提出了說明性的描述；但這並非實施或運用本發明具體實施例的唯一形式。實施方式中涵蓋了多個具體實施例的特徵以及用以建構與操作這些具體實施例的方法步驟與其順序。然而，亦可利用其他具體實施例來達成相同或均等的功能與步驟順序。

I. 定義

為方便起見，本說明書、實施例及所附申請專利範圍中所使用的特定專有名詞集中在此。除非本說明書另有定義，此處所使用的科學與技術詞彙之含義與本發明所屬技術領域中具有通常知識者所理解與慣用的意義相同。並且，在不和上下文衝突的情形下，本說明書所使用的單數名詞涵蓋該名詞的複數型，而所使用的複數名詞時亦涵蓋該名詞的單數型。具體而言，在本說明書與申請專利範圍中，單數形式「一」(a及an)包括複數參考值，但依據上下文而另有指示者除外。此外，在本說明書與申請專利範圍中，「至少一」(at least one)與「一或多」(one or more)表述方式的意義相同，兩者都代表包含了一、二、三或更多。

雖然用以界定本發明較廣範圍的數值範圍與參數皆是約略的數值，此處已盡可能精確地呈現具體實施例中的相關數值。然而，任何數值本質上不可避免地含有因個別測試方法所致的標準偏差。在此處，「約」通常係指實際數值在一特定數值或範圍的正負10％、5％、1％或0.5％之內。或者是，「約」一詞代表實際數值落在平均值的可接受標準誤差之內，視本發明所屬技術領域中具有通常知識者的考量而定。除了實驗例之外，或除非另有明確的說明，當可理解此處所用的所有範圍、數量、數值與百分比(例如用以描述材料用量、時間長短、溫度、操作條件、數量比例及其他相似者)均經過「約」的修飾。因此，除非另有相反的說明，本說明書與附隨申請專利範圍所揭示的數值參數皆為約略的數值，且可視需求而更動。至少應將這些數值參數理解為所指出的有效位數與套用一般進位法所得到的數值。在此處，將數值範圍表示成由一端點至另一段點或介於二端點之間；除非另有說明，此處所述的數值範圍皆包含端點。

所述「治療」(treatment或treating)一詞，可指一種治癒性或緩解性的處置，藉以達到所欲的藥學和/或生理學效果。例如，對一個體施用或投予一有效量之本揭示內容棘白菌素類化合物，所述個體是罹患黃病毒感染症、患有與黃病毒感染症相關的症狀、黃病毒感染症的續發性疾病(disease)或病症(disorder)，藉以部分或完全地減緩(alleviate)、改善(ameliorate)、緩解(relieve)、延遲發作(delay onset)、抑制病程(inhibit progression)、降低嚴重度(reduce severity)，及/或降低黃病毒感染症的一或多種症狀或徵象(feature)的發生。

所述「個體」(subject)一詞，是指一種可利用本揭示內容棘白菌素類化合物來治療的動物，包括人類。除非有具體指出其中一種性別，否則「個體」一詞是指男性及女性二者。據此，「個體」一詞包含任何可從本揭示內容棘白菌素類化合物治療中獲益的哺乳動物。可利用本揭示內容棘白菌素類化合物來治療的「個體」的實例包括，但不限於，人類、大鼠、小鼠、天竺鼠、猴子、豬、山羊、牛、馬、狗、貓、鳥及雞。在另一例示性的實施方式中，該個體是人類。

所述「投予」(administered、administering或administration)一詞，是指一種傳遞方式，用以將本揭示內容棘白菌素類化合物或組合物提供給個體。傳遞方式包括，但不限於，口服、顱內、脊椎內、靜脈內、動脈內、心內、皮內、皮下、經皮，或肌肉內等注射傳遞方式。

在此處，「一有效量」(an effective amount)一詞是指一種有效的量，在必要的劑量及時間內，使本揭示內容棘白菌素類化合物的治療可達到欲求的療效(例如，治療黃病毒感染症)的使用劑量。為達到治療的目的，一有效量也指一種藥物之成分的治療利益超越該成分的毒性或有害影響。藥劑的有效量不必然能夠治癒疾病或病症，但能夠延緩、阻礙或防止該疾病或病症的發生，或是可緩減與疾病或病症相關的病徵。可將一有效量可分成一、二或更多劑，並以適當的劑型在指定期間內施用一次、二次或更多次。具體的有效量取決於各種不同的因素，例如，所欲治療的病症、個體的生理條件(例如，個體體重、年齡或性別)、接受治療的物種、治療持續時間、並行療法(若有的話)的本質，及所用的具體劑型，以及該化合物或其衍生物之結構。可利用任何適當的方式來表示有效量。舉例來說，可將藥劑的有效量表示成藥物總重量(例如，公克、毫克或微克)，或表示成藥物重量相對於體重的比例(例如，每公斤體重幾毫克(毫克/公斤，mg/Kg))。或者，可將藥劑的有效量以濃度來表示，例如，莫耳濃度(molar concentration)、重量濃度(mass concentration)、體積濃度(volume concentration)、重量莫耳濃度(molality)、莫耳分率(mole fraction)、重量分率(mass fraction)及混合比例(mixing ratio)。當可理解，大幅調整所需劑量也是可以預期的，該種情形會視不同的組合物與不同的投予路徑所導致不同藥效而定。舉例而言，相較於靜脈注射，預期口服需要較高的劑量。本領域技術人員完全理解可依據經驗法則來調整劑量。

「藥學上可接受的載體」(pharmaceutically acceptable carrier)一詞，是指一般咸認為安全(generally regarded as safe)的分子成份及組合物，並且是指與製劑的其他成分相容並且對其接受者無害的載體，即，人體對於該些物質具有生理學上可耐受的特性，並且在投予至人體時，一般不會產生過敏反應或類似的不良反應(例如，反胃、頭暈)等。

II. 發明詳述

本揭示內容至少一部分是基於發明人意外發現棘白菌素類化合物具有對抗黃病毒感染細胞的功效，特別是可有效對抗登革病毒或茲卡病毒的感染，因此該棘白菌素類化合物有潛力作為一種可治療黃病毒感染症的治療藥物。基於上述，本揭示內容涵蓋一種用以治療黃病毒感染症的方法，所述方法包含利用該棘白菌素類化合物。此外，本揭示內容亦涵蓋該棘白菌素類化合物於上述治療中的用途，以及該棘白菌素類化合物於製備一藥物以達所述治療目的的用途。

本揭示內容是關於一種用以治療一個體之黃病毒感染症的方法，該方法包含對該個體投予一有效量之棘白菌素類化合物。

依據本揭示內容的實施方式，所述黃病毒感染症是由黃病毒科下屬的病毒所引起，所述黃病毒科下屬的病毒包括，但不限於，登革病毒、C型肝炎病毒、日本腦炎病毒、庫京病毒、蘭加特病毒、墨累山谷腦炎病毒、玻瓦散病毒、聖·路易腦炎病毒、蜱傳腦炎病毒、西尼羅河病毒、黃熱病毒，或茲卡病毒。依據本揭示內容的一較佳實施方式，該黃病毒為登革病毒。依據本揭示內容的另一較佳實施方式，該黃病毒為茲卡病毒。

依據本揭示內容的實施方式，所述棘白菌素類化合物為阿尼芬淨、卡泊芬淨、棘白菌素B，或是米卡芬淨。依據一操作實施例，所述棘白菌素類化合物為阿尼芬淨。依據另一操作實施例，所述棘白菌素類化合物為卡泊芬淨。依據其他操作實施例，所述棘白菌素類化合物為米卡芬淨。

非必要地，可將所述棘白菌素類化合物的其中兩種、三種或四種合併使用，以治療該黃病毒感染症。舉例來說，可併用兩種棘白菌素類化合物來治療該黃病毒感染症，包括但不限於，阿尼芬淨與卡泊芬淨、卡泊芬淨與棘白菌素B、棘白菌素B與米卡芬淨、米卡芬淨與阿尼芬淨、阿尼芬淨與棘白菌素B、或是卡泊芬淨與米卡芬淨之組合；或是可併用三種棘白菌素類化合物來治療該黃病毒感染症，包括但不限於，阿尼芬淨與卡泊芬淨與棘白菌素B、卡泊芬淨與棘白菌素B與米卡芬淨、阿尼芬淨與卡泊芬淨與米卡芬淨、或是阿尼芬淨與棘白菌素B與米卡芬淨；亦或是可併用四種棘白菌素類化合物來治療該黃病毒感染症，例如可併用阿尼芬淨、卡泊芬淨、棘白菌素B與米卡芬淨，來治療該黃病毒感染症。

依據本揭示內容進一步的實施方式，可將本揭示內容棘白菌素類化合物與一種抗病毒劑併用，來治療該黃病毒感染症。所述抗病毒劑可以是一種抗病毒穿入和脫殼的抑制劑、病毒蛋白酶抑制劑、干擾素、廣效的抗病毒製劑，或RNA聚合酶抑制劑。

舉例來說，所述抗病毒穿入和脫殼的抑制劑可以是金剛烷胺(Amantadine)、金剛乙胺(Rimantadine)、恩夫韋地(Enfuvirtide)、馬拉韋羅(Maraviroc)；所述病毒蛋白酶抑制劑可以是阿蘇納普雷韋(Asunaprevir)、波普瑞韋(Boceprevir)、西魯普韋(Ciluprevir)、丹諾瑞韋(Danoprevir)、法匹拉韋(Faldaprevir)、格卡瑞韋(Glecaprevir)、格拉諾平(Grazoprevir)、那拉匹韋(Narlaprevir)、帕利瑞韋(Paritaprevir)、司美匹韋(Simeprevir)、索瓦瑞韋(Sovaprevir)、特拉匹韋(Telaprevir)、萬尼普韋(Vaniprevir)、委卓瑞韋(Vedroprevir)、伏西拉普瑞韋(Voxilaprevir)；所述干擾素可以是干擾素α-2b、聚乙二醇干擾素α-2a；所述廣效的抗病毒製劑可以是法匹拉韋(Favipiravir)、加利地韋(Galidesivir)、瑞德西韋(Remdesivir)、美利司塔賓(Mericitabine)、嗎啉胍(Moroxydine)、普沙托韋(Presatovir)、利巴韋林(Ribavirin)、他巴韋林(Taribavirin)、三氮唑核苷(Triazavirin)。

依據本揭示內容的較佳實施方式，是將本揭示內容棘白菌素類化合物與一種RNA聚合酶抑制劑併用，該RNA聚合酶抑制劑包括，但不限於，貝拉布韋、達塞布韋、德勒布韋、法匹拉韋、非利布韋、拉達布韋、塞托布韋、索非布韋、3-羥基吡嗪-2-羧醯胺(T-1105)，以及優匹伏布韋(Uprifosbuvir)。在一操作實施例中，與本揭示內容棘白菌素類化合物併用的RNA聚合酶抑制劑是T-1105。

基於上述，本揭示內容亦涵蓋一種包含棘白菌素類化合物的藥學組合物。依據本揭示內容的某些實施方式，本揭示內容藥學組合物包含上述一或多種棘白菌素類化合物。依據本揭示內容的另一實施方式，本揭示內容藥學組合物包含該一或多種棘白菌素類化合物與上述抗病毒劑。依據本揭示內容的其他實施方式，本揭示內容藥學組合物更包含一藥學上可接受的載體，以便於對個體以特定投予方式施用本揭示內容棘白菌素類化合物。所述藥學上可接受的載體包括，但不限於，緩衝液(例如，含磷酸鹽、檸檬酸鹽及其他有機酸的緩衝液)；抗氧化劑(例如，抗壞血酸)；親水性聚合物(例如，聚乙烯吡咯烷酮)；胺基酸(例如，甘胺酸、穀胺醯胺、天冬醯胺、精胺酸或離胺酸)；單糖、雙糖及其他碳水化合物(例如，葡萄糖、甘露糖或糊精)；螯合劑(例如，乙二胺四乙酸(EDTA))；糖醇(例如，甘露醇或山梨醇)；成鹽平衡離子(例如，鈉)；以及非離子型表面活性劑(例如，聚氧化乙烯山梨糖醇酐脂肪酸酯(TWEEN™)、聚乙二醇(PEG)、及聚氧化乙烯/聚氧化丙烯嵌段共聚物(PLURONIC™))。基於上述，本揭示內容亦涵蓋上述的藥學組合物。

當本揭示內容棘白菌素類化合物配製成一種藥學組合物時，該棘白菌素類化合物的重量約佔該藥學組合物總重量的0.1至99％。在一些實例中，該棘白菌素類化合物的重量約佔該藥學組合物總重量的至少1％。在某些實例中，該棘白菌素類化合物的重量約佔該藥學組合物總重量的至少5％。在其他實例中，該棘白菌素類化合物的重量約佔該藥學組合物總重量的至少10％。在再其他實例中，該棘白菌素類化合物的重量約佔該藥學組合物總重量的至少25％。

當可理解，可將本揭示內容含棘白菌素類化合物的藥學組合物配製成一種藥學製劑，以利對個體施用該藥學組合物。所述藥學製劑的劑型應配合欲採取的施藥途徑來使用，例如，可配製成口服劑型或腸胃外施用的劑型。口服劑型可以是一種固體劑型或是液體劑型，包括，但不限於，片劑、膠囊、小膠囊、粉劑、丸劑、顆粒劑、懸浮液(例如，水性或非水性液態懸浮液、水包油乳液或油包水液態乳液)、溶液及酏劑等。在某些實施方式中，可將粉劑、丸劑和顆粒劑以適合的聚合物或常規包衣材料來包覆，以獲得在胃腸道內更好的穩定性或達到所期望的釋放率。此外，含有粉劑、丸劑或顆粒劑的膠囊可進一步利用包衣材料來包覆。片劑和小膠囊可以有劃紋以便進行劑量分割。基於方便配製和使用上的便利性，腸胃外施用的劑型通常優先選擇配製成液體的形式，例如配製成水溶液或懸浮液。可任選地，本發明劑型可以是一種單位劑型，該劑型的目的在於每次施用是遞送一次治療劑量。

本揭示內容藥學組合物的施用劑量，根據臨床治療藥物仿單建議其會隨著個體的體重與疾病的嚴重程度不同而變化，建議棘白菌素類化合物的施用劑量約為每日150毫克，最佳劑量為600毫克。依據一特定實施方式，本揭示內容棘白菌素類化合物的施用劑量為每日不超過896毫克。為達到治療的目的，在治療療程期間可一或多次投予棘白菌素類化合物。舉例來說，依據本揭示內容不同的實施方式，在治療療程期間可每日、每隔一日或於指定時間對該個體投予棘白菌素類化合物。此外，在投予棘白菌素類化合物的當日，可每日一次、二次或三次給予該藥物。

本揭示內容的其中一項特點在於，本揭示內容棘白菌素類化合物的施用劑量可以不受現有已知於治療真菌感染性疾病的使用劑量所限制。舉例來說，可對一個體投予米卡芬淨每日150毫克的劑量，測得該個體的C_max 值約為12至16微克/毫升。依據本揭示內容的一操作實施例，米卡芬淨於治療黃病毒感染症(例如，DENV-1、2、3、4)的使用劑量為50微體積莫耳濃度(約為63.5微克/毫升)，該暴露量約為上述暴露量的4至5倍，惟該暴露量(50微體積莫耳濃度)並不會對細胞或個體生理造成不良影響，因此，本揭示內容所提供之棘白菌素類化合物於治療黃病毒感染症的施用劑量(例如，米卡芬淨50微體積莫耳濃度的劑量)為臨床上的安全使用劑量。

下文提出多個實驗例來說明本發明的某些態樣，以利本發明所屬技術領域中具有通常知識者實作本發明，且不應將這些實驗例視為對本發明範圍的限制。據信習知技藝者在閱讀了此處提出的說明後，可在不需過度解讀的情形下，完整利用並實踐本發明。此處所引用的所有公開文獻，其全文皆視為本說明書的一部分。

實施例

材料及方法

1. 分子嵌合方法

利用結構生物資訊協作研究(Research Collaboratory for Structural Bioinformatics，RCSB)的蛋白質資料庫調出DENV-2的套膜蛋白檔案(PDB：1OAN)，並利用ChemSpider網站資料庫調出米卡芬淨的3D結構(ChemSpider：21106351)。接著，利用PatchDock網路伺服器執行分子嵌合構形(conformation)的總體(ensemble)，其中該網站會計算嵌合分數，並排列出最佳構形。

2. 病毒、細胞培養，以及化合物

在本研究中使用DENV-1、DENV-2、DENV-3及DENV-4的病毒株，以及ZIKV的病毒株。該些病毒株是利用Vero細胞來繁殖，接著以TCID₅₀ 分析來確定病毒效價。將Vero細胞培養在杜氏改良式基礎培養基(Dulbecco's modified Minimal Essential Medium，DMEM)中，並補充12.5毫體積莫耳濃度之HEPES、L-丙胺醯基-L-麩醯胺(L-Alanyl-L-Glutamine)、抗生素，以及5％之胎牛血清，以及培養在37°C、5％之CO₂ 中。分別購買阿尼芬淨、卡泊芬淨、米卡芬淨及T-1105，並配製成儲備原液(stock)以利後續實驗使用。

3. 免疫螢光分析 (IFA)

將Vero細胞種在48孔培養盤中，接著，在含有特定劑量的阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨的環境中，以DENV-1、2、3、4(MOI = 1)及ZIKV (MOI = 0.1)感染細胞。之後培養2天，再將細胞固定，並以抗體進行染色，其中抗體為抗-DENV之NS3蛋白抗體(1：400，GeneTex，GTX124252)、抗-ZIKV之套膜蛋白抗體(1：400，GeneTex，GTX133314)，且二級抗體為DL488標定的抗-兔IgG (1：1000，GeneTex，GTX213110-04)；抗-黃病毒之套膜蛋白單株抗體(1：200，用於進行病灶形成分析(foci formation unit assay))，且二級抗體為DyLight488標定的抗-小鼠IgG (1：500，GeneTex，GTX213111-04)。

在合併治療的部分，將Vero細胞種在48孔培養盤中，接著，在含有特定劑量的阿尼芬淨及T-1105的環境中，以ZIKV (MOI = 0.1)感染細胞，並培養2天。之後，利用IFA分析來確認ZIKV的感染率。利用影像分析軟體ImageJ來分析螢光訊號，並計算IC₅₀ 的濃度。

4. RT-qPCR 分析

將Vero細胞種在24孔培養盤中，接著，以DENV-1、3、4 (MOI = 0.1)感染細胞1小時，再更換為新鮮培養基培養3天。在感染過程中，或感染後，將一系列之連續稀釋的米卡芬淨加入培養基中。利用NC之RNA萃取試劑(EBL，MRE-N3200)來萃取經感染之細胞的總RNA，並以qPCR分析儀(mic qPCR Cycler)(Bio Molecular Systems，mic-2頻道)來進行RT-qPCR定量分析。利用qPCR試劑(QuantiTech SYBR Green RT-qPCR套組)(Qiagen，204243)來製備樣本混合物，其中所使用的引子序列如表1所示。所有的實驗數據皆以-ΔΔC_t 方法來計算，且各實驗皆重複進行至少三次。

表1 RT-qPCR所使用的引子序列

引子名稱	序列5’→3’	序列編號
DENV-F	5’-CAATATGCTGAAACGCGAGAGAAA-3’	1
DENV-1R	5’-CGCTCCATACATCTTGAATGAG-3’	2
DENV-2R	5’-AAGACATTGATGGCTTTTGA-3’	3
DENV-3R	5’-AAGACGTAAATAGCCCCCGAC-3’	4
DENV-4R	5’-AGGACTCGCAAAAACGTGATGAAT-3’	5
ZIKV-F	5’-AGGATCATAGGTGATGAAGAAAAGT-3’	6
ZIKV-R	5’-CCTGACAACACTAAGATTGGTGC-3’	7
肌動蛋白-F	5’ATTGCCGACAGGATGCAGAA-3’	8
肌動蛋白-R	5’-GCTGATCCACATCTGCTGGAA-3’	9

5. 細胞存活分析

將Vero細胞種在96孔培養盤中，接著，利用細胞活性檢測套組(Cell Counting Kit-8，CCK-8)(MedChemExpress，美國)分析來檢測細胞存活率。將10％之CCK-8試劑加入待測細胞中。在37°C下培養1小時，接著測量450奈米/650奈米的吸光值。所有實驗皆重複進行三次，且將所得的結果對控制組進行校正。

6. 時序分析

以DENV-2 (MOI=0.1)或ZIKV (MOI=0.1)感染Vero細胞1小時。接著，更換為新鮮培養基，並分別培養3天(DENV-2)或2天(ZIKV)。此外，將米卡芬淨(50微體積莫耳濃度)及阿尼芬淨(10微體積莫耳濃度)在四個期間內加入：在病毒感染前的1小時(前置處理)、於病毒感染期間(同時處理)、在病毒感染後(後置處理)，以及涵蓋上述三個期間(全程處理)。利用RT-qPCR分析來檢測病毒的RNA表現量。

7. 病毒結合及穿入分析

以DENV-2或ZIKV感染Vero細胞，其中，在病毒結合分析的部分，病毒量為MOI = 0.1，且在4°C下反應，而在病毒穿入分析的部分，病毒量為MOI = 0.01，且在37°C下反應；同時處理特定濃度的米卡芬淨及阿尼芬淨1小時。之後，將病毒移除，並以含有1.5％之甲基纖維素(methylcellulose)(重量/體積)及5％之FBS的培養基覆蓋細胞。培養2天後，以IFA分析進行細胞染色，並計算含病毒的螢光病灶個數。所有的實驗數據是對病毒控制組進行校正。

8. 病毒毒殺分析

在37°C下，將DENV-2或ZIKV的儲備原液處理特定濃度的米卡芬淨及阿尼芬淨1小時。接著，將上述反應物稀釋100倍，以去除米卡芬淨及阿尼芬淨，並將所得之混合物加入Vero細胞(種於24孔培養盤中)。在37°C下反應1小時後，移除上清液，並以含有1.5％之甲基纖維素(重量/體積)及5％之FBS的培養基培養細胞2天。之後，以IFA分析進行細胞染色，以確認上述病毒感染細胞的能力。利用影像分析軟體ImageJ來分析螢光訊號。所有的實驗數據是對病毒控制組進行校正。

9. 統計分析

利用Prism (GraphPad軟體)分析定量結果。利用學生t檢定來分析所有的實驗數據，且P ＜ 0.05視為具有統計學上的顯著意義。*：P ＜ 0.05；**：P ＜ 0.01；***：P ＜ 0.001。

實施例 1 棘白菌素類化合物對於病毒感染細胞的抑制功效

在本實施例中，為尋找有潛力作為對抗黃病毒感染的藥物，首先利用生物資訊學的方法進行分子模擬的研究，利用網路分子模擬器PatchDock運算來模擬米卡芬淨與DENV-2的套膜蛋白之間的分子嵌合情形。如第1圖所示，在本模擬結果中，米卡芬淨可結合至DENV-2的套膜蛋白第一及二結構域(domain I及II)之間的位置，先前的研究指出與第二結構域結合之抗體，具有抑制膜融合的作用而產生中和病毒之能力，米卡芬淨結合於這個位置，可能會干擾登革病毒套膜蛋白在膜融合之構型改變，造成無法順利折疊而阻斷膜融合的作用，因此米卡芬淨可結合至該位置，說明米卡芬淨會具有抑制DENV-2感染宿主細胞的能力。

基於上述生物資訊分析的結果，進一步以細胞實驗來驗證米卡芬淨對於DENV-2感染細胞的抑制能力。同時，考量到棘白菌素類化合物具有共通的主環結構特徵，因此在本實驗中一併評估另外兩種其他棘白菌素類化合物(包括阿尼芬淨及卡泊芬淨)對於DENV-2感染細胞的抑制能力。實驗結果如第2圖的A小圖所示，是利用IFA來進行分析，隨著化合物的使用濃度增加，DENV-2感染細胞的能力隨之下降，三種化合物(阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨)對於DENV-2感染細胞皆呈現出劑量依賴性的抑制結果，其中，阿尼芬淨的使用濃度為2.5至20微體積莫耳濃度，約為2.85至22.8微克/毫升；卡泊芬淨的使用濃度為12.5至100微體積莫耳濃度，約為13.6至109.3微克/毫升；米卡芬淨的使用濃度為12.5至100微體積莫耳濃度，約為15.8至127微克/毫升。惟，不同化合物所能達到抑制病毒感染的濃度各有不同，其中，阿尼芬淨約使用10微體積莫耳濃度即可達到90％以上的抑制感染能力，且20微體積莫耳濃度則幾乎無病毒感染細胞的情形；而卡泊芬淨在100微體積莫耳濃度始可達到90％以上的抑制感染能力；至於米卡芬淨，則是在50微體積莫耳濃度可達到90％以上的抑制感染能力，且100微體積莫耳濃度則幾乎無病毒感染細胞的情形。據此，本實驗數據證明棘白菌素類化合物(包括阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨)具有抑制DENV-2感染細胞的能力。

本實施例並評估棘白菌素類化合物對於同為黃病毒科的另一成員ZIKV於感染細胞的能力，其中該棘白菌素類化合物涵蓋阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨，且利用IFA來進行評估。實驗結果如第2圖的B小圖所示，該實驗結果與第2圖的A小圖的實驗結果相仿，阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨對於ZIKV感染細胞皆呈現出劑量依賴性的抑制情形，其中，阿尼芬淨於5微體積莫耳濃度即可達到90％以上的抑制感染能力，至10微體積莫耳濃度時甚至可達到95％以上的抑制感染能力，而在20微體積莫耳濃度則幾乎無病毒感染細胞的情形；而卡泊芬淨則是在100微體積莫耳濃度始可達到90％以上的抑制感染能力；至於米卡芬淨，則是在25微體積莫耳濃度可達到95％以上的抑制感染能力，且50或100微體積莫耳濃度則幾乎無病毒感染細胞的情形。據此，本實驗數據證明棘白菌素類化合物(包括阿尼芬淨、卡泊芬淨及米卡芬淨)具有抑制ZIKV感染細胞的能力。

為進一步瞭解棘白菌素類化合物對於其他血清型的DENV是否同樣具有抑制病毒感染細胞的能力，因此進行以下的感染實驗來驗證，其中，棘白菌素類化合物是以米卡芬淨為例，用於評估該化合物對於其他血清型的DENV(包括DENV-1、DENV-3及DENV-4)感染細胞的抑制能力。實驗結果如第3圖的A至C小圖所示，在本實驗中是以RT-qPCR來評估細胞中的病毒基因表現量，以反應出受感染的細胞中的病毒量。本實驗的結果與第2圖的A小圖的實驗結果相仿，米卡芬淨對於DENV-1、DENV-3及DENV-4感染細胞的能力皆呈現出劑量依賴性的抑制情形。其中，米卡芬淨在100微體積莫耳濃度時，對於DENV-1、DENV-3及DENV-4感染能力約可達到50至75％左右的抑制量。此結果即說明，米卡芬淨對於其他血清型DENV的感染同樣具有抑制能力。

為瞭解高濃度的棘白菌素類化合物對於細胞的正常生理是否會造成潛在的不良影響，於是進行以下實驗。在本實驗中，是將細胞處理高濃度的棘白菌素類化合物，包括20微體積莫耳濃度的阿尼芬淨、100微體積莫耳濃度的卡泊芬淨，以及100微體積莫耳濃度的米卡芬淨等，並在時隔24小時以後，評估細胞的存活率。實驗結果如第4圖所示，與控制組相比，三種高濃度的棘白菌素類化合物處理細胞，均未造成細胞的存活率下降，相反的是，高濃度的米卡芬淨還可些微促進細胞生長。據此，本實驗結果說明，高濃度的棘白菌素類化合物並不會對細胞造成生長抑制的結果。

總結上述，本實施例的實驗數據證明，棘白菌素類化合物(例如，阿尼芬淨、卡泊芬淨或米卡芬淨)對於黃病毒的成員(例如，DENV或ZIKV)感染細胞具有良好的抑制能力。

實施例 2 棘白菌素類化合物抑制病毒感染細胞的作用

上述實驗結果說明棘白菌素類化合物具有良好的抑制病毒感染能力，爰於本實施例中進一步探討該些化合物如何影響病毒感染細胞的作用。

首先，是探討棘白菌素類化合物可有效防止病毒感染細胞的時間點，其中是以米卡芬淨來抑制DENV-2感染細胞(第5圖的A小圖)，以及以阿尼芬淨來抑制ZIKV感染細胞(第5圖的B小圖)為例說明。如第5圖的A小圖所示，說明在不同的使用時間點上(包括在DENV-2感染細胞之前、與DENV-2感染細胞的同時、在DENV-2感染細胞之後，或涵蓋DENV-2感染細胞的全程)，利用50微體積莫耳濃度的米卡芬淨來抑制DENV-2感染細胞的結果。該結果顯示出，與DENV-2感染細胞的組別相比，僅有在DENV-2感染細胞之後才施用米卡芬淨無法防止病毒感染細胞以外，其餘時間點上(包括在DENV-2感染細胞之前、同時或全程)施用米卡芬淨均可達到防止病毒感染細胞的效果。而在阿尼芬淨(10微體積莫耳濃度)於抑制ZIKV感染細胞的實驗上也可獲得與上述相仿的結果，如第5圖的B小圖所示，與ZIKV感染細胞的組別相比，僅有在ZIKV感染細胞之後才施用阿尼芬淨無法防止病毒感染細胞以外，其餘時間點上(包括在ZIKV感染細胞之前、同時或全程)施用阿尼芬淨均可達到防止病毒感染細胞的效果。本實驗結果說明，棘白菌素類化合物對於抑制黃病毒感染細胞需考慮使用時機(例如，在病毒感染細胞之前、同時，或全程使用)以達到有效的抑制效果，因此，棘白菌素類化合物具有預防黃病毒感染細胞的功效。

進一步探討棘白菌素類化合物對於病毒感染細胞的各個步驟所產生的作用。由於病毒感染細胞必須經過病毒結合細胞以及穿入細胞等步驟，因此進行以下實驗來釐清棘白菌素類化合物對於該些步驟所造成的影響。在病毒結合細胞的部分，是以米卡芬淨對於DENV-2結合細胞(第6圖的A小圖)，以及以阿尼芬淨對於ZIKV結合細胞(第6圖的B小圖)為例說明。如第6圖的A小圖所示，相較於DENV-2感染細胞的組別，在不同濃度的米卡芬淨中，DENV-2結合細胞的比例呈現出劑量依賴性的降低情形，亦即，隨著所使用的米卡芬淨濃度增加，DENV-2結合細胞的比例隨之降低，並且在100微體積莫耳濃度的米卡芬淨中，約可達到抑制50％之病毒的細胞結合量。阿尼芬淨對於抑制ZIKV與細胞的結合上，也呈現出與上述米卡芬淨類似的結果，亦即，隨著阿尼芬淨的使用濃度增加，ZIKV結合細胞的比例呈現出劑量依賴性降低的情形，並且可在阿尼芬淨濃度為2.5微體積莫耳濃度即可達到抑制50％之病毒對細胞的結合量，而在阿尼芬淨濃度為10微體積莫耳濃度時，可達到抑制75％之病毒對細胞的結合量(第6圖的B小圖)。本實驗結果說明，棘白菌素類化合物具有抑制黃病毒結合細胞的作用。

另外，在病毒穿入細胞的部分，同樣是以米卡芬淨對於DENV-2穿入細胞(第7圖的A小圖)，以及以阿尼芬淨對於ZIKV穿入細胞(第7圖的B小圖)為例說明。如第7圖的A小圖所示，DENV-2穿入細胞的比例，會隨著米卡芬淨的使用濃度增加(從12.5微體積莫耳濃度至100微體積莫耳濃度)而呈現出反比例下降的結果，並且可在米卡芬淨濃度為12.5微體積莫耳濃度的時候，即可達到抑制50％之病毒穿入細胞的數量，且在米卡芬淨濃度為100微體積莫耳濃度的時候，更可達到抑制90％之病毒穿入細胞的數量。此結果說明米卡芬淨具有抑制DENV-2穿入細胞的作用。同樣地，阿尼芬淨對於ZIKV穿入細胞的抑制能力也呈現出劑量抑賴性抑制的現象。隨著阿尼芬淨的使用濃度增加(從1.25微體積莫耳濃度至10微體積莫耳濃度)，ZIKV穿入細胞的比例則從約為100％左右下降至75％(使用濃度為2.5微體積莫耳濃度)、25％(使用濃度為5微體積莫耳濃度)，甚至僅剩5％(使用濃度為10微體積莫耳濃度)的病毒穿入細胞的數量(第7圖的B小圖)。此實驗數據即說明，阿尼芬淨具有抑制ZIKV穿入細胞的作用。本實驗結果說明，棘白菌素類化合物具有抑制黃病毒穿入細胞的作用。

接著評估棘白菌素類化合物對於黃病毒是否具有損害病毒感染細胞的能力，或具有毒殺病毒的能力。本實驗是利用米卡芬淨處理DENV-2後(第8圖的A小圖)，或是利用阿尼芬淨處理ZIKV後(第8圖的B小圖)，再將經處理的病毒用於感染細胞，藉由測量感染細胞中的病毒量(陽性率)，來評估化合物損害病毒感染細胞的能力，或化合物毒殺病毒的能力。如第8圖的A小圖所示，當使用的米卡芬淨濃度增加(從6.25微體積莫耳濃度至100微體積莫耳濃度)，則細胞中的DENV-2病毒量隨之減少(從約為70％下降至10％以下)，代表米卡芬淨具有破壞病毒感染細胞的能力，或具有毒殺病毒的能力。與上述結果類似地，阿尼芬淨對於ZIKV也同樣具有破壞病毒感染細胞的能力，或具有毒殺病毒的能力(第8圖的B小圖)。上述結果即說明，棘白菌素類化合物對於黃病毒是否具有損害病毒感染細胞的能力，或具有毒殺病毒的能力。

最後，本實施例並評估棘白菌素類化合物與其他抗病毒藥物併用來治療黃病毒感染細胞的功效。本實施例是以不同濃度的阿尼芬淨與T-1105(一種法匹拉韋的類似物，可用於抑制RNA病毒的病毒複製)併用，來治療ZIKV感染細胞為例說明，本實驗是利用IFA檢測病毒感染細胞的數量。實驗結果如第9圖所示，相較於單獨使用阿尼芬淨(例如，僅使用2.5或5微體積莫耳濃度的阿尼芬淨，且T-1105的使用濃度為0微體積莫耳濃度)，或相較於單獨使用T-1105(例如，僅使用125或250微體積莫耳濃度的T-1105，且阿尼芬淨的使用濃度為0微體積莫耳濃度)來說，合併使用阿尼芬淨及T-1105(例如，使用2.5或5微體積莫耳濃度的阿尼芬淨，再加上使用125或250微體積莫耳濃度的T-1105)可呈現出抑制ZIKV感染細胞的協同效應，說明合併藥物治療具有加乘的治療病毒感染症(例如，ZIKV感染症)的功效。

同時，計算出阿尼芬淨及T-1105的IC₅₀ 濃度，其中阿尼芬淨的IC₅₀ 濃度為7.78微體積莫耳濃度，而T-1105的IC₅₀ 濃度則為235.14微體積莫耳濃度。

基於上述結果，本實驗說明棘白菌素類化合物與其他抗病毒藥物(例如，抗RNA病毒複製的藥物)併用來治療黃病毒感染會具有加乘性的藥效，且可降低棘白菌素類化合物的使用量，進而有助於降低使用單一高劑量藥物所導致的藥物副作用的風險。

總結上述，本實施例已提供充分實驗數據說明，本案棘白菌素類化合物(例如，阿尼芬淨、卡泊芬淨或米卡芬淨)具有抑制黃病毒(例如，DENV或ZIKV)感染細胞的能力，且當棘白菌素類化合物與其他抗病毒藥物併用時，可進一步降低化合物的使用量，同時強化化合物治療黃病毒感染症的功效。基於上述，本揭示內容已指出棘白菌素類化合物用於治療黃病毒感染症的用途。

雖然上文實施方式中揭露了本發明的具體實施例，然其並非用以限定本發明，本發明所屬技術領域中具有通常知識者，在不悖離本發明之原理與精神的情形下，當可對其進行各種更動與修飾，因此本發明之保護範圍當以附隨申請專利範圍所界定者為準。

無

在參閱以下的詳細說明、申請專利範圍及附隨圖式後，本揭示內容及其他特徵、態樣及優點將更明顯易懂，其中：

第1圖為一分子嵌合(molecular docking)的模擬結果圖，說明米卡芬淨與第二型登革病毒(DENV-2)的套膜蛋白(envelope protein)之間的分子嵌合結果。

第2圖為一免疫螢光分析(immunofluorescence assay，IFA)的結果，說明(A)阿尼芬淨、卡泊芬淨，以及米卡芬淨對於DENV-2感染非洲綠猴腎細胞(Vero細胞)的抑制作用，與(B)阿尼芬淨、卡泊芬淨，以及米卡芬淨對於茲卡病毒(ZIKV)感染Vero細胞的抑制作用。

第3圖為一即時定量PCR(real-time quantitative polymerase chain reaction，RT-qPCR)的結果，說明米卡芬淨對於(A)第一型登革病毒(DENV-1)、(B)第三型登革病毒(DENV-3)，以及(C)第四型登革病毒(DENV-4)病毒感染Vero細胞的抑制作用。

第4圖為一細胞存活分析的結果，說明以特定濃度的阿尼芬淨、卡泊芬淨，以及米卡芬淨處理細胞，使細胞抵抗病毒感染所得到的存活率。

第5圖為一即時定量PCR的結果，說明在不同的感染時間點上，特定的棘白菌素類化合物對於不同病毒感染細胞的抑制作用。(A)在DENV-2感染細胞之前(pre)、同時(co)、之後(post)或全程(full；涵蓋前述三個時間點)，以50微體積莫耳濃度之米卡芬淨處理細胞。(B)在ZIKV感染細胞之前、同時、之後或全程，以10微體積莫耳濃度之阿尼芬淨處理細胞。

第6圖為一病毒結合(binding)分析的結果，說明特定的棘白菌素類化合物對於不同病毒結合至細胞表面的影響。(A)以DENV-2感染Vero細胞後，在特定濃度的米卡芬淨下，病毒結合至細胞表面的比率。(B)以ZIKV感染Vero細胞後，在特定濃度的阿尼芬淨下，病毒結合至細胞表面的比率。

第7圖為一病毒穿入(entry)分析的結果，說明特定的棘白菌素類化合物對於不同病毒穿入至細胞內的影響。(A)以DENV-2感染Vero細胞後，在特定濃度的米卡芬淨下，病毒穿入至細胞內的比率。(B)以ZIKV感染Vero細胞後，在特定濃度的阿尼芬淨下，病毒穿入至細胞內的比率。

第8圖為一病毒毒殺(virucidal)分析的結果，說明特定的棘白菌素類化合物對於不同病毒的毒殺效果。(A)以特定濃度的米卡芬淨處理DENV-2後，再感染Vero細胞，並測量細胞中帶有病毒的比率(細胞陽性率(％))。(B)以特定濃度的阿尼芬淨處理ZIKV後，再感染Vero細胞，並測量細胞中帶有病毒的比率(細胞陽性率(％))。

第9圖為一免疫螢光分析的結果，說明阿尼芬淨與RNA聚合酶抑制劑T-1105的合併治療對於ZIKV感染Vero細胞的抑制作用。

Claims

一種棘白菌素類化合物(Echinocandins)於製備一抗黃病毒感染症之組合物的用途，於所需個體投入有效劑量之該組合物以達到抗黃病毒感染之功效，其中，該組合物包含一RNA聚合酶抑制劑及一棘白菌素類化合物，該RNA聚合酶抑制劑包括T-1105，該棘白菌素類化合物包括阿尼芬淨(Anidulafungin)，該黃病毒包括茲卡病毒(Zika virus)。
如請求項1所述之用途，其中該個體為人類。
如請求項1或2所述之用途，其中該棘白菌素類化合物進一步包括卡泊芬淨(Caspofungin)、棘白菌素B(Echinocandin B)或米卡芬淨(Micafungin)。
如請求項1或2所述之用途，其中該RNA聚合酶抑制劑進一步包括貝拉布韋(Beclabuvir)、達塞布韋(Dasabuvir)、德勒布韋(Deleobuvir)、法匹拉韋(Favipiravir)、非利布韋(Filibuvir)、拉達布韋(Radalbuvir)、塞托布韋(Setrobuvir)、索非布韋(Sofosbuvir)或其二以上之組合。
如請求項1或2所述之用途，其中該黃病毒進一步包括登革病毒(Dengue virus)、C型肝炎病毒(Hepatitis C virus)、日本腦炎病毒(Japanese encephalitis virus)、庫京病毒(Kunjin virus)、蘭加特病毒(Langat virus)、墨累山谷腦炎病毒(Murray valley encephalitis virus)、玻瓦散病毒(Powasan virus)、聖．路易腦炎病毒(Saint Louis encephalitis virus)、蜱傳腦炎病毒(Tick-borne encephalitis virus)、西尼羅河病毒(West Nile virus)、或黃熱病毒(Yellow fever virus)。