RU2001917C1 - Способ лечени патологических состо ний, сопровождающихс нехваткой GT РНК - Google Patents

Abstract

Использование: в терапии Сущность изобретени  дл  печени  патологических состо ний, сопровождающихс  нехваткой дт РНК в организме человека ввод т пожноспаренную дт РНК в количестве 1 - 1000 мкг/1мм биологической жидкости. При этом ложноспаренна  дт РНК представл ет собой комплекс полиинозмната и толицитидилата содержащего от 1 на 5 до 1 на 30 урациловых или гуанидиновых оснований включает районы разрыва св зей и соответствует формуле г1 )хп П 11-14

Description

Изобретение относитс  к постановке диагноза состо ни  нехватки дтРНК и процедурам подачи экзогенной дтРНК в подход щей молекул рной конфигурации дл  восстановлени  ее нормального уровн .

Новые способы постановки диагноза и терапии вирусных болезней, хронических патогенных инфекций в общем и рака по вл ютс , когда раскрыты разнообразные роли , которые играет дтРНК в хоз йской защите. Например, развитие СПИДа (ретро- вирусна  инфекци , рак) св зано с постепенно ужесточающейс  дисфункцией биологических процессов, которые катализируютс  дтРНК, включа  не только биосинтез интерферона, но также продукцию биоактивного 2-5А, активность РНКазы и различные опосредованные клеткой иммунные функции. Специфическое снижение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые завис т от дтРНК, внутри специфических клеток вносит вклад в прогрессию болезни.

Состо ние нехватки в пут х, вовлекающих биоактивную дтРНК, также лежит в корне различных клеточных повреждений в хоз йских системах защиты, привод щих к смерти. Ранее был обнаружен ингибитор РНКазы в лимфоцитах инфицированных ВИЧ пациентов, больных ССК к СПИД, который  вл етс  только одним результатом из многих неадекватных внутриклеточных уровней дтРНК. Терапи  при помощи имеющей подход щую конфигурацию синтетической дтРНК устран ет один или несколько этих ингибиторов, что может частично объ снить клинический ответ, который наблюдаетс  при уменьшении концентрации вируса и восстановлении иммунной функции с разными хроническими виреми ми, которые в насто щее врем  продолжают в значительной степени противосто ть решительному медицинскому вмешательству. Предлагаемый способ может объ сн ть, определить и корректировать р д состо ний нехватки дтРНК при различных болезн х. Некоторые дтРНК, т.н. ложносп ренные дтРНК, могут фактически замещать дтРНК природного происхождени , что помагает поддерживать функции, необходимые дл  нормальных клеточных процессов. Отсутствие такоей регул ции дтРНК, пе будучи скорректирозанно подход щей экзогенной дтРНК, может вызвать развитие аномальных клеточных процессов. Аномальнее клеточные процессы затем привод т к хроническим инфекци м вирусор ипи других внутриклеточных патогенов, сниженным функци м иммунных клеток в конце

0

5

0

5

0

5

0

5

0

5

концов к хронической болезненности и к собственно смерти.

Клинические стратегии. Вирусные инфекции могут часто следовать за частичным нарушением иммунной системы такими разными агентами, как стресс и вирусы, которые атакуют непосредственно иммунную функцию. Например, СПИД следует за прогрессивным ухудшением в иммунной системе , вызванным инфекцией Т-лимфонитов вирусом иммунного дефицита человека - ВИЧ (Coffin ef al, Science vol. 232, p.697. 1986).

Существуют разные обозначени  вируса ВИЧ: LAV - обозначение вируса СПИД, выделенного в Пастеровском институте, Париж , Франци ; HTLVIII - обозначение виру; -а СПИД, выделенного в Национальном институте здоровь , Бетезда, Мэриленд, США. Зджесь ВИЧ использован в качестве общего названи  вируса. Часть в тексте будут ссылки на ВИЧ в общем виде или ВИЧ, или HTLVIII, или LAV без попыток дифференцировать их. Более того, термин ВИЧ включает все другие вирусы, которые могут быть св заны с образованием СПИД, изолированы они уже или нет.

Инфекци  ВИЧ - это прогрессирующа  болезнь, хот  темп перехода от одной фазы к другой варьирует. У асимптоматических индивидуумов, инфицированных ВИЧ, может развиватьс  состо ние (LAS или пре- ARC), характеризованное как лимфоаденопати . Пациенты прогрессируют к СПИД св занному комплексу или ССК, демонстриру  дефицит Т4 клеток и позднее сниженную способность лимфоцитов подвергатьс  антиген-стимулируемой пролиферации и продуцировать IFN-гамма. Эти пациенты тер ют иммунные функции, опосредованные различными клетками, напримерзадержанна кожна  гиперчувствительность, со бременем станов ща с  совершенно в лой. Они демонстрируют свидетельства поломки в защитном хоз йском механизме, включа  инфекции герпесного опо сывающего лиша , орального кандидоза и такие симптомы, как продолжите тьные лихорадки, ночные поты, поносы и потер  веса. В конечном счете эти пациенты испытывают определенные сильные условно-патогенные инфекции (например , пневмони , вызываема  Pneumoc - ystls - carlnll) и затем их определ ют как имеющих полностью развитый СПИД с приблизительно 50% смертностью в течение 12 мес цев. Инфекци  вирусом ВИЧ выбрана в качестве иллюстративного примера, потому что уровень нехватки дтРНК столь выражен. Многие другие болезни, включа  в лотекущие вирусные инфекции, ассоциированы с похожими нехватками.

Существенно, что типична  прогресси , выведенна  выше, не описывает существенных различий в клинической симптоматоло- гии между ВИЧ-инфицированными пациентами или многими другими пациентами с хроническими болезн ми, такими как инфекци  Эпштейн-Барр или ЭБ, инфекци  вирусом гепатита, цитомегаловирусом, гер- лесные инфекции и т.п, Компоненты иммунной системы распадаютс  с крайне различной скоростью у разных пациентов, потер  биоактивной дтРНК - это причина или фактор, вли ющий на данный процесс. Инфекци  ВИЧ может развиватьс  в различных типах клеток (например, в кров ных клетках, глиальных клетках). У некоторых пациентов в качестве первого симптома развиваетс  нейрологическа  дисфункци . Следовательно, различные индивидуумы могут иметь крайне различные терапевтические потребности, даже если все нуждаютс  в уничтожении ВИЧ в Т4 клетках.

У многих вирусных инфекций, включа  такие у пациентов с ССК, могут быть выделены две общие патологические черты: набор иммунных нехваток и дл ща с  вирусна  инфекци  (: aucl, Proc. Nat . Acad. Sci. USA, vol. 83, p.9278, 1986). Терапевтиче- ское вмешательство, вли ющее лишь на иммунные нехватки, но неудачное в борьбе с репликацией вируса, оказывает обратное действие, в особенности когда така  обработка активирует Т 4 клетки. Например, Т- хелперные клетки с рецепторами Тас способы к ответу на лимфокин IL-2. У жертв СПИДа IL-2 вызывает распространение ВИЧ-чувствительных клеток и очевидное ухудшение в болезни.

Воздействие непосредственно на вирусные инфекции, например инфекцию ВИЧ, бывает успешным, в особенности ингибитором вирусной обратной транскрипта- зы, обозначенным азотимидином (АЗТ), который может уменьшить нагрузку ВИЧ у некоторых пациентов и продлить жизнь. Така  терапи  не свободна от нежелательных результатов. У меньшинства пациентов АЗТ также вызывает временное восстанов- ление иммуности, опосредованной Т4 клетками , суд  по измерени м временного роста Т4 клеток и по по влению гиперчувствительности замедленного типа (Fischl et al. New Eng. J. Med., July, 1987). Однако инги- биторы обратной транскриптазы токсичны в дозах, необходимых дл  получени  значимого антивирусного эффекта, и поэтому плохо перенос тс  при длительном применении . Применение антивирусных агентов

может быть необходимо дл  жизни пзциен- та. IFN (интерферон) неэффективен и как антивирусное вещество общего действи , и как анти-СПИДовое лекарство, возможно, потому, что он не  вл етс  противо дием дл  дтРМК-св занных дефектов. Конечно, жертвы ССК/СПИДа имеют различные дефекты в пути IFN, такие как продуцирование дефективного, кислотолабильного IFN и неспособность Т4 клеток вырабатывать подход щие количества IFN-гамма, которые хорошо описаны в медицинской литературе. Эти различные IFN-св занные дефекты у пациентов с СПИД и ССК могут быт ь частично или всецело св заны с потерей активности РНКазы1 в лимфоцитах.

Хот  в лимфоцитах крови индивидуумов с ССК/СПИД и с другими хроническими ви- реми ми увеличено количество дтРНК-зави- симой 2-5А синтетазы, те же клетки крови демонстрируют уменьшение количества аутентичной 2-5А и низкое количество PHKasaL. Низкую активность РНКазы. сопоставл ют с небольшими количествами белка с М 80.000, способного св зывать фо- тоаффинно меченые аналоги 2-5А. Это согласуетс  с путем дтРНК, который был блокирован и относительно отсутствует, и/или с ингибитором РНКазы..

Вакцинаци  против ВИЧ и других вирусов и использование пассивных антител ан- ти-ВИЧ также обсуждаютс  дл  предотвращени  и обработки вируса, но могут иметь существенные ограничени : например , ВИЧ (как и вирус гриппа) легко может инфицировать клетки скрытно.

дтРНК играет роль в усилении выработки антител против вирусов вообще и ретро- вирусов в частности. Двут жевые РНК, дтРНК, составл ют первую группу молекул. которые эффективны против как вирусных, так и иммунных повреждений при различных подострых/хронических вирусных инфекци х , как ВИЧ и другие. Эти дефекты могут быть исправлены с лазерной точностью без неблагопри тного повреждени  основных функций тела, что  вл етс  общим ограничением доступных сейчас терапий хронических вирусных инфекций. Пациенты с неразрешившимис  и в лотекущими вирусными инфекци ми части имеют специфические дефекты в жизненных внутриклеточных дтРНК-зависимых пут х, которые могут быть обращены или хот  бы частично исправлены экзогенно поданной дтРНК (это объ сн етс  графически на фиг. 1), и мониторинг этих путей перед и в течение обработки дает новый способ измерени  степени терапии замещением дтРНК,

ребуемой дл  индивидуального пациента ,или специфической основы болезни,

Критические ферменты, св занные с хоз йской защитой, требуют дтРН К дл  про влени  биоактивности. Эти ферменты могут быть активированы экзогенной дтРНК, если уровень внутриклеточной природной дтРНК столь низок. Часть плейотропного воздействи  дтРНК происходит из ее способности индуцировать синтез всего спектра IFN-аль- фа, бета и гамма, котора  действует через группу внутриклеточных медиаторов, включа  дтРНК-зависимую протеинкиназу, дтРНК-зависимую 2-5А синтетазу и 2-5А зависимую РНКазу. Эти дтРНК-зависимые ферменты могут выполн ть многие биологические активности, относимые к IFN, как описано Lengyel (Ann. Rev. Blochem, , p.251, 1982). Например, образование анти- смысловой РНК, котора  блокирует экспрессию 2-5А синтетазы, вызывает абсолютную чувствительность животных клеток к инфекци м разными вирусами (Bendettl et al. Prac. Natl. Acad. Scl USa, vol.84, p.658, 1987). дтРНК-активируема  протеинкиназа фосфорилируете Р2, чтоин- гибирует белковый синтез, она также обладает протеолитической активностью дл  расщеплени  вирусных белков. дтРНК-акти- вируема  2-5А синтеза синтезирует 2-5А, который играет критическую роль как в подавлении различных вирусов животных,так и дл  контрол  роста клеток (уход от которого может привести к образованию опухоли). 2 -5 -олигоадениловые кислоты необычны в том, что нормальна  3, 5 фосфодиэфирна  св зь, характерна  дл  большинства дтРНК, замещена новой фосфодиэфирной св зью с приобретением новых биологических свойств.

Антивирусна  активность дтРНК. дтРНК - хорошо известный индуктор антивирусного состо ни  (Marcus et. a. Nature, vol.66, p.815, 1977). Поли/А/: поли/У/ генерирует антивирусное состо ние без индукции IFN. Но существует природна  регул ци  gnPHK и, следовательно, действительные состо ни  нехватки дтРНК распространены у людей с патогенными случа ми (вирусные, грибковые, прогозой- ные, бактериальные инвазии и т д., в особенностите , которые имеют внутриклеточные у человека присутствие в качестве желательного или об зательного компонента жизненного цикла).

Антипролиферативна  активность дтРНК. Ранее обнаружено (J.IFN. Rys., vol. 6, р.373, 1986), что 42% из более чем 100 свежих человеческих опухолевых образцов

при исследовании в полужидком агаре демонстрировали 50% или более уменьшение образовани  колоний опухолевых клеток после лишь одной обработки дтРНК. Эти

клетки имеют нехватки дтРНК. Известна независима  IFN-дтРНК-чувствительность у разных линий опухолевых клеток человека. Человеческие опухоли, размножаемые в безволосых мышах, были чувствительны к

дтРНК; терапи  дтРНК исцел ла от некоторых опухолей (например, почечной) и живо- тные жили нормальной жизнью (см. Европейское патентное описание 0,113.162). В данном способе описана коррел ци  между клиническими ответами и активацией дтРН «-зависимых ферментов в противоположность измеримой индукции FN или IL-2, вторичной по отношению к приучению дтРНК.

Усиливающа  иммунитет активность дтРНК, Известно (J. Immunol, v.124, p.1852, 1980), что дтРНК повышает цитолитическую активность природных киллеров человека () по отношению к клеткам лейкемии человека . Требовани  к структуре дтРНК дл  прироста К параллельны с таковыми, нужными дл  активации 2-5А и индукции IFN.

Контроль генов, опосредованный

дтРНК. Sullo etal (Cell. 43, р.798, 1985) продемонстрировали , что дтРН К индуцирует гё- ны компетентности в поко щихс  фиброобласт х, включа  онкогены, обозначенные foe и туе. Здесь гены компетентности - те гены клетки, действие которых требуетс  дл  модулировани  жизненных действий, как мультипликаци , рост и т.д. Индукци  гена IFN-бета дтРНК может использовать регул торный белок, который

удал етс  при обработке дтРНК (Zlnn etal, Cell, v.45, p.611, 1986). По биологической активности экзогенно поданные дтРНК подобны такой природной невирусной внутриклеточной дтРНК, как гетерогенна   дерна 

РНК или комплексы мРНК с поли/У/. Например . IFM - индуцибельна  дтРНК в  драх клеток Hela способна активировать 2-5А синтетазу in vitro. Возникновение клеточной иммунности в далеком прошлом эволюциот ого цикла животных, очевидно, определило этап эволюции молекул IFM/дтРНК в направлении обеспечени  клеточной дифференцировки, в частности дифференцировки, запускаемой IFM. Таким

образом, дтРНК может обеспечивать диф- ференцировку, запускаемую другими регу- л торными белками, которые определ ют этап определени  состо ний нехватки дтРНК.

На фиг. 1 показана схема, иллюстрирующа  два пути: к болезненности хоз ина и его выздоровлению; на фиг. 2,а - графическа  диаграмма: число дней до и после начала терапии IF в обозначенном количестве относительно активности синтетэзы; на фиг, 2, б - график, сравнивающий количество белых кров ных телец и количество ложнос- паренной дтРНК после 120 дней обработки; на фиг, 3 - фотографи  электрофореза в полиакриламидном геле (в пластине), демонстрирующа  различные зоны и полосы на прот жении каждой дорожки; на фиг. 4 - график, сравнивающий абсолютное количество Т4 лимфоцитов на кубический миллиметр крови, выраженный в процентном изменении от нулевой линии с мес цами терапии.

Двут жевые РНК (дтРНК) составл ют первую группу молекул, которые эффективны как против вирусных, так и против иммунных повреждений различными подострыми/хроническими вирусными инфекци ми , как ВИЧ и другие. Эти дефекты могут быть исправлены с лазерной точностью без нежелательного повреждени  остальных функций тела, что  вл етс  общим ограничением дл  доступных в насто щее врем  терапий хронических вирусных инфекций . Пациенты с неразрешенными и в лотекущими вирусными инфекци ми часто имеют специфические дефекты в жизненных дтРНК-зависимых пут х, которые могут быть исправлены или улучшены по крайней мере частично экзогенно поданной дтРНК (это объ сн етс  графически на фиг. .мониторинг этих путем до и в течение обработки обеспечивает новый эффективный способ оценки степени заместительной терапии дтРНК, требуемой индивидуальным пациентом или специфическим состо нием болезни.

Этот способ обеспечивает диагностическую процедуру дл  определени  состо ни  нехватки дтРНК у пациента, количественного определени  этой нехватки (при наличии) и обеспечение терапевтической процедуры дл  восполнени  любой определенной нехватки дтРНК. Применением экзогенной дтРНК возможно с лимфокином. Обычно состо ние нехватки дтРНК заметно внутри клетки - компонента иммунной системы, находитс  клетка-компонент в процессе мультипликации или дифференциации или нет. Нехватка дтРНК заметна, например, по неспособности клетки - компонента иммунной системы поддерживать существующий уровень биоактивной РНКазы. Мониторинг внутриклеточных дтРНК-зэвисимых путей до, в течение и после терапии делает возможным дл  пациента оценить степень заместительной терапии дтРНК, требующейс  дл  индивидуального состо ни . Остальные значени  определени  нехваток дтРНК да- 5 ны ниже. Медиаторы определ ютс  по способу действи  как любые внутриклеточные частицы, например специфические оли- гонуклеотиды, белки, дтРНК сами по себе или в комбинации, которые про вл ют спе- цифические биохимические функции, инициируемые присутствием дтРНК. Такие биохимические функции внос т вклад в усилие механизма хоз йской защиты на уровне как единственной клетки, так и всего орга5 низма.

Услови , подход щие дл  терапевтических процедур, в общем те, при которых нехватка дтРНК больше нормальных пределов по сравнению со здоровыми инидиви0 дуумами. нехватка дтРНК вызывает патологии тканей и/или в присутствии ненормально низкого уровн  дтРНК, сочетающегос  или сосуществующего с присутствием внутриклеточного патогена.

5 Более частные услови  или патологии тканей и конституциональные симптомы вклю- чают такие вирусные инфекции, как ретровирусные, включа  ВИЧ, семейство вирусов герпеса, парамиксовирусы,ринови0 РУС. гепатит и синдром хронический усталости . Прочие включают неконтролируемую пролиферацию раковых клеток и патологии иммунной системы, находитс  компонентна  клетка в процессе мультипликации или

5 дифференциации или нет.

Под ложноспаренной дтРНК понимаютс  те, у которых чодородные св зи (стэкинг оснований) между цеп ми относительно ин- тактны, т.е. прерываютс  в общем менее

0 чем один раз на каждые 29 последовательных остатков оснований. Ложное спаривание - это разрыв в нормальной геометрии двойной спирали РНК путем вт гивани  (или вып чивани ) цепей, который пред5 ставл ет собой точку подверженности дтРНК расщеплению рибонуклеазами.

дтРМК может быть комплексом поли- инозината или полицитидилата, содержащим часть урациловых оснований или

0 гуанидиновых оснований, например, от 1:5 до 1:30 (поли1-поли/С4-29х U или С).

дтРНК может иметь общую формулу rlnx xr(Ci2U)n. Другие примеры дтРНК приведены ниже.

5 В предпочтительной ложноспаренной дтРНК. г1п r(Cia U)n, район, состо щий из неразрывной последовательности 6-12 пар оснований, т.е. от половины до одного полного витка спирали РНК, служит и как биотриггер , вызывающий освобождение

лимфокинов, и как облигатный внутриклеточный кофактор дл  ферментов, представл ющих природные антивирусные пути. Ложноспаренные районы, состо щие из остатков урацила, периодически инсертирова- ны в полипиримидовую цепь дл  ускорени  гидролиза РНК и предотвращени  токсичности .

Ложноспаренна  дтРНК, предпочтительна  дл  использовани  в насто щем изобретении, основана на кополинуклеоти- дах, выбранных из поли(Сп. G), где п - фактор имеет значени  от 4 до 29, и  вл ющихс  аналогами (ложноспаренными) комплексов полирибоинозиновой и полирибоцитидило- вой кислот, образованными модификацией rln rCn дл  введени  неспаренных оснований (урацила или гуанидина) в полирибоци- тидилатную (гСп) цепь. Альтернативно дтРНК может быть получена из дтРНК поли/1/-поли/С/ модификацией рибозильно- го скелета полирибоинозиновой кислоты (rln), например включением 2 -0-метилрибо- зильных остатков. Эти ложноспаренные аналоги rln rCn, предпочтительные из которых имеют общую формулу rln КСп-ц, U)n и rln КС29, G)n, описаны Carter и Tso в патентах США № 4130641 и 4024222, дтРНК, описанные в них, удобны дл  использовани  в предлагаемом способе. В некоторых случа х комплементарные олигонуклеотид- ные дуплексы (спирали) также достаточны в качестве заместительной терапии.

Другие примеры ложноспаренной дтРНК дл  использовани  в способе включают

ПОЛИ/1 /.ПОЛИ/С4, U/

поли/1/.поли/Су, U/ поли/1/.ПОЛИ/С13, U/

ПОЛИ/1/.ПОЛИ/С22, U/

поли/1/.поли/С20, G/

поли/1/.поли/Саэ, G/

поли/1/.поли/Ср/23 G р

Синерги  дтРНК-лимфокин. Поскольку дтРНК оказывает существенную часть своего биологического действи  через специфическую систему лимфокинов, опосредованную частично IFM, она должна (а) индуцировать IFM в IFM-дефицитных клетках, (б) активировать уместные дтРНК- зависимые ферменты-посредники, причем клеточна  дтРНК неиндуцибельна в клетках и не отвечает на экзогенно примененный IFN.

Если дтРНК действует только через систему IFN и дтРНК находитс  в клетках в избытке, тогда избыток одного IFN оказывает такое же биологическое действие, как и комбинаци  IFM и дтРНК. Однако это должно быть относительно редким состо нием,

поскольку имеетс  много примеров дтРНК- IFN-синергии и мало примеров отсутстви  синергии. Например, дтРНК синергична с человеческими IFN-альфа, -бета или -гамма

в ингибировании роста клеток из челове- ской карциномы пузыр , карциномы легких и фибросаркомы. Можно расширить эти результаты на 15 других лини х опухолевых клеток человека, причем только одна из них

0 не показана антипролиферативной синергии , Сходный синергизм был заметен на некоторых опухол х человека, привитых на безволосых мышах; клинически наблюдают, что комбинаци  IFN и дтРНК была лучше,

5 чем каждый из агентов в отдельности, в качестве противоракового режима по отношению как к опухол м почки, так и к CML

Состо ние нехватки дтРНК, Как протей типный путь, путь 2-5А синтетазы (РНКа0 зы1) включает одну или более дтРНК, 2-5А, сь занные ферменты и ингибиторы. Существует пр ма  биохимическа  св зь между дтРНК и РНКазой1 в том, что 2-5А, продукт дтРНК-зависимой 2-5А синтетазы  вл етс 

5 необходимым кофактором дл  активности РНКазы1. Примеры предназначены служить примером нескольких из многих возможных видов дефектов в дтРНК-опосредованиых пут х, которые могут быть исправлены экзо0 генно поданной дтРНК.

Схема на фиг. 1 иллюстрирует св зи между достатком дтРНК, привод щим к выздоровлению хоз ина, и нехваткой дтРНК, привод щей к болезненности хоз ина. Био5 активна  дтРН К вырабатываетс  внутрикле- точно или вводитс  при некоторых событи х, которые привод т к антивирусному состо нию так же, как и к дифференци- ровке иммунных клеток и выздоровлению

0 хоз ина.

Измерение 2-5а синтетазы In vitro имеет ограниченную ценность, поскольку не отражает активности 2-5А синтетазы In vivo. Отсюда разработан способ экстракции и ко5 личественного определени  2-5А из одно дерных клеток периферической крови (ОКПК) здоровых индивидуумов и инфицированных патогеном пациентов до и после терапии ложноспаренной дтРНК. Концент0 раци  может быть определена по способности 2-5А активировать аффинно очищенную PHKasyL и деградации по- ли/и//32Р/рСр. Методы.

5 Гепаринизированную и перифер -ie- скую кровь получали от дес ти здоровых индивидуумов и от п ти пациентов-мужских гомосексуалистов с LAS, CCK и СПИД, как определено Центрами по борьбе с болезн ми . С клинической точки зрени  проводили

еирологмческие и иммунологические характеристики пациентов, вовлеченных н это ис- опедование (пациенты 1-5) были охарактеризованы ранее как пациенты 10, 8, 1, 7 и 2 соответственно со статьей Lancet, June б, 1987 ОКПК изолировали на Flcoll - Hypagye. Клетки L929 и HL929 (РНКазэЬде- фицитный субклон L929) поддерживали в монослоной культуре. Цитоплазматические экстракты из клеток L929 и HL929 получали в грицериновом буфете, экстракты из ОКПК получали в МР40-лизисном буфете. Концентраци  белка в экстрактах составл ла 10-15 мгк/мкл. СК, саркома Капощи; ППК, пневмони 

Pneumocysilc carnll

Активность 2-5А синтетазы (колонка 3) определчли в экстрактах ОКПК (50 мкг белка/анализа ), использу  поли/G/ поли/С/- а г   п о з у2 5 А выдел ли из

эт нолраствооимой фракци экстрактов ОКПК (100 и-ч Селка, 70% этанол, об/об), экстрагированную этанолом затем лиофи- лизировали и раствор ли в воде (20 мкп). Концентрации внутриклеточной 2-5А присутствующей в экстрактах ОКПК (колонка 4), определ ли в анализах в кор-целлюлозой с экстрактами клеток L929 в качестве источника РНКазы1 по калибровочным кривым, полученным с истинной 2-5А Активаци  РНКазы1 2-5А в этом анализе основана на превращении поли/11//32Р/рСр в кислото- растворимые фрагменты. В контрольных опытах (в отсутствие 2-5А) на фильтрах из стекловолокна задерживалось 6500 расп./мин из общего добавленного количества 17700 расп./мин поли/U//32 Р/рСр (1,3 мкКи/нмоль). В присутствии Ј 1 х М истинной 2-5А поли/U//32 Р/рСр деградировал на 0%; в присутствии 1 х 10 М истинной 2-5А поли/U//32 Р/рСр деградировал на 100%. Уровни латентной РНКазы. определ ли двум  способами: (1) в анализах со св зыванием радиоактивности после добавлени  20000 расп/мин рзА4/32/Р/рСр к экстрактам ОКПК/50 мкг белка/анализ/и (2) в анализах с расщеплением рибосомной РНК в присутствии 2-5А (колонка 6) Экстракты , полученные из клеток L929 (150 мкг белка/анализ), инкубировали 60 мин при 30°С в присутствии 5 мкл этанолраствори- мой фракции экстрактов ОКПК и 1 х 10 М рзАз в конечном объеме 20 мкл. Тотальную РНК экстрагировали, денатурировали и анализировали электрофорезом в 1,8% агароз- ном геле. Окрашенные бромистым этидием полосы визуализировали в УФ-свете. Активированные уровни РНКазы1(колонка 6) определ ли в анализах в расщеплением

рибосомальной РНК в отсутствие добавленной 2-5А.

Концентраци  функциональной 2-5А с экстрактах ОКПК варьировала от 0.3 до 1,1

5 нмоль/г белка у здоровых индивидуумов и от уровней, меньше определ емых до 0,6 нмоль/г белка в экстрактах ОКПК из инфицированных вирусом пациентов до обработки ложноспаренной дтРНК (табл. 10,

колонка 4), Однако 2-5А накапливаетс  до более чем 10 н/моль/г белка по мере терапии ложноспаренной дтРНК, Ранее отмечалось , что 2-5А активизированна  частично очищенна  PHKasaL предпочтительно рас5 щепл ет поли/U/, но не поли/С/. Выделенна  человеческа  2-5А (как и истинна  2-5А) могла активировать аффинно очищенную PHKasyL из либо клеток L929, либо ОКПК от здоровых людей к специфической деграда0 Чии поли/U/, см. табл. 4. Важно отметить, что когда дл  экстракции 2-5А из ОКПК используетс  ТХУ в дополнение в поли/и/-де- градирующей активности (РНКазы1) экстрагируетс  поли/С/-деградирующа 

5 активность. Эта поли/С/-деградирующа  ТХУ-экстрагируема  активность может быть устранена протеазным расщеплением или дальнейшей экстракцией этанолом. По- ли/С/-деградирующа  активность была об0 наружена в ТХУ-растворимой фракции ОКПК от всех людей, но ни в одной из посто нных линий клеток (т.е. Hela L929, HL929), проверенных на это. Поли/С/-деградирую- ща  активность не была заметна ни в одной

5 из этанолрастворимых фракций ОКПК.

М01 обозначает множественность инфекции . Это означает приблизительное количество вирусных частиц, приход щихс  на каждую клетку-мишень.

БОЕ обозначает бл шкообраэующие

единицы. Это означает количество вирусных частиц, определенное подсчетом цито- пэтических (мертвых) клеток.

Хот  осуществл ли сообщени  о присутствии 2-5А в ткан х, выделенных из необработанных животных, и о накапливании 2-5А в ткан х мышей, обработанных дтРНК, здесь сообщаетс  о накапливании 2-5А в ткани человека. Точно установлено, что ис0 тинна  2-5А св зываетс  РНКазой1 и активирует ее к деградации рРНК до высокохарактерных продуктов специфического расщеплени  (СПСР). Поэтому активность 2-5А, выделенной из экстрактов ОКПК характеризуетс  в анализе с расщеплением рРНК. Специфический поттерн расщеплени , создаваемый РНКазой. с экстрагированной этанолом 2-5А, тот же, что и полученный в присутствии истинной 2-5А. Эти результаты показывают, что(внутривен5

нов) применение ложноспаренной дтРНК к инфицированным вирусом пациентам вызывало резкое повышение 2-5А в кров ных клетках от концентраций, которые были ниже определ емых.

Активность РНКазы1.

Отсутствие активности РНКазы у индивидуумов , инфицированных ВИЧ, было подтверждено и данные расширены {табл. 10 колонки 5-7). Чувствительный метод, основанный на специфичности активированной 2-5А РНКазы. к расщеплению рРНК (Wrescher et at, Nucleic Acids Res, v.9, nn.1571-1581. 1981), позвол ли измер ть активированную PHKasyL в экстрактах из ОКПК. выделенных из всего лишь 1 мл периферийной крови. Экстракты РНКэзы. дефицитного субклона линии клеток L929(HL929) были использованы в качестве источника рибосом. Экстракты ОКПК инфицированных ВИЧ пациентов имели в 5-7 раз более низкие уровни латентной РНКазы1, чем экстракты здоровых индивидуумов, как определено в анализах со св зыванием радиоактивности (табл. 1, колонка 5, 240-280 против 1350 расп/мин). Сходные наблюдени  описаны Wu и др. (AIDS Reserarch, v. 2, p.127-131, 1986). Применение анализа со св занной радиоактивностью ограничено в отношении определени  уровн  латентной РНКазы - у пациентов, обработанных ложноспаренной дтРНК, поскольку в образцах ОКПК от этих пациентов присутствует накопленна  2-5А (табл. 1, колонка 4), котора  может конкурировать за св зывание с РНКазой1, Поэтому определение уровн  активированной 2-5А РНКазы1 необходимо.

Сначала уровни активированной РНКа- зы1 определ ли, измер   специфическое расщепление рРНК экстрактом из ОКПК в отсутствии экзогенно добавленной 2-5А (табл.1, колонка 7). Использу  этот анализ, PHKaaaL не была активирована в экстрактах ОКПК пациентов, инфицированных ВИЧ, до терапии (полиакриламидные гели, показанные на фиг. 3). Зна , что уровни внутоикле- точной 2-5А в этих образцах ОКПК были низкими (табл, 2), эти результаты не были неожиданными. Однако экстракты мх ОКПК от всех проверенных здоровых индивидуумов демонстрировали присутствие активированной РНКазы1, котора  образовывала продукты специфического расщеплени  в анализах с расщеплением рРНК, хотч количество 2-5А у некоторых здоровых индивидуумов было столь низко, как 0,3 нмоль/г белка (табл. 2), Существенно, что отсутствие активности РНКазы1 в образцах от ВИЧ-инфицированных пациентов до терапии не могло быть благодар  накоплению конкурентного ингибитора 2-5А, как сообщалось в Caylet et al, European J. Bloch., v.143, p.165-177, 1984, активность РНКазы1 не могла быть восстановлена добавлением истинной 2-5А (табл. 1, колонка 6).

Затем определ ли уровни латентной РНКазы в двух независимых измерени х. Латентную активность РНКазы1 определ ли в анализах специфическим расщеплением рРНК, но в присутствии добавленной 2-5А (табл, 2). В образцах, вз тых до терапии ложноспаренной дтРНК, ни у одного из п ти обследованных пациентов не была обнаружена латентна  PHKaaaL

5 Способ фотозффинного мечени  с (32Р)рСр был использован дл  дальнейшего определени  отсутстви  PHKasaL в ОКПК ВИЧ-инфицированных пациентов (илп она изменена). Предыдущие исследова0 иич с фотоаффинным мечением идентифицировали белок с Mr 80.000 с PaA PJpCp св зывающей активностью и специфической поли/У/эндорибонуклеолитической активностью как РНКазу1. Аффинное мече5 ни& РНКэзыЬ, присутствующей в экстрактах ОКПК, определ ли, использу  PaA PjpCP. PHKasyL из экстрактов ОКПК (50мкг белка) от нормальных индивидуумом в сравнении с ССК-пациентом (пациентом до терапии

0 ложноспаренной дтРНК) или экстрактом клеток L929 (50 мкг белка) фотоэффинно метили после добавлени  РзА4( Р)рСр (30000 расп./мин, 3000 Ки/ммоль) в отсутствии или в присутствии истинной РЗА4 (1 х М).

5 PHKasyL из экстрактов ОКПКот нормальных индивидуумов (100 мкг белка) очищали от 2-5А кор-целлгалозе и фотометиле после добавлени  РзА4(32Р)рСР (ЗООООрасп./мин, 3000 Ku/ммоль). После 90 мин инкубации

0 при 0°С образцы переносили на охлажденные во льду фарфоровые капельные пластины и фотомуировали 3 мин, использу  254 нм UVC-11 Mlnerallght лампу (Vltravlolet Products) на рассто нии 2 см(1 J/м . Опре5 делили положение маркерных белков и РНКазы1сМг80000.

Исследовани  с фотомечением вы вили , что РзА( Р)рСр ковалентно пришиваетс  к белку с Mr 80000 в экстрактах ОКПК от

0 здоровых людей (данные полиакриламидно- го гел  не приведены). Однако мечение белков отсутствовало в экстрактах ОКПК от хронически инфицированного вирусом пациента . При тех же экспериментальных ус5 лови х в экстрактах клеток L929 специфически фотометилс  белок с Mr 80000. Добавление РзА4 (1 х М) к инку- бационным смес м, содержащим РзА(32Р)рСр предотвращало фотомечение, т.е. обеспечивало дополнительное сеидетельство , что фотомечение было высокоспецифично к PHKa3eL Исследовани  с фото- мечением белка, очищенного из экстактов ОКПК от здорового человека корцеллюлоз- ным методом, вы вило ковалентное св зывание с белком с Mr 80000, который был способен деградировать поли/У/, но не поли/А/ , поли/Ц/ и поли/Г/ в присутствии истинной 2-5А (табл, 4). Сведенные вместе эти результаты доказывают, что белок очищен от ОКПК здоровых индивидуумов и мечен РзА4(32Р)рСр.

После 4-17 недель терапии ложноспа- ренной дтРНК активированна  PHKasaL впервые определ лась в экстрактах ОКПК от всех п ти хронически инфицированных пациентов; от 17 до 28 недель терапии ложнос- пареннойдтРНКактивность

активированной РНКазы1 дл  всех п ти пациентов была эквивалентна уровн м РНКа- зы1, наблюдавшимс  у здоровых индивидуумов (табл. 1, колонка 7). Уровень активированной РНКазы1 показывал очень тесную коррел цию с концентрацией функциональной 2-5А, выделенной из тех же образцов (табл. 1. в сравнении с колонками 4 и 7). Крайне интересно, что пациент 1 поддерживал повышенный внутриклеточный уровень 2-5А и полностью активированную PHKaayL на 28 недел х 3 недел ми позднее того, как терапи  ложноспарениой . дтРНК была прервана (табл. 1, колонки 4 и 7).

Описанные здесь эксперименты показывают , что п ть ВИЧ-инфицированных пациентов имеют общий молекул рный фенотип в одно дерных кров ных клетках, сниженный уровень 2-5А и отсутствие определ емой активности РНКазы1. Одно дерные кров ные клетки здоровых людей про вл ли фенотип, отличный в том. что уровни 2-5 были в среднем выше и активность РНКазы1 была легко определ ема. Последний фенотип больше сочетаетс  с тем, что ожидаетс  от функционального пути 2-5А синтетазы (РНКэзы1). У нормальных индивидуумов неизменное состо ние пула 2-5А - измеримое; заметна  часть этой внутриклеточной 2-5А может стать тесно ассоциированной с РНКазой1, т.е. активиру  PHKasyL В экспериментальных процедурах установлено, что в одно дерных кров ных клетках хронически инфицированных вирусом людей внутриклеточные уровни 2-5А ниже детектируемых и отсутствует активируема  PHKasaL, как определено доступными в насто щее врем  способами.

Важное открытие здесь то, что дефекты в пути 2-5А синтетаза/РНКэза1. были исправлены терапией ложноспаренной дтРНК.

Результаты не объ сн ютс  просто нормальными уровн ми белка РНКазы1 без 2- 5А, поскольку активность РНКазыЬ In vltrc не была восстановлена добавлением 2-5А к 5 экстрактам ОКПК. Белок РНКазы1 должен отсутствовать или быль ингибированным. Это подтверждаетс  потерей св зывани  фотоаффино меченного аналога 2-5А. У обработанных пациентов уровни РНК ВИЧ

0 уменьшались в ОКПК за 10-20 дней, количество инфекционных центров (кокультива- ци ) падало более медленно, Увеличение внутриклеточной 2-5А и активности РНКА- зыЬ более близко соответствует уменьше5 нию инфекционных центров у этих пациентов, Путь 2-5А синтезы (РНКззы1) становилс  у обработанных ВИЧ-инфицированных пациентов более активным, чем у здоровых людей, после нескольких недель

0 терапии ложноспаренной дтРНК, таким образом , некоторые хронические вирусные инфекции представл ют собой состо ние нехватки дтРНК, которое может быть исправлено подачей экзогенного источника

5 биоактивной дтРНК,

Пример 1. Координированна  обработка IFN идтРНК.

Состо ние нехватки дтРНК таково, что в нем обработанные IFN опухолевые клетки

0 демонстрируют небольшое IFN-индуциро- ванное прекращение роста или отсутствие такового. Это функциональный или операциональный тест на нехватку дтРНК, который может быть строго подтвержден, если

5 необходимо, различными биохимическими измерени ми, описанными ниже. Во многих случа х клинический диагноз нехватки дтРН К станет достаточным по мере того, как способ станет более широко практикуемым.

0 Известно, что IFN-устойчивые опухолевые клетки редко дефицитны по рецепторам IFN и могут содержать высокие или низкие уровни медиоторов, но в каждом случае они отвечают на экзогенно поданную дтРНК, Эти

5 примеры клинически значимы, поскольку они показывают, что дтРНК существенно расшир ет терапевтическое значение IFN и также других лимфокинов, например 1L-2, различные факторы стимулировани  коло0 ний и ФНО, Хроническа  миелогенна  лейкеми  (ХМЛ) - подход щий случай. Около 60% пациентов с ХМЛ отвечают на один интерферон, в то врем  как 40% - нет. Последние не могут индуцировать 2-5А синте5 тазу в одно дерных кров ных клетках (ОКК), как описано Rosenblum b/Cancer Res., v.460 p.4848. 1986). На фиг. 2,а представлен IFN- резистентный случай, который обработан ложноспаренной дтРНК плюс IFN после короткого курса (7 дней) одного IFN, затем

ложноспаренна  дтРНК в комбинации с IFN, Этот пациент не мог индуцировать активность 2-5А синтетазы, получа  один IFN, но показал существенный рост активности этого медиатора при комбинации IFN и лож- носпаренной дтРНК. Индукци  2-5А синтетазы сопровождалась полной гематологической ремиссией, котора  продолжалась несколько мес цев после мимолетного увеличени  клеток крови, вызванного прерыванием предшествовавшей химотерапии. Измер ли также активность РНКазы1. и обнаружили, что она была в 10-100 раз выше нормальной (фиг. 3, дорожка 1), дава  продукты расщеплени  In vitro, которые представл ют собой дальнейшую деградацию обычных продуктов расщеплени  РНКазы1. Активность РНКэзы1 вернулась к нормальным значени м и профил  расщеплени  после 30 дней терапии комбинацией 1РМ/дтРНК(фиг. 3, дорожка 2). Этот вид ответа наблюдаетс  регул рно.

Пример 2. Вирусна  инфекци  Т4 клеток.

Другое состо ние нехватки дтРНК та- кое, при котором сам животный вирус (или его реплакативный интермедиатор) обеспечивает ингибирование активации медиаторов дтРНК или частично биоактивный дтРНК, хот  IFN и его медиаторы индуциро- ваны вирусными инфекци ми. В эту категорию попадают многие вирусы, ассоциированные с хронической симптоматологией у хоз ина. Инфекци  Т4 клетки ВИЧ также может представл ть такую ситу- ацию, как предложено на фиг. 1. Репликаци  ВИЧ в Т4 клетках эффективно блокируетс  ложноспаренной дтРНК в культуре ткани {Европейский патент 0.213.921) несмотр  на тот факт, что репликаци  ВИЧ в этих же клетках только умеренно подавл етс  UFN- альфа, -бета, или -гамма отдельно или в физиологических смес х. Поскольку сама РНК ВИЧ демонстрирует существенную вторичную структуру, котора  не блокирует ее соб- ственную экспрессию, разные дтРНК, возможно, вызывает разные биологические ответы. Один район развитой стр кгуры дтРНК на 5 -конце мРНК ВИЧ св зывает полипептид с М 150000, предположительно транслирующий ВИЧ белок tat (Muesing et al, Cell, v.48, p,691, 1987). Ложноспаренна  дтРНК может конкурировать с РНК ВИЧ за белок tat. Свойство поддерживать эффективную инфекцию ВИЧ, так же как и другие хронические виремии, может быть другим состо нием нехватки дтРНК при СПИД и

сек.

Пример 3. Клетки, инфицированные ВИЧ.

Третий тип состо ни  нехватки дтРНК наблюдалс  в лимфоцитах крови индивидуумов с хроническими вирусными инфекци ми , такими как ВИЧ при СПИД и ССК. РгеЫе atet(J. Infect. DIs, v.152,1985)сообщали, что эти клетки демонстрируют повышенный уровень дтРНК-зависимой 2-5А синтетазы. Этот результат был типичен дл  серии последовательных ССК и СПИД-пациентов, которые были изучены. Основа изобретени  - центральна  роль дтРНК в хоз йском выздоровлении и необходимость замещени  состо ний нехватки дтРНК подход щим источником экзогенной дтРНК.

PHKasbiL часто истощена у пациентов с СПИД и ССК (June 6, 1987, The Lancet), однако PHKaaaL может восстановитьс  до более нормальной активности после нескольких недель терапии ложноспаренной дтРНКв некоторых случа х. Как предполагает фиг. 3, колонка 4, экстракты ССК-лимфоцитов могут ингибировать активность нормальной РНКазы лри некоторых услови х. Поскольку экстракты ТХУ и эталоны не имеют ингибиторой активности, ингибитор , наблюдаемый в ОЯК ССК-пациентов и допускающий передачу, может быть описан Williams et al в герпес-индуцированных клетках (Virolgy, V. 151, р.233, 1986). Также не обнаружены ингибиторы в экстрактах ОЯК от здоровых индивидуумов (дорожка 5), изученных на сегодн .

Поскольку ложноспаренна  дтРНК пр мо воздействует на эти клетки, они должны быть также дтРНК-дефицитными. Следовательно , разные дтРНК имеют различные биоактивности (дтРНК ВИЧ  вл ютс  ингибитором , в то врем  как дтРНК- нет). Похоже , что лимфоциты пациентов с ССК и СПИД дтРНК дефицитны в том смысле, что выполн ютс  только некоторые из необходимых дтРНК зависимых функций. По крайней мере одна функци  - поддержка существенного уровн  биоактивной РНКазыС не выполн етс , если не добавлена экзогенна  дтРНК.

Пример 4. Синдром хронической усталости.

Пример нехватки дтРНК, требующей подход щей заместительной терапии, - синдром хронической усталости (СХУ). Это состо ние, охватывающее 10-12 миллионов американцев, трудно в диагностике: всеобщее расстройство, характеризуемое экстре- мальной утомленностью, увеличением лимфатических железок и такими констици- ональными симптомами, как потер  веса, потер  аппетита и т.д. Состо ние возникает преимущественно у молодых, активных людей . Поскольку некоторые пациенты с СХУ

демонстрировали нейропсихиатрические изменений, такие как депресси , потер  пам ти и сходные расстройства, синдром хронической усталости иногда трудно отличим от полностью нейрологмческих расстройств , в частности депрессии. Различные лабораторные исследовани  показывают, что у индивидуумов имеющих синдром хронической усталости, могут реплицироватьс  многие вирусы, и что такие люди станов тс  в реультате вирусными помойками. У таких индивидуумах часто присутствует вирус, ретровирусы, вирусы герпеса и т.п.

Концентрацию молекул 2 -5 А In vivo, биохимически св занное, аккуратное измерение внутриклеточных уровней дтРНК у субъектов с синдромом хронической устало- сти.проводили следующим образом: этэнол- растворимые фракции образцов от пациентоо (очищенных нз Ficoll - Hypague лимфоцитах периферической крови) анализировали на содержание в них 2 -5 А в анализах с 2 -5 А кор-целлюлозой (аффинна  хроматографи ) с поли U-{32p}-pCp. В этом анализе способность 2 -5 А-актвированной РНКазы1. гидролизовать поли/У/ использовали дл  определени  концентрации функциональной .

Относительно уровни были определены тестированием 15-нормальных субъектов, не перенос щих вирусные инфекции, суд  по отсутствию жара, отсутствию конституциональных симптомов, сыпи и т.д. Уровни концентрации 2 -5 А в их лимфоцитах определ ли , использу  калибровочные кривые, полученные с истинной 2-5А. Относительные уровни нормальных индивидуумов, вы- раженные в виде нзномолей 2-5А, варьирует от 0,3 до 1,1 нмоль/г клеток ОКПК.

С использованием этого метода анализа было проверено дес ть пациентов, про вл ющих обычные симптомы синдрома хронической усталости, и были получены следующие результаты:

Пациенты с синдромом хронической усталости имеют в общем менее 0,1 и менее примерно 0,2 нмоль 2 -5 А/грамм белка лимфоцитов. Решительна  обработка таких индивидуумов с синдромом хронической усталости обеспечена подачей экзогенных дтРНК до тех пор, пока внутриклеточный уровень 2 -5 А олигонуклеотидов не достигнет нормы, показыва  возвращение внутриклеточного уровн  дтРНК к норме и/или до устранени  клинической симптомологии пациента . Устойчивость пациента к синдрому хронической усталости и сопутствующим вирусам поддерживаетс  продолжением

измерений уровн  внутриклеточных 2 -5 А олигонуклеотидов пациента и подачей экзогенной дтРНК по мере потребности дл  поддержани  уровн  в нормальном 5 диапазоне, обычно более чем 0,2 нмоль 2- БА на грамм белка лимфоцитов.

Природна  дтРНК играет роль в хоз йской защите при борьбе с такой вирусной болезнью, как синдром хронической устало0 сти. Специфическое уменьшение количества биоактивной дтРНК или ферментов, которые завис т от дтРНК, в особенности вирус-ассициированный ингибитор РНКа- эы, сочетающийс  с ненормально низкими

5 уровн ми 2 -5 А в лимфоцитах периферической крови, внутри специфических клеток, вносит вклад в развитие болезни. дтРНК, в особенности ложноспаренна  дтРНК. обращает развитие болезни.

0 Пациенты, имеющие синдром хронической усталости, обработаны внутривенными введением от 200 до 600 мг в зависимости от т жести болезни и вирусной нагрузки (ri r/Cn-14, U) дважды неделю. Повыше5 ние уровн  2 -5 А ассоциировано с клиническим улучшением. При определении количества примен емой дтРНК и частоты применени  руководствуютс  измеренными уровн ми 2 -5 А в сочетании с клиниче0 скими улучшением пациента. Количество примененной дтРНК обеспечивают уровень от 0,01 до 1 микрограмма дтРНК на миллилитр системной циркул ции крови пациента сразу после применени  при измерении в

5 точке, удаленной от места введени .

Пример 5. Антивирусный эффект на попул ци х Т4 клеток.

Экзогенно примененна  дтРНК, в частности ложноспаренна  дтРНК, восстанав0 ливает способность пациента отвечать иа вирусную угрозу. В качестве вирусного состо ни  был выбран ВИЧ как один из наиболее опасных. Первична  мишень инфекции ВИЧ-Т4 лимфоциты и их попул 5 ци  резко уменьшаетс  с прогрессией вирусной инфекции. Далее уменьшение попул ции Т4 клеток - нежелательный, количественно оцениваемый параметр болезни , чье уменьшение отражает ухудшение в

0 болезни. Увеличение же попул ции Т4 клетки - предпочтительное диагностическое свидетельство, показывающее улучшение при терапевтическом вмешательстве.

Нормальна  попул ци  Т4 клеток у здо5 рового индивидуума - 400 клеток на кубический миллиметр крови. Были проведены измерени  у 31 пациентов (см. фиг. 4), диагностированных как наход щихс  в преССК или ССК состо ние, они были разделены на

три категории по абсолютному числу Т4

клетки на мм крови: а) более чем 300 (18 пациентов, данные не приведены), б) 150- 300 (13 пациентов) и в) менее 1500 (8 пациентов , среднее - 92). Пациенты из группы б) и в) были обработаны 100-200 мг rln- (Ci2 U)/AmpilgenR дважды в неделю путем внутривенного введени  в течение 3-16 мес цев (в среднем 8,4 мес ца). В цел х сравнени  данные о попул ци х Т4 клеток необработанных ВИЧ инфицированных пациентов (18Т) включены (соединенные треугольники) дл  того, чтобы показать неизбежное в противном случае снижени  попул ции Т4 у таких индивидуумов.

Нулева  лини  - это начальна  абсо- лютна  концентраци  Т4 лимфоцитов до начала терапии. Улучшение выражено в виде процентного изменени  (позитивного или негативного) от этой нулевой пинии и показано на фиг. 4. Пациенты были первонэчаль- но обследованы и измерена концентраци  Т4 клеток. Группа пациентов б), показанна  на фиг. 4 линией, соедин ющей светлые кружки, имела концентрацию клеток Т4 в пределах 1SO-300 к ./мм . Эти пациенты получали сначала 100 мг Ampllgen (внутривенно дважды в неделю)в виде безопасного количества и их обследовали на неблагопри тные реакции, затем была увеличена доза до 200 мг, примен ема  с той же частотой, втора  группа пациентов б), чь  концентраци  Т4 клеток была менее 150 кл/мм . получала 300 мг Ampllgen (внутривенно дважды в неделю). Процентные изменени  от нулевой линии показана в виде линии, соедин ющей темные кружки. У необработанных пациентов (181) абсолютна  концентраци  Т4 лимфоцитов продолжала резко уменьшатьс , как показано линией, соедин ющей треугольники.

Среднее количество Т4 клеток увеличивалось на 3/4% после 4 мес цев у 30 пациентов , на 8% после 8 мес цев у 10 пациентов и на 17% после 12 мес цев у 8 пациентов. Только 2 пациента (среднее ко- личество Т4 клеток - 82 клетки) продвинулись к СПИД, получа  дл щуюс  терапию fin {Си, U)n, и еще у пациента с ССК, который прервал терапию на 2 мес ца, развилась саркома Калоши.

Эти данные демонстрируют, что инфицированные индивиды, чьи абсолютные уровни Т4 лимфоцитов ниже чем 150 кл/мм, требуют существенные количества лекарства дл  замедлени  темпа убывани  Т4 кле- ток, однако пациенты в интервале 150-300 Эффективно поддерживаютс  при меньших дозах. Эти данные также подчеркивают важность начала терапии до крутого спада

R состо нии пациента ВИЧ. Эти данные демонстрируют также пр мую св зь между степенью нехватки дтРНК, определенной косвенно, но точно по абсолютной попул ции Т4 клеток, и количество экзогенной дтРНК, требующейс  дл  коррекции нехватки и восстановлени  полного здоровь  (в виде восстановлени  попул ции Т4 клеток до уровн , приближающегос  у уровню менее т жело инфицированных и неинфициро- ванных индивидуумов), Чем больше нехватка Т4, тем большее количество дтРНК требуетс  дл  восстановлени  нехватки.

Пример 6. Заместительна  терапи  дтРНК при пзрамиксовирусной инфекции, другой пример преход щей нехватки дтРНК, требующей подход щей замести- тепьнбй терапии, - различные фазы жизни новорожденного и развити  ребенка, у которого иммунна  система тела не полностью развита. В этих случа х могут чозникать потенциально опасные дл  жиз- ш инфекции, из которых могут возникнуть самолитирующие инфекции в юности и взрослом состо нии. Следует частный пример: члены семейства парамиксовируса, такие как респироторный синцитиальный вирус (PC В), могут вызывать острый бронхи- олиту детей (обычно б-18 мес це в) с еще не полностью развитой иммунной антивирусной системой защиты. В таких случа х заместительна  терапи  дтРНК rtn r(Ci2, U)n может быть круциальной и прерывать то, что в противном случае может привести к летальному событию,

Дл  развити  этого нового понимани  выращена лини  клеток человека, полученных из амниона, обозначенна  СС25 при стандартных лабораторных услови х. Клетки СС 25, полученные из American Type Culture Collection Rockvill, Marylang, USA, поддерживают рост и репликацию РСВ тем же образом, что и человеческие ткани бронхиол новорожденных. Табл. 4 убедительно демонстрирует, что возможно снижение мультипликации РСВ приблизительно на 99%, использу  дозы дтРНК, которые хорошо перенос тс  людьми.

Мете ды.

РНКэзы1, очищенные от экстрактов (в 100 мкг белка) ОКПК от здоровых индивидуумов или из клеток L929, инкубировали при услови х кор-челлюлозного анализа в присутствии поли (U)(32P)pCP (11000 расп. /мин, 0,1 мКи./ммоль) или поли (С)(32Р(рСР (12400 расп./мин, 0,3 мКи/нмоль) после добавлени  истинной 2-5А (РзА4, 5 х ) или 2-5А, выделенной из экстракта (12,5 мкг белка) ОКПК от пациента 5 (на 9 неделе терапии ложноспареннойдтРНК), поли(и)(32Р)рСр и

поли (С) (32Р)рСР синтезировали из поли (У) или поли (Ц) (Sigma) и (32Р)рСр (Amersham) при помощи Т4 лигазы (Bethesda Research Laboratories). В контрольных экспериментах в отвутствие РзАл на фильтрах из стек- ловолокна задерживалось 3300 расп./мин прли(и)(32Р)рСри 11000 расп./мин поли (С) ( Р)рСр, что отнесли к отсутствию (0%) деградации .

Поскольку установлено, что образова- ние инфекционных центров, индуцированных РСВ, включает пр мое распространение вируса от клетки к клетке, просто повышением внутриклеточной дтРНК можно эффективно снижать распро- странение РСВ от клетки к клетке без значимых неблагопри тных эффектов дл  других тканей тела.

.Таким образом, болезненна  патологи , вызванна  потенциально самолимити- рованными патогенами, такими как РСВ (семейство парамиксовирусов) и другие РНК-образующие вирусы, которые поражают назально (трахеально) бронхиальное древо, таких как риновирусы или вирусы гриппа, может быть эффективно сдержана по механизму заместительной терапии дтРНК. Локальные входные ворота патогена , такие как воздушные пути (не ограничива сь ими), могут иметь присущие или преход щие низкое содержание дтРНК (дтРНК здесь определ етс  по способу действи  как люба  из тех молекул, которые включают уместные иммунные антивирусные защитные каскады дл  пресечени  ре- продукции патогена /патологии ткани).

Пример 7. Обработка гепатита.

Многочисленные наблюдени  болезней печени со СПИД по вились в литературе в течение последних 2-3 лет. Тема, к которой неоднократно обращаютс , - это широкий массив гистологических находок как в образцах биопсии, направл емых иглой,так и биопсии во врем  аутопсии. Во всех исследовани х , упом нутых ниже, удовлетворе- ны критерии диагноза СПИД Центра США по борьбе с болезн ми, Атланта, Джорджи , США. Обычно присутствующие симптомы и черты пациентов, у которых обнаружена обширна  болезнь печени, в целом неспеци- фичны и включают потерю веса, лихорадку, лимфоденопатию, гепатосплиномегалию и боли в животе. У большинства пациентов со СПИД обычно повышены сериновые транс- аминазы. У повышенных щелочных фосфа- тах существует склонность быть непропорционально высокими. Предполагаетс , что такое увеличение щелочной фос- фатазы коррелирует с гистологическим диагнозом гранулемной болезни. Исследовани  аутопсией, проведенные на неотобранных пациентах, т.е. непредвз тый отбор пациентов в противоположность исследовани м бопсией на пациентах с гепатомега- лией и тестом на повышенную функцию печени, всегда демонстрируют широкую ин- тергепатическую патологию. Приблизительно 80-90% всех случаев аутопсии на пациентах со СПИД демонстрируют аномальную анатомию печени. Печеночные аномалии включают закупорку сосудов, воспаление ворот, ожирение, фокальный некроз , гранулематоз, желчное состо ние, цирроз и гиперплазию Купферовских клеток в приблизительном пор дке частоты. Интересно , что в одном исследовании (Schnelderman et al, Annals Internal Med. vol. 105, p.207,1987) интергепатический диагноз саркомы Капоши на аутопсии был наиболее распространенным специфическим интер- гепатическим патогеном (18%).

Желчна  болезнь к насто щему времени описана у небольшого числа пациентов со СПИД. В виде единичных случаев описаны склеротический холангит, интрагепати- ческие деструктивные нехватки желчных протоков и доброкачественна  экстрагепа- тическа  закупорка желчи на пациентах со СПИД. В этих случа х не было отмечено специфического этиологического агента; цитомегаловирус был привлечен в качестве возможной причины, вторичной к гистопа- тологическим находкам на биопсии. У пациентов со СПИД с доброкачественной экстрагепатической желчной закупоркой, обычно присутствуют жалобы на печень, боли в правом верхнем квадранте и умеренный подъем билирубина. На аутопсии или лапаратомии был поставлен диагноз ампул с водой - структуры, вторичной к фиброзу. В двух случа х экстрагепатической закупорки из желчного древа были выделены крип- тоспоридии. В других случа х привлекали внимание тельца включени  цитомегалови- руса вблизи от ампул с водой. Как и в описанном выше случае интрагепатического холангита, специфическа  этиологи  неизвестна и специфические патогены могут играть только нерегул рную роль в патогенезе этих расстройств.

Введение дтРНК rln т (Ci2U)n 200 мг дважды в неделю внутривенно исправл ет или существенно улучшает основные клеточные аномалии,ассоциированные с мультипликацией вируса гепатита в (ВНВ). Дл  завершени  этого утверждени  был использован следующий способ.

Определение уровн  ВГВ-специфиче- ской ДНК в сыворотке или плазме. Присутствие св занной с сывороткой (или плазмой) ДНК ВГВ - индикатора присутстви  вируса гепатита В определ ли слот-блот гибридизацией . Образцы сыворотки разводили в МНдОАс до конечной концентрации соли 1 М. Использу  72- чеечный аппарат дл  микрофильтрации (Schlelcher and Schuell, Keene, N, H.), образцы наносили пр мо на нитроцеллюлозный фильтр, который был предварительно замочен в течение 10 мин в 1 М . ДНК денатурировали щелочью In situ и нейтрализовали. Разведени  очищенной РНК ВНВ в нормальной человеческой сыворотке были проанализированы таким же образом дл  количествен ной оценки каждой слот-блот гибридизации. Фильтры отжигали, лрегибридизовали, гибридизовали и отмывали в услови х высокой жесткости и акторадиографировали при стандартных услови х (Maniatis, Т., Frltsch, E.F., and Sambrook, J., Molecular Cloning: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory. Cold Spring Harbor, 1982). Проба РНК ВГВ, использованна  в гибридизации. была получена из рекомбинантной плазми- ды, содержащей одну копию единичной дли- ны ДНК ВГВ (HBs AG серотип adw2), клонированную по ЕсоР1 сайту. Плазмиду расщепл ли УсоН1 и ДНК ВГВ очищали в двух циклах препаративного электрофореза в агарозном геле и электроэлюции. Очищенную ДНК ВГВ метили32Р-дЦТФ до удельной активности 1-2 х 109 имп./мин х мкг, использу  способ мечени  со случайным прай- мером (Felnberg, A.P., and Vogelsteln, В. Analyt. Blochem, 132, 6-13, 1983). Уровень чувствительности, достигнутый при помощи этого анализа, равен 1 пг ДНК ВГВ. На этом уровне чувствительности детектируетс  2,9 х Ю5 молекул ЖНК ВГВ.

Полученные радиоавтографы были оценены по степени относительной интенсивности , численно ранжированы согласно наблюденной интенсивности и описаны в табл. 5. Дни терапии даны в скобках.

Благодар  предлагаемому способу можно ставить клинический диагноз нехватки дтРНК, не основыва сь на обширных лабораторных данных. Может также существовать много менее очевидных состо ний нехватки дтРНК. Например, поскольку IFN действует как (обратимый - ) ингибитор пролиферативных путем (Aulllo и др., Cell, vol.43, pp. 793, 1985) и поскольку дтРНК-за- висимые медиаторы принадлежат к этим пут м , клетки, провод щие дифференцировку с опухолегенным/метастазным потенциалом , могут быть дтРНК-дефицинтыми.

Из указанных примеров  сно, что по св занной биологической функции (например , клеточный ответ на экзогенный IFN), или биохимической функции (например, повышенна  2-5А синтетаза), или по присутствию интермедиатов 2-5 олигоаденплатного

пути легко диагностировать состо ни  нехватки дтРНК и определ ть степень деградации различными способами, включа 

а). Определение концентраций эндогенного 2-5 олигоаденилата;

б). Количественный анализ концентрации 2-5А молекул рного размера 2-5А из образцов пациентов посредством жидкостной хроматографии высокого давлени ; в), Проверка биологической функцио5 нальности 2-5А синтетаз у пациентов, использу  анализ с расщеплением рибосомной РНК;

г). Анализ св зывани  с 2, 5- РзА/( Р)3 рСр дл  определени  уровн  сво0 (несв занной) PHKasbiL в образцах пациентов;

д). Кор-целлюлозный анализ (аффинна  хроматографи ) с поли(и)-(32Р)рСр дл  характеристики специфичности активации

5 РНКазыЬ 2-%А, синтезированной в образцах пациента;

е). Анализ с расщеплением рибосомаль- ной РНК дл  определени  уровн  активации PHKasbiL 2-5A, синтезированной в образ0 цах пациентов;

ж). Анализ с расщеплением рибосомной РНК дл  определени  уровн  активированной РНКазы1 в образцах пациентов.

Некоторые из этих способов детально

5 описаны в патентном описании, озаглавленном Вырабатывание метиаторов хоз йской защиты в биологические жидкости, серийный № 029, 823, зарегистрированном 12 августа 1987 г. и Исправление двут жевой

0 РНК аберрантных метаболических путей, серийный № 074,649, зарегистрированном 17 июл  1987.

Могут существовать также состо ни  достатка дтРНК, например CMLn лейкеми 

5 (волосатых - ) клеток (Л В К) часто способны к ответу на IFN, который даетс  в виде единственной терапии и отражают внутриклеточные ситуации природного достатка дтРНК. Дл  подтверждени  этого замеча0 ни , обнаружены сходные уровни 2-5А синтетаза - активирующей дтРНК в  драх одно дерных кров ных клеток от необработанных пациентов и в  драх обработанных IFN клеток HeLa.

5 Ложноспаренна  дтРНК. В то врем  как многие дтРНК могут индуцировать лимфо- кины, включа  IFN, и активировать 2-5А синтетазу, не все дтРНК обладают этими свойствами. Из синтетических дтРНК поли (I): поли (С) наилучший индуктор IFN и активатор 2-5А синтетазы, но он также очень токсичен. Поли (I): поли (Си, U), также обозначаема  ложноспаренной дтРНК или Ampllgen R (НЕМ Research. INc, Rockvllle, Maryland, USA), содержит периодические остатки урацила в полипиримидиновой цепи . Ложное спаривание вызывает быстрый распад без нарушени  биологической функции . Например, поли(1): поли (€21, U) про вл ет антивирусную, антиопухолевую и повышающую иммунитет активность и не токсична.

дтРНК используетс  в качестве заместительной терапии в терапии широкого спектра вирусов и рака. Ложноспаренна  дтРНК может быть, в частности, очень удобна при хронических вирусных инфекци х, включа  обработку ССК, поскольку она и антивирусный агент широкого спектра, и усилитель иммунности, даже в высоких до- зах она в сущности свободна от токсичности продолжительного действи . Данные на 45 последовательных пациентах, обработанных внутривенно 200-250 мг поли (1) - поли (С, U) дважды в неделю, показывали быстрое снижение концентрации вируса (ВИЧ, CML и герпес) и долговременное усилие как Т, так и В-клеточной иммуности, сопровождающейс  улучшенным выполнением, с отсутствием существенных побочных эффектов. У многих пациентов клинические ответы продолжались более приблизительно 18 мес цев или столь долго, сколь они продолжали терапии дтРНК (100-400 мг дважды в неделю ). В некоторых случа х могут требоватьс  более часто примен емые большие дозы. Вирусные инфекции и иммунные нехватки у СПИД пациентов могут отличатьс  от одного индивидуума к другому, ни от одного агента нельз  ожидатьс  исправлени  всех возможных клинических проблем. Однако дтРНК может играть ведущую роль в различных режимах обработки. Например, поскольку дтРНК про вл ет синергию с АЗТ в блокировании инфекции ВИЧ в Т4 клетках (описание № 028.823), ложноспэренна  дтРНК и очень низкие дозы АЗТ могут быть важной комбинацией на ранних стади х инфекции , включа  ССК.

Как дтРНК, так и IL-2 усиливают актив- ность Т клеток, ПК клеток и LAK клеток, отсюда в комбинации два агента демонстрировали терапевтический синергизм без добавочной токсичности. Поскольку IFN усиливают дифференцировку В клеток и моноцитов, некоторые лимфокины могут усиливать способность дтРНК промо- тировать специфические нейтрализующие антилела против ВИЧ и увеличить киллер- ную активность моноцитов. Сходным образом , поскольку ретиноиды увеличивают число Т4 клеток и промотируют дифференцировку как Т. так и В клеток IFN, комбинаци  дтРНК с ретиноидами может обеспечить дополнительные преимущества при ССК и СПИД. Комбинаци  дтРНК с тимусными пептидами может также иметь восстанавливающее действие на Т4 клетки, особенно у пациентов с очень низким числом Т4 клеток. Тот факт, что дтРНК про вл ет пр мую ан- типролиферативную активность против клеток саркомы Капоши. котора  может быть усилена добавлением IFN альфа или IL-2, предполагает новый противоопухолевый режим при данной болезни. Контроль параметров кров ных клеток при СПИД вы вил увеличение проблемы с ЦНС. С этой стороны ложноспаренна  дтРНК пересекает мышиный гематоэнцефэлический барьер в количествах, достаточных дл  активации 2- 5А аденилатсинтетазы в клетках паренхимы мозга. Следовательно, комбинаци  дтРНКс другими агентами, включа  лимфокины, которые пересекают гематоэнцефалический барьер, должна быть полезна при вируссв - занных сумашестви х. Здесь лимфокины включают интерфероны, предпочтительно интерферон альфа, интерлейкины, в особенности интерлейкин- 2(1L-2) и рекомбинант- ный интерлейкин-2 (rlL-2), и фактор некроза опухоли (ФНО). Такие включены лимфокин-активированные киллеры (ЛАК) образованные у животных в ответ на обработку лимфокином.

Когда в качестве лимфокина используетс  интерферон (альфа), обеспечиваетс  количество от 0,01 до 100,000 IRU на миллилитр жидкости тела пациента. Когда лимфо- кин IL-2, предпочтительно rlL-2. примен емое количество лежит в пределах от 102 ед. IL-2 на кг тела пациента до значений , приближающимс  к непереносимым уровн м токсичности дл  пациента, которые могут быть столь высоки к 106 ед. IL-2. Однако наиболее эффективные уровни с переносимыми токсическими реакци ми лежат в диапазоне от примерно 10 до примерно 10 ед. IL-2 на кг веса тела.

Обычно примен емые количества ложноспаренной дтРНК обеспечивают уровень от 0,1 до 1,000 мг дтРНК миллилитр жидкости тела пациента. Термин жидкость тела введен дл  ссылки на тот раствор сыворотки , солей, витаминов и т.р., который циркулирует внутри организма и омывает ткани. Когда оба агентта (дтРНК и лимфокин) примен ютс , они могут быть применены в смеси , отдельно или одновременно, или последовательно.

Применение дтРНК и лимфокинэ в комбинации включает случаи, в которых оба агента примен ютс  вместе в виде терапевтической смеси, а также процедуры, в которых эти два агента примен ютс  раздельно, но одновременно.

Фиг. 1 - это схема, иллюстрирующа  типичную нехватку дтРНК, котора  приводит к болезненности хоз ина, и достаток дтРНК, который приводит к выздоровлению хоз ина. Биоактивна  дтРНК вырабатываетс  внутриклеточно или вводитс  некоторыми вирусами (например, ЕМС)и включает последовательность энзиматических событий , включа  продукцию лимфокинэ и активацию медиаторов, котора  приводит к антивирусному состо нию, дифференци- ровке иммунных клеток и выздоровлению хоз ина. дтРНК, введенна  различными виентов с CML, иллюстрирована на этой пластине . Венгерские клетки L929, которые по- ставл ют рРНК, но не РНКазуЦ депонированы на услови х Будапештской

5 конвенции и Американский коллектор типов культур в качестве АТСС Nb CRL9659, клетки L929 депозированы в качестве CCL 1 и одн- ро дерные клетки от пациентов с CML получали согласно Karlko и Ludwlg и Sllverman

10 и ДР затем измер ли PHKasyL из ОЯК.

Это также фотографи  пластин электро- форега в полиакриламидном геле, демонстрирующа  присутствие фактора, ингибирующего РНКазуЬ), в экстрактах

15 ОКПК пациента с ССК, как определено в анализе с расщеплением рРНК. Экстракты клеток L929, которые служат источником и РНКазы. рРНК, и ОЯК были приготовлены по Ksrlko и Ludwlg и Sllverman и др. соответрусами (например, ВИЧ) или опухолевые 20 ственно. Дорожка 1:18 мкл экстракта клеток клетки могут разрушать этот путь, действу  L929(150 мкг тотального белка)инкубировали в присутствии 4 мкл буфера, использованного дл  лизиса ОЯК плюс 5.5 мкл

как ингибиторы. Физиологические событи  могут ограничивать образование дтРНК или вызывать образование аберрантной дтРНК. Также аномалии привод т к хроническим инфекци м и болезненности хоз ина. При ВИЧ и других хронических вирусных инфекци х иммунное расстройство может также быть результатом ингибитора РНКазы. (поводы ,

25 Дорожка 2: идентична дорожке 1 за тем исключением, что вместо воды в инкубацию было добавлено 5,5 мкл истинной РзАз. 5 х .

Дорожка 3: идентична дорожке 1 за тем

казано как альтернативный путь), который 30 исключением, что до инкубации было добавистощаетс  подачей экзогенной дтРНК с подход щей конфигурацией.

На фиг, 2, а и б - индукци  2-5А олиго- аденилатсинтетазы ложноспареннойдтРНК в ОЯК от пациентов с CML. Пациент с CML был обработан одним ITN в течение нескольких дней (фиг. 2. а), затем ложноспа- ренной дтРНК и IFN (фиг. 2. б). До и в течение обработки активность синтетазы измер ли в очищенных на FIcollOHK.

Фиг. 3 - это фотографи  пластин агароз- ного гел  после электрофореза, демонстрирующа  указанное число дорожек и полосы или зоны по длине каждой дорожки, Повышенна  активность РНКазы, св занна  с

35

40

лено 5,5 мкл ТХУ-растворимого экстракта (100 мкг тотального белка) из ОЯК от пациента с ССК.

Дорожка 4: 18 мкл экстракта клеток L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от пациента с ССК (100 мкг тотального белка) и 5,5 мкл воды,

Дорожка 5: 18 мкл экстракта клеток L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от здорового индивида (100 мкл тотального белка)и 5,5 мкл воды. Обозначены 28S и 16S рРНК, а также нормальные уровни продуктов специфического расщеплени  2-5А активированной РНКазы.

45

новым продуктом расщеплени  в ОЯК паци (56) Flsch et al. New Eng. J. Mecl., Sulg, 1987. - Marcus et al Nature, 1977, v.66, p.815.

Таблица 1

Внутриклеточна  концентраци  2-5 А и активность 2-5 А синтетазы и РНКазы L in vitro в экстрактах ОКПК инфицированных вирусом индивидуумов

ентов с CML, иллюстрирована на этой пластине . Венгерские клетки L929, которые по- ставл ют рРНК, но не РНКазуЦ депонированы на услови х Будапештской

конвенции и Американский коллектор типов культур в качестве АТСС Nb CRL9659, клетки L929 депозированы в качестве CCL 1 и одн- ро дерные клетки от пациентов с CML получали согласно Karlko и Ludwlg и Sllverman

и ДР затем измер ли PHKasyL из ОЯК.

Это также фотографи  пластин электро- форега в полиакриламидном геле, демонстрирующа  присутствие фактора, ингибирующего РНКазуЬ), в экстрактах

ОКПК пациента с ССК, как определено в анализе с расщеплением рРНК. Экстракты клеток L929, которые служат источником и РНКазы. рРНК, и ОЯК были приготовлены по Ksrlko и Ludwlg и Sllverman и др. соответводы ,

Дорожка 2: идентична дорожке 1 за тем исключением, что вместо воды в инкубацию было добавлено 5,5 мкл истинной РзАз. 5 х .

Дорожка 3: идентична дорожке 1 за тем

исключением, что до инкубации было добав

лено 5,5 мкл ТХУ-растворимого экстракта (100 мкг тотального белка) из ОЯК от пациента с ССК.

Дорожка 4: 18 мкл экстракта клеток L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от пациента с ССК (100 мкг тотального белка) и 5,5 мкл воды,

Дорожка 5: 18 мкл экстракта клеток L929 инкубировали с 4 мкл экстракта ОЯК от здорового индивида (100 мкл тотального белка)и 5,5 мкл воды. Обозначены 28S и 16S рРНК, а также нормальные уровни продуктов специфического расщеплени  2-5А активированной РНКазы.

Продолжение табл. 1

Примечание.8 нмоль АТФ, включенной в 2-5 А/мг белка, как определено в анализе с поли /I/: поли /СЛагарозой, стандартное отклонение 9%, НО не определено;

нмоль/г белка, как определено в анализе с кор-целлюлозой (в повторности), стандартное отклонение 20%;

расп./мин 50 мг белка, как определено в анализе со св зыванием радиоактивности (в повторности), стандартное отклонение 20%;

г определено в анализе с расщеплением рРНК (колонки 6 и 7) в двух независимых опытах. Количество образующегос  специфического продукта расщеплени  (СПР) определ ли, денси- тометриру  фотографии гелей, и выражали в виде соотношени  образующегос  СПР к 18S и 28S рРНК х 100; - . 0; +. 10-30; ++. 31-63; 64-85; ++++, 86-100.

35

Вли ние дтРНК на образование инфекционных центров клетками СС 25, инфицированными респираторным синцитиальным вирусом

Примечание.

Данные не использованы дл  подсчета средних количеств. Наивысша  концентраци  ложноспаренной дтРНК (25 мкг/мл) была не токсична дл  клеток СС 25.

8 Счетверенные  чейки сливающихс  клеток СС 25 в 24- чеечной плате были заново снабжены 1,5 мл поддерживающей среды, содержащей дтРНК в обозначенной концентрации за 1 ч до рассева клеток, инифицированных РСВ. Контрольно обработанные клетки снабжались свободной от дтРНК средой.

6 4 х 104 клеток СС 25 в суспензии инфицировали в общем объеме 1 мл, содержащем 5 х 105 БОЕ РСВ (М01 12). Адсорбци  вируса происходила в течение 2-чассвой инкубации при 37°С с прерывистым ресуспендированием клеток. В конце этого периода суспензию разводили 1/100 поддерживающей средой, 0,5 мл аликвоты инфицированных клеток добавл ли непосредственно в каждую экспериментальную  чейку и в каждую  чейку контрол  инфекционных центров. В каждую  чейку контрол  клеток добавл ли 0,5 мл поддерживающей среды. Все культуры инкубировали при 37°С в 5% С02 95% воздуха в течение 72 ч, фиксировали метанолом и окрашивали по Гимза. Бл шки (инфекционные центры) подсчитывали под микроскопом .

Таблица 3

2001917

36 Таблица 2

37200191738

Таблица 4

Активность 2-5А и РНКазы L, выделенных из ОКПК людей на гомополирибонуклеотидах

8 Среднее из трех независимых определений; стандартное отклонение 20%.

Таблица 5

Действие применени  дтРНК на уменьшени  концентрации ДНК ВГВ (вируса гепатита В) в

жидкости тела

Примечание. ноль (перед терапией).

+ относитс  к относитс  к относительной интенсивности рентгеновской пленки, экспонированной в течение п ти дней и содержащей Р вирусной ДНК. Больше плюсов (например, 3+ по сравнению с 1+) относитс  к более интенсивным и большим слот-блотам на рентгеновской пленке, показывающим присутствие большего количества вирусной ДНК. Дл  увеличени  чувствительности измерени  вируса использовали различные разведени  сыворотки пациента, обычны равзедени  1:40, 1:200, 1:40 и 1:1500. Завершающие результаты были основаны на денситометрировании слот-блотов. Методологи  была основана на реагентах, обеспеченных Schlelcher and Schuell (материалы обдозначены № 370 2/284). Сочетающиес  результаты были получены при анализе специфического вирусного антигена (иммуноанализ на определение поверхностного антигена гепатита В в сыворотке или плазме), набор доступен от Abbott Laboratories (обозначен технически 83-0804/В 12, датирован июлем 1985).

ЕМС

отситствие биоактивной дтРНН

i

сниженное образование лимфокина i

сниженный медиатор

неактивна 

сниженна  активность иммунных клеток

Болезненность хоз ина (хронические инфекции

Фиг.1

HIV 8ИЧ

i

неадекватный уровень дтРНК, мог у/л присутствовать ингибиторы am РНКопосредованного пути

оЬразоВание а8еррантно2о лимфо- кина(кислотно-лабильный WDH)

повышенна  синтетозас менее функциональным конечным медиатором (РНКозой L

SCPffCP

Фиг.З

+20 л

Мес цы обработки

Фиг. 4