PT88415B - Processo para a determinacao de estados de deficiencia em pacientes de arn de dupla cadeia e para a preparacao de composicoes farmaceuticas contendo arndc para o tratamento dessas deficiencias - Google Patents

Description

Memória descritiva

Pf> A presente invenção refere-se ao diagnóstico de um estado de deficiência em ARNdc e a procedimentos para o fornecimento de ARNdc exógeno de configuração molecular apropriada a fim de restabelecer um nível normal de ARNdc.

Antecedentes da invenção

Estabelecem-se novos métodos para o diagnóstico e para a terapia de doenças virais, de infecções patogénicas crónicas em geral e de cancro quando se descobrem as diversas funções na defesa do hospedei ro desempenhadas pelo ARNdc natural. Por exemplo, o

- 1 desenvolvimento da SIDA (uma infecção por retrovírus/cancro) está associado com uma disfunção grave progressiva em processos biológicos que verifiquei serem catalisados por ARNdc incluindo não apenas a biossintese de interferão mas também a produção de 2-5A bioactivo, a actividade de RNase L e várias funções imunes mediadas por células. Mostro que a redução específica em ARNdc bioactivo ou em enzimas que dependem de ARNdc no interior das células con tribui para o progresso da doença.

No centro de várias lesões celulares em sistemas de defesa que levam à morte encontra-se também um estado de deficiência em vias metabólicas em que participa o ARNdc bioactivo. Anteriormente eu detec tei um inibidor de RNase L em linfócitos de pacientes de ARC e de SIDA infectados por HIV, o que é apenas um resul tado (entre muitos) de níveis inadequados de ARNdc intracelular. A terapia com ARNdc sintético de configuração apropriada elimina este inbidor ou estes inibidores, o que pode explicar parte, da resposta clínica que eu ebservei com respeito à redução na concentração de vírus e a restauração da fuúção imune em pacientes com várias viremias crónicas que actualmente continuam a desafiar em grande medida a intervenção médica definitiva. Deste modo, eu desenvolvi agora uma invenção integrativa que pode explicar, quantificar e corrigir vários estados de deficiência em ARNdc em vários estados de doença. Verifiquei também que alguns ARNdc's, por exemplo o ARNdc desemparelhado, podem realmente substituir um ARNdc de ocor rência natural que ajude a manter as funções essenciais para os processos celulares normais. A ausência desta regulação de ARNdc, se não for corrigida com um ARNdc exó geno adequado, pode causar o desenvolvimento de vários processos celulares anormais. Os processos celulares anormais conduzem em seguida a infecções virais crónicas ou a outras infecções patogénicas intracelulares, a uma redução das funções das células imunes e, por fim, à morbilidade crónica e possivelmente à própria morte.

Estratégias Clinicas

As infecções virais podem muitas vezes seguir-se a distúrbios parciais do sistema imune através de agentes tão diversos como stress e vírus que atacam directamente a função imune. Por exemplo a SIDA (Síndrome da Imunodeficiência Adquirida) segue-se à deterioração progressiva do sistema imune causada pela'infecção dos linfócitos T pelo vírus da imunodeficiência humana, HIV (Coffin êt al., Science vol. 232, p. 697, 1986).

Para se ser completo, deve notar-se que existem diferentes designações para o vírus HIV; LAV é a designação para o vírus da SIDA isolado no Instituto Pasteur, Paris, França e HTLV-III é a designação para o vírus da SIDA isolado no Instituto Nacional de Saúde, Bethesda, Maryland, E.U.A. Normalmente usa-se como termo genérico para o vírus a designação de HIV, No presen te texto o vírus HIV será referido genericamente ou designado por HIV ou HTLV-III ou por LAV sem intenção de dife renciação entre eles. Para além disso, o termo HIV na memória descritiva e nas reivindicações inclui todos os outros vírus podem ser associados com a produção da SIDA, quer tenham já sido isolados quer não.

A infecção por HIV é uma doença progressiva embora a taxa de transição de uma fase para outra seja variável. Os indivíduos assintomáticos infec tados pelo HIV podem desenvolver uma condição (LAS ou pré -ARC) caracterizada por linfadenopatia. Os pacientes progridem para o complexo relacionado com SIDA ou ARC (AIDS-related complex) apresentando uma deficiência das células T4 e mais tarde mostram uma capacidade reduzida dos linfócitos para sofrer proliferação estimulada pelos antigenes e produção de IFN-gama. Estes pacientes perdem várias funções imunes mediadas pelas células como hipersensibilidade cutânea retardada, eventualmente tornando-se completamente anérgicos. Estes pacientes apresen- 3 tam evidência de quebra nos mecanismos de defesa do hospe deiro incluindo infecções por Herpes Zoster, candidíase oral (aftas) e sintomas como por exemplo febres prolonga?· das, suores noturnos, diarreia e perda de peso» Por fim, estes pacientes experimentam certas infecções oportunistas graves (por exemplo, pneumonia por Pneumocystis carinii) e considera-se que nesse momento desenvolveram a SIDA de modo completo, com uma taxa de mortalidade de 50 % no período de 12 meses. A infecção por vírus de HIV é escolhi da como um caso ilustrativo simplesmente porque o nível de deficiência de ARNdc é tão pronunciado. Muitas outras doenças, incluindo infecções virais indolentes, serão associadas com deficiências semelhantes; deste modo, a minhéi invenção tem uma aplicabilidade inesperadamente alargada.

É imortante notar que a progressão típica referida acima não descreve a disparidade notável em sintomatologia clínica entre os pacientes infectados por HIV ou muitos outros pacientes com doenças crónicas tais como infecção por vírus de Epstein Barr ou de EB, ir fecção pelo vírus da hepatite, citomegalovírus, infecções de herpes, etc.. Os componentes do decaimento do sistema imune com taxas muito diferentes em vários pacientes e a ausência de ARNdc bioactivo são a causa ou o factor con tributivo neste processo. À infecção por HIV pode desen volver-se de acordo com vários tipos diferentes de célulae (por exemplo, células sanguíneas, células gliais). Alguns pacientes desenvolvem disfunções neurológicas como primeiros sintomas. Deste modo, vários indivíduos podem ter necessidades terapêuticas muito diferentes mesmo que todos necessitem provavelmente da erradicação de HIV das células T4.

Duas características patológicas gerais necessitam de ser atribuídas em muitas infecções vi rais diferentes incluindo as dos doentes com ARC: uma série déficits imunológicos e infecções virais continuadas

(revisão em Fauci, Proc. Nat 1» Acad. Sei. USA, vol. 83, p. 9278, 1986). Parece que a intervenção terapêutica que ataca apenas os déficits imunológicos mas não evita a replicação do vírus é contraproducente especialmente qt ando este tratamento activa as células T4. Por exemplo, as células T ajudantes com receptores Tac respondem à lin foquina IL-2. Nas vítimas de SIDA, a IL-2 causa a éxpan são das células sensíveis a HIV e ao agravamento aparente da doença.

ataque directo às infecções virais, por exemplo às infecções por HIV, teve algum êxito especialmente evidicenciado pelo inibidor da transcritase inversa virai designado por azidotimidina (AZT) que podetr reduzir a carga de HIV em alguns pacientes e prolongar-lhe a vidã. Esta terapia arrasta alguns resultados indesejáveis. Numa minoria de pacientes a AZT causa também uma recuperação temporária da imunodade mediada pelas células T de acordo com a avaliação por meio do aumento transitório das células T4 e pelo aparecimento da hipersensibilidade do tipo retardado (Fischl et al., New Eng.

J. Med., Julho, 1987). No entanto os inibidores de transcritase inversa são tóxicos nas doses necessárias para produzir efeitos antivirais significativos e são em consequência mal tolerados em tratamentos prolongados. Pode haver necessidade de administrar agentes antivirais durante toda a vida do paciente.

O IFN é eficaz como um composto an tiviral geral e também como um produto anti-SIDA, provavelmente porque não é um antídoto para os efeitos relacic nados com o ARNdc que eu agora estudei. Algumas vítimas de ARC e de SIDA têm certos defeitos nas vias metabólicas do IFN, como por exemplo a produção de um IFN defeituoso instável perante os ácidos e a incapacidade das células T4 para produzirem as quantidades apropriadas de IFN gama, que se encontram sufucientemente descritos na literatura médica. Anteriormente eu conclui que se pode

provar que estes vários defeitos relacionados com IPN nos pacientes com ARC e com SIDA estão relacionados totalmente ou em parte com uma falta de actividade de RNase L normal (um mediador terminal da via metabólica) em linfócitos que eu descrevi no meu pedido de Patente US com o número de sérir 021 372 depositado em 3 de Março de 1987 que dou aqui por reproduzido. Se bem que a sintetase de 2-5A dependente de ARNdc se encontre elevada nos linfócitos sanguíneos de indivíduos com ARC e com SIDA bem como em outras viremias crónicas, verifiquei que as mesmas células sanguíneas apresentam níveis reduzidos de 2-5A autêntico e RNase L baixa (ver seguidamente). Correlacionei a baixa actividade de RNase l com as baixas quantidades de proteína de P.M. 80 000 capaz de ligação com um análogo de

2-5A marcado por fotoafinidade. Os resultados das minhas investigações estão em concordância com uma via metabólica ou com vias metabólicas de ARNdc que tenham sido encerradas e com a ausência relativa e/ou a inibição de RNase L.

A vacinação contra o HIV e contra outros vírus e a utilização de anticorpos anti-HIY passivos são também de considerar para a prevenção e para o tra tamento, respectivamente, de afecções virais, mas estas técnicas apresentam limitações significativas: por exemplo o HIV (bem como o vírus da gripe em particular) pode infec tar rapidamente as células sem sintomas. Eu descrevi tam bém uma função para o ARNdc a fim de provocar o aumento da formação de anticorpos contra os vírus em geral e contra os retrovírus em particular no pedido de patente acima men cionado.

Descrevo na presente memória descritiva um novo fenómeno que indica que os ARNs de dupla cadeia (ARNdc's) constituem o primeiro grupo de moléculas que estão eficazes tanto contra as lesões virais como contra as lesões imunes de várias infecções virais subagudas/ /crónicas como seja por HIV e outros vírus. Estes defeitos podem ser corrigidos com uma precisão de laser sem afectar de modo adverso outras funções corporais, o que cor titui uma limitação comum das terapias presentemente dispç níveis para infecções virais crónicas. Concluo que os pç. cientes com infecções virais não resolvidas e indolentes têm muitas vezes deficiências específicas em vias metabóll cas vitais intracelulares dependentes do ARNdc que podem ser invertidas ou melhoradas pelo menos em parte por um ARNdc fornecido de modo exógeno (este facto é explicado graficamente no fluxograma da Figura 1) e que a monitoriza ção destas vias, antes e durante o tratamento, proporciona um novo método eficaz de medir o grau de terapia de substituição de ARNdc necessário numa base de um paciente individual ou de uma doença específica.

Algumas enzimas críticas associadas com a defesa do hospedeiro necessitam dos ARNdc's para a expressão da bioactividade. Estas enzimas podem ser activadas por ARNdc exógeno se o nível de ARNdc natural intracelular é demasiado baixo. Parte da acção pleitrópica do ARNdc deriva da sua capacidade para induzir a síntese de toda a série de IFNs - alfa, beta e gama - que ope ram através de um grupo de mediadores intracelulares inclu indo uma quinase de proteína dependente de ARNdc, uma sintetase de 2-5A dependente de ARNdc e uma RNase L dependente de 2-5A. Estas enzimas dependentes de ARNdc podem exe cutar muitas actividades biológicas atributíveis ao IFN de acordo com a revisão de Lengyel (Ann. Rev. Biochem., vol. 51, p. 251, 1982). Por exemplo, a produção de um ARN de sentido invertido que bloqueia a expressão da sintetase de

2-5A causa uma sensibilidade profunda das células animais à infecção por diferentes vírus (Bendetti et al., Prac, Natl. Acad. Sei, USA, vol. 84, p. 658, 1987). A quinase de proteína activada por ARNdc fosforila o elF2 que inibe a síntese das proteínas; tem também uma actividade proteolítica que causa a degradação das proteínas virais. A

- 7 sintetase de 2-5A activada por ARNdc sintetiza ο 2-5A que activa a RNase L, uma via metabólica que eu sugiro que desempenha uma função crucial tanto na inibição de vários vírus de animais como na regulação do crescimento celular (podendo a desregulação deste crescimento levar a formação de tumores). Os ácidos 2'-5'-oligoadenílicos não são normais devido ao facto de quê a ligação de fosfodiés ter 3', 5’ normal característica da maior parte dos ARNdc's se encontra substituída por uma nova ligação de diés. ter com aquisição do novas propriedades biológicas.

Actividade antiviral do ARNdc

ARNdc á um indutor bem conheci do de um estado anti-viral (Marcus et al,, Nature, vol. 66, p. 815, 1977). Do mesmo modo, o poli(A):poli(U) gera um estado antiviral sem induzir o IPN. Mas, antes da minha presente invenção, não se sabia que os reguladores de ARNdc naturais existiam e que, por conseguinte, os estados de deficiência em ARNdc eram realmente comuns em pa cientes humanos, particularmente associados com episódios patogénicos (por vírus, fungos, protozoários, invasões bacterianas, etc., especialmente as que têm uma presença intracelular (humana) como componentes valiosos necessári os do seu ciclo de vida).

Actividade antiprolíferativa do ARNdc

Anteriormente eu verifiquei (J, IFN Res,, vol. 6, p. 373, 1986) que 42 % de mais do que 100 especimens de tumores humanos frescos, quando estudados em agar macio, apresentavam uma redução superior a 50 % na formação de colónias de células tumorais após apenas uma exposição a ARNdc. Estas células são deficientes em ARNdc. Descrevi também a sensibilidade independente a IFN e a ARNdc em várias linhas de células de tumores huma nos e verifiquei que os tumores humanos propagados em ra8

tos pelados eram sensíveis a ARNdc; a terapia por ARNdc foi curativa para alguns tumores (por exemplo renais) e que os animais viviam de acordo com uma esperança de vida normal (ver publicação de pedido de Patente Europeia 0 113 162), Na presente memória descritiva eu descrevo uma correlação forte entre as respostas clínicas e a acti vação das enzimas dependentes de ARNdc em oposição à indu çSo detectável por IFN ou por IL-2 secundária a administração de ARNdc.

Intensificação imune da actividade de ARNdc

Anteriormente relatei (J. immunol., vol. 124, p. 1852, 1980) que o ARNdc aumentava a actividade citlítica das células destruidoras naturais hu manas (natural Killer = NK) contra células de leucemia hu mana. As necessidades estruturais de ARNdc para o aumen to de NK são paralelas às requeridas para a activação da sintetase de 2-5A e parã a indução de IFN.

Regulação génica mediada por ARNdc

Sullo et al. (Cell, vol. 43, p. 793, 1985) demonstraram que o ARNdc induz a competência dos genes em fibrohlastos em repouso incluindo os oncogenes designados por fos e myc. Na presente memória des critiva, por genes competentes entendem—se os genes numa célula cujas acções são necessárias a fim de modular acçôes vitais, como por exemplo a multiplicação, o cresci mento, etc.. A indução do gene de IFN-beta pelo ARNdc pode utilizar uma proteína de regulação que é eliminada por exposição das células a ARNdc (Zinn et al., Cell, vol 45, p, 611, 1986). Eu determinei que, no que respeita a actividade biológica, os ARNdc's fornecidos por via exóge na tem uma actividade mimética‘do ARNdc natural não virai intracelular como o ARN nuclear heterogénio ou o ARNm com plexado com poli(U). Por exemplo, inventei recentemehte um ARNdc inductível por IFN em núcleos de células Hela

com capacidade de activar a sintetase de 2-5A in vitro.

advento da imunidade celular estabeleceu aparentemente o estágio para a evolução de moléculas de IFN/ARNdc num momento bastante atrasado do ciclo da evolução dos animais no sentido da diferenciação celular, particularmente na diferenciação promovida por IFN. Consegui determinar dum modo mais geral que o ARNdc pode provocar a diferenciação promovida por outras proteínas de regulação que estabelecem o estágio para a minha definição de estados de deficiência de ARNdc.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS

A Figura 1 representa um esquema de fluxo que ilustra as vias alternativas para a morbilidade do hospedeiro e a via de recuperação do hospedeiro;

A Figura 2A é um gráfico que representa o número de dias antes e depois do início da terapia com IFN na quantidade indicada contra a actividade de sintetase;

A Figura 2B é um gráfico no qual se compara a contagem de glóbulos brancos no sangue e a quantidade de ARNdc desemparelhado após 120 dias de trata mento;

A Figura 3 é uma fotografia de placas de electroforese em gel de poliacrilamida que apre sentam várias zonas e bandas ao longo de cada pista; e

A Figura 4 é um gráfico no qual se compara o número absoluto de linfócitos T4 por milímítro cúbico de sangue, expresso em alteração em % em rela ção ao valor de base, com os meses de terapia.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA INVENÇÃO

Descrevo na presente memória des critiva um novo fenómeno que indica que os ARNs de dupla cadeia (ARNdc's) constituem o primeiro grupo de moléculas que são eficazes tanto contra as lesões virais como contra as lesões imunes de várias infecções virais subagudas/crónicas como seja por HIV e outros vírus. Estes defeitos podem ser corrigidos com uma precisão de laser sem afectar de modo adverso outras funções corporais, o que constitui uma limitação comum das terapias presentemente disponíveis para infecções virais crónicas. Concluo que os pacientes com infecções virais não resolvidas e indolentes têm muitas vezes deficiências específicas em vias metabólicas vitais intracelulares dependentes do ARNdc que podem ser invertidas ou melhoradas pelo menos em parte por um ARNdc fornecido de modo exógeno (este facto é explicado graficamente no esquema de fluxo da Eigura 1) e que a monitorização destas vias, antes e durante o tratamento, proporciona um novo método eficaz de medir o grau de terapia de substi tuição de ARNdc necessário numa base de um paciente indivi dual ou de uma doença específica.

A presente invenção proporciona um meio de diagnóstico para determinar um estado de deficiência em ARNdc numa amostra de um paciente, de quantificar esta deficiência (se existir) e de proporcionar um procedimento terapêutico para a restauração de qualquer deficiência de ARNdc identificada por meio da administração de ARNdc exógeno opcionalmente em combinação com uma linfoquina. Normalmente, um estado de deficiência em ARN dc evidencia-se numa célula componente do sistema imune esteja ou não a célula componente no processo de multipli cação ou de diferenciação. A deficiência em ARNdc é evidenciada, por exemplo, pela falta de capacidade de uma célula componente do sistema imune para manter um nível sufi ciente de RNase L bioactiva. A monitorização das vias

dependentes de ARNdc intracelular antes, durante e depois da terapia permite a determinação clínica do grau de terapia de substituição de ARNdc necessário numa base individual. Outros meios de avaliar as deficiências em ARNdc são apresentados na descrição pormenoriaada que se segue.

Na presente memória descritiva definem-se especificamente mediadores como quaisquer espécies intracelulares (por exemplo, oligonucleótidos específicos, proteínas, ARNdc's - isoladamente ou em combinação) que podem efectuar funções bioquímicas específicas iniciadas pela presença de ARNdc. Estas funções bioquímicas contribuirão para um fortalecimento do mecanismo de defesa do hospedeiro quer ao nível da célula isolada quer ao nível geral (organismo).

As condições susceptíveis aos processos terapêuticos da presente invenção são geralmente aquelas em que a deficiência do nível intracelular de ARNdc está abaixo dos limites normais em comparação com indivíduos saudáveis, causando a deficiência em ARNdc uma patologia de tecido e/ou na presença um nível anormalmente baixo ligado a ou coexistindo com a presença de um estado patogénico intracelular. Condições ou patologias tecidu ais mais específicas e sintomas constitucionais incluem infecções virais como por exemplo infecções por retrovíruE incluindo HIV, vírus da família do Herpes, paranixovírus, rinivírus, hepatite e síndrome da fadiga crónica. OutraE condições incluem a proliferação incontrolada de células cancerosas e patologias do sistema imune quer a célula componente se encontre ou não num processo de multiplicação ou de diferenciação.

Por ARNdc¹s desemparelhados en tendem-se os ARNdc’s nos quais a ligação de hidrogénio ( empilhamento de bases) entre as duas cadeias se encontra relativamente Intacta, isto é, se encontra interrompida em média menos de um par de bases em cada 29 resíduos de bases consecutivos. 0 desemparelhamento é uma interru- 12 pção da geométria normal da dupla hélice do ARN por formação de laçadas para o interior (ou para o exterior) das cadeias que representam pontos de vulnerabilidade do ARNdc à digestão com ribonucleases. 0 termo ARNdc desemparelftado deve ser entendido em concordância.

ARNdc pode ser um complexo de poliinosinato e policitidilato contendo uma proporção de bases de uracilo ou de bases de guanidina, por exemplo, de 1 em 5 a 1 em 30 destas bases (poli I. poli (C^ 29 ^X

U ou G)).

ARNdc pode ter a fórmula geral rl_n»r(C]_₂*U)_n· Discutem-se seguidamente outros exemplos adequados de ARNdc.

No ARNdc desemparelhado preferido rl_n.r(C-£₂,U)_n., uma região constituída por uma extensão de 6 a 12 pares de bases, isto é, metade de uma volta inteira da hélice de ARN, serve tanto de desencadeador biológico que causa a libertação de linfoquinas como de cofactor intracelular obrigatório para enzimas que fazem parte das vias metabólicas antivirais naturais, As regióes desemparelhadas constituídas por resíduos de uracilo estão inseridas periodicamente na cadeia de polipirimidina a fim de acelerar a hidrólise de ARNdc a deste modo evitar a toxicidade.

Os ARNdc's preferidos para utilização na presente invenção estão baseados em copolinucleótidos seleccionados de entre poli (C_n,G) nos quais n é um número inteiro com um valor de 4 a 29 e são análogos desem parelhados de complexos de ácidos polirriboinosínicos e polirribocitidílicos, formados por modificação de rl_n.rC_n a fim de incorporar bases sem par correspondente (uracilo e guanidina) ao longo da cadeia de polirribocitidilato (rC_n). Em alternativa, o ARNdc pode ser um derivado do

ARNdc com a fórmula poli (I). poli (C) por modificação da espinha dorsal de ácido polirriboinosínico (rl^), por exemplo por inclusão de resíduos de 2'-O-metil-ribosilo. Estes análogos desemparelhados de rI_n*rC_n# de que os preferidos têm a fórmula ri .r(C., _1Z,U) e ri .r(C_nri,g) , encontram-se descritos por cárter e Ts‘o nas patentes US 4 130 641 e 4 024 222, cujas memórias descritivas se dão aqui por reproduzidas. Os ARBdCs descritos nestas patentes são em geral adequados para utilização de acordo com a presente invenção. Em certos casos são suficientes como terapia de substituição oligonucleótidos complementares tipo duplex (hélices).

Outros exemplos de ARNdc's desempei relhados utilizáveis na presente invenção incluem;

poli	(I).poli	(c4,u)
poli	(I).poli	(c?,u)
poli	(I).poli	(Ci3,U)
poli	(I).poli	(C22,U)
poli	ÇI).poli	<C20'G)
poli	(I).poli	G 2 9 * G) ®
poli	(I).poli	(C ) 23 G>p

Sinergia ARNdc-linfoquina

Uma vez que o ARNdc exerce uma par te importante da sua acção biológica através de um sistema específico de linfoquinas mediadas em parte por IFN, raciocinei que o ARNdc deve (a) induzir o IFN em células deficientes em IFN bem como (b) os mediadores relevantes das enzimas dependentes de ARNdc, uma vez que o ARNdc não é inductível em células que não respondem a IFN aplicado de forma exógena.

Se o ARNdc actua apenas através do sistema do IFN e se o ARNdc se encontra em excesso nas

células, então um excesso de IFN isolado exerceria uma bioactividade tão elevada como as combinações de IFN com ARNdc. No entanto esta condição deve ser relativamente rara uma vez que eu agora encontrei muitos exemplos de si nergia ARNdc-IFN e verifiquei uma escassez de exemplos de falta de sinergia. Por exemplo, verifiquei que o ARNdc apresentava sinergisrao com IFN alfa, beta ou gama humano na inibição do crescimento de células do carcinoma da bexiga, do carcinoma do pulmão e do fibrosarcoma humanos. Estendi estes resultados a 15 outras linhas de células de tumores humanos, verificando-se ausência de sinergia ant_i proliferativa apenas em uma linha. Observei sinergismo antitumor semelhante em alguns tumores humanos enxertados em ratos pelados e observei clinicamente de modo consisten te que a combinação de IFN com ARNdc era superior a qualquer dos dois agentes isolados num regime anticanceroso tanto em tumores do rim como em CML,

Estados de deficiência em ARNdc

Como via metabólica protótipo, a via da sintetase de 2-5A/RNase L inclui um ou vários ARN— dc's, 2-5A, enzimas ligadas e inibidoras. Existe uma li gação bioquímica directa entre o ARNdc e a RNase L no fac to de o produto da sintetase de 2-5A dependente dê ARNdc,

2-5A, ser um cofactor necessário para a actividade de RNase L. Os exemplos que se apresentam seguidamente têm por finalidade exemplificar algumas de várias espécies possíveis de deficiências em vias mediadas por ARNdc que podem ser invertidas por fornecimento de ARNdc por via exógena.

O esquema de fluxo da Figura 1 ilustra mais completamente as relações entre a suficiência em ARN<gc, que conduz à recuperação do hospedeiro, e a deficiência em ARNdc, que conduz à morbilidade do hospedeiro. 0 ARNdc bioactivo é produzido intracelularmente ou

- 15 é introduzido por certos acontecimentos que conduzem a um estado antiviral bem como à diferenciação das células imu nes e à recuperação do hospedeiro.

A determinação in vitro da sintetase de 2-5A tem um valor limitado, uma vez que esta análise não reflecte a actividade in vivo da sintetase de

2-5A. Por conseguinte, eu desenvolvi um método para extrair e para quantificar ο 2-5A a partir das células mono nucleares do sangue periférico (CMSP) em indivíduos saudá veis e a partir de pacientes infectados por agentes patogénicos antes e depois de terapia com ARNdc desemparelhado. A concentração de 2-5A pode ser determinada por meio da capacidade do 2-5A para activar RNase L purificada por afinidade para degradar o poli(U)^ p /pCp.

QUADRO I

Concentração	intracelular de 2-5A	e Actividade in vitro
	de	! Sintetase de 2-5A e	de RNase	L
em Extractos	de CMSP	de Indíviduos	; com infecçôes virais
Origem Semanas	Activi	2-5A	RNase L
das	com	dade de	intrace
CMSP ARNdc	sinteta	lular
desempa	se de	b latenteC/d	activadod
relhado	2—5Aa
coluna:		1	2 3	4	5
Ns 1 SIDA	0	49	<0,2 260	—	—
+	4	105	ND		-
SK	9	4	<0,2		—
	15	10	1.8		+4*
	19	21	0.8		-
	24	26	>10,0
	28	20	>10,0		++++
N2 2 SIDA	-1	205	<0,2 240	—	-
+	0	180	ND	-	-
SK	4	117	1,4
+	8	19	2,4		+++
PPC	21	ND	6,8		++
	26	9	5,4
N2 3 ARC	-6	11	<0,2 270	—	—-
	2	13	ND		-
	4	19	<0,2		-
	17	3	1/8		++++
N2 4 ARC	0	130'	<0,2 270	-	-
	2	185	ND		-
	4	18	0,4
	8	ND	<0;2		-
	22	ND	>10,0

NS 5 LAS	0	30	0,6	280	-	—
4	36	<0,2			-
	9	12	1/0			++
	17	21	3,0			++++
Voluntários		5	0,3-1,1	1350		ttf+

saudáveis

nmole de ATP incorporada em 2-5A/mg de proteína por análi se em agarose de poli(I)jpoli(C); desvio padrão 9 %; ND = = não determinado.

nmole/g de proteína por análise (em duplicado) em celulose nuclear; desvio padrão 20 %.

dpm/50 yug de proteína por análise de radioligação (em duplicado) (coluna 3); desvio padrão 20 %.

determinado em análises de cisão de ARNdc (colunas 4 e 5) em duas análises independentes. O produto de cisão especí fica (PCE) foi quantificado por traçagem densitométrica em fotografias de geis e é expresso sob a forma de uma proporção entre a formação de PCE dividida por ARNr de 18S e de 28S x 100; - = 0;, + = 10 a 30; ++ = 31 a 63; - 64 a 85;

+ +++ = 86 a 100.

Métodos:

Obteve-se sangue periférico hepari nizado a partir de dez indivíduos saudáveis e de cinco pacientes homossexuais do sexo masculino com LAS, ARC e SIDA (de acordo com a definição do Centers for Disease Contrõl). As características clínicas, virológicas e imunológicas dos pacientes que faziam parte deste estudo (pacientes N2 1 a 5) foram anteriormente caracterizadas sob as designações de pacientes 10, 8, 1, 7 e 2, respectivamente, no meu artigo em Lancet de 6 de Junho de 1987. As CMSP foram isoladas

*A»vsifcuKes em Ficoll-Hypaque. As células L929 e HL929 (um subclone de L929 deficiente em RHase L) foram mantidas numa cultura de monocamada. prepararam-se os extractos citoplasma ticos das células L929 e HL929 em tampão de glicerol e os extractos de CMSP em tampão de lise NP40. A concentração proteica nos extractos situava-se entre 10 e 15 jug//il, SK = sarcoma de Kaposi; PPC = pneumonia por Pneumocystis carnii.

Determinou-se a actividade de sin tetase de 2-5A (coluna 1) em extractos de CMSP (50 pg de proteína/análise) usando agarose de poli(I):poli(C). Iso lou-se ο 2-5A a partir da fracção solúvel em etanol de extractos de CMSP (100 jug de proteína) (70 % de etanol, v/v). Liofilizou-se em seguida o 2-5A extraído com etanol e redissolveu-se em água (20 pl). Determinaram-se as concentrações do 2-5A intracelular presente nos extrac tos de CMSP (coluna 2) por análise de celulose nuclear com extractos de células L929 para fonte de RNase L de curvas de calibração obtidas com 2-5A autêntico. A acti vação de RNase L por 2-5A nesta análise baseia-se na conem fragmentos solúveis em

Em experiências de comparação (na ausência de — 32 — versão de poli(U)/ p_/ ^c 3? P ácido.

tinham adicionado (1,3 jiCi/nmole)

2-5A), foram retidos 6500 dpm em filtros de fibra de vi—32 — dro de um total de 17700 dpm de polidl)^ ^p__/p^Cp 9X® ^se Na presença de - 1

-10 ’ — 32 — x 10 M de 2-5A autêntico, o poli(U)/ P__/ C degra.-7 dou-se 0 %; na presença de 1 x 10 M de 2-5A autêntico — 32 — o poli(U)/ P__/pCp degradou-se 100 %. Mediram-se os níveis latentes de RNase L por dois métodos: (i) em análi ses de radioligação após adição de 20 000 dpm de p^A^L ³²p_7pcp a extractos de CMSP (50 jug de proteína/análise) (coluna 3) e (ii) em análises de cisão de ARN ribosso mal na presença de 2-5A (coluna 4). Incubaram-se extrac tos (150 pg de proteína/análise) preparados a partir de células L929 na presença de 5 iil de fracções solúveis em • · s etanol de extractos de CMSP e de 1 x 10 M de P^A^ num - 19 -

volume final de 20 yul para 60 minutos a 30°C. Extraiu-se o ARN total, desnaturou-se e analisou-se por electroforese em geis de agarose a 1,8 %. Visualizaram-se as bandas de ARN coradas por brometo de etídio sob luz ultra violeta. Determinaram-se os níveis de RNase L activada (coluna 5) por análise de cisão ribossomal na ausência de 2-5A adicionado.

As concentrações de 2-5A funcional em extractos de CMSP variavam de 0,3 a 1,1 nmole/g de proteína para indivíduos saudáveis e desde níveis inf£ riores ao limiar detectável até 0,6 nmole/g de proteína em extractos de CMSP de pacientes infectados por vírus an tes do tratamento com ARNdc desemparelhado (Quadro 1, coluna 2). No entanto, ο 2-5A acumulou-se até um nível su perior a 10,0 nmole/g de proteína à medida que o tratamen to com ARNdc desemparelhado prosseguiu. Anteriormente já foi relatado que a RNase L purificada activada por 2-5A cinde preferencialmente poli(U) mas não poli(C). 0

2-5A humano isolado, como ο 2-5A autêntico, pode activar a RNase L purificada por afinidade obtida de células L929 ou de CMSP de indiúiduos saudáveis de forma a que esta en zima activada possa degradar especificamente poli(U); ver Quadro 4. é importante notar que quando se usa ATC para extrair 2-5A de CMSP, se extraiu uma actividade de degradação de poli(C) além da actividade de degradação de poli (U) (RNase L). Esta actividade de degradação de poli(C) extractável por ATC pode ser eliminada por digestão por proteases ou por nova extracção por etanol. Detectou-se uma actividade de degradação de poli(C) em fracções de CMSP solúveis em ATC de todos os seres humanos mas não nas linhas de células permanentes (isto é, Hela L929 e HL929) experimentadas até agora. A actividade de degradação de poli(C) não era detectável em qualquer das fracções solúveis em etanol de CMSP.

QUADRO 3

Efeito de ARNdc na Formação do Centro Infeccioso por

Células CCL 25 Infectadas pelo Vírus Sincitial Respiratório

Concentração de ARNdc desempare lhadoa	Centros	Inf ecciosos^*	Percentagem
Contage	m de	placas	Contagens médias	de redução
0 ^ig/ml	49/ 44/	jií 15 ,	. 33	42,0
0,5 pg/ml	38, 36,	26,	16*	33,3	21,7
1,0 /ig/ml	54 f 44/	42,	53	48,5	15,5
2,5 ^ig/ml	37, 32,	24,	30	30,8	26,7
5,0 jug/ml	27, 14,	17,	18	19,0	54,8
10,0 pg/ml	1/ 1/	7, 5		3,5	91,7
2 5,0 jug/ml	0, 2,	0, 0		0, 5	98,8

Dados não usados para o calculo das contagens médias.

nao (a)

CCL

A concentração máxima de ARNdc /f’rI.r(C^fU)_n, 2 5 yug/ml__/ era tóxica para células CCL 25.

Realimentaram-se alvéolos em quadruplicado de células 25 confluentes em placas de 24 alvéolos com 1,5 ml de meio de manutenção contendo ARNdc às concentrações indica das anteriormente 1 hora antes de inocular nas placas células infectadas por RSV, Realimentaram-se células de tratamento em branco com meio de manutenção isento de ARNdc.

(k) Infectaram-se 4 x 10^ células CCL 25 em suspensão num volume total de 1 ml contendo 5 x 10^ UPE de RSV (MDI = =12). A absorção virai ocorreu durante uma incubação de 2 horas a 37°C com ressuspensão intermitente das células, No fim deste período, a suspensão foi diluida de 1/100 em meio de manutenção. Adicionaram-se 0,5 volumes

- 21 de meio de manutenção aos alvéolos das células de compara ção. Incubaram-se todas as culturas a 37°C em 5 % de C0₂ e 95 % de ar durante 72 horas, fixaram-se com metanol e coraram-se com Giemsa. Contaram-se as placas (centros de infecção) microscopicamente.

mdi refere-se a multiplicidade de infecções; isto é, o número aproximado de partículas virais disponíveis para infectar cada célula visada. UPE refere-se a unidades de formação de placas; isto é, o número de unidades virai determinado por contagem da citopatia (células mortas).

Se bem que vários autores tenham relatado a presença de 2-5A em tecidos isolados a partir de animais não tratados bem como a acumulação de 2-5A em tecidos de ratos tratados com ARNdc, pertence-me o primei ro relato da acumulação de 2-5A num tecido humano. Está já provado que ο 2-5A autêntico se liga à RNase L e que activa esta enzima para a tornar capaz de degradar ARNr a produtos de cisão específica (PCE) altamente caracterís, ticos. por conseguinte, eu caracterizei a actividade de

2-5A isolado de extractos de CMSP em ensaios de cisão de ARNr. 0 padrão de cisão específica gerado por RNase L com 2-5A extraído com etanol foi idêntico ao obtido nã presença de 2-5A autêntico. Estes resultados mostram que a administração i.v. de ARNdc desemparelhado a pacien tes infectados por vírus causaram aumentos drásticos do

2-5A nas células sanguíneas, com início em concentrações que estavam abaixo do limiar de detecção.

Actividade de RNase L

A ausência de actividade de RNase L em indivíduos infectados por HIV foi confirmada e ampliada (Quadro 1, colunas 3, 4 e b) . Uma técnica simples baseada na especificidade da cisão de ARNr por RNase L activada por 2-5A (Wresschner et al., Nucleic Acids Rês.

vol. 9, pp. 1571-1581, 1981) permitiu a medida de RNase L activada em extractos de CMSP isoladas a partir de quantidades tão pequenas como um ml de sangue periférico. Utilizaram-se para origem dos ribossomas extractos de um subclone deficiente em RNase L da linha de células L929 (HL929). Os extractos de CMSP de pacientes infectados com HIV tinham níveis 5 a 7 vezes mais baixos de RNase L latente do que os de indíviduos saudáveis por determinação em análises de radioligação (quadro 1, coluna 3; 240-280 dpm em comparação com 1350 dpm). Foram relatadas observa ções semelhantes por Viu et al. (AIDS Research, vol. 2, pp. 127-131, 1986). A aplicação da análise de radioligação é limitada no que se refere à determinação do nível latente de RNase L em pacientes tratados com ARNdc desemparelha do porque ο 2-5A acumulado presente em amostras de CMSP destes pacientes (Quadro 1, coluna 2) pode competir na ligação com a RNase L. Por conseguinte, a determinação do nível da RNase L activada por 2-5A era essencial.

Em primeiro lugar, determinaram-se os níveis de RNase L activada por medida da cisão específi ca de ARNr por extractos de CMSP na ausência de 2-5A adicionado exogenamente (Quadro 1, coluna 5). Por meio desta análise, eu demonstrei que a RNase L não era activada em extractos de CMSP de pacientes infectados por HIV antes da terapia (geis de poliacrilaraida apresentados na Figura 3). Sabendo que os níveis de 2-5A intracelular eram baixos nestas amostras de CMSP (Quadro 3, coluna 2), este resultado não era inesperado. No entanto, extractos de CMSP de todos os indíviduos saudáveis experimentados mostraram a presença de RNase L activada que produziu produtos de cisão específica em ensaios de cisão de ARNr, mesmo sendo o nível de 2-5A em alguns indivíduos saudáveis tão baixo como 0,3 nmole/g de proteína (Quadro 3, coluna 5) . É significativo que a ausência de RNase L em amostras de pacientes infectados com HIV antes da terapia não pode ser devida a acumulação de um inibidor competitivo de

2-5A conforme descrito (Caylet et al. Buropean J, Bioch.,

vol. 143, PP. 165-177, 1984). Não foi possível restaurar a actividade de RNase L pela adição de 2-5A autêntica (Quadro 1, coluna 4),

Em seguida, determinaram-se os níveis de RNase L por duas medidas independentes. Deter— minou-se a actividade de RNase L latente em análises de cisão específica de RNAr, mas na presença de 2-5A adicionado (Quadro 3, coluna 4). Em amostras colhidas antes da terapia com ARNdc desemparelhado, não foi possível detectar qualquer actividade de RNase L em qualquer dos 5 pacientes examinados.

Usou-se a técnica de marcação por fotoafinidade com P₃A₄/ P_/pCp para determinar também se a RNase L estava ausente ou alterada em CMSP de pacien tes infectados por HIV. Por estudos de marcação por fotoafinidade anteriores identificou-se uma proteína de P.M. 80 000 com afinidade de ligação para p^A^/ P/pCp © de— terminou-se a actividade endorribonucleolítica específica de poli(U) como RNase L. Determinou-se a marcação por afinidade da RNase L presente em extractos de CMSP usando — 32 —

P₃A₄/ P_/pCp, Comparou-se a RNase L de extractos de CMSP (50 Jig de proteína) de um indivíduo normal com a de um paciente com ARC (paciente antes de terapia com ARNdc desemparelhado) ou marcaram-se por fotoafinidade extractos de células L929 (50 pg de proteína) após a adição de —32 —

P₃A₄/ P_/PCP (30 000 dpm, 3000 Ci/mmole) na ausência ou ·—Q na presença de p^A^ autêntico (1 x 10 M). Purificou-se RNase L a partir de extractos de um indivíduo normal (100 pg de proteína) em celulose nuclear 2-5A e marcou-se por fotoafinidade após a adição de p^A^/ P_/pCp (30 000 dpm, 3000 Ci/mmole). Após incubação a 0°C durante 90 minutos, transferiram-se as amostras para placas de depósito de porcelana geladas e fotolisaram-se durante 3 minutos, usando uma lâmpada Mineralight UVG-11 a 254 nm (Ultraviolet Products) a uma distância de 2 cm (1,0 J/m ). - 24 -

Determinaram-se as posições dos marcadores proteicos e da RNase L de P.M. 80 000.

Os meus estudos de fotomarcação — 32 — revelaram que a p^A^ P_/pCp se encontrava ligada por uma ligação covalente a uma proteína com um P.M. de 80 00C em extractos de CMSP de indivíduos saudáveis (dados de gei de poliacrilamida não apresentados). No entanto, não foi marcada qualquer proteína em extractos de CMSP de um paciente infectado por vírus de forma crónica. Em condições experimentais idênticas, uma proteína de P.M. 80 000 foi fotomarcada de forma específica em extractos celulares de

Q

L929. A adição de ρ^Α^ (1 x 10 M) a misturas de incubação contendo a p^A^/ P__/pCp de modo a evitar a fotomarcação proporcionou-se uma prova adicional de que a fotomarcação era altamente específica para a RNase L. Estudos de fotomarcação com a proteína purificada a partir de extractos de CMSP de um indivíduo saudável pelo método de celulose nuclear revelaram a ligação covalente a uma proteína de P.M. 80 000 que possuia a capacidade de degradar poli(U) mas não poli(A), poli(C) ou poli(G) na presença de 2-4A autêntica (Quadro 4) Tomados no seu conjunto, estes resultados confirmam que a proteína purificada a partir de CMSP de indivíduos saudáveis e fotomarcada por p_oA,/ p / pCp.

Após 4 a 17 semanas de terapia com ARNdc desemparelhado, detectou-se RNase L activada primeiramente em extractos de CMSP de todos os cinco pacientes com infecção crónica; às semanas 17 a 28 da terapia com ARNdc desemparelhado, á actividade de RNase L para todos os cinco pacientes era equivalente aos níveis de RNase L observados em indivíduos saudáveis (Quadro 1, coluna 5).

nível de RNase L activada mostrou uma correlação muito estreita com a concentração do 2-5A funcional isolado a partir das mesmas amostras (Quadro 1, por comparação com as colunas 2 e 5). á do maior interesse notar que o pa- 25 -

ciente N^s 1 manteve um nível de 2-5A intracelular elevado e uma RNase L completamente activada às 28 semanas, 3 semanas depois de se ter interrompido a‘terapia com ARNdc desemparelhado (Quadro 1, coluna 2 e 5).

As experiências descritas na presente memória descritiva mostram que cinco pacientes infec tados com HIV possuem um fenótipo molecular comum nas célu las mononucleares do sangue: níveis reduzidos de 2-5A e au sência de actividade de RNase L detectável. Os níveis de células mononucleares no sangue para os individuos saudáveis apresentaram um fenótipo diferente na circunstância de que os níveis de 2-5A eram superiores em média e de que a actividade de RNase L era facilmente detectável. Este fenótipo está mais de acordo com o que era de esperar de uma via de sintetase de 2-5A funcional/RNase L. Em indivíduos normais, é detectável o conjunto do estado estacionário de 2-5A; uma fracção apreciável deste 2-5A intracelular pode tornar-se estreitamente associada com a RNase L, activancio deste modo a RNase L. Nos procedimentos experimentais elucidados na presente memória descritiva estabelece-se claramente que em células mononucleares do san gue de pessoas infectadas por vírus de forma crónica, os níveis intracelulares de 2-5A situam-se abaixo do limiar de detecção e não existe RNase L activada de acordo com a determinação pela tecnologia disponível actualmente.

Em resumo, uma constatação importante para a presente invenção consiste no facto de que os defeitos na via da sintetase de 2-5A/RNase L foram inverti dos por meio da terapia com o ARNdc desemparelhado. Os meus resultados não são explicados simplesmente por meio dos níveis normais de RNase L sem a ocorrência de 2-5A, uma vez que a actividade de RNase L in vitro não foi restaurada por adição de 2-5A a extractos de CMSP. A proteí na RNase L deve estar ausente ou ser inbida, uma conclusão confirmada pela falta de ligação por um análogo de 2-5A

- 26 marcado por fotoafinidade. Nos pacientes tratados descritos na presente memória, os níveis de ARN de HIV em CMSP reduziram-se em 10 a 20 dias e o número de centros de infecção (co-cultura) de CMSP infectadas com HIV diminuiu mais lentamente. O aumento no 2-5A intracelular e na actividade de RNase L determinados neste caso seguiram de modo mais perfeito a'diminuição dos centros de infecção nestes pacientes. Os meus resultados mostram claramente que a via de sintetase de 2-5A/RNase L se torna mais activa em pacientes infectados por HIV-tratados do que em indivíduos saudáveis após várias semanas com ARNdc desemparelhado. Os meus resultados são deste modo completamente concordantes com a hipótese de que certas infecções virais crónicas representam um estado de deficiên cia em ARNdc que pode ser invertido pelo fornecimento de uma origem exógena de ARNdc bioactivo.

A presente invenção é mais completamente descrita por referência aos seguintes exemplos ilustrativos nos quais as partes e as percentagens são em peso sempre que nada em contrário seja indicado.

EXEMPLO 1 - Tratamentos coordenados com IFN e ARNdc

Num estado de deficiência em ARN dc as células tumorais tratadas com IFN não mostram qualquer paragem no crescimento induzida por IFN ou mostram-na apenas em reduzido grau. Esta circunstância permite um modo de detecção funcional e operacional da deficiência de ARNdc que pode ser confirmado rigorosamente se necessário por várias mediçdes bioquímicas descritas seguidamente. Em muitos casos, será suficiente um diagnóstico clinico de uma deficiência em ARNdc à medida que a minha invenção se tornar mais amplamentê praticada. Sabe-se que as células tumorais IFNr são raramente deficientes em receptores de IFN e qúe podem conter níveis altos ou baixos de mediadores, mas em qualquer caso eu verifiquei que estas células respondem ao ARNdc fornecido por

via exógena. Estes exemplos são de grande importância clínica uma vez que indicam que o ARNdc expanderá de modo consequente o domínio terapêutico do IFN em particular e também de outras linfoquinas, por exemplo da IL-2, de vários factores de estimulação de colónias e do TFN. A leucemia mielogénica crónica (LMC) é um caso importante. Cerca de 60 % dos doentes com LMC respondem à terapia com IFN isolado, enquanto que 40 % não respondem. Estes últimos não induzem sintetase de 2-5A nas células mononucleares do sangue (CMN), conforme descrito por Rosenblum et al. em Câncer Res., vol. 46, p. 4848, (1986). A Figura 2-A apresenta um caso de resistência ao IFN que eu tratei com ARNdc desemparelhado e com IFN após um curto pe ríodo (7 dias) de IFN isolado e seguidãmente com ARN desemparelhado em combinação com IFN. Este paciente não induziu qualquer actividade de sintetase de 2-5A enquanto era tratado com IFN isolado mas apresentou um aumento subs tâncial na actividade deste mediador com a combinação de IFN com ARNdc desemparelhado. A indução de sintetase de 2-5A foi acompanhada por remissão hematológica completa que durou vários meses após um aumento transitório no núme ro de células sanguíneas causado pela interrupção da quimioterapia anterior. A actividade de RNase L foi também medida e verificou-se que era 10 a 100 vezes superior ao normal (Figura 3A, pista 1) dando produtos de cisão de ARN in vitro que representavam uma degradação adicional para além dos produtos normais de cisão de ARNr pela RNase L normal. A actividade de RNase L voltou aos níveis e aos perfis de cisão normais após 30 dias de terapia com a combinação IFN/ARNdc (Figura 3A, pista 2). Faço notar que esta espécie de resposta foi observada de um modo regular.

EXEMPLO 2 - Infecção virai de células T4

Outro estado de deficiência em ARNdc é um estado em que o próprio vírus animal (ou os seus intermediários de replicação) fornecem um ARNdc de inibição ou um ARNdc parcialmente bioactivo para as activações por mediador, mesmo que o IPN e os seus mediadores sejam induzidos por infecções virais. Muitos vírus asso ciados com sintomatologia crónica no hospedeiro pertencem a esta categoria, A infecção das células T4 pelo HIV po de também constituir uma situação destas, conforme é'suge rido pela Pigura 1. A replicação de HIV em células T4 foi bloqueada de modo eficaz pelo ARNdc em culturas de tecidos (ver a publicação do meu pedido de Patente Europeia N2. 0 213 921) apesar do facto de a replicação de HIV nestas mesmas células ser apenas moderadamente reduzi da pelo IFN alfa, beta ou gama isoladamente ou em misturas fisiológicas. Uma vez que o próprio ARN do HIV apre senta uma estrutura secundária considerável que não bloqueia a sua própria expressão, ARNdc’s diferentes provavelmente provocam respostas biológicas diferentes. Uma região de estrutura de ARNdc extensa na extremidade 5’ do ARNm do HIV liga-se a um polipeptídeo de P.M, 15 000 suspeito de ser a proteína de transacção de HIV (tat) (Muesing et al., Cell, vol. 48, p. 691, 1987) e eu sugiro que o ARNdc desemparelhado pode competir com o ARN do HIV para a proteína tat. A propriedade de suportar uma' eficaz infecção por HIV bem como outras viremias crónicas pode ser um segundo estado de deficiência de ARNdc no ARC e na SIDA.

EXEMPLO 3 - Células infectadas por HIV

Observa-se nos linfócitos do sangue de indivíduos com infecções virais crónicas como por exemplo HIV no ARC e na SIDA uma terceira espécie de defi ciência em ARNdc. Preblé et al. (J. Infect. Pis,, vol. 152, 1985) descreveram que estas células possuem níveis elevados de sintetase de 2-5A dependente de ARNdc, uma verificação que eu confirmei. Este resultado era típico de uma série de pacientes com ARC e com SIDA consecutivos que eu estudei e ajuda a formar a base da minha invenção

- 29 no que se refere ao papel central do ARNdc na recuperação do hospedeiro e à necessidade de substituir as condições de deficiência dé ARNdc por uma origem apropriada de ARNdc exógeno.

Eu descrevi que a RNase L se encontra esgotada em pacientes com ARC e com SIDA (6 de Junho de 1987, The Lancet); no entanto eu descrevi que a RNase L pode voltar à actividade normal após várias semanas de terapia com ARNdc desemparelhado em certos casos Conforme sugere a Figura 3B na pista 4, extractos de linfócitos com ARC podem apresentar a actividade de RNase L normal em certas condições. Uma vez que os extractos solúveis em ácido tricloroacético (ATC) e em etanol não apresentavam actividade inibidora, a inibição transferível observada nas CMN em doentes com ARC não pode ser a inibição descrita por Williams et al. em células infectadas com herpes (Virology, vol. 151, p. 233, 1986). Eu observei também de forma regular a ausência de inibição em extractos de CMN de indivíduos saudáveis (Pista 5) estudados até agora.

Uma vez que o ARNdc desemparelhado actua directamente sobre estas células, as células de vem ser também deficientes em ARNdc. Deste modo, eu mos, trei que diferentes ARNdc·s têm bioactividades diferentes (sendo o ARNdc do HIV inibidor enquanto que o ARNdc desem parelhado não o é). Verifica-se que os linfócitos de pa cientes com ARC e com SIDA são deficientes em ARNdc no sentido de que apenas são executadas algumas das funções dependentes de ARNdc necessárias. Pelo menos uma função a manutenção de níveis suficientes de RNase L bioactiva, não é executada a menos que de adicione ARNdc exógeno.

EXEMPLO 4 - Síndrome da Fadiga Crónica

Um exemplo de uma deficiência de ARNdc que necessita de uma terapia de substituição apro-

priada é a Síndrome da Fadiga Crónica (SFC), uma condição que afecta cerca de 10 a 12 milhões de americanos, uma afecção difícil de diagnosticar e que apresenta múltiplos efeitos caracterizada por fadiga extrema, aumento dos gânglios linfáticos e sintomas constitucionais como por exemplo perda de peso, perda de apetite e outros. Esta afecção ocorre principalmente em pessoas jovens e activas. Uma vez que alguns pacientes com SFC manifestam alterações neuropsiquiátricas, como depressão, perda de memória e alterações do mesmo tipo, o síndrome da fadiga crónica é por vezes difícil de distinguir de afecções inteiramente neurológicas, particularmente de depressão. Vários estudos laboratoriais indicam que muitos vírus diferentes podem replicar-se em indivíduos com o síndrome da fadiga cró nica e que estes indivíduos se tornam, com efeito, vivei ros de vírus. Nestes indivíduos estão com frequência presentes vírus como o vírus de Epstein-Barr, o citomegalovírus, retrovírus, vírus de herpes, etc..

A concentração in vivo de moléculas de 2'-5’A, uma medição precisa por via bioquímica dos níveis intracelulares de ARNdc, em individuos normais e em pacientes com o síndrome da fadiga crónica, é determina da como se segue: analisaram-se fracções solúveis em etanol de amostras de pacientes (linfócitos de sangue periférico purificados com Ficoll-Hypaque) para determinação do respectivo conteúdo em 2'-5'A por meio de uma técnica em celulose com núcleo de 2’-5'A (cromatografia de afinidade) com poli U-j«.pCp. Nesta análise utiliza-se a capacidade da RNase L activada por 2’-5’A para hidrolisar poli(U) a fim de determinar a concentração de 2'-5Ά funcional.

Os valores de referência foram estabelecidos por experiências com 15 indivíduos normais sem qualquer história recente de infecções virais conforme ava liação pela ausência de febre, ausência de sintomas consti

tucionais, de enxantema, etc.. As concentrações dos níveis de 2'-5*A nos linfócitos foram determinadas usando curvas de calibração obtidas com moléculas de 2'-5’A autên ticas. Os valores de referência dos indivíduos normais expressos em nanomoles de 2'-5·A situam-se numa gama de 0,3 a 1,1 nanomoles por grama de células CMSP.

Utilizando este método de determinação, analisaram-se dez pacientes que apresentavam os sintomas habituais da síndrome da Fadiga Crónica, sendo os seguintes os resultados obtidos:

QUADRO 2

Número do índividuo n moles de 2'—5'A por grama de proteína dos linfócitos <0,08 < 0,05 <0,05 <0,05 nd^ nd* <0,01 <0,01 <0,01 <0,08 *

nao detectável

Os pacientes com a Síndrome da Fadiga Crónica apresentam em geral de 2’-5’A inferiores a

- 32 0,1 nmoles e sempre inferiores a 0,2 nmoles por grama de proteína de linfócitos. 0 tratamento definitivo destes indivíduos com a síndrome da Fadiga Crónica é proporciona do, conforme necessário, até que o nível intracelular de oligonucleótidos 2*-5'A atinja o normal indicando o regres so do nível intracelular de ARNdc à normalidade e/ou reduza a sintomatologia clínica do paciente, A resistência do paciente à síndrome da Fadiga Crónica e aos vírus oportunistas é mantida pela continuação da medição dos niveis de oligonucleótidos 2'-5'A intracelular e pelo fornecimento de ARNdc exógeno, conforme necessário, a fim de manter o nível de 2'-5'A nos valores normais, normalmente em níveis superiores a 0,2 nanomoles de 2'-5'A por grama de prc teína dos linfócitos.

Os ARNdc·s naturais desempenham um papel na defesa do hospedeiro quando ameaçado por uma doença virai comop por exemplo a Síndrome da Fadiga Crónica. Uma redução específica no ARNdc bioactivo ou nas enzimas que dependem de ARNdc, principalmente um inibidor de RNase L associado a vírus acoplado com níveis anormalmente baixos de 2'-5'A em linfócitos de sangue periférico no interior de células específicas, contribui para a progressão da doença. Os ARNdc’s, principalmente os ARNdc* *s desemparelhados, invertem a progressão da doença.

Os pacientes com a Síndrome da Fadiga Crónica são tratados com perfusões intravenosas de 200 a 600 mg (em dependência das doenças e da carga virai, etc.) de rl.r(C^^_^₄,U) duas vezes por semana e os níveis de 1-’5’A aumentam em associação com as melhorias clínicas A quantidade de ARNdc administrado e a frequência da admi nistração serão guiadas pelos níveis de 2'-5’A medidos em conjunção com as melhorias clínicas do paciente. As quar tidades de ARNdc administradas proporcionarão um nível de 0,01 a 1000 microgramas de ARNdc por mililitro da circulação do sangue sistémico do paciente imediatamenè a seguir

à administração medida num ponto distai em relação ao pon to da perfusão.

EXEMPLO 5 - Efeito antiviral sobre as Populações de células T4

Os ARNdc*s, em particular os ARNdc' ’s desemparelhados, administrados por via exógena, restau ram a capacidade do paciente infectado com vírus para res ponder à ameaça virai. Como ilustração de uma condição virai, seleccionou-se HIV como um dos mais prejudiciais.

alvo primário de uma infecção por HIV são os linfócitos T4 e a sua população é drasticamente reduzida à medida que a infecção virai prossegue. Para além disso, 'a redução da população de células T4 é um parâmetro da doença não desejável e quantificável que reflecte um agravamento da doença. De modo correspondente, um aumento da população de células T4 é uma indicação de diagnóstico favorável indicando uma melhoria na intervenção terapêutica.

A população normal de células T4 para um indivíduo saudável é de 400 células por milímetro cúbico de sangue. Analisaram-se 39 pacientes (ver figura 4) com um diagnóstico de estarem na categoria de pré-ARC ou de ARC e dividiram-se em três categorias com base q

no número absoluto de células T4 por mm de sangue: (a) superior a 300 (18 pacientes, dados não apresentados);

(b) 150 a 300 (13 pacientes); e (c) menos de 150 (8 pacien tes, média = 92). Os pacientes nos grupos (b) e (c) fo( Rl ram tratados com 100 a 200 mg de ri . (Ο^,υ) (Ampligen' ' duas vezes por semana por perfusão IV durante 3 a 16 meses (média = 8,4 meses). Para efeitos de comparação, os dados da população de células T4 de pacientes infectados por HIV não tratados (181) estão incluídos (triângulos ligados) a fim de mostrar a redução que seria de outro mo do inevitável da população de células T4 nestes indivíduos ·

A linha de base é a concentração absoluta inicial de linfócitos T4 antes do início da terapia. A melhoria é expressa em termos de alteração em per centagem, positiva ou negativa, a partir desta linha de base conforme se mostra graficamente na Figura 4. 0bservaram-se os pacientes no início e mediu-se a concentra ção de células T4. o grupo (b) de pacientes, representados na Figura 4 pela linha que liga os círculos vazios, tinha concentrações de células T4 na gama de 150 a 300 células/mm . Estes pacientes receberam inicialmente 100 mg de Ampligen (IV, duas vezes por semana) como medida de precaução e foram observados para detecção de reacções adversas, aumentando-se em seguida a dose até 200 mg administrados com a mesma frequência. A um segundo grupo de pacientes (c) cuja concentração de células T4 era inferio a 150 células/mm administraram-se 300 mg de Ampligen (IV, duas vezes por semana). A alteração em percentagem a partir da linha de base é apresentada pela linha que liga os círculos a cheio. Os pacientes não tratados (1-81), com linfócitos T4 absolutos, continuaram com uma redução rápida conforme se representa através da linha que liga os triângulos.

número médio de células T4 aumentou 4,3 % depois de 4 meses em 30 pacientes. 8,0 % após 8 meses em 10 pacientes e 17 % após 12 meses em 6 pacientes, Apenas 2 pacientes (linha de base média = 82 células) evoluíram até à SIDA quando estavam recebendo uma terapia contínua de rl_n>(C^₂,U)_n e um outro paciente com ARC que interrompeu a terapia durante 2 meses desenvolveu um sarcoma de Kaposi.

Estes dados demonstram que indiví duos infectados cujos níveis absolutos de linfócitos T4 3 são inferiores a 150 células/mm necessitam de quantidades significativas do produto à fim de retardar a velocida de de redução das células T4; ho entanto, os pacientes na

gama de 150 a 300 são mantidos de modo eficaz com níveis de dosagem inferiores. Estes dados também revelam a importância de se iniciar a terapia antes de um agravamento drástico do estado do paciente com HIV.

Estes dados demonstram ainda a relação directa entre a grandeza do déficit de ARNdc (avalia do indirectamente mas com precisão por meio da população absoluta de células T4) e a quantidade de ARNdc exógeno necessária para corrigir a deficiência e para restaurar a saúde integral do paciente (sob a forma de uma restauração da população das células T4 até valores próximos dos que se verificam em indivíduos não infectados ou menos gravemente infectados) — quanto maior o déficit de células T4, tanto maior a quantidade de ARNdc necessária para restaurar o estado normal.

EXEMPLO 6

Terapia de Substituição de ARNdc em infecções

E££

Outro exemplo de uma deficiência transitória de ARNdc que necessita de uma terapia de subs_ tituição apropriada pode ocorrer em várias fases durante a vida neonatal e juvenil quando o sistema imune do corpo ainda não se desenvolveu completamente. Nestes casos, podem ocorrer infecções potencialmente perigosas para a vida que noutros casos seriam apenas infecções auto-limitadas da adolescência ou da idade adulta. Um exemplo es_ pecífico é constituido pelos membros da família dos paramyxovírus, como por exemplo o vírus sincital resperatório (VSR) que pode causar uma bronquiolite aguda em crianças (normalmente entre os 6 e os 18 meses de idade) com os respectivos sistemas imunes de defesa antiviral intriásicos ainda não completamente desenvolvidos. Nestes casos, eu demonstro em seguida que a terapia de substituição com /~Γΐ_η.Γ(Ο₁₂,υ)_η__7 pode ser crucial e fazer abortar uma doença que de outor modo poderia ser letal*

)

A fim âe desenvolver esta nova perspectiva, cultivei uma linha de células derivada do âmnio designada por CCL 25 em condições normais de laboratório. As células CCL 25 (obtidas a partir da American Type Culture Collection, Rockville, Maryland, EUA) suportam o crescimento e a replicação do VSR de um modo análogo ao dos tecidos dos bronquíolos neonatais humanos. 0 quadro que se segue mostra de modo conclusivo que eu fui capaz de reduzir a multiplicação de VSR em aproximadamente 99 % usando doses de ARNdc que são bem toleradas por humanos, conforme eu demonstrei independentemente.

QUADRO 4

Actividade de 2-5A e de RNase L isolados a partir de

CMSP de individuos com homopòlirribonucleótidos

Origem da RNase L

CMSP % de degradação'

Células L929 % de.degradação'

Poli(U)- Poli(C)/“³²p/_pcp Z”³²p/pcp

Poli(U)- Poli (O/³²p7pcp zT³²ê7pc»

2-5A autêntico

2—5A isolado a partir de CMSP ^a média de 3 determinações independentes; desvio padrão

%.

- 37 Métodos

Incubou-se RNase L, purificada a partir de extractos (100 pg de proteína) de

CMSP de um indivíduo saudável ou de células L929, sob con —32 —~ diçdes de celulose nuclear na presença de poli(U)^ p__/—32 — pCp (11000 dpm, 0,10 pCi/mmole) ou de poli(C)^ P_/pCp (12400 dpm, 0,33 jiCi/nmole) após a adição de 2-5A autênti co (ρ^Α^, 5 x 1O~⁷ M) ou de 2-5A isolado a partir de um extracto (12,5 pg de proteína) de CMSP do paciente NS. 5 (a 9 semanas da terapia com ARNdc desemparelhado). 0 poli(U)^ P__/pCp e o poli(C)^ P_/pCp foram sintetiza~ “ —32 dos a partir de poli(U) ou de poli(C) (Sigma) e de pCp (Amersham) por meio de ligase T4 (Bethesda Research Laboratories). Em experiências de comparação (na ausência de p_oA~) foram retidos em filtros de fibra de vidro ^{3 3} -32 - -29 4

300 dpm de poli (U) P__/pCp e 11000 dpm de poliíC),/ ^zp/ pCp e estes valores são utilizados para referência como ausência (0 %) de degradação.

Uma vez que se encontra estabelecido que a formação de centros infecciosos induzida por VSR implica a disseminação directa do vírus de célula para célula, eu determinei agora que simplesmente por aumento de concentração intracelular do ARNdc eu pude reduzir de modo eficaz a disseminação de célula para célula do VSR sem efeitos inconvenientes sobre outros tecidos do corpo.

Deste modo, a patologia de doenças causadas por outros agentes patogénicos potencialmente auto-limitados como por exemplo o VSR (da família dos paramyxovírus) bem como por outros vírus que produzem ARN que afectam a árvore nasal/traqueal/brônquica, tais como os rinovírus ou o vírus da gripe, pode ser limitada de modo eficaz por um mecanismo de terapia de substituição de ARNdc. Os locais de entrada de agentes patogénicos, como por exemplo (mas sem limitaçaõ a estes locais) as vias aéreas, podem ter de modo intrínseco ou temporariamente um conteúdo de ARNdc mais baixo (definindo-se neste contexto ARNdc como qualquer das moléculas que desencadeiam as cas38 catas de defesa imune/antiviral importantes para contrariar a patologia induzida pela reprodução ou pelos tecidos de agentes patogénicos).

EXEMPLO 7 - Tratamento da Hepatite

Têm aparecido na literatura nos últimos 2 ou 3 anos numerosos artigos de revisão sobre doenças no fígado em pacientes com SIDA, 0 tema recorrente é um amplo conjunto de descobertas histológicas tanto em espécimens de biópsia dirigida por agulha como em biópsia por ocasião de autópsia. Em todos os estudos seguidamente mencionados foi dada satisfação aos critérios para o diagnóstico da SIDA do U.S. Center for Disease Control, Atlanta, Georgia, EUA. Os sintomas e os sinais que normalmente se apresentam nos pacientes que se verificou possuírem uma doença hepática grave são completamente não específicos e incluem perda de peso, febre, linfadenopatia, hepatoesplenomegalia e dores abdominais. As transaminases no soro são normalmente elevadas na maioria dos pacien tes de SIDA. Existe uma propensão para as fosfatases alcalinas elevadas serem desproporcionadamente altas; fõi sugerido que estas elevações da fosfatase alcalina estão relacionadas com um diagnóstico histológico de doença de granulomato.se. Estudos baseados em autópsias feitos em pacientes não seleccionados (isto é, selecção de pacientes não enviezada em oposição aos estudos de biópsia em pacien tes com hepatomegalia e ensaios de função do fígado elevada) demonstraram a ocorrência universal de uma gama ampla de patologia intra-hepática. Aproximadamente 80 a 90 % de todos os casos de autópsias de pacientes com SIDA demonstraram a ocorrência de uma anatomia anormal do fígado. As modificações hepáticas encontradas incluem congestão vascular, inflamação portal, esteatose, necrose focal, gra nulomatose, estease biliar, cirrose e hiperplasia das células de Kupffer (por ordem de frequência aproximada) é de interesse notar que o diagnóstico intra-hepático do Sarco39

ma de Kaposi na autópsia era o estado patogénico intra-he pático específico mais comum (18 %) num estudo (Schneider man et al., Annals Internai Med., Vol. 105, pg. 207, 1987).

Recentemente foi descrita doença biliar num pequeno número de doentes de SIDA. Relatórios de casos isolados descreveram colangite esclerosante, lesões do tracto biliar destrutivas intra-hepáticas e obs. trução biliar extra-hepática benigna em pacientes com SIDA Nao foi documentado nestes casos qualquer agente etiológi co específico; o citomegalovírus tem sido implicado como uma causa secundária possível das observações histopatoló gicas na biópsia. Em doentes com SIDA com obstrução biliar extra-hepática benigna as queixas mais frequentes in cluem dor no quadrante superior direito do fígado e eleva ções moderadas da bilirrubina. Na autópsia ou na lapara tomia foi feito um diagnóstico de ampolas de água de estrutura secundária a fibrose. Pelo menos em dois casos de obstrução extra-hepática, isolou-se criptosporídia a partir da árvore biliar. Outros casos incluem corpos de inclusão de citomegalovírus na vizinhança das ampolas de água. Como nos casos anteriores de colangite intra-hepá tica, é desconhecida uma etiologia específica e os estados patogénicos podem ter apenas um papel casual na patogénese destas afecções.

Eu determinei que uma perfusão de ARNdc /rl.r (C_q „,U) , 200 mg, duas vezes por semana, IV__/ corrige também ou melhora de modo significativo a anormalidade celular subjacente associada com a multiplicação do vírus da hepatite B (VHB). A fim de levar a efeito este objectivo utilizou-se o método seguinte:

Avaliação de Soro e de Plasma para ADN específico de VHB: Determinou-se por meio de hibridação de fenda-mancha a presença de ADN de VHB associado a soro (ou a plasma), um

indicador da presença do vírus da hepatite B. Diluíram-se as amostras de soro em NH^OAc até uma concentração final do sal de 1 M. Usando um aparelho de microfiltração de 72 membranas (Scleicher & Schuell, Keene, N.H.) aplicaram-se as amostras directaménte a um filtro de nitrocelulose previamente mergulhado durante 10 minutos em NH^OAc 1 M. 0 ADN foi desnaturado in situ com um alcali e em seguida foi neutralisado. Analisaram-se diluições de ADN de VHB purificado em soro humano normal de modo idêntico a fim de quantificar cada hibridaçao de fenda-mancha. Os filtros foram aquecidos, pré-hibridados, hibridados e lavados sob condições altamente críticas e foram autorradiografados usando condições normais (Maniatis, T., Fritsch,

E.F. e Sambrook, J., Molecular Cloningj A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor,

1982) . 0 ADN sonda de VHB usado nas hibridações foi obtido a partir de um plasmídeo recombinante contendo uma única cópia de comprimento unitário de ADN de VHB (HBsAG serotipo adw2) clonado no local EcoRI. Digeriu-se o pias mídeo com EcoRI e purificou-se o ADN de VHB por 2 ciclos de electroforese em gel de agarose preparativa e por elec32 troeluição. Marcou-se o ADN de VHB purificado com p-dCTP até uma actividade específica de 1 a 2 x 10⁹ cpm/jig usando a técnica de marcação de iniciador aleatório (Feinberg, A.P. e Vogelstein, B., Analyt. Biochem., 132:6-13,

1983) . 0 nível de sensibilidade obtido com esta análise é de 1 pg de ADN de VHB. A este nível de sensibilidade eu detectei 2,9 x 10 moléculas de ADN de VHB.

As autorradiografias produzidas foram avaliadas no que se refere ao grau de intensidade relativa e foram ordenadas de acordo com a intensidade observada, sendo os valores obtidos apresentados no quadro que se apresenta em seguida. Os dias de terapia são dados por vià parentérica.

QUADRO 4

Efeito da Administração de ARNdc sobre a Redução da Concen

tração	de ADN de	VHB (vírus de hepatite B)	em Fluidos corpo
rais
	Paciente	NS. 1	,Paciente N2. 2	(Paciente	N2 3
Número de	(dia da	amostra-	(dia da amostra-	(dia da	amostra-
série	gem) Intensida-	gem) intensida-	gem) Intensida-
	de da mancha por	de da mancha	de da mancha
	terapia	P
T*	3+	(0)	3* (O)	3*	(0)
1	3+	(20)	3+ (21)	3+	(31)
2	3 +	(64)	2,5* (42)	3+	(72)
3	3 +	(106)	2* (56)	3*	(86)
4	2+	(162)	2+ (84)	3+	(.115)
5	2^	(219)	1,5* (140)	2*	(170)
6	2*	(266)	1 (180)	2+	(227)
7	1, 54·	(310)		1, 5*	(270)
8	1+	(353)		1, 5+	(296)
9	1+	(400)		1,5*	(324)
10	14*	(450)		1, 5+	(387)

+ refere-se à intensiLegenda; T^X = zero (pré-terapia), dace relativa da película de raios X exposta durante 5 di32 as a ADN virai contendo p. Os valores superiores com + (por exemplo 3+ em comparação com 1+) referem-se a resultados da análise por fenda-mancha mais intensos e maiores em películas de raios X indicando a presença de mais

ADN virai. A fim de aumentar a sensibilidade das medições virais, usaram-se várias diluições dos soros dos pacientes, normalmente diluições de 1:40, 1:200, 1:40 e 1: :1500, Estabeleceram-se resultados de confirmação com traçagens densitométricas das ansalises de fenda-mancha.

- 42 A metodologia £oi baseada em reagentes fornecidos por Schleicher und Schnell (materiais designados pelos números 370 2/284). Obtiveram-se resultados complementares com o kit de análise de antigenes específicos virais (aná lise imunológica para a detecção do antigene superficial da hepatite B em soro ou em plasma humano) fornecido por Abbott Laboratories (designado por prova técnica 83-0804/ /R12 com data de Julho de 1985),

A medida que a minha invenção se torne publicamente conhecida e que seja mais desenvolvida e aplicada a outras condições/infecções/afecções, pode bem tornar-se possível fazer um diagnóstico clínico da de ficiência de ARNdc sem necessidade de resultados de laboratório laboriosos e talvez mesmo da revisão cientifica e da novidade que eu desenvolvi na presente memória descritiva. Podem também existir muitos estados de deficiência em ARNdc menos óbvios. Por exemplo, uma vez que o IFN actua naturalmente como um inibidor retroactivo das vias de proliferação (Aullo et al., Cell, Vol. 43, pg. 793, 1985), e uma vez que os mediadores dependentes de ARNdc contribuem para estes acontecimentos, as células que sofrem diferenciação ou com potencial tumorigénico/rms tastático podem ser deficientes em ARNdc.

A partir dos exemplos anteriormente mencionados, torna-se evidente que por interrelação de funções biológicas (por exemplo, a presposta celular a IFN exógeno) ou de funções bioquímicas (por exemplo, sin— tetase de 2-5A elevada) ou a presença de intermediários da via de 2’-5¹A-oligoadenilato, eu posso facilmente diagnosticar estados de deficiência em ARNdc e quantificar o grau de afecção por vários meios, incluindo:

(a) Determinação de concentrações de 2¹-5¹A-oligoadenilato endógeno.

(b) Análise quantitativa da concen tração de 2-5A e da dimensão molecular do 2-5A a partir de amostras de pacientes por meio da cromatografia líquida de alta pressão.

(c) Prova da funcionalidade biológica de 2-5A sintetizado in vivo em pacientes utilizando ensaios de cisão de ARN ribossomal.

(d) Análises de ligação com 2·-5·-p₃A₃|³²pj-3’-pCp a fim de determinar o nível de RNase L livre (sem ligação) em amostras de pacientes.

(e) Análises de celulose nuclear (cromatografia de afinidade) com poli U-|³²pj-pCp a fim de caracterizar a especificidade da activação da RNase L por 2—5A sintetizado em amostras de pacientes.

(f) Análises de cisão de ARN ribos somai a fim de determinar o nível de RNase activada por 2-5A sintetizado em amostras de pacientes.

Alguns destes métodos estão descri tos em pormenor nos meus pedidos de Patente intitulados Elaboração de Mediadores de Defesa do Hospedeiro em Fluidos Biológicos, Número de série 028 823 depositado em 12 de Agosto de 1987, e Correcção por ARN de Dupla Cadeia em Vias Metabólicas Aberrantes, Número de série 076 649, que se dão como reproduzidos na presente memória descritiva.

Podem também existir estados de suficiência de ARNdc, Por exemplo a LMC e a leucemia das células filamentosas (LCP) respondem frequentemente a IFN administrado como terapia única e reflectem situações intracelulares de suficiência natural de ARNdc. A fim de apoiar esta noção, eu encontrei níveis semelhantes de ARNdc activando a sintetase de 2-5A em núcleos de células san

guíneas mononucleares de pacientes não tratados com LCF e em núcleos de células Hela tratadas com IFN.

ARNdc desemparelhado. Se bem que muitos ARNdc's possam induzir várias linfoquinas, incluin do IFN, e activar a sintetase de 2-5A, nem todos os ARNdc' 's possuem estas propriedades. De entre os ARNdc's sintéticos, o poli(I)jpoli(C) é um excelente indutor de IFN e activador de sintetase de 2-5A mas é também muito tóxico. 0 ARNdc de fórmula poli (I) jpoli (C-, „ ,U), também desi f r) gnado como ARNdc desemparelhado ou Ampligen ¹ (HEM Research, Inc., Rockville, Marylahd, EUA) contém periodicamente resíduos de uracilo na cadeia de polipirimidina. O desemparelhado induz uma rápida biodegredação sem destruir a função biológica. Por exemplo o ARNdc poli(I) jpoli(Cl₂,U) apresenta actividade antiviral, antitumor e.de in tensificação imune e não é tóxico.

ARNdc como Terapia de Substituição em Terapia Virai de Largo Espectro e do Cancro. O ARNdc desemparelhado pode ser particularmente adequado para o tratamento de infecções virais crónicas incluindo o ARC porque é simultaneamente um antiviral de largo espectro e um intensificador imune; mesmo em altas doses não apresen ta essencialmente toxicidade de longo termo. Os meus resultados obtidos em 45 pacientes consecutivos tratados por via intravenosa com 200 a 250 mg de politl)jpoli(C^₂, U) duas vezes por semana mostraram uma redução rápida na concentração de vínus (HIV, CMV e de herpes) e uma melhoria rápida da imunidade das células T e B acompanhadas de uma melhoria do estado geral sem efeitos secundários significativos. Em muitos pacientes, a resposta clínica continua durante aproximadamente 18 meses ou durante todo o período em que recebem a terapia de ARNdc (100 a 400 mg duas vezes por semana). Em alguns casos são necessárias doses superiores ou com maior frequência de administração,, As infecções virais e as lesões imunes em pacientes com SIDA podem ser diferentes de indivíduo para indivíduo e

e não se pode esperar resolver todos os problemas clínicos com um único produto. No entanto, o ARNdc desempenha um papel central em vários regimes de tratamento. Por exem pio, uma vez que o ARNdc desemparelhado apresenta sinergia com A2T para o bloqueio da infecção com HIV das células T4 (ver o meu pedido de Patente pendente de despacho N^s. de série 028 823), um ARNdc e uma dose muito baixa de AZT pode ser uma combinação importante nas fases primárias da infecção incluindo ARC. Tanto o ARNdc como a IL-2 intensificam a actividade das células T, NK e LAK e déste modo eu mostrei que quando em combinação os dois produtos biológicos apresentavam sinergismo terapêutico sem adição de toxicidade. Para além disso, eu previ que, uma vez que os IFNs intensificam a diferenciação das células B e dos monócitos, certas linfoquinas podem aumentar a capaci dade do ARNdc para a promoção da neutralisação específica de anticorpos contra o HIV e aumentar a actividade destru idora dos monócitos. Dê modo análogl, uma vez que os retinoides aumentam o número de células T4 e promovem a diferenciação das células T e B com IFN, a combinação de ARNdc com retinoides pode proporcionar benefícios adicionais no ARC e na SIDA. As combinações de ARNdc com peptideos do timo pode também ter efeitos de restauração das células T4, especialmente em pacientes com um número de células T4 muito baixo. Por fim, o facto de que o ARNdc apresenta uma actividade antiproliferativa directa contra as células do sarcoma de Kaposi que pode ser aumentado por adição de IFN ou de IL-2 sugere um novo regime antitumor em estados avançados da doença. A análise de parâmetros das células sanguíneas na SIDA revelam problemas do SNC aumentados. Com este fim, o ARNdc atravessa a barreira do sangue no cérebro murino em qmntidades suficientes para activar a sintetase de 2’5’-adenilato nas células do parênquima do cérebro; deste'modo, combinações de ARNdc e de outros agentes incluindo linfoquinas que atravessam a barreira do sangue no cérebro serão úteis em demências relacionadas com vírus. Entende-se que as lin

foquinas incluem interferões, de preferência o interferão alfa, as interleuquinas, especificamente a interleuquina 2 (IL-2) e a interleuquina 2 recombinante (rIL-2), e o factor de necrose de tumores (TNF). Também se consideram incluídas as células destruidoras activadas por linfo quinas (lymphokine activated killer = LAK) formadas em animais como resposta à exposição a uma linfoquina.

Quando a linfoquina utilizada é o interferão (alfa), usa-se uma quantidade de 0,01 a 100 000 IRU por mililitro do fluido corporal do paciente. Quando a linfoquina é a IL-2, de preferência a rIL-2, a quan2 tidade administrada situa-se numa gama desde cerca de 10 unidades de IL-2 por Kg do peso corporal do paciente até um valor próximo de níveis de toxicidade inaceitáveis para o paciente, o que pode atingir um máximo de 10θ unidades. No entanto, os valores mais eficazes que permitem uma reacção tóxica admissível situam-se na gama de cerca de 10^ até cerca de 10⁴ de IL-2 por Kg de peso corporal.

As quantidades habituais de ARNdc administrado proporcionam um nível desde 0,1 a 1000 micro gramas de ARNdc por mililitro do fluido corporal do paciente. 0 termo fluido corporal refere-se à solução de soro, sais, vitaminas, etc., que circula nó interior do organismo e banha os tecidos. Quando os dois agentes (um ARNdc e uma linfoquina) são administrados podem sê-lo sob a forma duma mistura, administrados em separado mas simultaneamente ou em sequência.

A administração de um ARNdc e uma linfoquina em combinação inclui as apresentações nas quais os dois agentes são* administrados juntamente sob a forma de uma mistura terapêutica mas também os procedimen tos em que os dois agentes são administrados em separado mas simultaneamente.

........

A FIGURA 1 é ura diagrama de fluxo que indica uma deficiência típica de ARNdc que leva a uma morbilidade do hospedeiro e uma suficiência de ARNdc que leva a uma recuperação do hospedeiro. 0 ARNdc bioactrivo é produzido intracelularmente ou é introduzido por certos vírus (por exemplo por EMC) e desencadeia uma série de acontecimentos enzimáticos, incluindo a produção de linfo quinas e a activação de mediadores, o que conduz a um estado antiviral, bem como a uma diferenciação das células imunes e a uma recuperação do hospedeiro. 0 ARNdc intro duzido por vários vírus (por exemplo pelo HIV) ou por células tumorais pode subverter esta via actuando como um inibidor. Os acontecimentos fisiológicos podem limitar a produção de ARNdc ou causar a produção de ARNdc aberran te. Estas anomalias conduzem a infecções crónicas e a morbilidade do hospedeiro. Em infecções crónicas por HIV e por outros vírus a disfunção imune pode resultar de um inibidor da RNase L (apresentado como via alternativa) que é ultrapassada por um fornecimento de ARNdc exógeno configurado de modo apropriado.

AS FIGURAS 2A e 2B ilustram a inducção de sintetase de 2'5’-oligoadenilato por ARNdc desemparelhado em CMN de um paciente com LCM. Um paciente com LCM foi tratado com IFN isolado durante sete dias (Fig. 2A) e em seguida com ARNdc e IFN (Fig. 2B). A intervalos antes e durante o tratamento mediu-se a activida de de sintetase em CMN purificadas com Ficoll.

A FIGURA 3A é uma fotografia de placas de electroforese em gel de poliacrilamida que mostram o número indicado de pistas e bandas e zonas ao longo de cada pista. Ilustra-se nesta placa a elevada acti vidade de RNase L associada com novos produtos de cisão em CMN de um paciente com LCM, conforme ilustrado nesta placa. As células húngaras L929 que fornecem ARNr mas não RNase L encontram-se depositadas de acordo com os ter mos da Convenção de Budapeste na American Type Culture

Collection sob o número ATCC N^s. CRL 9659; As células L92Ç foram depositadas sob a forma de CCL 1 e de Cmn de pacientes com LCM e foram preparadas de acordo com Kariko e Ludwig e com Silverman et al., e em seguida mediu-se a RNase L das ChJN conforme descrito no meu pedido de Patente pendente de despacho com o número de série N². 074 649 depositado em 17 de Julho de 1987, cuja memória descritiva se dá aqui por reproduzida,

A FIGURA 3B é também uma fotografia de placas de electroforése em gel de poliacrilamida que mostram a presença de um factor de inibição de RNase L em extractos de CMSP de um paciente com ARC de acordo com uma análise de cisão de ARNdc. Prepararam-se extrac tos de células L929 (que fornecem tanto RNase L como ARNr) e de CMN de acordo com Kariko e Ludwig e com Silverman et al., respectivamente·

Pista 1: Incubaram-se 18 F¹ de um extracto de células L929 (150 pg de proteína total) na presença de 4 pl de tampão NP40 usado para lise das CMN mais 5,5 pl de água.

Pista 2; Idêntica à pista 1, excepto em que em vez de água se adicionaram às incubações 5,5 pl de P3A3 autêntico 5 x IO⁸ M.

Pista 3j Idêntica à pista 1, excepto em que se adicionaram antes da incubação'5,5 pl de extracto solúvel em ATC de extracto de CMN (100 pg de proteína total) de um paciente com ARC.

Pista 4? Incubaram-se 18 pl de extracto de células L929 com 4 pl de extracto de CMN de um paciente com ARC (100 pg de proteína total) e 5,5 pl de água.

Pista 5; Incubaram-se 18 pl de extracto de células L929 com 4 pl de extracto de CMN de um indivíduo saudável (100 pg de proteína total) e 5,5 pl de água. Estão indicados

os ARNr 28S e 18S bem como os níveis normais de produtos de cisão específicos de RNase L activada por 2'5’A.

Claims (1)

1. Processo para a determinação de um estado de deficiência em ARNdc num paciente caracterizado por se administrar por perfusão em primeiro lugar ao refe rido paciente uma quantidade de ARNdc sintético suficiente para simular a concentração expectável de ARNdc natural numa pessoa saudável e, em seguida, se determinar se se observarem quaisquer alterações positivas em qualquer das vias metabólicas mediadas por ARNdc ou em qualquer parâmetro do estado clínico como resultado da referida administração.

   - 2ã Processo para a preparação de uma composição farmacêutica útil para o tratamento de um esta do de deficiência em ARNdc num paciente caracterizado por se incorporar como princípio activo numa forma apropriada para administração por perfusão uma quantidade eficaz de ARNdc exógeno.

   - 33 Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o ARNdc administrado ser um ARNdc emparelhado.

   _ 4a _

   Processo de acordo com qualquer das reivindicações 1 ou 2 caracterizado por o ARNdc admi nistrado ser um ARNdc desemparelhado.

   - 5ã Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ARNdc desemparelhado ser um complexo de poliinosinato e policitidilato contendo entre 1 em 5 até 1 em 30 bases de uracilo ou de guanina,

   - 6s Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ARNdc desemparelhado ser ^rIn*^r(Cll-14⁾n·

   - 7s Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ARNdc desemparelhado conter regiões de quebra de ligações a apresentar a proprieda de de proporção terapêutica favorável de rI_n.r(C₁-^ 14)_n*

   - 8â Processo de acordo com a reivindicação 4, caracterizado por o ARNdc desemparelhado ser incorporado numa quantidade tal que tenha como resultado um nível de 1 a 1 000 microgramas de ARNdc por mililitro de fluido biológico primário do paciente e quantidades pro porcionais de substâncias mediadoras induzidas por ARNdc nos fluidos secundários ou compartimentalizados,

   - gs —

   Processo de acordo com a reivindicação 2, caracterizado por se incorporar uma linfoquina para além do ARNdc exógeno.

   A requerente declara que o primeiro pedido desta patente foi apresentado nos Estados Unidos da América em 4 de Setembro de 1987, sob o número de sério 07/093,523.