CN1431907A - 治疗丁型肝炎病毒感染的方法 - Google Patents

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Abstract

一种治疗宿主中丁型肝炎病毒感染的方法，包括施用有效数量的一种核苷或核苷类似物，或其前药或可药用盐，它们能在体内将宿主的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的表达降低到比治疗前低100倍或更多，或者不超过每毫升1微克。在一项优选实施方案中，该核苷是L－FMAU或其可药用盐或前药。

Description

治疗丁型肝炎病毒感染的方法
联邦资助说明
本发明受到美国卫生与人类服务部的部分资助，拨款号为NIHAI-35164、AI-33655、AI-05399、N01-AI-45197和N01-AI-82698。
发明领域
本发明属于治疗被丁型肝炎病毒(也称作“HDV”)感染的宿主的方法和组合物这一领域，包括施用有效数量能显著减小乙型肝炎表面抗原浓度的化合物，特别是核苷或核苷类似物。在一项非限制性实施方案中，核苷类似物是2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷(也称作“L-FMAU”)或其可药用盐或前药。
发明背景
丁型肝炎是最严重的病毒性肝炎，它是由丁型(δ)肝炎病毒(HDV)引起的，该病毒是乙型肝炎病毒(HBV)的卫星亚病毒(Smedile，A等(1994)Prog Liver Dis  12，157-75)。与病毒性肝炎的其它代表相比，急性HDV感染更经常地伴随着暴发性肝炎，这是一种迅速发展的、常常是致命的疾病，会使大量的肝破坏。慢性丁型肝炎通常以坏死性炎性损伤为特征，与慢性HBV感染相似，但更为严重，常常迅速发展成肝硬化和肝衰竭，导致慢性HDV感染与晚期肝病的不成比例的联系(Smedile，A等(1994)Prog Liver Dis  12，157-75；Rizzetto，M等(1983)Ann Intern Med  98，437-41)。虽然HDV感染影响的个体较HBV少，但所造成的急性或慢性肝衰竭在欧洲及北美是需要肝移植的常见指示(Smedile，A.&  Rizzetto，M.(1992)Int J Clin Lab Res22，211-215；Wright，T. L. & Pereira，B.(1995)Liver TransplantSurgery  1，30-42)。慢性疾病在全世界侵袭1500万人，美国约70000人。疾病控制中心估计美国每年因HDV感染而死亡1000人(Alter，M.J.& Hadler，S.C.(1993)Prog Clin Biol Res 382，243-50；Alter，M.J.& Mast，E.E.(1994)Gastroenterol Clin North  Am 23，437-55)。
目前尚无普遍接受的丁型肝炎的有效疗法，对于伴生的晚期肝病，肝移植是仅有的选择。虽然干扰素α曾在治疗某些丁型肝炎病例中获得一定的成功，但它所需的剂量很高、响应不定、停止治疗后复发频繁以及服药困难，说明需要有更好的治疗选择方案
                                  (Thomas，H.C.et al.(1987)Prog Clin Biol Res234，277-90；Hoofnagle，J.et al.(1987)Prog Clin Biol Res 234，291-8；Rosina，F.etal.(1987)Prog Clin Biol Res 234，299-303；Rosina，F.et al.(1991)Hepatology 13，1052-6；Farci，P.et al.(1994)N Engl J Med 330，88-94；Hadziyannis，S.J.(1991)JHepatol 13 Suppl 1：S21-6；Di Marco，V.et al.(1996)J Viral Hepat 3，123-8；Porres，J.C.et al.(1989)J Hepatol 9，338-44).
拉米夫定(β-L-2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷，3TC是对于治疗HIV和HBV感染有效的一种合成核苷。参见美国专利5,539,116(Liotta等)。已知拉米夫定在治疗期间造成对HBV复制的持续抑制(Nevens，F等，(1997)Gastroenterology， 113：1258-1263)。但是，拉米夫定不改善慢性丁型肝炎患者的疾病活性或降低HDV-RNA水平(Lau，D.T.等(1999)Hepatology  30，546-9)。拉米夫定最近在美国和其它几个国家被批准用于治疗慢性HBV感染。长期用拉米夫定治疗慢性HBV携带者能导致血清中HBV浓度减小和肝组织结构改善(Lai，C.L.etal.(1998)N Engl J Med 339，61-8；Tyrrell，D.et al.(1993)Hepatology18，112A；Nevens，F.et al.(1997)Gastroenterology 113，1258-63；Dienstag，J.L.et al.(1995)N Engl J Med 333，1657-61)。尽管对HBV有显著的作用，但对于被HBV和HDV同时慢性感染的患者，用拉米夫定治疗对HDV的循环浓度影响甚小；更重要的是，即使HBV水平被降低，但疾病活性没有改善(Honkoop，P.et al.(1997)Hepatology 24(Suppl)，1219(Abstract)；Lau，D.T.et al.(1999)Hepatology 30，546-9)。
曾尝试过其它治疗方式。例如，苏拉明在体外试验中封阻了病毒颗粒进入肝细胞的入口，但它毒性太强，不能对人长期使用(Smedile，A.等(1994)Prog Liver Dis  12，157-75)。阿昔洛韦在体外试验中增强HDV的复制(Smedile，A.等(1994)Prog Liver Dis  12，157-75)。利巴韦林对于病毒学或生物化学参量无显著影响，而且有严重的副作用(Smedile，A.等(1994)Prog Liver Dis 12，157-75)。合成的胸腺素类似物对于治疗HDV感染也无效(Smedile，A等，(1994)Prog Liver Dis12，157-75)。
上述的对于HDV感染的治疗没有一种被普遍承认是有效的。HDV病毒颗粒是由核糖核蛋白核心和包膜组成。核心中含有HDV-RNA和丁型肝炎抗原(HDAg)，它是仅有的被该病毒编码的蛋白(Wang，K.S.等(1986)Nature 323，508-14)。包膜是由辅助病毒——乙型肝炎病毒的表面抗原蛋白形成(乙型肝炎表面抗原，或HBsAg)(Bonino，F(1984)Infect Immum  43，1000-5；Bonino，F等(1981)Hepatology  1，127-31；Bonino，F等(1986)J Virol  58，945-50)。该包膜是仅有的由HBV提供的辅助功能。HDV能在HBV不存在的情况下在细胞内复制其RNA(Kuo，M.Y等(1989)，J.Virol  63，1945-50)，但是需要HBsAg用于包装和释放HDV病毒颗粒(Wu，J.C.等(1991)J.Virol  65，1099-104；Ryu，W.S.等(1992)J.Virol  66，2310-2315)，以及用于感染性(Sureau，C.等(1992)J.Virol  66，1241-5)。由于HDV对HBV的依赖性，HDV只是在与HBV联合时才感染个体。
因为土拨鼠肝炎病毒(WHV)与HBV紧密相关(约85％核酸同源性)，它已被广泛用来在其天然宿主东方土拨鼠(M.monax)中作为HBV感染和疾病的模型使用(Gerin，J. L(1990)Gastroenterol  JPn25(supp)，38-42；Tennant，B.C.等(1988)Viral Hepatitis and LiverDisease，462-464)。实验感染的土拨鼠还被广泛用于抗HBV疗法的分析和开发(Zahm，F.E.etal.(1998)Ital J Gastroenterol Hepatol 30，510-6；Tennant，B.C.et al.(1998)Hepatology 28，179-91；Mason，W.S.et al.(1998)Virology 245，18-32；Korba，B.E.et al.(1996)Hepatology 23，958-63；Hurwitz，S.et al.(1998)Antimicrob AgentsChemother 42，2804-2809；Block，T.M.et al.(1998)Nat.Med 4，610-4；Cullen，J.M.et al.(1997)Antimicrob Agents Chemother 41，2076-82；Fourel，G.et al.(1990)Nature 347，294-8；Gangemi，J.et al.(1997)Antivir Therap 1，64-70；Genovesi，E.V.et al.(1998)Antimicrob Agents Chemother 42，3209-17；Korba，B.E.et al.(2000)Antiviral Res 45，19-32；Korba，B.E.et al.(2000)Antiviral Therapy 55，95-105；Korba，B.E.et al.(2000)Antimicrobial Agents and Chemotherapy 44，19-32.用于试验性治疗土拨鼠中慢性WHV感染的几种抗HBV药剂(单磷酸阿糖腺苷、利巴韦林、叠氮胸苷、ACV、3TC、泛西洛维、FTC、α-干扰素、非阿尿苷、丙氧鸟苷、胸腺素α-1、使用3TC和α-干扰素或3TC与泛西洛维的组合疗法)的效力与在临床试验期间受治疗的HBV患者服用这些药剂的效力及毒性情况准确地一致。在用抗HBV药剂治疗的感染WHV的土拨鼠和感染HBV的人中观察到类似的效力，说明土拨鼠动物模型可以预测对人类的抗HBV治疗(Zahm，F.E.et al.(1998)Ital J Gastroenterol Hepatol 30，510-6；Tennant，B.C.et al.(1998)Hepatology 28，179-91；Mason，W.S.et al.(1998)Virology 245，18-32；Hurwitz，S.et al.(1998)Antimicrob Agents Chemother 42，2804-09；Fourel，G.et al.(1990)Nature 347，294-8；Gangemi，J.et al.(1997)Antivir Therap 1，64-70；Genovesi，E.V.et al.(1998)Antimicrob Agents Chemother 42，3209-17；Korba，B.E.et al.(2000)Antiviral Res 44，19-32；Korba，B.E.et al.(2000)Hepatology 31，1165-75；Korba，B.E.et al.(2000)Antiviral Therapy 5，95-105；Korba，B.E.et al.(2000)Antimicrob Agents Chemother 44，1757-60)。与HBV相似，WHV可以支持HDV颗粒形成和感染，东方土拨鼠是一种适用的HDV感染模型
            Negro，F.et al.(1989)J Virol 63，1612-8；Parana，R.，Gerard，F.，Lesbordes，J.L.，Pichoud，C.，Vitvitski，L.，Lyra，L.G.&Trepo，C.(1995)J Hepatol22，468-73；Ciccaglione，A.R.et al.(1993)Arch Virol Suppl 8，15-21；Bergmann，K.F.et al.(1989)J Immunol 143，3714-21；Ponzetto，A.et al.(1984)Proc Natl Acad SciUSA 81，2208-12；Ponzetto，A.et al.(1987)Prog Clin Biol Res 234，37-46
HDV对其辅助病毒HBV的依赖性表明，HDV感染的成功治疗应是支持性HBV感染的成功治疗的必然结果。遗憾的是，如最近用药物拉米夫定(Glaxo-Wellcome，Inc.)得到的结果所示，情形似非如此。(Honkoop，P.et al.(1997)Hepatology 24(Suppl)，1219(Abstract)；Lau，D.T.et al.(1999)Hepatology 30，546-9)。拉米夫定对于HBV-HDV感染的患者缺乏效力强调了在这类患者中HDV对于疾病严重性的直接作用。虽然拉米夫定抑制了HBV和WHV的复制，但不影响病毒表面抗原的产生(Lau，D.T.et al.(1999)Hepatology 30，546-9；Doong，S.L.etal.(1991)Proc Natl Acad Sci USA 88，8495-9；Korba et al.Hepatology，(2000)31，1165-75)。HBV和该族病毒其它代表(例如WHV)的生命周期的独特之处在于，复制该病毒的基因组拷贝的过程和病毒蛋白(例如HBV或WHV表面抗原)的生产是被分别调节的(Ganem，D.1996，嗜肝DNA病毒科，在“Fields病毒学”中，Fields BN，Knipe  DM，Howley P，编著，Lippincott-Ravne，Philadelphia，P.2703-2737)。因此，抗病毒药剂，例如以病毒聚合酶为目标的合成核苷(如拉米夫定)，可以显著地抑制HBV复制(如通过血中病毒的减少所测定的)，但不影响病毒mRNA或病毒蛋白生产的水平(例如通过血浆或血清中的HBV表面抗原浓度所测定的)。已知HBV的生命周期的特点是分别调节病毒蛋白质以及HBsAg可以由多种其它转录物产生，但至少尚不清楚何种参量对于实现治疗HDV的目标是最为重要的。
美国专利5,747,044公开了重组产生的可作为疫苗使用的免疫原性HDV多肽。
Chiron的美国专利5,932,219公开了丁型肝炎病毒的完整的基因组，整个HDV基因组的一族cDNA复制物，并提出这些cDNA序列的各部分适合作为诊断临床样品中病毒存在的探针。该专利还公开了被cDNA编码的蛋白，它们适用于制造疫苗。特别是，美国专利5,932,219公开了一种用于丁型肝炎的疫苗，其中掺加了P24和P27病毒多肽。Chiron的美国专利5,750,350公开了一种用于分析丁型肝炎病毒的试剂盒，其中含有被HDV基因组的ORF5编码的一种肽。美国专利5,747,044公开了一种重组产生的免疫原性颗粒，它产生对抗HDV的抗体，该颗粒中包含被HDV核苷酸序列或其补体的ORF5编码的一种免疫原性多肽。
美国专利6,020,167(Medeva  Holdings  B.V)公开了一种治疗慢性肝炎，特别是乙型肝炎的方法，其中包括服用一种含抗HBsAg的组合物。
美国专利5,770,584公开了一种服用烷基类脂或烷基类脂衍生物治疗肝炎病毒感染的方法。
美国专利4,619,896公开了一种将动物血液中的δ抗原解掩蔽的方法，该方法包括用表面活性剂和任选地用一种抗体-抗原解离剂处理血清。血液衍生的δ抗原是作为诊断剂用于检测和确定丁型肝炎病毒的不同类别的抗体。
美国法定发明登记号H 1,345公开了一种通过服用蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂预防或治疗肝炎病毒的方法。
Sureau等在“感染性丁型肝炎病毒在体外的产生和用对抗乙型肝炎病毒前-S抗原的抗体进行中和”一文(Journal of Virology，1992年2月，p 1241-1245)中公开了体外产生的感染性的HDV颗粒，而且(1)该感染性颗粒被HBV包膜蛋白包覆，蛋白中包含前-S1和前-S2区，(2)HBV包膜蛋白的前-S1和前-S2域的抗原表位暴露在HDV颗粒的表面上，和(3)定向对抗这些表位的抗体具有对抗HDV的中和活性。
核苷类似物L-FMAU[2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷]是已知化合物，它已显示出对抗细胞培养物中HBV复制和对抗细胞培养物及受感染的鸭中相关的鸭乙型肝炎病毒的显著活性(Aguesse-Germon，S.et al.(1998)Antimicrob Agents Chemother 42，369-76；Balakrishna Pai，S.et al.(1996)Antimicrob Agents Chemother 40，380-6；Chu，C.K.et al.(1995)Antimicrob AgentsChemother 39，979-81；Fu，L.et al.(1999)Biochem Pharmacol l57，1351-9；Kotra，L.P.et al.(1997)J Med Chem 40，3635-44；Kukhanova，M.et al.(1998)BiochemPharmacol 55，1181-7；Ma，T.et al.(1997)J Med Chem 40，2750-4；Ma，T.et al.(1996)J Med Chem 39，2835-43；Ku，A.S.et al.(1998)Biochem Pharmacol 55，1611-9；Yao，G.Q.et al.(1996)Biochem Pharmacol 51，941-7)；Peek，S.et al.(2001)Hepatology 33，254-66；Zhu，Y.et al.(2001)J.Virol 75，311-22.
Chu等的美国专利5,587,362和WO 95/20595公开了用于治疗HBV的L-FMAU及其药物组合物，并提供了该化合物合成方法的详细说明。Chu等的美国专利5,567,688对一种用L-核苷(包括L-FMAU)治疗HBV的方法提出权利要求。Chu等的美国专利5,565,438提出了一种用L-FMAU治疗受EB病毒(EBV)感染的患者的方法。美国专利5,808,040和5,753,789公开了使用L-FMAU来稳定低聚核苷酸，其作法是将该化合物包含在低聚核苷酸的5′-末端、3′-末端或内部。WO 98/15375公开了一种制造L-FMAU的方法。
L-FMAU已显示出对于在慢性感染的土拨鼠中WHV的复制是显著有效和快速作用的抗病毒剂(Korba，B.et al.(1999)Antivir Res.41，A54；Chu，C.et al.(1998)in Therapies for viral hepatitis，eds.Schinazi，R.&Sommadossi，J.(International Medical Press，Atlanta)，Vol.pp303-12；Peek，S.F.et al.(1997)Hepatology 26，425A(Abstract 1187)；Peek，S.F.etal(2001)Hepatology 33，254-66；Zhu，Y.et al(2001)J.Virol 75，311-22)还曾提到，L-FMAU引起血清中WHV表面抗原的减少(Korba，B.etal.(1999)Antivir. Res.41，A54；Chu，C.et al.(1998)in Therapies for viralhepatitis，eds. Schinazi，R. & Sommadossi，J.(International MedicalPress，Atlanta)，Vol.pp303-12；Peek，S.B.et al.(1997)Hepatology 26，425Aand Peek，S.B.et al(2001)Hepatology 33，254-66。L-FMAU还显示出在大鼠和土拨鼠中具有有利的药物动力学型式和足够的口服生物利用度，这使得它适合每天用药一次(Wright，J.D.et al.(1995)Pharm Res12，1350-3；Wright，J.D.et al.(1996)Biopharm Drug Dispos 17，197-207；Witcher，J.W.et al.(1997)Antimicrob Agents Chemother 41，2184-7)。
因为感染丁型肝炎病毒的人数巨大，丁型肝炎病毒感染对个体的破坏作用，以及有效疗法的缺乏，所以极其需要用于治疗丁型肝炎病毒感染的有效的新方法和组合物。
因此，本发明的目的是提供用于治疗被丁型肝炎病毒感染的宿主(包括人)的方法和组合物。
本发明的又一目的是提供一种用于鉴定对于丁型肝炎病毒感染的治疗有效的化合物的方法。
                        发明概要
现已发现，服用能显著降低宿主内乙型肝炎表面抗原(以后称作HBsAg)水平的核苷或核苷类似物，或其前药或可药用的盐，对于治疗该宿主的丁型肝炎病毒感染是有用的。显著降低宿主内的HBsAg意味着，如同用任何合适的标准免疫测定法，例如用于人HBsAg的商品化测定法(AUSZYME，Abbott Laboratories)或在下述文献(ViralImmunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronha and J.Gerin.1993)中描述的用于土拨鼠乙型肝炎表面抗原的方法在血浆或血清中所测定的，该核苷或核苷类似物在体内或体外将乙型肝炎表面抗原降低到比治疗前低至少100倍或更多，优选200或500倍，或者降低到体内每毫升不超过1微克，优选不超过0.5或0.1微克。
先前已知，如果一种核苷或核苷类似物对受丁型肝炎感染的宿主的HBsAg水平无显著影响，例如3TC(β-L-2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷)，则该核苷对于治疗丁型肝炎病毒无效。然而，虽然已知HBV的生命周期的特点是分别调节病毒蛋白以及HBsAg可以由多种其它转录物产生，但至今仍不清楚什么参量对于实现治疗HDV的目的最为重要，包括由核苷或核苷类似物造成的HBsAg的减少(和消除不同)是否会表现为对HDV的任何治疗作用。另外，此前还没有关于为达到所希望的结果(如血清浓度测定结果)所需要的HBsAg抑制度或为实现持久作用所需要的治疗时间的报道。已知的核苷不以所有的用于制造HBsAg的模板为目标，而且没有一种是以常规方式抑制血清中HBsAg水平。最后，为了使HBsAg的抑制对于防止丁型肝炎病毒形成有效，宿主肝细胞必须受HBV或一种支持HDV感染的非乙型肝炎的嗜肝病毒与丁型肝炎病毒共感染，而且在每种情形里都不清楚制造HBsAg但不被共感染的肝细胞的比例。只受HBV感染的肝细胞可能对血清中HBsAg水平有贡献，但这些细胞中HBsAg的抑制不会影响丁型肝炎病毒形成。
现在已经通过示例核苷和一个非限制性实施方案L-FMAU第一次确定，如果一种核苷抑制HBsAg的产生，以致于血浆或血清HBsAg浓度显著而持久地降低，即，在体内或体外试验中比处理前数值降低约100倍或更多，则它可用于治疗丁型肝炎病毒。
因此，本发明的一个方面提供了一种治疗HDV感染的宿主(特别是人)的方法，这包括服用有效数量的核苷或核苷类似物，它在体内或体外试验中，如同在血清或血浆中用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商品化测定法(AUSZYMETM，Abbott Laborabories)或在以下文献中描述的用于土拨鼠乙型肝炎表面抗原的方法：ViralImmunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronha and J.Gerin.1993)所测定的，将受感染的宿主中的HBsAg降低到比治疗前低至少约100倍，优选200或500倍或更多，或者降低到不超过每毫升1微克，或优选0.5或0.1微克。
在另一项实施方案中，现已发现，服用显著降低宿主中前S1抗原水平的核苷或核苷类似物对于治疗宿主中丁型肝炎病毒感染有用。所谓显著降低宿主中的前S1抗原，是指用任何合适的测定方法，包括用以下测定方法：Deepen R，Heermann KH，Uy A，Thomssen R，Gerlich WH.“Assay of preS epitopes and preS1 antibody inhepatitis B virus carriers and immune persons”Med MicrobiolImmunol(Berl).1990；179(1)：49-60，在体内或体外试验中测得的乙型肝炎表面抗原与治疗前数值相比，被核苷或核苷类似物降低至少约100倍或更多，优选200或500倍。
在另一方面，提供了一种用于治疗感染HDV的宿主(特别是人)的方法，其中包括服用有效数量的非核苷有机小分子(即，分子量小于500，不是在自然界中发现的生物物质或保留其预期活性的衍生物或类似物，例如肽、蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子)，它不是一种蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素α-1，如同在血清或血浆中用任何合适的测定方法，包括标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商品化测定法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或下述文献中对土拨鼠乙型肝炎表面抗原所述的方法：Viral Immunology6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronha and J.Gerin.1993)所测得的，将受感染的宿主中的HBsAg降低到比治疗前低至少约100倍或更多，优选至少200或500倍，或者降低到不超过每毫升1微克，优选不超过每毫升0.5或0.1微克。
在一项实施方案中，对于需要治疗的宿主施用有效数量的L-FMAU或其可药用盐或前药以便治疗丁型肝炎病毒感染。在一项优选的实施方案中，向需要治疗的宿主施用不存在其相应的β-D对映体的L-FMAU(即，对映体富集形式或对映体纯形式)。
在另一实施方案中，L-FMAU是与至少一种其它的HBsAg或前S1抗原降低剂一起服用，它们可以是用于治疗丁型肝炎感染的宿主的另一种核苷、核苷类似物或非核苷。在又一实施方案中，丁型肝炎治疗剂与一种具有对抗乙型肝炎的活性的药剂结合施用，不管该抗乙型肝炎药剂是否降低乙型肝炎表面抗原。
在另一项实施方案中，提供了一种治疗丁型肝炎的方法，其中包括服用一种化合物，包括核苷、核苷类似物或本文中定义的其它小分子，它减少乙型肝炎之外的其它支持HDV感染的嗜肝DNA病毒的表面抗原。
在另一实施方案中，提供了用来筛选对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，该方法包括利用本文提供的方法或现成的方法，根据用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商业测定法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或下文中对土拨鼠乙型肝炎表面抗原所述方法：Viral Immunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronhaand J.Gerin.1993，在血清或血浆中的测定结果，评估该化合物是否在体内或体外试验中将乙型肝炎表面抗原的表达降低得比治疗前低100倍或更多(优选200-500倍)，或者最好是降低到不超过每毫升1微克(优选0.5或0.1微克)。
在又一实施方案中，提供了用来筛选对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的一种方法，其中包括用本文提供的方法或现成的方法，根据用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商业测定法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或下文中对土拨鼠乙型肝炎表面抗原所述方法：Viral Immunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronhaand J.Gerin.1993，在血清或血浆中的测定结果，评估该化合物是否在体内或体外试验中将乙型肝炎表面抗原的表达降低到比治疗前低100倍或更多(优选200或500倍)，或者降低到不超过每毫升1微克(优选0.5或0.1微克)。
在另一实施方案中，提供了一种用于筛选对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，该方法包括由标准的免疫测定法在血清或血浆中的测定值判定，与治疗前相比，该化合物是否抑低前S1表面抗原的表达100倍或更多(优选200或500倍)。
本发明是基于以下的基本发现，即，作为模型活性化合物的L-FMAU充分地抑制乙型肝炎表面抗原的表达，从而有效地抑制HDV病毒颗粒的包装和释放。本发明展示了L-FMAU通过抑制乙型肝炎表面抗原的表达使HDV病毒血浓度显著减小的证据。
在另一实施方案中，宿主中的HDV感染可以通过服用一种针对乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的RNA转录物的反义低聚核苷酸治疗，它可以单独服用或者与L-FMAU，或另一种降低HBsAg或前S1抗原的核苷或核苷类似物一起服用。术语“低聚核苷酸”包括在自然界中发现的各类低聚的核酸部分，例如DNA和RNA的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸结构，以及能结合到自然界中发现的核酸上的人造类似物。本发明的低聚核苷酸可以以被磷酸二酯键连接的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体为基础，或以被磷酸甲酯、硫代磷酸酯、氨基磷酸酯、二硫代磷酸酯或其它的低聚核苷酸稳定键连接的类似物为基础。它们也可以包含基本结构改变或有其它变动、但仍保留与天然存在的DNA及RNA结构结合的单体部分。这些低聚核苷酸可以用本领域众所周知的方法制备，例如用现成的商品仪器和可由Perkin-Elmer/AppliedBiosystems(Foster City，Calif.)得到的试剂制备。
最好是选择一种针对HBV表面抗原或前S1基因序列的反义低聚核苷酸，使得该低聚核苷酸在基因的AUG起始密码子的约25个碱基内杂交。指向HBV表面抗原和前S1基因的反义低聚核苷酸描述于Korba等的美国专利5,646,262中，包括：(SEQ ID NO：1)CTTAGGACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：2)GACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：3)AGGACTACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：4)TACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：5)TCTTCCCCAGGATCCT；(SEQ IDNO.：6)TTTGGGGCGGACATTG；(SEQ ID NO.：7)CCTAAGAACAGTTGTT；(SEQ ID NO.：8)GTACAAGTCGCGTCCCAGG；(SEQ ID NO.：9)TAGGAGCTCTTCTAAC；(SEQ ID NO.：10)TATTCCCTAGTCTTGT；(SEQ IDNO.：11)CAAGAGGTACAAGTC；(SEQ ID NO.：12)CGACCACCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：13)CCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：14)TAAGACGGGGTA；(SEQ ID NO.：15)GACGGGGTACGACAT；(SEQ ID NO：16)GTACGACATCTAGAA。授予Isis Pharmaceuticals，Inc.的美国专利5,985,662描述了用于治疗HDV感染的反义低聚核苷酸的其它实例，其中包括：(SEQ ID NO：17)CCTGATGTGATGTTCTCCAT；(SEQ ID NO：18)GAACTGGAGCCACCAGCAGG；(SEQ ID NO：19)GAAAGATTCGTCCCCATGC；和(SEQ ID NO：20)CCACTGCATGGCCTGAGGATG。
本发明的其它的和进一步的情况、特点和优点，根据对目前优选的本发明实施方案的描叙将是显而易见的。给出这些实施方案是用于公开本发明。
附图简述
图1是L-FMAU(2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷)的图示说明。
图2是1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰-β-L-呋喃核糖(化合物10)制备方法的示意说明。
图3是1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰-β-L-呋喃核糖(化合物10)的另一制备方法的示意说明。
图4是1，3，5-三-O-苯甲酰-2-脱氧-2-氟-β-L-呋喃阿糖(化合物13)的制备方法的示意说明。
图5是受或不受5′-苯甲酰保护的2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿糖基]-5-甲基尿苷(化合物17-18)的制备方法图示说明。
图6A是对土拨鼠用L-FMAU治疗的周数对照每ml血清中HDVRNA的基因组当量数的直线图，它显示出用L-FMAU治疗感染了HDV的土拨鼠20周内HDV RNA的减少。慢性感染WHV的土拨鼠是用由实验室感染性克隆衍生的适应土拨鼠的HDV接种物感染的。慢性是通过在治疗开始前的至少11个月期间有至少74％的抽血日可检测到HDV病毒血而确定的。结果表明，用L-FMAU治疗使血清HDV-RNA显著减少。
图6B是对土拨鼠用L-FMAU的治疗周数对照以每ml中基因组当量数表示的土拨鼠血清WHV-DNA的直线图。慢性感染WHV的土拨鼠是用由实验室感染性克隆衍生的适应土拨鼠的HDV接种物感染的。慢性是通过在治疗开始前的至少11个月内有至少74％抽血日可检测到HDV病毒血而确定的。结果表明，用L-FMAU治疗使血清WHV-DNA显著减少。
图6C是对土拨鼠用L-FMAU的治疗周数对照以μg/ml表示的土拨鼠血清WHsAg的直线图。慢性感染WHV的土拨鼠是由实验室感染性克隆衍生的适应土拨鼠的HDV接种物感染的。慢性是通过在治疗开始前的至少11个月内有至少74％抽血日可检测到HDV病毒血而确定的。结果表明，用L-FMAU治疗使血清WHsAg显著减少。
图7A是表示在L-FMAU不存在下感染HDV的土拨鼠在20周内血清中HDV RNA的存在的直线图。
图7B是表示在L-FMAU不存在下土拨鼠在20周内的血清中WHV-DNA浓度的直线图。
图7C是表示在L-FMAU不存在下土拨鼠在20周内的血清中WHsAg浓度的直线图。
图8是以每毫升中基因组当量数表示的平均血清HDV  RNA对照周数的直线图。该图比较了5只未治疗的土拨鼠中的平均血清HDV浓度(园圈数据点)与L-FMAU治疗的土拨鼠4878，4879及4883的平均血清HDV浓度(方形数据点)，其中在治疗期间WHsAg浓度下降100倍以上(见图6B)。该图表示，与同一动物在治疗开始时以及5只未治疗的动物在任何时间的浓度相比，这三只治疗了8周的动物中的HDV RNA显著减小。
                        发明详述
本发明是一种通过施用能显著而持久地减小乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或前S1抗原的表达的有效数量的核苷或核苷类似物，或其前药或药学上可接受的盐，治疗宿主(特别是人)中丁型肝炎病毒(HDV)感染的方法。一种已知能抑制HBV复制的化合物拉米失定在降低患者HDV-RNA水平方面的出乎意料的失败，说明HBV的成功治疗不一定和HDV的成功治疗相关。本发明是基于这样的令人惊奇的发现，即，使乙型肝炎表面抗原(HBsAg)或前S1抗原的表达显著而持久降低的化合物是HDV复制的有效的抑制剂。L-FMAU是一种特别强的乙型肝炎表面抗原表达的抑制剂。本发明因此展示了这一基本发现，即，HBsAg或前S1抗原的显著和持久的抑制可以在受这些病毒感染的宿主中造成HDV病毒血的显著降低。或者是，同时感染了丁型肝炎和一种支持HDV感染的非乙型肝炎嗜肝DNA病毒的宿主，可以通过显著抑制该嗜肝DNA病毒的表面抗原的表达得到治疗。
在本发明的一项实施方案中，提供了一种治疗感染HDV的宿主的方法，其步骤包括：任意地与可药用的载体一起，服用有效数量能显著抑制乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的表达的一种核苷或核苷类似物，或其可药用的前药或盐。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种治疗受HDV感染的宿主的方法，其步骤包括：任意地与可药用的载体一起，服用有效数量的L-FMAU，或其可药用的前药或盐。
在又一实施方案中，对需要的宿主施用可任意处在可药用载体中的L-FMAU或作用方式相似的另一种核苷或核苷类似物，或其可药用的前药或盐，以及与其组合的至少一种能降低乙型肝炎表面抗原或前S1抗原水平的其它化合物。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，其步骤包括：a)对乙型肝炎病毒的动物模型，如东方土拨鼠，施用试验化合物；b)适当时，监测用试验化合物治疗的动物中表达的肝炎表面抗原或前S1抗原水平；c)将用试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原或前S1抗原水平与未用试验化合物治疗的动物比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中如用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商业测定法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或下文中对土拨鼠乙型肝炎表面抗原所述的方法：Viral Immunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronha andJ.Gerin.1993所测得的，肝炎表面抗原或前S1抗原的水平大大低于未经试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原的水平，在优选的实施方案中，比体内或体外的治疗前数值低100倍或更多；或者降低到不超过每毫升1微克。
在本发明的又一实施方案中，提供了一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，其步骤包括：a)向被土拨鼠肝炎病毒慢性感染并受适应土拨鼠的HDV接种物感染的土拨鼠施用试验化合物；b)监测用试验化合物治疗的动物中表达的肝炎表面抗原或前S1抗原的水平；c)将用试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原或前S1抗原的水平与未用试验化合物治疗的对照动物比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中如用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商业测定法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或下文中对土拨鼠乙型肝炎表面抗原所述的方法：ViraI Immunology  6：161，169；Cote，P.J.，C. Roneker，K. Cass，F. Schodel，D. Peterson，B. Tennant，F.DeNoronha and J.Gerin.1993所测得的，肝炎表面抗原或前S1抗原的水平大大低于未经试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原的水平，在优选的实施方案中，比体内或体外的治疗前数值低100倍或更多；或者降低到不超过每毫升1微克。
在一项优选的实施方案中，所选择的化合物应当使用试验化合物治疗的动物中肝炎表面抗原或前S1抗原的水平与丁型肝炎RNA水平同时降低。
在本发明的另一实施方案中，提供了一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物的方法，其步骤包括：a)对已转染人乙型肝炎病毒的离体细胞，例如2.2.15细胞(参见Sells MA等(1988)J.Virol. 62：2836-2844；Korba BE和Gerin JL(1992)Antiviral Res. 19：55-70.HB611；Ueda K等(1989)Virology  169：213-216)，施用试验化合物；b)监测用试验化合物治疗的动物中表达的肝炎表面抗原或前S1抗原的水平；c)将用试验化合物处理的细胞内的肝炎表面抗原或前S1抗原的水平与未用试验化合物治疗的对照动物比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中肝炎表面抗原或前S1抗原的水平显著低于未用试验化合物治疗的动物中肝炎表面抗原的水平，在优选的实施方案中，比体内或体外治疗前数值降低100倍，优选降低200或500倍。
在本发明又一实施方案中，提供了一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，其步骤包括：a)对已经转染成同时表达乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的离体细胞(例如，Casey，J.L.，A.G.Polson，B.L.Bass，J.L.Gerin；p290-294：Viral Hepatitis and Liver Disease；M. Rizzetto et al.，eds.Edizione Minerva Medica，Turin，1997)施用试验化合物；b)监测胞内表达并分泌到用试验化合物处理的细胞培养基中的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平；c)将由用试验化合物处理的细胞中分泌出的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平与未用试验化合物处理的对照细胞作比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中分泌出的肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平比从未用化合物处理的细胞分泌出的乙型肝炎抗原的水平显著降低。I.定义
这里使用的术语“HBsAg”和“乙型肝炎表面抗原”是指嗜肝DNA病毒家族中任何成员的表面抗原蛋白质，特别包括人乙型肝炎病毒(HBV)和土拨鼠肝炎病毒(WHV)。
这里使用的术语“对映体纯的”是指核苷的成分中包含至少约95％、优选约97％、98％、99％或100％的该核苷的单独一种对映体。
这里所说的“宿主”一词是指能感染丁型肝炎的任何动物，包括但不限于人和其它哺乳动物。
术语“药用盐”是指保留了母体化合物的生物活性且不赋予不良毒性作用的盐。可药用盐包括由可药用的无机或有机碱和酸衍生的盐。合适的盐包括由碱金属(如钾和钠)、碱土金属(如钙、镁和铵)衍生的盐，以及药学领域中熟知的其它酸的盐。
这里使用的“核苷”一词是指以N-配糖键或碳环键与碳水化合物或假碳水化合物(优选戊糖)，或糖的类物或可含一个或多个杂原子的改性的碳环体系相连接的杂环含氮碱，优选嘌呤或嘧啶，且其可以结合上任何想要的取代基，而且该化合物可以是天然的或合成的，其中该核苷可以具有能获得所要效果的任何立体化学结构。
这里使用的术语“核苷类似物”是指以N-配糖键或碳环键与可含杂原子的无环碳链连接的杂环含氮碱，优选嘌呤或嘧啶，且其可以在环链或无环链上含有取代基，包括羟基。
本说明书中使用的术语“前药”是用来描述在患者服用时能形成母体活性化合物的该活性化合物(核苷或核苷类似物)的任何衍生物。
这里所用的嘌呤或嘧啶碱一词，包括但不限于：6-烷基嘌呤和N6-烷基嘌呤，N6-酰基嘌呤，N6-苄基嘌呤，6-卤代嘌呤，N6-乙烯基嘌呤，N6-乙炔基嘌呤、N6-酰基嘌呤，N6-羟烷基嘌呤，N6-硫烷基嘌呤，N2-烷基嘌呤，N4-烷基嘧啶，N4-酰基嘧啶，4-苄基嘧啶，N4-卤代嘧啶，N4-乙炔基嘧啶，4-酰基和N4-酰基嘧啶，4-羟烷基嘧啶，4-硫烷基嘧啶，胸腺嘧啶，胞嘧啶，6-氮杂嘧啶，包括6-氮杂胞嘧啶，2-和/或4-巯基嘧啶，尿嘧啶，C5-烷基嘧啶，C5-苄基嘧啶，C5-卤代嘧啶，C5-乙烯基嘧啶，C5-乙炔基嘧啶，C5-酰基嘧啶，C5-羟烷基嘌呤，C5-氨基嘧啶，C5-氰基嘧啶，C5-硝基嘧啶，C5-氨基嘧啶，N2-烷基嘌呤，N2-烷基-6-硫嘌呤，5-氮杂胞苷基，5-氮杂尿嘧啶基，三唑并吡啶基，咪唑并吡啶基，吡咯并嘧啶基，和吡唑并嘧啶基。碱上的功能性氧基和氮基可以根据需要或希望加以保护。合适的保护基团是本领域技术人员所熟知的，包括三甲代甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基、烷基、酰基(如乙酰基和丙酰基)、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。碱的实例包括胞嘧啶、5-氟胞嘧啶、5-溴胞嘧啶、5-碘胞嘧啶、尿嘧啶、5-氟尿嘧啶、5-溴尿嘧啶、5-碘尿嘧啶、5-甲基尿嘧啶、胸腺嘧啶、腺嘌呤、鸟嘌呤、肌苷、黄嘌呤、2，6-二氨基嘌呤、6-氨基嘌呤、6-氯嘌呤和2，6-二氯嘌呤、6-溴嘌呤、2，6-二溴嘌呤、6-碘嘌呤、2，6-二碘嘌呤、5-溴乙烯基胞嘧啶、5-溴乙烯基尿嘧啶、5-溴次乙基胞嘧啶、5-溴次乙基尿嘧啶、5-三氟甲基胞嘧啶、5-三氟甲基尿嘧啶。
除非另外定义，本文中所用的“被保护的”一词是指加到氮或氮原子上的某个基团，用以防止该氮和氧在其所处的分子中其它部分衍生变化期间发生进一步的反应。各式各样的氧或氮保护基团是有机合成领域技术人员所熟知的。
除非另外指明，本文所用的烷基一词，是指饱和的直链、支链或环状的伯、仲或叔烃基，通常为C1-C18，具体包括甲基、乙基、丙基、异丙基、丁基、异丁基、叔丁基、戊基、环戊基、异戊基、新戊基、己基、异己基、环己基、环己基甲基、3-甲基戊基、2，2-二甲基丁基和2，3-二甲基丁基。烷基可以任意地被一个或多个下述基团取代：羟基、氨基、烷氨基、芳氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯、膦酸基、磷酸基或磷酸酯基，可以是未被保护的，或者如本领域技术人员所知道的在需要时加以保护，如Greene等在“ProtectiveGroups in Organic Synthesis”(有机合成中的保护基团)，JohnWilev and Sons，第二版，1991中所述，该文献在本文中引用作为参考。
除非另外指明，这里所说的低级烷基一词是指C1-C4直链或支链的饱和烷基。
除非另外指明，这里所用的芳基一词是指苯基、联苯基或萘基，优选苯基。芳基可以任选地被一个或多个以下基团取代：羟基、氨基、烷氨基、烷氧基、芳氧基、硝基、氰基、磺酸、硫酸酯基、磷酸基、磷酸酯或膦酸酯基，可以是未保护的，或者如本领域技术人员所知道的，在需要时加以保护，如Greene等在Protective Groups in OrganicSynthesis”，John Wiley and Sons，第二版，1991中所述
术语烷芳基或烷基芳基是指带有芳基取代基的烷基。
术语芳烷基或芳基烷基是指带有烷基取代基的芳基。
本文所说的卤素一词，包括氯、溴、碘和氟。
这里使用的术语酰基，是指化学式为-C(O)R′的基团，其中R′是烷基，芳基，烷芳基，芳烷基，杂环基，烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)，芳基烷基(包括苄基)，芳氧基烷基(如苯氧基甲基)，芳基(包括任意被卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的苯基)，或氨基酸的残基。
术语氨基酸包括天然存在的和合成的氨基酸，其中包括但不限于丙氨酸、缬氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、蛋氨酸、甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、天冬氨酸、戊二酰、赖氨酸、精氨酸和组氨酸基。
这里使用的杂环基一词是指在环体系中包含至少一个硫、氧或氮原子的成环部分。非限制性实例是呋喃基、吡啶基、嘧啶基、噻吩基、异噻唑基、咪唑基、四唑基、吡嗪基、苯并呋喃基、苯并苯硫基、喹啉基、异喹啉基、苯并噻吩基、异苯并呋喃基、吡唑基、吲哚基、异吲哚基、苯并咪唑基、嘌呤基、咔唑基、噁唑基、噻唑基、异噻唑基、1，2，4-噻二唑基、异噁唑基、吡咯基、喹唑啉基、哒嗪基、吡嗪基、曾啉基、2，3-二氮杂萘基、喹喔啉基、黄嘌呤基、次黄嘌呤基和蝶呤基。杂环碱上的功能性氧和氮可以根据需要或希望加以保护。合适的保护基是本领域技术人员所熟知的，包括三甲代甲硅烷基、二甲基己基甲硅烷基、叔丁基二甲基甲硅烷基和叔丁基二苯基甲硅烷基、三苯甲基或取代的三苯甲基、烷基、酰基(如乙酰基和丙酰基)、甲磺酰基和对甲苯磺酰基。杂环基可以被任何合适的取代基取代，包括但不限于氟、碘、溴、氯和低级烷基，包括环丙基。
术语亲油性前药是指在5′-羟基位上含一个共价取代基的核苷，该取代基使核苷比带有5′-羟基的母体核苷更为亲油。II.活性化合物
已经发现，服用能在体内或体外将宿主中的乙型肝炎表面抗原(本文称作HBsAg)水平降低到比治疗前数值低至少100倍或更多，优选低200或500倍，以及最好是，降低到不超过体内每ml不超过1μg、优选不超过0.5或0.1μg的任何核苷、核苷类似物或本文指定的某些非核苷，或其前药或可药用盐，可用于治疗宿主中的丁型肝炎病毒感染。核苷将HBsAg降低到所需最低水平的能力可以用本文详述的方法或其它的已知方法确定。
业已发现，服用能在体内或体外将宿主中的前S1抗原水平降低到比治疗前数值低至少100倍或更多，优选低200或500倍的任何核苷、核苷类似物或某些非核苷，或其前药或可药用盐，可用于治疗宿主中的丁型肝炎病毒感染。核苷将前S1抗原降低到所需最低水平的能力容易用已知方法确定。
先前已知，如果一种核苷或核苷类似物不能显著降低感染丁型肝炎宿主中的HBsAg的水平，例如3TC(2′，3′-二脱氧-3′-硫代胞苷)，则该核苷对于治疗丁型肝炎病毒无效。但是，其逆说法至今未得到确认，即，如果一种核苷或核苷类似物，如用标准的免疫测定法(例如用于人HBsAg的商品化方法(AUSZYMETM，Abbott Laboratories)或在以下文献中描叙的用于土拨鼠乙型肝炎表面抗原的方法：ViralImmunology  6：161，169；Cote，P.J.，C.Roneker，K.Cass，F.Schodel，D.Peterson，B.Tennant，F.DeNoronha and J.Gerin.1993)所测定的，能在体内或体外将HBsAg水平降低得比治疗前数值低100倍或更多，或者不超过每毫升1微克，则可用于治疗丁型肝炎病毒。现在通过示例性核苷类似物和一个非限制性实施方案L-FMAU，首次确认了这一点。III.L-FMAU在治疗HDV感染中的应用
在本发明的一项实施方案中，服用有效数量结构如下的式I化合物或其可药用的前药或盐：
Figure A0181041300271
其中R是5-甲基尿嘧啶(也称作胸腺嘧啶)，R′是氢、酰基、烷基、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯或稳定化的磷酸酯衍生物，包括5′-醚脂类或5′-磷脂类，或其可药用的盐。VI.活性化合物的前药
活性化合物可以以接受者在服用时能直接或间接地形成母体化合物的任何衍生物的形式服用。非限制性的实例是可药用的盐，以及活性化合物(如果是核苷或核苷类似物)的5′-和嘌呤或嘧啶酰化或烷基化的衍生物。在一项实施方案中，活性化合物的酰基是一种羧酸酯，其中酯基的非羰基部分是选自直链、支链或环形的烷基、烷氧基烷基(包括甲氧基甲基)、芳烷基(包括苄基)、芳氧基烷基(例如苯氧基甲基)、芳基(包括任意被卤素、C1-C4烷基或C1-C4烷氧基取代的苯基)、磺酸酯基(例如烷磺酰或芳烷磺酰，包括甲磺酰)、一、二或三磷酸酯基、三苯甲基或一甲氧基三苯甲基、取代的苄基、三烷基甲硅烷基(如二甲基叔丁基甲硅烷基)或二苯基甲基甲硅烷基。酯中的芳基最好包含一个苯基。烷基可以是直链、支链或环形，最好是C1-C18基团。
为了增加活性、生物利用率、稳定性或改变核苷的性质，活性化合物可以以前药形式，包括核苷酸前药(如果是核苷或核苷类似物)的形式施用。“前药”是在宿主体内通过内源性酶或其它的化学物质及/或条件的作用转化为活性形式的治疗药物。许多核苷酸前药配体是已知的。一般来说，核苷的一、二或三磷酸酯的烷基化、酰化或其它亲油改性作用将提高核苷酸的稳定性。可以取代磷酸酯部分上的一个或多个氢的取代基的实例是烷基、芳基、甾类、碳水化合物(包括糖)、1，2-二酰基甘油和醇。R.Jones和N.Bischofberger在Antiviral Research27(1995)1-17中描述了很多实例。它们均可与所公开的核苷结合使用以达到所希望的效果。
可以取代磷酸酯部分或羟基上的一个或多个氢的取代基的实例是烷基、芳基、甾类、碳水化合物(包括糖)、1，2-二酰基甘油和醇。R.Jones和N.Bischofberger在Antiviral Research  27(1995)1-17中描述了很多实例。它们均可与所公开的核苷或其它化合物组合使用以达到所希望的效果。
活性核苷或其它含羟基的化合物也可以如以下参考文献中所公开的，作为一种醚脂(特别是核苷的5′-醚脂)提供，这些文献在本文中被引用作为参考文献：Kucera，L.S.，N.Iyeu.E.Leake，A.Raben，Modest E.K.，D.L.W.，and C.Piantadosi.1990.“Novel membrane-interactive ether lipid analogs that inhibit infectious HIV-1production and induce defective virus formation.”AIDS Res.Hum.Retro Viruses.6：491-501；Piantadosi，C.，J.Marasco C.J.，S.L.Morris-Natschke，K.L.Meyer.F.Gumus，J.R.Surles，K.S.Ishaq，L.S.Kucera，N.Iyer，C.A.Wallen，S.Piantadosi，andE.J.Modest.1991.“Synthesis and evaluation of novel ether lipid nucleosideconjugates for anti-HIV activity.”J.Med. Chem.34：1408.1414；Hosteller，K.Y.，D.D.Richman，D.A.Carson，L.M.Stuhmiller，G.M.T.van Wijk and H.van den Bosch.1992.“Greatly enhanced inhibition of human immunodeficiency virus type 1replication in CEM and HT4-6C cells by 3’-deoxythymidine diphosphatedimyristoylglycerol，a lipid prodrug of 3，-deoxythymidine.”Antimicrob.AgentsChemother.36：2025.2029；Hostetler.K.Y.，L.M.Stuhmiller，H.B.Lenting，H.vanden Bosch，and D.D.Richman，1990.“Synthesis and antiretroviral activity ofphospholipid analogs of azidothymidine and other antiviral nucleosides.”J.Biol.Chem.265：61127.
一些美国专利公开了可以共价结合到核苷或其它含羟基或胺的化合物中(优选在核苷的5′-OH位结合)的合适的亲油性取代基或亲油性制剂，这些专利的非限制性实例包括：美国专利5,149,794(9月22，1992，Yatvin et al)；5,194,654(3月16，1993，Hostetler et al.，5,223,263(6月29，1993，Hostetler et al)；5,256,641(10月26，1993，Yatvin et al.)；5,411,947(5月2，1995，Hostetler et al.)；5,463,092(10月31，1995，Hostetler et al.)；5,543,389(8月6，1996，Yatvin et al.)；5,543,390(8月6，1996，Yatvin et al.)；5,543,391(8月6，1996，Yatvin et al.)；和5,554,728(9月10，1996，Basava et al.)，它们均在本文中引用作为参考文献。公开了可以连接到本发明的核苷上的亲油性取代基或亲油性制剂的外国专利申请包括：WO 89/02733，WO 90/00555，WO91/16920，WO 91/18914，WO 93/00910，WO 94/26273，WO 96/15132，EP 0 350 287，EP 93917054.4，和WO 91/19721。
以下文献中描叙了核苷酸前药的非限制性实例：
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在本发明的其它实施方案中，HDV感染的治疗可以用L-FMAU或其它核苷或核苷类似物或符合本发明指定要求的有机小分子与其它药剂结合或交替使用来实现，这些药剂能降低宿主中的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的水平，或者已知能治疗丁型肝炎感染，这包括但不限于：核酶(见美国专利5,985,621)，细胞因子(包括白介素)，干扰素(包括α、β或γ型)，乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的抗体或者乙型肝炎表面抗原或前S1抗原表达的转录因子或其它中介体(赋予被动免疫性)；乙型肝炎表面抗原或前S1抗原或乙型肝炎表面抗原表达的转录因子或其它中介体(赋予主动免疫性)，蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂(法定发明No.HI-345)或肽类激素(例如，胸腺素α-1)。
一般，在交替治疗期间，顺序地服用有效剂量的各个药剂，而在组合疗法中，有效剂量的两种或多种药剂一起服用。剂量将取决于诸如各药剂的吸收、生物分布、代谢和排泄速率，以及本领域技术人员已知的其它因素。应该指出，剂量值也随要减轻的病症的严重程度而变。还要知道，对于任何特定的对象，具体的用药方案和日程表应该根据个别需要和管理或指导施用该组合物的人员的专业性判断而随时调整。所公开的组合和交替用药方案可用于预防和治疗HDV感染及其它相关病症。此外，这些化合物或制剂可以预防性地用来防止或延缓已接触HDV的个体中临床疾病的发展。VI.用于治疗HDV感染的其它可能的实施方案
在一项本发明的其它实施方案中，宿主的HDV感染可以通过单独地或与L-FMAU一起服用至少一种以乙型肝炎表面抗原的RNA转录物为目标的反义低聚核苷酸来治疗。本发明所用的“低聚核苷酸”一词包括了自然界中发现的那类低聚核酸部分，例如DNA和RNA的脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸结构，以及能与自然界中发现的核酸相结合的那些人造类似物。本发明的低聚核苷酸可以以通过磷酸二酯键合的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸单体，或以通过磷酸甲酯键、硫代磷酸酯键或其它键键合的类似物为基础。它们还可以包含具有不同的碱基结构或其它变化，但仍保留着与天然存在的DNA和RNA结构键合的能力的单体部分。这些低聚核苷酸可以通过本领域熟知的方法制备，例如使用现成的商用机械和可自Perkin-Elmer/Applied Biosystems(Foster City，CA)得到的试剂来制备。
磷酸二酯键合的低聚核苷酸对于血清或细胞内的核酸酶的作用特别敏感，因此，在一项优选的实施方案中本发明的低聚核苷酸是硫代磷酸酯或磷酸甲酯连接的类似物，它们已显示出有抗核酸酶性。本领域技术人员能够选择用于本发明的其它键合。
针对特定基因的反义低聚核苷酸的相对活性一般与其和目标基因的AUG起始密码子的相对位置成反比。在先有技术中已知，位于产生HBsAg的PLC/PRF/5细胞中染色体整合的HBV表面抗原(HBsAg)基因(S基因)序列的AUG起始密码子下游超过60个碱基处的反义低聚核苷酸导向序列，对于抑制HBsAg产生是无效的，而距离AUG在20个碱基内的低聚核苷酸能抑制HBsAg产生的50-90％。因此，优选选择一种以HBV表面抗原基因序列为目标的反义低聚核苷酸，使得该低聚核苷酸在基因的AUG起始密码子的约25个碱基内杂交。在美国专利5,646,262(Korba等)中描述了优选的针对HBV表面抗原基因的低聚核苷酸，包括：(SEQ ID NO：1)CTTAGGACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：2)GACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：3)AGGACTACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID No.：4)TACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：5)TCTTCCCCAGGATCCT；(SEQ IDNO.：6)TTTGGGGCGGACATTG；(SEQ ID NO.：7)CCTAAGAACAGTTGTT；(SEQ ID NO.：8)GTACAAGTCGCGTCCCAGG；(SEQ ID NO.：9)TAGGAGCTCTTCTAAC；(SEQ ID N0.：10)TATTCCCTAGTCTTGT；(SEQ IDNO.：11)CAAGAGGTACAAGTC；(SEQ ID NO.：12)CGACCACCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：13)CCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：14)TAAGACGGGGTA；(SEQ ID NO.：15)GACGGGGTACGACAT；(SEQ ID NO.：16)GTACGACATCTAGAA.在授予Isis pharmaceuticals，Inc.的美国专利5,985,662中公开了用于治疗HDV感染的反义低聚核苷酸的其它实例，包括：(SEQ ID NO：17)CCTGATGTGATGTTCTCCAT；(SEQ ID NO：18)GAACTGGAGCCACCAGCAGG；(SEQ ID NO：19)GAAAGATTCGTCCCCATGC；和(SEQ ID NO：20)CCACTGCATGGCCTGAGGATG。
为了选择反义低聚核苷酸的优选长度，必须达到一种平衡以获得最有利的特性。长度为10-15个碱基的较短的低聚核苷酸容易进入细胞，但基因专一性低。相反，较长的20-30个碱基的低聚核苷酸具有优越的基因专一性，但摄入细胞的速度降低。参见Stein et al.，PHOSPHOROTHIOATE OLIGODEOXYNUCLEOTIDE ANALOGUESin“Oligodeoxvnucleotides-Antisense Inhibitors of Gene Expression”Cohen，Ed.McMillan Press，London(1988)。在一项优选实施方案中，本发明设想使用约14-25个核苷酸长度的低聚核苷酸。VII.L-FMAU的合成
本发明公开的L-核苷酸可以按以下的详细说明或本领域技术人员已知的其它方法制备。
参看图3，由L-木糖(1a)开始，关键中间体1-O-乙酰-2，3，5-三-O-苯甲酰-α-呋喃核糖(10)以20％的总产率合成(L.Vargha，Chem.Ber.，1954， 87，1351；Holy，A.等，Procedures in Necleic Acid Chemistry，V1，163-67)。如图4所示，化合物10也可以用更贵的起始物L-核糖合成(Holy，A.，et al.，Synthetic Proceduces in Neucleic AcidChemistry，VI，163-67)。图3说明了化合物10的另一合成方法(产率53％)，随后将其在C2处氟化(J.Org.Chem.1985，50，3644-47)，得到1，3，5-三-O-苯甲酰-2-脱氧-2-氟-L-呋喃阿糖(13)，它与甲硅烷基化的胸腺嘧啶经由溴化糖进行缩合，得到被保护的L-FMAU。1，2-二-O-异亚丙基-α-L-呋喃木糖(3)
向650ml无水丙酮中加入4ml浓硫酸、5g分子筛(4A)、80g无水硫酸酮和50gL-木糖，将混合物在室温下搅拌36小时，过滤并用丙酮充分洗涤。合并的滤液用氨水中和，然后蒸发至干。加入乙酸乙酯(200ml)，然后过滤并蒸发，得到的油溶于250ml 0.2％盐酸溶液中，室温下搅拌2.5小时。用饱和NaHCO3将pH调节至8，随后蒸发至干，残余物用乙酸乙酯萃取。除去溶剂，得到黄色油状的化合物3(41.7g，82.3％)。1H-NMR(CDCl3)：δ5.979(d，J＝3.78Hz，1H，H-1)；4.519(d，J＝3.6Hz，1H，H-2)；4.308(bd，1H，H-3)；4.080(m，3H，H-4和H-5)；1.321(s，3H，CH3)；1.253(s，3H，CH3).1，2-二-O-异亚丙基-3，5-二-O-邻甲苯基磺酰-α-L-呋喃木糖(4)
将化合物3(40g，210mmol)在500ml无水吡啶中于0℃下搅拌，同时逐滴加入溶于100ml CHCl3中的TsCl(75g，393mmol)。3小时后，象上面一样地加入另一份TsCl(50g，262mmol)在50ml CHCl3中的溶液。将溶液在室温下搅拌24小时。然后在0℃下冷却，加10ml水，在室温下搅拌30分。将反应混合物倒入500ml冰水中，用CHCl3萃取(150ml×4)，用1.5M H2SO4(150ml×4)和饱和NaHCO3溶液(200ml×2)洗，干燥(MgSO4)。除去溶剂后得到棕色浆体，它在自乙醇中结晶后得到白色固体化合物4(103.8g，99％)。1H-NMR(CDCl3)：δ7.282，7.836(m，8H，OTs)；5.849(d，J＝3.51Hz，1H，H-1)；4.661，4.779(m，2H，H-3和H-4)；4.193(dd，1H，H-2)；4.011(d，2H，H-5)；2.448，2.478(2s，6H，-OTs)；1.261，1.320(2s，6H，CH3).1，2-二-O-乙酰基-3，5-二-O-对甲苯基磺酰-α，β-呋喃木糖(5)
将化合物4(70g，140.5mmol)溶于700ml冰醋酸和100ml乙酸酐中，同时在0℃下逐滴加入50ml浓硫酸。形成的溶液在室温下搅拌过夜，然后倒入1升冰水中，用CHCl3(200ml×4)萃取，用饱和NaHCO3洗，干燥(MgSO4)。减压除去溶剂后，得到浆状的化合物5(84.2g，粗产率110％)。甲基-3，5-二-O-对甲苯磺酰基-α，β-呋喃木糖(6)
将粗产物5(80g)在室温下于500ml 1％HCl/CH3OH中搅拌30小时。减压除去溶剂，残余物溶在300ml CHCl3中，用饱和NaHCO3洗，干燥(MgSO4)。除去溶剂后得到浆状化合物6(60g，自化合物4起，产率90％)。甲基-2-O-苯甲酰-3，5-二-O-对甲苯磺酰-α，β-呋喃木糖苷(7)
将浆状化合物6(60g，127mmol)溶于200ml吡啶中并在0℃下搅拌，同时逐滴加入苯甲酰氯(40ml，345mmol)，将形成的溶液在室温下搅拌17小时。将其浓缩至约50ml，然后倒入300ml冰水中，用CHCl3萃取，用3N H2SO4和饱和NaHCO3洗，干燥(MgSO4)。蒸除溶剂后，得到浆状化合物7(71g，97％)。甲基-2，3，5-三-O-苯甲酰-α-β-L-呋喃核糖苷(9)
将浆体7(70g)和苯甲酸钠(100g，694mmol)悬浮在1200ml DMF中，并在回流下机械搅拌16小时。冷却到室温后倒入1升冰水中，用乙醚萃取，干燥(MgSO4)。蒸除溶剂后得到浆体(50g，8a和8b)，将其溶于180ml吡啶，在室温下苯甲酰化(BzCl，20ml，172mmol)17小时。经后处理，得到棕色浆体9(48g，自化合物7起83％)。1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰-β-L-呋喃核糖(10)
化合物9(26g，54.6mmol)用275ml冰乙酸、55ml乙酸酐和16ml浓硫酸在0℃至室温下处理17小时。然后倒入1升冰水中，用氯仿萃取(200ml×4)。合并的萃取液用饱和NaHCO3洗并干燥(MgSO4)。除去溶剂，得到棕色浆体，将其用乙醇处理，得到化合物10，为白色固体。(8.8g，32％)。m.p.124.7℃，文献值.129°-130℃；D型；130°-131℃[α]D＝-45.613(C 1.0，CHCl3)，D型：[α]D＝+44.2。1H-NMR(CDCl3)：δ7.317，8.134(m，15H，OBz)；6.437(s，1H，H-1)；5.835(m，2H，H-2和H-3)；4.649(m，3H，H-4和H-5)；2.003(s，3H，CH3COO--).1-O-乙酰基-2，3，5-三-O-苯甲酰-β-L-呋喃核糖(自L-核糖)
将L-核糖(5g，33.3mmol)悬浮于120ml的1％ HCl/MeOH中并在室温下搅拌3小时，此时得到透明的溶液。加入30ml无水吡啶使反应停止，然后减压蒸发。形成的浆体与吡啶(30ml×2)共蒸发，随后溶于80ml无水吡啶中，在0℃搅拌，同时逐滴加入苯甲酰氯(20ml，172mmol)。在室温下搅拌17小时后，反应已完全。加水(10ml)，将混合物在室温下搅拌0.5小时，然后浓缩至约50ml，倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取，依次用3N H2SO4(30ml×2)和饱和碳酸氢钠(30ml×3)洗，干燥(MgSO4)。除去溶剂，得到浆状化合物9共13g。
将粗制的化合物9溶于80ml HBr/AcOH(45％，W/V)中，室温下搅拌1.5小时。向此混合物中加入50ml冰乙酸，所形成的溶液在0℃搅拌，同时慢慢加入34ml水以保持温度低于7℃，然后在室温下搅拌1小时，倒入200ml冰水中，用氯仿(50ml×5)萃取，合并的萃取液用饱和的NaHCO3溶液洗，用MgSO4干燥。除去溶剂得到浆状物(13g)，将其溶于40ml无水吡啶中，在0℃下搅拌，然后逐滴加入乙酸酐(14ml，148.4mmol)。反应完成后，将其倒入150ml冰水中，用氯仿(50ml×4)萃取，依次用3N H2SO4(30ml×2)，饱和NaHCO3(50ml×2)洗，干燥(MgSO4)。除去溶剂，并用甲醇处理，得到白色固体10(9.2g，自L-核糖起的产率53.7％)。1，3，5-三-O-苯甲酰-α-L-呋喃核糖(11)
将化合物10(9g，17.84mmol)于100ml CH2Cl2中在0℃下搅拌，同时一次加入含HBr(3.2g，30.5mmol)的70ml CH2Cl2。将该混合物在0℃搅拌3.5小时，加水(55ml)，将混合物在室温下搅拌18小时。分离出有机层，用饱和NaHCO3水溶液洗，用MgSO4干燥。溶剂蒸发后得到泡沫体，它在自CH2Cl2和正己烷中重结晶后，得到白色固体11(6.2g，75.5％)。m.p.137°-138℃，文献值.140°-141℃，[α]D＝-81.960(C 0.55，CHCl3)；D型：[α]D＝+83.71。1H-NMR(CDCl3)：δ7.312，8.187(m，15H，OBz)；6.691(d，J＝4.59 Hz，H-1)；5.593(dd，J4.3＝6.66Hz；J2-3＝1.8Hz，1H，H-30；4.637，4.796(m，4H，H-2，H-4和H-5)；2.3(b，OH).1，3，5-三-O-苯甲酰-2-O-咪唑磺酰基-α-L-呋喃核糖(12)
将化合物11(5.94g，12.84mmol)在50ml无水CH2Cl2中于-15℃(干冰/CCl4)下搅拌。依次加入无水DMF(15ml)和磺酰氯(3.2ml，3.98mmol)。将溶液在-15℃下搅拌30分，然后在室温放置4小时。将咪唑(8.7g，12.78mmol)分三批加入到于冰浴中冷却的反应混合物中，然后在室温下搅拌17小时。将混合物倒入150ml冰水中，水相用CH2Cl2(50ml×3)萃取。合并的有机层用水洗，干燥(MgSO4)。在柱上纯化后(己烷：EtOAc/5∶1-1∶1)，得到白色固体12(3.7g，49％)。m.p. 124.5°-125.5℃，文献值.129℃；[α]D＝-68.976；D型：+66.154。1H-NMR(CDCl3)：δ6.9，8.2(m，18H，Ar-H)；6.67(d，J＝4.4Hz，1H，H-1)；5.59(dd，1H，H-3)，5.21(dd，1H，H-2)；4.5，4.8(m， 3H，H-4和H-5).1，3，5-三-O-苯甲酰-2-脱氧-2-氟-α-L-呋喃阿糖(13)
将化合物12(3.33g，562mmol)和KHF2(1.76g，22.56mmol)在30ml 2，3-丁二醇中的悬浮液于氩气下搅拌。将其加热至150℃，同时加入1ml HF/H2O(48％，27.6mmol)，将混合物在160℃搅拌1.5小时。加入冰/盐水使反应停止，然后用二氯甲烷萃取(50ml×4)，合并的萃取液用盐水、水、饱和NaHCO3溶液洗，用无水MgSO4和活性炭(Darco-60)干燥。将其倒在硅胶柱(5cm×5cm)上，依次用二氯甲烷和乙酸乙酯洗，得到浆状物，自95％EtOH中结晶，得到化合物13(1.3g，49.8％)。m.p.77°-78℃，文献值：82℃1H-NMR(CDCl3)：δ7.314，8.146(m，15H，OBz)；6.757(d，J＝9.1Hz，1H，H-1)；5.38(d，J＝48.5Hz，1H，H-2)；5.630(dd，J＝22.5Hz，1H，H-3)；4.768(m，3H，H-4和H-5).
将化合物13(464mg，1mmol)溶于10ml二氯甲烷中，同时加入1.4ml HBr/ArOH(45％w/v)。将该溶液在室温下搅拌24小时，然后蒸发至干，残余物溶在20ml二氯甲烷中，用水、饱和NaHCO3溶液洗，干燥(MgSO4)。过滤和蒸发后得到溴化糖14(根据TLC，产率100％)。N，-(2′-脱氧-2′-氟-3′，5′-二-O-苄基-β-L-呋喃阿糖基)胸腺嘧啶(17)
向化合物13(400mg，0.86mmol)在无水CH2Cl2(10ml)中的溶液加入溴化氢/乙酸(45％w/v，1.5ml)，将形成的溶液在室温下搅拌17小时。蒸发溶剂后与甲苯共蒸发，得到化合物14。
与此同时，将胸腺嘧啶(215mg，1.72mmol)在六甲基二硅胺烷(25ml)中于氮气下回流17小时，得到均匀的溶液。蒸发溶剂后，得到甲硅烷基化的胸腺嘧啶。
将化合物14在二氯乙烷(50ml)中的溶液加到甲硅烷基化的胸腺嘧啶中，形成的溶液在氮气下回流3天。加水后用CHCl3萃取。有机层用水和盐水洗，用MgSO4干燥。蒸发溶剂后得到粗产物，将其用2％MeOH/CHCl3在制备型TLC上纯化，得到化合物17(235mg，58％)，m.p.99°-101℃。UV(甲醇)：230，264nm，[α]D＝+22.397。1H-NMR(CDClCl3)：δ7.343-8.389(m，12H，Ar-H，NH)；6.34(dd，JH-H＝2.97Hz，JF-H＝28.32Hz，1H，H-1＇)；5.383(dd，JH-H＝2.7Hz，JF-H＝63.27Hz，1H，H-2＇)；5.565(dd，1H，H-3＇)；4.812(d，2H，H-5＇)；4.466(m，1H，H-4＇)；1.775(s，3H，CH3)分析结果(C24H21N2O7F)，C：61.01；H，4.57；N：5.73；F：3.92.N，-(2′-脱氧-2′-氟-β-L-呋喃阿糖基)胸腺嘧啶(18)
化合物17(145mg，0.309mmol)用NH3/CH3OH在室温下处理18小时。蒸发溶剂并在制备型TLC(15％MeOH/CHCl3)上纯化后，得到化合物18(70mg，87.5％)。m.p.174°-175℃。UV：264nm，[α]D＝104.36。H-NMR(DMSO-d6)：δ11.401(s，1H，NH)；7.575(s，1H，H-6)；6.093(dd，JH-H＝4.41Hz，JF-H＝15.6Hz，H-1＇)；5.844(d，1H，3＇-OH)；5.019(dt，JF-H＝53.3Hz，1H，H-2＇)；5.087(t，1H，5＇-OH)；4.194(dq，1H，H-3＇)；3.647(m，3H，H-4＇和H-5＇)；1.781(s，3H，CH3).分析结果(C10H13N2FO5)，C：44.80；H：4.97；N：10.04；F：7.03.L-FMAU的5′-烷基和一、二及三磷酸化衍生物
在5′位上有一个烷基的L-FMAU衍生物可以通过胸腺嘧啶碱用氢化钠和叔丁基二苯基硅氧保护基的保护作用制备。5′-羟基的苯甲酰化可以用苯甲酰氢化物实现。形成的化合物可以用氟化四丁铵去甲硅烷基化。向5′-位上引入烷基是用氢化钠和烷基溴完成的，苯甲酰基团可以用碱除去。
L-FMAU的一、二和三磷酸衍生物可以按下述制备。一磷酸酯可以根据Imai等的步骤(J.Org.Chem.，34(6)，1547-1550(June 1969))制备。例如，约100mg  L-FMAU与约280μl磷酰氯在约8ml无水乙酸乙酯中在约0℃下搅拌约4小时。用冰停止反应。水相在活性炭柱上纯化，用5％氢氧化铵在乙醇和水的1：1混合物中的溶液洗脱。蒸除洗脱剂后得到一磷酸L-FMAU-5′铵。
二磷酸酯可以按照Davisson等的步骤(J.Org.Chem.，52(9)，1794-1801(1987))制备。二磷酸L-FMAU可以由相应的甲苯磺酸酯制备，后者可以制备如下：核苷与甲苯磺酰氯在吡啶中于室温下反应约24小时，按常规方式对产物进行后处理(例如，洗涤、干燥和结晶)。
三磷酸酯可按Hoard等的方法(J.Am.Chem.Soc.，87(8)，1785-1788(1965))制备。将L-FMAU活化(按照本领域技术人员已知的方法制备咪唑酰胺)并在DMF中用焦磷酸三丁铵处理。此反应主要得到核苷的三磷酸酯，其中含一些未反应的一磷酸酯及少量二磷酸酯。用DEAE柱进行阴离子交换色谱法纯化，随后以例如四钠盐的形式分离出三磷酸酯。VIII.示例性实施例
使用土拨鼠作为慢性HDV感染的实验模型以确定L-FMAU治疗对HDV复制的作用。将慢性感染WHV的土拨鼠用自实验室的感染性克隆衍生得到的适应土拨鼠的HDV接种物感染。11只被感染的动物中有9只被确定受到慢性HDV感染，其依据是在治疗开始前至少11个月中有至少74％的抽血日查到RT/PCR可检测的HDV病毒血(Niro等(1997)Hepatology  25，728-734)。研究开始前的病毒血症的持续时间为11.4-20个月，阳性抽血日占74-100％。治疗组的动物(4)每日服用10mg/kg L-FMAU，对照组中的动物(5)给予安慰剂。在治疗开始前以及第2、4、8、12、16及20周获取血清样品。对血清样品进行WHV DNA、WHV表面抗原和HDV RNA分析。
所有接受治疗的动物在治疗4周后的血清WHV DNA，都象先前对此化合物观察到的一样(Peek，S等(2001)Hepatology  23，254-66)，有显著的减小(超过107倍，图6B)。治疗动物中除一只(动物4543)外，在12周内都观察到表面抗原浓度减小近1000倍(图6C)。四只动物中的三只的HDV RNA经16周治疗后变得检测不到(图6A)。对照组中这些病毒指标均未观察到任何明显的变化(图7A、图7B、图7C、图8)。
特别是，减小的HDV病毒血与表面抗原的血清浓度降低有相关关系。在乙型肝炎表面抗原浓度降低100倍或更多之后，特别是在降低到低于1微克/毫升之后，HDV病毒血变得不可检测。在治疗的剩余阶段仍保持这一作用。在表面抗原浓度降低的所有动物中HDV RNA都变得不可检测。治疗组中的一只动物(动物4543)的表面抗原浓度没有降低(虽然WHV DNA浓度降低)，此动物的血中HDV浓度也保持高值。
当其中WHsAg减小的三只用L-FMAU治疗的动物合成一组(WHsAg响应组)时，很显然，与治疗前的水平及对照组在任何时刻的浓度相比，HDV RNA浓度显著下降(图8)。用Student t-试验进行的统计分析表明，这一显著下降是高度统计显著性的(在WHsAg响应组中，第0周对第20周的成对单侧比较，p＝0.02，在未治疗的WHsAg响应组中，第20周浓度的不成对单侧比较的p＝0.02)。
发现L-FMAU是慢性感染的动物中HDV的有效抑制剂，这部分地是由于对于表面抗原表达的强烈抑制。先前的研究已显示了慢性HDV病毒血的水平与疾病严重性的关系(Smedile，A.et al.(1986)Hepatology 6，1297-302；Smedile，A.et al.(1987)Prog Clin Biol Res 234，235-41；Niro，G.A.et al.(1997)Hepatology 25，728-734；Shakil，A.O.et al.(1997)Virology234，160-7)。因为对于HDV没有象HBV一样的长期存在的贮藏所(即，没有共价闭合的环形DNA)，而且HDV感染的细胞的半寿期可以短至2周(Netter，H.J.等(1993)J.Virol  67，3357-62)，根据这些结果，L-FMAU和其它的核苷、非核苷及核苷类似物可以一起用来通过延长病毒血降至低水平的作用而消除所治疗的患者中的HDV感染。IX.药物组合物的制备
患有由HDV感染引起的疾病的人们可以通过在可药用的载体或稀释剂存在下向患者施用有效数量的核苷或核苷类似物或其可药用盐或前药得到治疗，如同用标准免疫测定法在血清或血浆中测定的，它们能在体外或体内将宿主中的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的浓度降到比治疗前低100倍或更多，优选低200或500倍，或者在体内将HBsAg降至不超过1微克/毫升，优选不超过0.5或0.1微克/毫升。在一项优选的实施方案中，该核苷是2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷或其可药用盐或前药。活性化合物(或其前药)可以以任何合适的途径，例如口服、非肠道、静脉内、皮内、皮下或局部方式，以液体或固体形式施用。
活性化合物(或其前药)是包含在可药用的载体或稀释剂中，其数量足以向患者输送治疗有效量的化合物，从而在体内降低HDV病毒血或其症状，而不会在受治疗的患者中引起严重的毒性作用。“降低数量”是指活性组分的数量足以使用例如某种测定方法(例如本文所述的方法或其它已知方法)测得的HDV病毒血浓度减小。
对于所有上述条件，化合物的优选剂量范围是每kg体重每天1-50mg，优选1-20mg，更一般的是每天每kg体重0.1至约100mg。可药用的衍生物的有效剂量可以根据要释放出的母体核苷的重量计算。如果该衍生物自身具有活性，则有效剂量可以如上所述利用衍生物的重量估算，或者用本领域技术人员已知的其它方法估算。
化合物宜以任何合适的单位剂型的形式服用，包括但不限于每单位剂型含7-3000mg，优选含70-1400mg活性组分。口服剂量为50-1000mg通常是方便的。
活性组分的服用方式应使其血浆峰值浓度达到约0.2-70μM，优选约1.0-10μM。这可以通过例如静脉内注射活性组分的0.1-5％溶液(优选盐水溶液)或以活性组分大丸剂的形式给药来实现。
活性化合物在药物组合物中的浓度取决于该药物的吸收、失活和排泄速度以及本领域技术人员已知的其它因素。应当指出，剂量值还随要减缓的病症的严重程度而变。还应该了解，对于任何特定的对象，具体的用药方案应当根据个别需要和管理或指导药物组合物服用的人员的专业判断而随时调整，而且这里所提到的浓度范围仅是示例性的，无意用来限制所述组合物的范围或实施。活性组合物可以一次给药，也可以分成几个较小的剂量以各种不同的时间间隔施用。
活性组合物的一种优选的用药方式是口服。口服组合物一般包括惰性稀释剂或可食性载体。它们可以包封在明胶胶囊中或压制成药片。为了口服治疗用药，活性化合物可以与赋形剂掺混，用于片剂、锭剂或胶囊。可以包含药学上相容的粘合剂和/或辅助材料作为组合物的一部分。
片剂、丸剂、胶囊、锭剂等可以含有下述的任何成分或性质类似的化合物：粘合剂、例如微晶纤维素、黄蓍胶或明胶；赋形剂，如淀粉或乳糖；崩解剂，如藻酸，Primogel(羧甲基淀粉钠)或玉米淀粉；润滑剂，如硬脂酸镁或Sterotes；滑动剂，如胶体二氧化硅；甜味剂，如蔗糖或糖精；或风味剂，如薄荷、水杨酸甲酯或桔子香精。在剂量单位形式是胶囊的情形，除了以上各类物质之外，还可包括液体载体，例如脂肪油。此外，剂量单位形式可以包含改变剂量单位的物理形式的各种其它物质，例如糖、虫胶或其它肠溶剂的包衣。
本发明化合物可以作为酏剂，悬混剂、糖浆剂、水剂、咀嚼剂等的一种成分施用。糖浆剂除了活性化合物外，还可含有作为甜味剂的蔗糖和某些防腐剂、染料和着色剂、香料。化合物或其可药用的衍生物或盐也可以与不损害所期望的功能的其它活性物混合，或与补充所期望功能的物质混合，例如抗生素、抗真菌剂、消炎剂或其它抗病毒剂等，包括核苷抗HIV化合物。用于肠道外、皮内、皮下或局部给药的溶液剂或悬混剂可以包含以下组分：无菌的稀释剂，如注射用水、盐水、不挥发油、聚乙二醇、甘油、丙二醇或其它合成溶剂；杀菌剂，如苯甲醇或羟基苯甲酸甲酯；抗氧化剂，如抗坏血酸或亚硫酸氢钠；螯合剂，如乙二胺四乙酸；缓冲剂，如乙酸盐、柠檬酸盐或磷酸盐；以及调节渗透压的试剂，例如氯化钠或葡萄糖。肠道外制剂可以封在安瓿瓶、一次性注射器或者玻璃或塑料制的多剂量小瓶中。
如果是静脉内给药，优选的载体是生理盐水或磷酸盐缓冲液(PBS)。
在优选的实施方案中，将活性化合物用能保护该化合物不会从体内迅速排出的载体配制，例如受控释药制剂，包括植入剂和微胶囊化的释药体系。可以使用可生物降解的、生物相容性聚合物，例如乙烯乙酸乙烯酯、聚酐、聚乙醇酸、胶原、聚原酸酯和聚乳酸。这类制剂的制备方法对于本领域技术人员是显而易见的。各种材料也可以由AlzaCorporation购得。
脂质体悬浮剂(包含以受感染的带有病毒抗原的单克隆抗体的细胞为目标的脂质体)也优选作为可药用载体。它们可以按照本领域已知的方法，例如美国专利4,522,811(该专利在本文中全文引用作为参考)中所描述的方法制备。例如，脂质体制剂可以制备如下：将合适的类脂(例如硬脂酰磷脂酰乙醇胺、硬脂酰磷脂酰胆碱、花生酰磷脂酰胆碱和胆固醇)溶于有机溶剂中，随后将其蒸发，在容器的表面上留下干燥的类脂的薄膜。然后向容器中加入活性化合物或其一磷酸酯、二磷酸酯和/或三磷酸酯衍生物的水溶液。用手摇动容器使类脂物质从容器的边面脱离，将类脂聚集体分散，从而形成脂质体悬浮液。
本发明已参照其优选实施方案作了说明。对于本领域的技术人员，根据以上对本发明的详细描述，显然可以对本发明进行修改和变动。所有这些变动和修改都将包括在所附权利要求的范围之内。

Claims (38)

1.一种治疗丁型肝炎感染的方法，包括：对受丁型肝炎病毒感染的宿主施用有效数量的一种核苷或核苷类似物化合物，或其可药用盐或前药，它能将宿主中的乙型肝炎表面抗原浓度降低得比治疗前数值低100倍或更多。
2.权利要求1的方法，其中该化合物具有以下化学式，或是其可药用盐或前体
Figure A0181041300021
其中R是5-甲基尿嘧啶(也称作胸腺嘧啶)，R′是氢、酰基、烷基、一磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯，或是稳定化的磷酸酯衍生物，包括5′-醚脂或5′-磷脂。
3.权利要求2的方法，其中化合物是2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷，或其可药用的盐或前药。
4.权利要求3的方法，其中化合物以对映体富集的形式施用。
5.一种治疗丁型肝炎感染的方法，包括：向受丁型肝炎病毒感染的宿主施用有效数量的一种核苷或核苷类似物化合物，或其可药用盐或前药，它能将宿主中前S1抗原的浓度降低得比治疗前数值低100倍或更多。
6.一种治疗受HDV感染的宿主的方法，包括施用有效数量的核苷或核苷类似物，它能将受感染的宿主中的HBsAg降低到血清或血浆中测定值不超过每毫升1微克。
7.一种治疗受HDV感染的宿主的方法，包括服用有效数量的一种分子量小于500的非核苷有机小分子，而且它(1)不是自然界发现的生物物质或是保留了所期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是一种蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素α-1；它将受感染的宿主的血清或血浆中测得的HBsAg降低至少约100倍或更多，或者将受感染的宿主的HBsAg降至不超过每毫升约1微克。
8.一种治疗受HDV感染的宿主的方法，包括服用有效数量的一种分子量小于500的非核苷有机小分子，而且它(1)不是自然界发现的生物物质或是保留了所期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是一种蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素α-1；它将受感染的宿主的前S1抗原降低至少约100倍或更多。
9.一种筛选对于治疗HDV感染有效的化合物的方法，其中包括评估该化合物是否在体内或体外将血清或血浆中测定的乙型肝炎表面抗原的表达降低到比治疗前的数值低100倍或更多，或者降低到不超过每毫升1微克。
10.一种筛选对于治疗HDV感染有效的化合物的方法，包括评估该化合物是否在体内或体外将前S1抗原的表达降低到比治疗前数值低100倍或更多。
11.一种治疗HDV感染的方法，包括服用至少一种以乙型肝炎表面前S1抗原为目标的反义低聚核苷酸。
12.权利要求11的方法，其中的反义低聚核苷酸是选自：(SEQ ID NO：1)CTTAGGACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：2)GACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：3)AGGACTACACTACAAGAGGTTA；(SEQ ID NO.：4)TACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：5)TCTTCCCCAGGATCCT；(SEQ IDNO.：6)TTTGGGGCGGACATTG；(SEQ ID NO.：7)CCTAAGAACAGTTGTT；(SEQ ID NO.：8)GTACAAGTCGCGTCCCAGG；(SEQ ID NO.：9)TAGGAGCTCTTCTAAC；(SEQ ID NO.：10)TATTCCCTAGTCTTGT；(SEQ IDNO.：11)CAAGAGGTACAAGTC；(SEQ ID NO.：12)CGACCACCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：13)CCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：14)TAAGACGGGGTA；(SEQ ID NO.：15)GACGGGGTACGACAT；和(SEQ ID NO.：16)GTACGACATCTAGAA
13.权利要求11的方法，其中的反义序列是选自：
         (SEQ ID NO.：17)CCTGATGTGATGTTCTCCAT；(SEQ ID NO.：18)GAACTGGAGCCACCAGCAGG；(SEQ ID NO.：19)GAAAGATTCGTCCCCATGC；和(SEQ ID NO.：20)CCACTGCATGGCCTGAGGATG.
14.一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，其步骤包括：a)对受土拨鼠肝炎病毒慢性感染、同时还感染了适应土拨鼠的HDV接种物的土拨鼠，施用一种试验化合物；b)监测用试验化合物治疗的动物中表达的肝炎表面抗原浓度；c)将用试验化合物治疗的动物中表达的肝炎表面抗原浓度与未用试验化合物治疗的对照动物比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中肝炎表面抗原的浓度显著低于未用试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原的浓度，在优选的实施方案中，血清中浓度不高于每毫升1微克。
15.权利要求14的方法，其中用试验化合物治疗的动物中的肝炎表面抗原和肝炎D RNA的浓度同时减小。
16.一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，包括以下步骤：a)对已经转染了人类乙型肝炎病毒的离体细胞，例如2，2，15细胞，施用试验化合物；b)监测用试验化合物处理的该细胞内表达的肝炎表面抗原的浓度；c)将用试验化合物处理的细胞内的肝炎表面抗原浓度与未用试验化合物处理的对照细胞比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中肝炎表面抗原的浓度显著低于未用试验化合物处理的肝炎表面抗原浓度，在优选的实施方案中，比对照样降低100倍或更多。
17.权利要求1的方法，其中还包括与能降低宿主中乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的浓度或已知以其它方式治疗丁型肝炎感染的其它药剂一起，以组合或交替方式施用该化合物。
18.权利要求17的方法，其中的药剂是选自核酶，细胞因子(包括白介素)，干扰素，乙型肝炎表面抗原的抗体或乙型肝炎表面抗原的转录因子或其它介体；乙型肝炎表面抗原或乙型肝炎表面抗原表达的转录因子或其它介体；蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素-α1。
19.权利要求18的方法，其中的药剂是一种抑制乙型肝炎表面抗原或前S1抗原的表达的反义低聚核苷酸。
20.权利要求19的方法，其中的反义低聚核苷酸具有以下的一种序列：SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，SEQ ID NO：18，SEQ ID NO：19，和SEQ ID NO：20。
21.一种鉴别对于治疗HDV感染有效的化合物(包括核苷或核苷类似物)的方法，其步骤包括：a)对已经转染以便同时表达乙型肝炎表面抗原或前S1抗原和丁型肝炎的细胞施用试验化合物；b)监测用试验化合物处理的细胞胞内表达并分泌到细胞介质中的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平；c)将用试验化合物处理的细胞中分泌的乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平与未用试验化合物处理的对照细胞比较；d)选择步骤c)中的化合物，其中乙型肝炎表面抗原或前S1抗原及丁型肝炎病毒的水平显著低于从未用化合物处理的细胞中分泌的乙型肝炎表面抗原的水平。
22.核苷或核苷类似物，或其可药用盐或前药在治疗受丁型肝炎感染的宿主方面的应用，其中该化合物能将宿主中乙型肝炎表面抗原的水平降低到比治疗前数值低100倍或更多。
23.权利要求22的应用，其中化合物是下式化合物或其可药用盐或前药其中R是5-甲基尿嘧啶(也称作胸腺嘧啶)，R′是氢、酰基、烷基、单磷酸酯、二磷酸酯、三磷酸酯，或是稳定化的磷酸酯衍生物，包括5′-醚脂或5′-磷脂。
24.权利要求23的应用，其中化合物是2′-氟-5-甲基-β-L-呋喃阿糖基尿苷，或其可药用盐或前药。
25.权利要求22的应用，其中化合物以对映体富集的形式服用。
26.核苷或核苷类似物化合物，或其可药用盐或前药，在治疗受丁型肝炎病毒感染的宿主中的应用，其中该化合物将宿主中的前S1抗原的浓度降低到比治疗前数值低100倍或更多。
27.核苷或核苷类似物化合物，或其可药用盐或前药，在治疗感染乙型肝炎的宿主中的应用，其中该化合物将受感染的宿主血清或血浆中测得的乙型肝炎表面抗原的浓度降低至不超过每毫升约1微克。
28.一种分子量小于500的非核苷有机小分子在治疗感染丁型肝炎的宿主中的应用，该分子(1)不是自然界中发现的生物物质或保持其期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素-α1，其中由血清或血浆中测得，该分子将受感染的宿主中的HBsAg降低至少约100倍或更多，或者将受感染的宿主中的HBsAg降低到不超过每毫升约1微克。
29.一种分子量小于500的非核苷有机小分子在治疗感染丁型肝炎的宿主中的应用，该分子(1)不是自然界中发现的生物物质或保持其期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素-α1，其中，该分子将受感染的宿主中的前S1抗原降低至少约100倍或更多。
30.一种以乙型肝炎表面抗原为目标的反义低聚核苷在治疗感染丁型肝炎病毒的宿主中的应用。
31.权利要求30的应用，其中的反义低聚核苷是选自：
      (SEQ ID NO.：1)CTTAGGACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：2)GACTACACTACAAGAG；(SEQ ID NO.：3)AGGACTACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：4)TACACTACAAGAGGTA；(SEQ ID NO.：5)TCTTCCCCAGGATCCT；(SEQ ID NO.：6)TTTGGGGCGGACATTG；(SEQ ID NO.：7)CCTAAGAACAGTTGTT；(SEQ IDNO.：8)GTACAAGTCGCGTCCCAGG；(SEQ ID NO.：9)TAGGAGCTCTTCTAAC；(SEQ ID NO.：10)TATTCCCTAGTCTTGT；(SEQ IDNO.：11)CAAGAGGTACAAGTC；(SEQ ID NO.：12)CGACCACCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：13)CCTTTCTAAGACGGG；(SEQ ID NO.：14)TAAGACGGGGTA；(SEQ ID NO.：15)GACGGGGTACGACAT；和(SEQ ID NO.：16)GTACGACATCTAGAA
32.权利要求30的应用，其中的反义序列是选自：(SEQ ID NO：17)CCTGATGTGATGTTCTCCAT；(SEQ ID NO：18)GAACTGGAGCCACCAGCAGG；(SEQ ID NO：19)GAAAGATTCGTCCCCATGC；和(SEQ ID NO：20)CCACTGCATGGCCTGAGGATG。
33.核苷或核苷类似物，或其可药用盐或前药，在制造用于治疗感染丁型肝炎的宿主的药物中的应用，其中该化合物将宿主中的乙型肝炎表面抗原的浓度降低到比治疗前数值低100倍或更多。
34.核苷或核苷类似物，或其可药用盐或前药，在制造用于治疗感染丁型肝炎病毒的宿主的药物中的应用，其中该化合物将宿主中前S1抗原的浓度降低到比治疗前数值低100倍或更多。
35.核苷或核苷类似物，或其可药用盐或前药，在制造药物中的应用，其中由血清或血浆中测得，该化合物将受感染的宿主中乙型肝炎表面抗原的浓度降低到不超过每毫升约1微克。
36.一种分子量低于500的非核苷有机小分子在制造用于治疗感染丁型肝炎的宿主的药物中的应用，该分子(1)不是自然界中发现的生物物质或保持其期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素α-1；其中由血清或血浆中测得，该分子将受感染的宿主中的HBsAg降低至少约100倍或更多，或将受感染的宿主中的HBsAg降低至不超过每毫升约1微克。
37.一种分子量低于500的非核苷有机小分子在制造用于治疗感染丁型肝炎病毒的宿主的药物中的应用，该分子(1)不是自然界中发现的生物物质或保持其期望活性的衍生物，包括蛋白质、抗体、激素、核酶、核酸或细胞因子；或(2)不是蛋白质-异戊二烯化转移酶抑制剂或胸腺素α-1；它将受感染的宿主中的前S1抗原降低至少约100倍或更多。
38.一种以乙型肝炎表面抗原为目标的反义低聚核苷酸在制造用于治疗感染丁型肝炎病毒的宿主的药物中的应用。
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PB01 Publication
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