CN106333960A

CN106333960A - 臭氧化油在肝病防治中的应用

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Publication number: CN106333960A
Application number: CN201610935354.4A
Authority: CN
Inventors: 李新平; 侯建生
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2016-11-01
Filing date: 2016-11-01
Publication date: 2017-01-18

Abstract

本发明涉及臭氧化油在肝病防治中的应用和与治疗肝病的药物联合用药，有效地预防和治疗乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。

Description

臭氧化油在肝病防治中的应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及臭氧化油用于肝病的预防、治疗和与治疗肝病的药物联合用药。

背景技术

Velio Bocci在《臭氧治疗学》一书中概述了使用低剂量的臭氧气体能够发挥许多有益功能，且无副作用，即臭氧疗法（见Velio Bocci撰写的《Oxygen-Ozone Therapy》，北京大学医学出版社，2004）。臭氧疗法可以通过多种给药途径来实现，并针对不同疾病产生不同的功效。臭氧化油外用作为抗菌剂、除臭剂用于褥疮和溃疡等皮肤病的治疗药物。因此，现已知臭氧具有氧化和抗菌作用。将臭氧化油直接灌胃用于幽门螺旋杆菌引起的胃炎的治疗。肌肉或皮下注射臭氧气体来治疗慢性病毒肝炎和血管性疾病。阴道直接通入臭氧气体能够治愈炎症和细菌感染。将臭氧气体直接与一定体积的血液在体外混合，再回输给患者被称为自体血疗法，能够调理人体内环境，降低机体的敏感性和增强机体免疫力。直肠直接吹臭氧气体能够改善帕金森病的症状（见Lamberto Re， Mohamed N. Mawsouf， SilviaMenendez， Olga S. Leon， Gregorio M. Sanchez， and Frank Hernandez 撰写的《OzoneTherapy: Clinical and Basic Evidence of Its Therapeutic Potential》，Archivesof Medical Research，2008， 39: 17-26）。腹腔给臭氧气体能够保护心脏免受急性心肌梗塞的损伤（Clara Di Filippo， Margherita Luongo， Raffaele Marfella， FrancaFerraraccio， Biagio Lettieri， Annalisa Capuano， Francesco Rossi， Michele D'Amico撰写的《Oxygen/ozone protects the heart from acute myocardial infarctionthrough local increase of eNOS activity and endothelial progenitor cellsrecruitment》，Naunyn-Schmied Arch Pharmacol，2010， 382:287–291）。从结构上看，尽管臭氧化油和臭氧气体（:O-O-O）并不是同一物质，但臭氧化油是通过对油的加成臭氧得到，故在其分子中具有臭氧化物结构，与臭氧气体的功能相似。以上各种给药途径均表明臭氧能够以气体的方式直接被机体吸收并发挥功能。臭氧气体的功能可能通过以下三个途径来实现：（1）、臭氧在体内通过生物化学反应，生成类似活性氧的物质（羟基自由基OH^-、超氧阴离子O₂ ^-等），广泛影响着机体氧化还原系统；（2）、臭氧能够引起内皮祖细胞聚集和促进一氧化氮（NO）的生成，起到舒张血管的作用；（3）、臭氧能够诱导骨髓干细胞到血管损伤部位，促进损伤血管修复重建，但具体机制尚不明确。

上述给药途径存在诸多缺陷：沿途与太多物质接触，难以保证气体进入机体的有效浓度。若给予过量极易诱发机体产生不适反应，且操作过程繁琐，再加上疗程较长，患者难以接受。尤其是自体血疗法，每周2～3次，连续10周为一疗程。本发明以油与臭氧加成的方式，得到臭氧化油，再将此油以肠溶胶囊包裹，能够克服直接使用臭氧气体的诸多缺点。既保证臭氧化油不与外界任何物质接触，在常态下亦可长期稳定保存；还能定量控制臭氧化油进入机体，从而避免通过其它给药方式给药，人为造成药量不当。臭氧化油肠溶胶囊的给药途径为直接口服，对机体伤害最小，操作简单易行，方便携带，为其推广奠定了良好的基础。

在臭氧化油产品中，臭氧化橄榄油、葵花油、大豆油作为抗菌剂、除臭剂用于褥疮和溃疡等皮肤病的治疗的外用药品已经上市。但将臭氧化油制成肠溶胶囊的形式通过直接口服的方式进入机体而产生功效，目前尚无报道。在本发明中，通过直接口服臭氧化油肠溶胶囊，腹腔注射、灌肠、灌胃、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和栓剂的方式，能够产生药物作用。

臭氧由于它广泛地存在于常见的大气中，具有多种生物活性，如：心血管保护作用、抗氧化作用、抗紫外及抗辐射作用、抗诱变及抗癌作用、抗菌作用、抗病毒作用、降脂降糖作用、免疫调节作用等。在医药化工和食品等领域都具有广泛的应用。

发明内容

本发明的目的是利用臭氧化油制剂和给药途径来预防和治疗乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝，制备简便、成本低廉。经临床应用验证，本发明具有疗效显著，口服剂量低，无毒副作用，有效率高等优点。

在本发明中，之所以选择权利要求1、2所述的各种油中的一种、两种和两种以上，是因为这些油不饱和脂肪酸含量较高，其中核桃油的不饱和脂肪酸高达92%以上，在不饱和脂肪酸结构中至少有一个烯烃类双键。若将权利要求1、2中的一种、两种和两种以上含不饱和脂肪酸高的油与权利要求3～7中的一种、两种和两种以上的表面活性剂混合，亦能与臭氧发生加成反应。可见只要加成物的结构中存在烯烃不饱和键即可与臭氧发生加成反应，不饱和键数目越多，反应越容易发生，且与臭氧加成的量越多，加成物能够携带臭氧分子的数目也越多。

为达到上述目的，本发明采用的技术方案将结合下面的制作流程和实施方式进行简单的说明。

1、制备臭氧气体。

2、制备臭氧化油。

3、制备臭氧化油肠溶胶囊。

4、制备含表面活性剂的臭氧化油。

5、制备含表面活性剂的臭氧化油肠溶胶囊。

6、臭氧化橄榄油胶囊治疗慢性病毒性乙型肝炎临床试验

7、臭氧化橄榄油胶囊治疗丙型肝炎病毒的试验

8、臭氧化橄榄油胶囊治疗丁型肝炎的试验

9、臭氧化橄榄油胶囊治疗戊型肝炎的试验

10、臭氧化油橄榄胶囊治疗肝纤维化的试验

11、臭氧化橄榄油胶囊治疗肝硬化临床试验

12、臭氧化橄榄油胶囊治疗脂肪肝临床试验。

具体实施方式

下列非限制性实施例用于说明本发明。

实施例1臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备

1、制备臭氧气体。本发明采用医用氧气通过臭氧发生器来制备臭氧气体。

选自西安德润生物技术有限责任公司设计生产的DRO3-A型臭氧机（功率≦55W）。

2、制备臭氧化油和臭氧化油肠溶胶囊整个过程须要在20～25℃进行，确保臭氧化油不会发生热解反应。

3、橄榄油3kg置入反应釜中；臭氧以150m³/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。

4、得到臭氧化橄榄油浓度为40 mg/L，25℃可稳定保存十个月。

5、制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊。

（1）、囊材的制备:按重量比3：3：1：1的比例称取水、明胶、甘油和糯米粉或淀粉倒入胶罐中，溶胶时温度先设置成75℃，在温度到达60℃的时候开始加水，加水10分钟，用手触有微烫的感觉，开始加入甘油，搅拌2分钟，从胶罐底部取2次，倒回胶罐中，迅速加明胶，搅拌时间为2小时，搅拌后温度设定为60℃，静置脱气泡8小时。

（2）、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25mL。

室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25mL，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。

实施例2臭氧化橄榄油、大豆油和花生油混合油的肠溶胶囊制备

3、橄榄油1kg，大豆油1kg和花生油1kg置入反应釜中；臭氧以150m³/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。

4、得到臭氧化混合油浓度为40mg/L，25℃可稳定保存十个月。

5、制备臭氧化混合油肠溶胶囊。

（2）、采用压制法制备臭氧化混合油肠溶胶囊，容量0.25mL。

室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25mL，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得臭氧化混合油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。

实施例3含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备

3、橄榄油3kg置入反应釜中，缓慢加入失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（吐温80）20mL，混匀，臭氧以150m³/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。

4、得到臭氧化橄榄油浓度为40 mg/L，25℃可稳定保存十个月。

5、制备含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊。

（2）、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25mL。

室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25mL，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得含表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。

实施例4含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊制备

3、橄榄油3kg置入反应釜中，缓慢加入失水山梨醇单油酸酯聚氧乙烯醚（吐温80）20mL和纯乙醇20mL，混匀，臭氧以150m³/h流速加入，总反应时间为20小时。反应结束后，余气灭活。

4、得到臭氧化橄榄油浓度为40 mg/L，25℃可稳定保存十个月。

5、制备含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊。

（2）、采用压制法制备臭氧化橄榄油肠溶胶囊，容量0.25mL。

室温22℃制胶囊，胶皮厚度为0.7mm，容量为0.25mL，制得的软胶囊在转笼里冷却8小时，出笼，干燥即得含表面活性剂和助表面活性剂的臭氧化橄榄油肠溶胶囊，于4℃避光冷藏备用。

实施例5臭氧化橄榄油胶囊治疗慢性病毒性乙型肝炎临床试验

一、诊断标准

西医诊断标准：参照1995年北京全国传染病寄生虫病学术会议修订《病毒性肝炎防治方案)》有关慢性病毒性乙型肝炎的诊断标准。

二、病例纳入标准:

(1)临床试验用药前2周内诊查符合上述“慢性乙型病毒性肝炎”诊断标准。

(2) ALT, AST>正常3倍以上，17.1μmol/L<TBIL<51.3μmol/L。

(3)年龄18-65岁。

三、试验方法与分组：

1、方法:采用随机对照试验方案。

2、病例来源及分组：本组病例均系住院病人，其中试验组50例，对照组50例。

四、试验用药:

1、观察药物:本发明臭氧化橄榄油胶囊剂，规格:0.25mL/粒。本发明胶囊剂1粒/次，每日1次空腹服用，1个疗程：3个月，治疗12个月。

2、对照药物：清肝胶囊，长春海外制药集团有限公司，批准文号:国药准字220050091，规格:0.25g/粒。对照组:4粒/次，每日两次，疗程：12个月。

五、观察项目及指标

1、安个性指标：治疗前及治疗结束时各查一次肾功(BUN,Cr) ,ECG及血、尿、便常规。

2、肝功(ALT,AST,TBIL,DBIL,A/G,PT/PA)，肝炎病原学等实验室指标于治疗前及结束时至少各查一次，但肝功在治疗过程中可根据病情定期复查。

六、疗效

疗效判定标准:参照“新药治疗乙型肝炎的临床研究指导原则”，疗效判定标准，分痊愈，显效，有效，无效。

1、痊愈:症状消失，皮肤、巩膜黄染及体征消失，肝功能恢复正常，血清总胆红素降至17μmol/L以下。

2、显效:症状明显改善，皮肤、巩膜黄染及体征大有好转，血清总胆红素降至17-25.6μmol/L。

3、有效:症状有所改善，皮肤、巩膜黄染及体征好转，血清总胆红素降至25.6-34μmol/L。

4、无效:症状无改善，体征、血清胆红素无变化，甚或加重。

七、结果：

治疗组50例，对照组50例，治疗组中男性35例，女性15例，平均年龄36.3±11.5岁(18-58岁)，对照组男性28例，女22例，平均年龄31.9±10.5岁(19-55岁)。经治疗观察，患者连用12个月。25例治愈，15例显效，5例有效，5例无效，有效率90%。没有任何副作用和不良反应。对照组只有5例治愈，15例无效，对比有显著差异。

典型病例:

病例1：刘某，男，48岁，患者于4年前始患慢性病毒性乙型肝炎，肝功能明显损害，住院近两年，出院后肝功能时常波动，肝功能明显异常，来诊前检查:谷丙转氨酶382U,服用臭氧化橄榄油胶囊制剂，1粒/次，每日1次空腹服用，1个疗程:3个月。3个月后，两胁胀痛大为减轻，自觉良好，饮食正常，能坚持工作，又服本发明胶囊制剂9月余，症状全部消失，肝功能化验：谷丙转氨酶正常。

病例2：马某，女，36岁。2年前入职健康检查时发现谷丙转氨酶156U,诊断为肝炎，经“保肝”治疗一直未愈，来诊前查:谷丙转氨酶200U,患者服用本发明胶囊制剂3个月，1粒/次，每日1次空腹服用，肋痛日渐缓解，精神渐振，续服本发明胶囊制剂3个月，小便正常，复查：谷丙转氨酶60U；又服本发明胶囊制剂3月余，复查肝功能已完全恢复正常。

病例例3：章某，男，41岁，自述肝区疼痛、院胀腹满、恶心1个月。查肝功能异常:麝香草酚浊度试验18U，HBsAg234U，其面暗萎黄，确诊慢性乙型肝炎。服用本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂1粒/次，每日1次空腹服用，3个月，肋痛日渐缓解；继续服本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂3个月，小便正常，复查:谷丙转氨酶71U；又服本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂6月余，复查肝功能已完全恢复正常。

实施例6臭氧化橄榄油胶囊治疗丙型肝炎病毒的试验

下面结合具体实施方式对本发明的上述发明内容作进一步的详细描述。

针对现有技术中存在的不足，本发明的目的是在于提供一种臭氧化油治疗或预防丙型肝炎病毒感染药物中的应用，该药物是一种无毒无副作用，并且有明显的预防和治疗作用，经过口服给药方式，使用方便。该物质兼有抗炎作用，故能提高治疗过程中的耐受性，提高治疗质量和给药依从性，减轻治疗痛苦和副作用，同时不会诱发病毒突变。

本发明从细胞和分子层面对臭氧化油抗HCV病毒作用进行了评价，为其进一步开发应用奠定了良好的基础。表明该药物具有开发成抗HCV病毒的有效药物而应用于临床研究。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

通过CCK-8胞活性检测与Real-Time荧光定量PCR试验，对药物的给药剂量及有效性做出分析。同时采用体外细胞模型-HuH7细胞，从直接杀病毒、抑制病毒的吸附与入侵、抑制病毒的复制、影响病毒出膜等方面研究药物的抗病毒机制。

研究结果表明臭氧化橄榄油在细胞水平上对HCV病毒具有良好的预防病毒感染和抗病毒作用，并且具有一定的抗感染作用，同时在临床上用于抗病毒抗肿瘤有很好的应用基础，表明该药物可以作为临床上潜在的抗病毒药物进一步开发。从而为临床上丙型肝炎病毒(HCV)性疾病的治疗提供一种安全有效、毒副作用小的药物。为其进一步开发应用奠定了良好的基础。

相对于目前其他抗HCV病毒药物而言，本发明具有以下优点和效果:

1、臭氧化油在较大浓度范围内没有细胞毒性。

2、臭氧化油能够提高细胞对病毒感染的预防作用。

3、降低病毒在细胞中的复制效率，对病毒感染有治疗作用。

4、臭氧化油来源于氧气，资源广泛，制备相对简单。

5、具有结果稳定，毒副作用小等优点。

6、既有治疗作用，也有预防作用。

7、可口服，使用方便。

下面结合具体实施例，进一步阐明本发明的技术方案。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明请求保护的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规实验条件如Sambrook等人，分子克隆，实验手册(第三版)(New York：ColdSpring Harbor Laboratory Press,2002)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

所用的HCV病毒为毒株JFH-1，来自日本京都大学病毒研究所。所用细胞HuH7来自中国典型培养物保藏中心(武汉大学保藏中心)，保藏编号:313100001000700182。细胞培养液为DMEM高糖液体培养基(HyClone)，10%的胎牛血清(FBS，gibco);细胞维持液为DMEM高糖液体培养基(HyClone)，加入后占总体积的2%的胎牛血清(FBS，gibco)。胰酶(HyClone)；CCK-8试剂盒(上海领潮生物科技有限公司)；荧光定量PCR试剂为Bestar qPCR MasterMix(SYBR Green),(DBI Bioscience)；IFN-alpha1(干扰素ɑ1，Sigma) 。

实施例7 臭氧化橄榄油抗HCV病毒作用

1) 臭氧化橄榄油对HCV病毒的预防作用

经24-48h培养的HuH7细胞基本长满单层时，吸弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1mL。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将臭氧化橄榄油用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，稀释后再把不同浓度的药物加入弃去培养液的细胞培养孔中，每孔1mL，每个浓度重复3孔，同时设立抗病毒阳性对照细胞孔(加病毒，加IFN- ɑ1至1000U/mL，加培养液)，病毒对照孔(不加药，加病毒，加细胞维持液)和细胞对照孔(不加病毒不加药，只加细胞维持液)。药物孵育1h后，弃去上清，用PBS洗三次，加入用细胞维持液稀释的病毒，每孔1mL, 37 ℃孵育3小时，弃去上清，用PBS洗三次，换新鲜细胞维持液，置于细胞培养箱中37℃,5% CO₂培养48h后，检测细胞中HCV的非结构蛋白NS5B的mRNA基因表达量。HCV引物根据文献中HCV在NS5B区基因序列设计PCR引物为:

NS5B-F‘5-TCGTATGATACCCGATGCT-3‘

NS5B-R‘5-GTTTGACCCTTGCTGTTGA-3‘

提取细胞里的总mRNA，用Real Time PCR检测病毒RNA的表达量，反应条件：1,95℃4分钟；2,94℃ 10秒，55℃ 30秒，72℃ 30秒为第二步35个循环。将荧光定量结果中病毒对照组的基因表达量默认为1，计算出其它实验组的相对基因表达量，结果如表1。实验数据显示臭氧化橄榄油在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。

表1 臭氧化橄榄油预防HCV病毒感染的作用

实验结果表明，细胞在臭氧化橄榄油提前孵育后，再被病毒感染，病毒基因表达量明显低于病毒对照组，并且随着药物浓度的增高，对HCV感染的预防作用越为明显。根据实验数据显示臭氧化橄榄油在较低浓度时对细胞也有较好的预防病毒感染作用。其效果与IFN-ɑ1有可比性。

2) 臭氧化橄榄油抑制HCV病毒感染的作用

经24-48h培养的HuH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1mL。置于细胞培养箱中培养18-24h，使细胞生长成单层备用。将臭氧化橄榄油用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，稀释后加入细胞维持液稀释的病毒，孵育1h后，加入弃去上清液的细胞培养孔中，每孔1mL，每个浓度重复3孔，置于细胞培养箱中37℃,5% CO₂培养48h。同时设立抗病毒阳性对照细胞孔(加病毒，加IFN-ɑ1至1000U/mL，加细胞维持液)，病毒对照孔(不加药，加病毒，加细胞维持液)和细胞对照孔(不加病毒不加药，只加细胞维持液)。置于细胞培养箱中37℃,5%CO₂培养48h后，检测细胞中HCV的非结构蛋白NS5B的mRNA基因表达量。方法同上，结果如表2。

表2 臭氧化橄榄油对HCV病毒基因表达量的影响

实验结果表明：HCV病毒预先与臭氧化橄榄油孵育后，感染细胞的活性明显减弱，并且药物的浓度越高，mRNA的表达量越少。该数据显示臭氧化橄榄油对HCV病毒感染细胞的活性有明显的抑制作用。其效果与抗病毒药IFN-ɑ1有可比性。

3) 臭氧化橄榄油治疗HCV感染的作用

经24-48h培养的HuH7细胞基本长满单层时，倾弃细胞培养液，加入胰酶消化，传至12孔无菌细胞培养板中，每孔1mL，置于细胞培养箱中培养18-24h,使细胞生长成单层备用。将细胞维持液稀释的病毒加入弃去上清的细胞培养孔中，孵育3h后弃上清，将臭氧化橄榄油用细胞维持液逐倍稀释成实验所需的五个浓度梯度，加入去上清的培养孔中，每孔1mL，每个浓度重复3孔，置于细胞培养箱中37℃,5% CO₂培养48h。同时设立抗病毒阳性对照细胞孔(加病毒，加IFN-ɑ1至1000U/mL，加细胞维持液)，病毒对照孔(不加药，加病毒，加细胞维持液)和细胞对照孔(不加病毒不加药，只加细胞维持液)。48h后提取细胞的总RNA，进行荧光定量PCR反应，方法同上，结果如表3。

实验结果表明:当HCV病毒感染细胞后，臭氧化橄榄油对被感染细胞具有很好的治疗作用。

表3臭氧化橄榄油治疗HCV病毒感染的作用

实验结果表明：当HCV病毒感染细胞后，臭氧化橄榄油对细胞的治疗作用也相当明显，感染细胞的基因表达量明显减少，并且随着药物浓度的增加逐步降低。该数据显示臭氧化橄榄油对HCV病毒感染后的细胞具有很好的治疗作用。

实施例7臭氧化橄榄油胶囊治疗丁型肝炎的试验

示例性实施例

使用土拨鼠作为慢性HDV感染的实验模型以确定臭氧化橄榄油治疗对HDV复制的作用。将慢性感染WHV的土拨鼠以适应感染来自实验室的感染性克隆HDV，得到感染HDV的土拨鼠。12只被感染的动物中有10只被确定受到慢性HDV感染。病毒血症的持续时间为11.6-21个月。治疗组的动物(5)每日服用2.5mg/只/d 臭氧化橄榄油，对照组中的动物(5)给予安慰剂。在治疗开始前以及第4，8, 12. 16及20周获取血清样品。对血清样品进行WHV DNA, WHV表面抗原和HDV RNA分析。所有接受治疗的动物在治疗4周后的血清WHV、DNA，有显著的减小。治疗动物中除一只外，在16周内都观察到表面杭原浓度减小近856倍。五只动物中的四只的HDV RNA经16周治疗后变得检测不到。对照组中这些病毒指标均未观察到任何明显的变化。

减小的HDV病毒血与表面抗原的血清浓度降低有相关关系。在表面杭原浓度降低的所有动物中HDV RNA都变得不可检测。治疗组中的一只动物的表面杭原浓度没有降低(虽然WHV DNA浓度降低)，此动物的血中HDV浓度也保持高值。

实验结果表明: 臭氧化橄榄油可以抑制HDV复制和感染，该数据显示臭氧化橄榄油对HDV病毒感染后的动物具有很好的治疗作用。

实施例8臭氧化橄榄油胶囊治疗戊型肝炎的试验

戊型肝炎病毒(Hepatitis E virus, HEV)是肝炎病毒科肝病毒属成员之一， HEV在许多发展中国家流行，特别是南亚、东南亚、北非、中东地区，流行病学调查全球有1/3人感染。HEV通过饮用污染水源的粪口途径传播。普通人感染的死亡率1-15 %。

1材料和方法

1.1HEV病毒

HEV传染性病毒，人基因III型HEV美国株、人基因IV型中国株，来自美国NIH，用毒株感染猪，其粪便用PBS稀释成10%悬液，使含3.4 X10⁸基因等量滴度/mL(GE)。

1.2试验方法

抗HEV IgG抗体阴性，健康，6周龄24头猪，随机分成4组，每组6头，在BSL-2的试验房中单独饲养，严格按生物安全条例进行喂食和饲养。

第一组为模型对照组，第二组、第三组、第四组分别空腹饲喂臭氧化橄榄油高（0.5ml/只/d）、中（0.25ml/只/d）、低剂量（0.125ml/只/d），第二组、第三组、第四组、第五组分别用3.4X10⁸GE人基因III型HEV美国株静脉注射攻击。攻击后4周，所有猪进行肝病毒损伤观察。淋巴间质溶解分值评估，0代表无炎症；1代表10个肝叶有1-2个淋巴细胞溶解浸润；2代表10个肝叶有3-5个淋巴细胞溶解浸润；3代表10个肝叶有6-10个淋巴细胞溶解浸润；4大于10代表10个肝叶有10个以上淋巴细胞溶解浸润。治疗前后每周收集粪便、血液样本用巢式RT-PCR检测HEV-RNA。

1.2.1样品收集

治疗前收集血清和粪便拭子，攻毒后每周取血和粪便拭子用巢式RT-PCR检测HEV RNA。尸检后收集肝、胆汁、小肠内含物，胆汁和10%的小肠悬液检测HEV RNA，肝进行病理观察并按分级打分。

1.2.2 RT-PCR检测HEV-RNA

人基因III型HEV的引物，

H3-HEVORFl-FWD15'-GTTGCTCTTCGTGCTTTTGCCTATG-3'，

H3-HEVORF1-REV15'-CCAGCGGGCGATAACGGATTGTAGC-3'

H3'-HEVORFl-FWD25'-GGCGGTGGTTTCTGGGGTGAC-3'

H3-HEVORFI-REV25'-GTACCCGAAGCGACAGATGACG-3'

基因III型HEV特异巢式PCR, 100μL10%粪便悬液或血清用Trizol试剂(LifeTechnologies)提取，重悬于30μL无菌水中，反应体系加入lμL(l0μM)外部逆转录引物HEVORFl-REVl, 1μL (200units/μL) SuperscriptII逆转录酶,lμL的0. 1M DTT, 4 μL的5XRT缓冲液，0.5μL (40units/μL) RNasin核酸酶抑制剂,lμL的10mM dNTP 42℃ 1h进行逆转录反应。

第一轮PCR反应，用引物HEVORFl-FWDl和引物HEVORFl-REVl扩增471bp产物，第二次用巢式PCR，正向引物HEVORFl-FWD2和反向引物HEVORFl-REV2,5μL AmpliTaq Gold DNA聚合酶,5μL第一轮PCR产物扩增277bp片段，见表11。循环参数包括95℃变性9min后，进行39个循环:94℃变性1min,52℃退火lmin,72℃延伸1min,39次循环完成后，最后72℃延伸7min。 PCR产物采用1%琼脂糖胶电泳观察分析。

1.2.3统计学分析

用不对称的t-test统计分析。P<0.05为显著差异。

2试验结果

2.1 攻毒4周后尸检，各组样本猪肝切片进行淋巴胞质肝炎病理观察，未治疗猪攻击的症状分值较高，而治疗组人基因III型病毒感染攻击产生亚临床轻微症状，表明臭氧化橄榄油有效降低人基因III型HEV引起的肝损伤，也表明对人HEV的肝损失产生保护。

2.2 RT-PCR检测血清和粪便中的HEV RNA

攻毒后用HEV ORFl的引物进行巢式RT-PCR检测HEV RNA，第一组猪用人基因3型HEV攻毒，感染期的1-3周共有6/6的猪发生了病毒血症，第二组有6/6无病毒血症，第三组有1/6头检测发现有病毒血症，第四组1/6猪血清中有HEVRNA检出。第一组在试验的2-4周都排毒，持续2-3周；第二组有0/6的猪粪便检出HEV RNA检出；第三组所有猪粪便有0/6HEV RNA检出，第四组有1/6的猪粪便检出HEV RNA检出。

最后需要指出的是，不应将上述实施例理解为对上述主题的范围仅限于上述实施例。在不脱离本发明上述技术思想情况下，根据本领域普通技术知识和惯用手段，做出各种替换和变更，均应包括在本发明的范围内。

实施例9臭氧化油橄榄胶囊治疗肝纤维化的试验

动物试验

臭氧化橄榄油对小鼠肝纤维化的治疗

1材料和仪器

1.1动物

清洁级昆明小鼠40只、雄性、体重24±2g，西安交通大学实验动物中心提供。昆明小鼠在常温、常湿的适当条件下饲养，给予昆明小鼠足够食物和饮用水。实验将40只昆明小鼠分为模型组8只、秋水仙碱组8只、臭氧化橄榄油高（5mg/只/d）、中（2.5mg/只/d）、低（1.25mg/只/d）剂量组各8只。

1.2试剂

秋水仙碱购买于西双版纳版纳药业有限责任公司，血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、三型前胶原(PCIII)、四型胶原(CIV) 、谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、羟脯氨酸(Hyp) 、TGF-β1测定试剂盒购买于南京建成生物工程研究所。

2方法

2.1肝纤维化小鼠模型的治疗

小鼠正常饲养一周后开始制备肝纤维化小鼠模型。采用30 % CCl₄制成橄榄油剂，按1μL/g比例小鼠腹腔注射，每周注射2次，共8周。于第8周后，各组小鼠眶下静脉采血进行化验，确认肝纤维化小鼠模型制备成功。秋水仙碱以0.00039·k^-1·d^-1给药，模型组小鼠给予等量的橄榄油灌胃，灌胃持续时间为30d。

2.2生化指标测定

血清ALT，AST，AKP含量，肝组织Hyp、HA、LN、PCIII、CIV、TGF-β1含量按照试剂盒的说明书测定。

2.3统计分析

采用SPSS16.0软件进行统计学处理，实验数据采用均值±标准差表示，多组间比较采用单因素方差分析实验数据。

3结果

3.1臭氧化橄榄油对肝纤维化小鼠血清ALT、AST、AKP含量的影响

表1臭氧化橄榄油对肝纤维化小鼠模型ALT、AST、AKP含量的影响(X±SD)

组别	n	剂量	ALT	AST	AKP
						模型组	8		108±16	178±18	32±2
秋水仙碱	8	0.00039·k^-1·d^-1	59±6**	106±11**	21±3**
						高剂量	8	5mg/只/d	56±8**	105±12**	20±4**
中剂量	8	2.5mg/只/d	57±4**	107±10**	21±3**
						低剂量	8	1.25mg/只/d	59±7**	108±11**	22±4**

注:与模型组比较:** P<0.01

实验结果表明，模型组肝纤维化昆明小鼠ALT、AST、AKP的含量明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与模型组比较，臭氧化橄榄油高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型ALT、AST、AKP的含量明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义(见表1)。

3.2臭氧化橄榄油对肝纤维化小鼠肝Hyp、HA、LN、PCIII、CIV 、TGF-β1的影响

表2臭氧化橄榄油对肝纤维化小鼠肝Hyp、HA、LN、PCIII、CIV 、TGF-β1的影响(X±SD)

组别

n

剂量

Hyp

HA

LN

PCIII

CIV

TGF-β1

模型组

8

0.89±0.21

3.01±0.14

1.71±0.17

95±16

205±18

31±3

秋水仙碱

8

0.00039

0.52±0.22**

2.15±0.21**

1.21±0.13**

64±6**

146±11**

21±2**

高剂量

8

5mg/只/d

0.49±0.09**

2.04±0.12**

1.17±0.14**

59±7**

135±13**

20±3**

中剂量

8

2.5mg/只/d

0.50±0.04**

2.11±0.15**

1.18±0.13**

60±5**

137±12**

19±2**

低剂量

8

1.25mg/只/d

0.51±0.05**

2.15±0.11**

1.22±0.14**

61±5**

148±14**

21±3**

注:与模型组比较:** P<0.01

实验结果表明，模型组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp、HA、LN、PCIII、CIV 、TGF-β1的含量明显升高(P<0.01)，差异有统计学意义；与模型组比较，臭氧化橄榄油高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp、HA、LN、PCIII、CIV 、TGF-β1的含量明显降低(P<0.01)，差异有统计学意义(见表2)。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

实施例10臭氧化橄榄油胶囊治疗肝硬化临床试验

本发明药物的临床观察资料：

临床资料:本发明共治疗肝硬化患者76例，其中男65例，女11例，年龄为35-68岁。本发明药物的用法及用量:每日1次，1次1粒空腹口服；3个月为一个疗程。疗效评价标准:

治愈：临床症状消失，腹水吸收完全，肝功能恢复正常；

显效：临床症状消失，腹水基本吸收完全，肝功能恢复正常；

有效：临床症状基本消失，腹水吸收>70%以上，肝功能接近正常；

无效：临床症状、腹水及肝功能均无明显改善。

经过1-6个疗程(3个月为一个疗程)的治疗，治愈56例，显效11例，有效4例，无效5例，治愈率为74%，有效率为93%。通过上结果可以明确看出，本药针对不同性别、年龄、病情、治疗方法的各类患者均有疗效，具有非常好的市场前景和推广价值。

典型病例:

病例1：

吕某某，女，47岁，患肝硬化2年有余，期间服用过多种中、西药物治疗，均未能彻底治愈肝硬化，近期患者肝区疼痛明显、面部和眼睛泛黄、浑身无力，消瘦、厌食严重，经B超检查诊断为肝硬化，少量腹水出现。服用臭氧化橄榄油胶囊制剂每天空腹服用1次，每次1粒，服药3个月后，浑身无力、厌食的症状消失，继续服药9个月后，检查一切正常，患者痊愈。一年后电话回访，肝硬化未复发。

病例2：

周某某，男，42岁，公务员，吃饭没有规律，应酬比较多，近期出现间歇性乏力的症状，伴有呕血、黑便等症状，经B超诊断，显示肝内光点粗大不均，且腹水，确诊为肝硬化。服用臭氧化橄榄油胶囊制剂每天空腹服用1次，每次1粒，服药3个月后，乏力的症状消失，大便基本正常，继续服药3个月后，肝腹水消除，肝功能逐步恢复，患者痊愈。为了巩固治疗，患者又继续用药9个月。

病例3：

李某某，男，47岁，患肝硬化多年，之前服用过多种中药、西药进行治疗，一直未见好转，失去了治疗的信心。经常伴有胸肋痛、肚子鼓胀等症状，身体消瘦，厌食。后经人介绍抱着试试看的态度开始服用本臭氧化橄榄油胶囊制剂每天空腹服用1次，每次1粒，服药3个月后，肚子鼓胀的症状消失，食欲增大，继续服药3个月后，患者面色好转，肝功能恢复正常，患者继续服药9个月后痊愈，随即停药。一年后回访，身体很好，没有复发。

病例4：

杨某，女，65岁，患肝硬化多年，食欲减退，肚子胀，经B超检查诊断为肝硬化，经B超检查诊断为肝硬化。服用本臭氧化橄榄油胶囊制剂每天空腹1次，每次1粒，服药3个月后，患者食欲增大，继续服药3个月后，经B超检查肝脏回声未见异常，肝功能明显改善，恢复正常。应患者要求又继续巩固治疗3个月，患者痊愈。

实施例11臭氧化橄榄油胶囊治疗脂肪肝临床试验

本发明提供一种治疗脂肪肝的臭氧化油，以解决现有治疗脂肪肝西药长期应用带来的不良反应、中药疗效不明显的问题。本发明利用了臭氧化油的多种功效，可以起到保肝、抗菌消炎、增强机体免疫功能等作用，增强人体的免疫力和抗应激能力，有效提高对人体脂肪肝的治愈率。

临床统计

本发明的治疗脂肪肝的臭氧化橄榄油胶囊制剂用于临床治疗200人，其中，男性100人，女性100人，年龄最大75岁，最小38岁，病长着3年，短者半年。每日空腹服药1次，每次1粒，3个月为一个疗程。治疗分析：结果治疗200例，治愈199例，有效率99.5%。

典型病例

病例1

范某，男，42岁，因上腹疼痛入院，无转移放射，既往有脂肪肝，一年前TG4.45mmol/L，TC6.28mmol/L，无肝炎、胆石症史，上腹压痛，无反跳痛。经服用本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂每日空腹服药1次，每次1粒，3个月后，症状消失，继续服用9个月，复查，脂肪肝未复发。

病例2

童某，女，45岁，因持续性上腹疼痛入院，进油食后出现中上腹痛，呈持续性、阵发性加重，无肝炎、胆石症史。化验示TG14. 46mmol/L， TC8. lmmol/L， Cat. 11mmol/L。经服用本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂每日空腹服药1次，每次1粒，3个月后病情好转，继续服用8个月治愈，后至今未出现病变。

病例3

黄某，男，45岁，食欲不振、疲倦乏力、恶心、呕吐、体重减轻；诊断为脂肪肝。经服用本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂每日空腹服药1次，每次1粒，3个月后病情好转，继续服用9个月治愈，后至今未出现病变。

病例4

李某，男，46岁，查体B超提示脂肪肝3年，经服用本发明臭氧化橄榄油胶囊制剂每日空腹服药1次，每次1粒，3个月后病情好转，继续服用8个月治愈，后至今未出现病变。

以上内容不能认定本发明具体实施只局限于这些说明，对于本发明所属技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思前提下，还可以做出若干简单推演或替换，都应当视为属于本发明由所提交的权利要求书确定的专利保护范围。

Claims

1.一种臭氧化油在肝病防治中的应用，其特征在于，油至少选自橄榄油、豆油、葵花籽油、亚麻籽油、菜籽油、粟米油、玉米油、玉米胚芽油、芝麻油、棉籽油、蓖麻油、花生油、茶籽油、紫苏油、红花籽油、杏仁油、榛子油、核桃油、松子油、文冠果油、食用调和油、鱼肝油和鱼油中的一种，通过对油的亲电加成臭氧，得到的臭氧化油制成容量为0.1～0.75mL的糯米或淀粉材质肠溶胶囊、用2～100mL玻璃瓶盛装, 以0.1~100mL的剂量，经口服途径给药和采用腹腔注射、灌肠、灌胃、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和栓剂的方式给予，能够用于制备预防和治疗各种肝病的药物，肝病选自乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。

2.根据权利要求1所述的油，其特征在于，对权利要求1所述的油进行两两的混合和两种以上油的混合，通过亲电加成臭氧，得到的臭氧化油制成容量为0.1～0.75mL的糯米或淀粉材质肠溶胶囊、用2～100mL玻璃瓶盛装, 以0.1~100mL的剂量，经口服途径给药和采用腹腔注射、灌肠、灌胃、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和栓剂的方式给予，能够用于制备预防和治疗各种肝病的药物，肝病选自乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。

3.根据权利要求1～2所述的油，其特征在于，通过选择非离子表面活性剂、阴离子表面活性剂和阳离子表面活性剂中的一种、两种和两种以上的混合，与权利要求1～2所述的油中的任何一种混合，通过亲电加成臭氧，得到含表面活性剂的臭氧化油制成容量为0.1～0.75mL的糯米或淀粉材质肠溶胶囊、用2～100mL玻璃瓶盛装, 以0.1~100mL的剂量，经口服途径给药和采用腹腔注射、灌肠、灌胃、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和栓剂的方式给予，能够用于制备预防和治疗各种肝病的药物，肝病选自乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。

4.根据权利要求3所述的表面活性剂，其特征在于，选自甘油不饱和脂肪酸酯、聚甘油不饱和脂肪酸酯、丙二醇不饱和脂肪酸酯、山梨糖醇酐不饱和脂肪酸酯、聚氧乙烯山梨糖醇酐不饱和脂肪酸酯、聚氧乙烯不饱和脂肪酸酯、甘露糖醇不饱和脂肪酸酯、季戊四醇不饱和脂肪酸酯、蔗糖不饱和脂肪酸酯、聚乙二醇不饱和烷基醚和聚丙二醇不饱和烷基醚中的非离子表面活性剂中的一种、两种和两种以上。

5.根据权利要求3所述的表面活性剂，其特征在于，选自不饱和脂肪酸盐、不饱和脂肪醇硫酸酯盐、α-磺基不饱和脂肪酸酯、烯烃硫酸盐和烯烃磺酸盐中的阴离子表面活性剂的一种、两种和两种以上。

6.根据权利要求3所述的表面活性剂，其特征在于，选自不饱和脂肪烃基单取代三甲基铵盐、不饱和脂肪烃基二取代二甲基铵盐、不饱和脂肪烃基单取代二甲基苄基铵盐、不饱和脂肪烃基单取代胺有机酸盐、不饱和脂肪烃基二取代胺有机酸盐和N-甲基二羟乙基胺不饱和脂肪酸酯盐酸盐中的阳离子表面活性剂的一种、两种和两种以上。

7.根据权利要求3所述的表面活性剂，其特征在于，选自食品级石油醚、聚乙二醇不饱和烷基醚、失水山梨醇单酯聚氧乙烯醚表面活性剂的一种和两种。

8.根据权利要求1～7所述的任意一种臭氧化油，其特征在于，通过选择乙醇、丙二醇、丙三醇、己二醇、丁二醇、戊二醇、丁三醇、己三醇中的一种、两种和两种以上混合，通过亲电加成臭氧得到含助表面活性剂和表面活性剂的臭氧化油，制成容量为0.1～0.75mL的糯米或淀粉材质肠溶胶囊、用2～100mL玻璃瓶盛装, 以0.1~100mL的剂量，经口服途径给药和采用腹腔注射、灌肠、灌胃、静脉注射、皮下注射、肌肉注射和栓剂的方式给予，能够用于制备预防和治疗各种肝病的药物，肝病选自乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。

9.根据权利要求1～8所述的任意一项制成的臭氧化油及其给药途径，其特征在于，该臭氧化油通过所述的途径能够与治疗肝病的药物联合用药有效地预防和治疗乙型肝炎、丙型肝炎、丁型肝炎、戊型肝炎、酒精性肝炎、药物性肝炎、自身免疫性肝炎、及肝纤维化、肝硬化、脂肪肝。