CN104800474A - 一种治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法和应用，属于中药领域。本发明中药组合物由以下重量份的原料药组成：北豆根10-20份、天南星5-15份、通天草10-20份。药理学实验结果表明，本发明中药组合物可以改善肝纤维化昆明小鼠的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，改善肝组织Hyp含量水平，改善肝纤维化小鼠模型脾脏、肝脏和胸腺的脏器指数，改善肝纤维化小鼠模型HA、LN、PCIII、CⅣ含量水平，改善肝纤维化肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白表达水平，改善肝纤维化肝组织超微结构，并且对小鼠体重无明显的影响。由此可见，本发明中药组合物对肝纤维化的治疗效果明显，无副作用。

Description

一种治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及一种中药组合物，特别涉及一种治疗肝纤维化的中药组合物及其制备方法和应用，属于中药领域。

背景技术

肝纤维化(Hepatic fibrosis)是肝脏中肝细胞发生坏死及炎症刺激时，肝细胞之间的胶原蛋白等细胞外基质的增生与降解失去平衡，表现为胶原蛋白增生过多或者胶原蛋白降解减少，进而导致肝脏内肝细胞之间、肝小叶之间的纤维结缔组织异常沉积的病理过程，少量的胶原蛋白沉积称为肝纤维化，大量的胶原蛋白沉积，伴有肝小叶结构改建，假小叶生成及其特殊结节形成，就可以逐渐演化为为肝硬化、肝癌等，严重危害着人们的健康。

肝纤维化的病因很多，很多因素均参加了肝纤维化的发生发展，例如长期酒精的刺激下可以诱发机体出现酒精性肝纤维化(Wang Q，Dai X，Yang W，et al.Caffeineprotects against alcohol-induced liver fibrosis by dampening the cAMP/PKA/CREBpathway in rat hepatic stellate cells[J].Int Immunopharmacol.2015Apr；25(2)：340-352.)，乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus)感染后可以促进机体出现肝纤维化，进而演化为肝癌(Li Y，Zhang Z，Shi J，et al.Risk factors for naturally-occurringearly-onset hepatocellular carcinoma in patients with HBV-associated liver cirrhosis inChina[J].Int J Clin Exp Med.2015Jan 15；8(1)：1205-1212.)，日本血吸虫病可以诱发机体出现肝纤维化(Xiang JJ，Cheng BJ，Tian F，et al.Perforation of small bowel causedby Schistosoma japonicum：A case report[J].World J Gastroenterol.2015Mar 7；21(9)：2862-2864.)，慢性丙型肝炎病毒(Hepatitis C virus)感染可以诱发机体出现肝纤维化进而引起肝硬化(Bourlière M，Bronowicki JP，Ledinghen V，et al.Ledipasvir-sofosbuvir with or without ribavirin to treat patients with HCV genotype 1infection and cirrhosis non-responsive to previous protease-inhibitor therapy：arandomised，double-blind，phase 2trial(SIRIUS)[J].Lancet Infect Dis.2015Apr；15(4)：397-404.)，非酒精性脂肪肝疾病(Nonalcoholic fatty liver disease)也可以诱发机体出现肝纤维化，进而导致肝硬化(Iloon Kashkooli R，Najafi SS，Sharif F，et al.The effectof berberis vulgaris extract on transaminase activities in non-alcoholic Fatty liverdisease[J].Hepat Mon.2015Feb 5；15(2)：e25067.)，除了这些常见的因素之外，还有药物治疗、肝脏毒素、自身免疫攻击等诸多因素均可以诱发机体出现肝纤维化。

肝纤维化是各种慢性肝脏疾病病理学的共同基础，同时也是慢性肝脏疾病向肝硬化发展的必经之路。肝纤维化已成为我国乃至世界范围内威胁人类健康的问题。不过，近几年的研究结果表明，肝纤维化在一定情况下是可以逆转的(Friedman SL，Bansal MB.Reversal or hepatic fibrosis-Fact or fantasy[J].Hepatology，2006，43(2Suppl)：82-88.)。因此对肝纤维化的诊断和防治就显得尤为重要，同时也激励研究者去研发新的抗肝纤维化药物。如能延缓或阻断肝纤维化，从而减少肝硬化甚至肝癌的发生，就有可能减少食管静脉曲张破裂出血、肝性脑病和腹水等并发症，因而对延长慢性肝脏疾病患者的生命，改善其生活质量方面具有重大研究意义。

肝纤维化的形成过程是比较复杂的，肝纤维化的形成不是静止的，而是一种不断变化的动态过程，近年来，随着分子生物学技术的应用，对参与肝纤维化形成的细胞成分、细胞外基质(Extracellular matrix)等方面的研究不断深入，目前公认的肝纤维化形成过程是：致肝损伤因子如病毒性肝炎、血吸虫病、化学毒性物质等，造成肝细胞损伤坏死，引起肝巨噬细胞(Kupffer cell)激活(Xu J，Liu X，Koyama Y，et al.The types of hepatic myofibroblasts contributing to liver fibrosis of differentetiologies[J].Front Pharmacol.2014Jul 22；5：167.)，肝巨噬细胞分泌多种细胞因子，如转化生长因子-β(TGF-β)、血小板源性生长因子(PDGF)、白细胞介素-1(IL-1)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)等，随同血小板、肝窦内皮细胞和肝细胞等分泌的各种细胞因子以及某些化学介质共同作用于静息状态的肝星状细胞(Hepatic stellate cell)，使其激活并转化为肌成纤维细胞(Myofibroblast)。由于干扰素-α(INF-α)、TGF-β1等因子的作用，肌成纤维细胞受到刺激，合成和分泌大量细胞外基质，这其中包括大量的胶原纤维沉积于肝组织内，最终形成肝纤维化(Weiskirchen R，Tacke F.Cellular andmolecular functions of hepatic stellate cells in inflammatory responses and liverimmunology[J].Hepatobiliary Surg Nutr.2014Dec；3(6)：344-363.)。

细胞外基质的过度沉积是肝纤维化形成的最终因素，过度沉积的细胞外其质不仅是由于细胞外基质的合成增多，而且在很大程度上特别是纤维化后期是由于降解减少所致，在细胞外基质降解过程中起主导作用的酶是基质金属蛋白酶(MMP-1)和基质金属蛋白酶抑制因子(TIMP-1)。研究表明，MMP-1是肝纤维化分期的重要标志之一(Attallah AM，El-Far M，Abdel Malak CA3，et al.Fibro-check：a combinationof direct and indirect markers for liver fibrosisstaging in chronic hepatitis Cpatients[J].Ann Hepatol.2015Mar-Apr；14(2)：225-233.)，但是MMP-1在肝纤维化的发生发展中含量变化不明显。TIMP-1在肝纤维化中表达异常(Ramezani-Moghadam M，Wang J，Ho V，et al.Adiponectin Reduces Hepatic StellateCell Migration by Promoting Tissue Inhibitor of Metalloproteinase-1(TIMP-1)Secretion[J].J Biol Chem.2015Feb 27；290(9)：5533-5542.)，肝纤维化在很大程度上与TIMP-1高水平基因表达有关(Greenwel P，Rojkind M.Accelerated developmentof liver fibrosis in CCL₄treated rats by the weekly induction of acute phase responserepisoed：upregulation of lapha(1)procollagen and tissue inhibitor of metalloproteinase-1mRNAs[J].Bionchim Biophys Acta，1997，136(2)：177-188.)，因此评价肝纤维化的发生发展，TIMP-1比MMP-1重要的多。

肝纤维化的治疗药物种类很多，包括TNF-α拮抗剂、环氧化酶抑制剂、抗氧化剂、TGF-β1拮抗剂、抑制TIMP活性药物、抗纤维化治疗等，但是这些药物往往会有副作用，影响着机体的健康水平。祖国医药以多成分、多靶点、多效应、毒副作用小的特点，在肝纤维化这种多因素、多病理靶点的复杂性疾病治疗中具有独特优势。由于相对于西药而言，祖国医药的毒副作用相对较小，因此开发新型祖国医药的中药组合物就显得尤为重要。

目前开展肝纤维化研究所选用的模型种类很多，例如CCI₄诱导小鼠建立肝纤维化小鼠模型(Mazagova M，Wang L，Anfora AT，et al.Commensal microbiota ishepatoprotective and prevents liver fibrosis in mice[J].FASEB J.2015Mar；29(3)：1043-1055；Lee JH，Jang EJ，Seo HL，et al.Sauchinone attenuates liver fibrosis andhepatic stellate cell activation through TGF-β/Smad signaling pathway[J].Chem BiolInteract.2014Oct 16；224C：58-67；卢秉久，姜冬冬.健脾疏肝方对CCl₄诱导小鼠肝纤维化抑制作用的实验研究[J].辽宁中医杂志，2013，40(10)：2134-2136.)，CCI₄诱导大鼠建立肝纤维化大鼠模型(Yu F，Ji S，Su L，et al.Adipose-derivedmesenchymal stem cells inhibit activation of hepaticstellate cells in vitro and amelioraterat liver fibrosis in vivo[J].J Formos Med Assoc.2015Feb；114(2)：130-138；Gao TJ，Dong L，Shi HT，et al.Effect of alcohol extract of Plumula Nelumbini on carbontetrachloride induced rat liver fibrosis：an experimental study[J].Zhongguo Zhong Xi YiJie He Za Zhi.2014Dec；34(12)：1476-1480.)，硫代乙酰胺诱导建立肝纤维化硫代乙酰胺模型(Jang Y，Kim M，Cho M，et al.Effect of bone marrow-derived mesenchymalstem cells on hepatic fibrosisin a thioacetamide-induced cirrhotic rat model[J].BMCGastroenterol.2014Nov 25；14(1)：198；Lee TY，Chang HH，Wen CK，et al.Modulationof thioacetamide-induced hepatic inflammations，angiogenesis and fibrosis byandrographolide in mice[J].J Ethnopharmacol.2014Dec 2；158Pt A：423-430；ChangZY，Lee TY，Huang TH，et al.Hepatoprotective effects of Ger-Gen-Chyn-Lian-Tang inthioacetamide-induced fibrosis in mice[J].J Chin Med Assoc.2014Jul；77(7)：360-366.)，猪血清诱导建立肝纤维化猪血清模型(Ping J，Gao AM，Xu D，et al.Therapeutic effectof indole-3-carbinolon pig serum-induced hepatic fibrosis in rats[J].Yao Xue Xue Bao.2011Aug；46(8)：915-921；Hasegawa-Baba Y，Doi K.Changes in TIMP-1and-2expression in the early stage of porcine serum-induced liver fibrosis in rats[J].ExpToxicol Pathol.2011May；63(4)：357-361；陈嘉，顾丰华，刘翔，等.鳖甲煎丸对猪血清所致大鼠免疫性肝纤维化的治疗作用[J].上海中医药大学学报，2013，27(1)：69-73.)等。基于CCI₄建立肝纤维化模型较多，且被国外的众多研究者认可，因此，本发明采用CCI₄诱导建立肝纤维化小鼠模型。

基于以上的分析，本发明开展以昆明小鼠为研究对象，采用CCI₄腹腔注射小鼠建立肝纤维化小鼠模型。采用由北豆根15g，天南星9g，通天草15g组成的中药组合物为施加因素，设定中药组合物高、中、低、极低剂量(10.14g·kg^-1·d^-1、5.07g·kg^-1·d^-1、2.57g·kg^-1·d^-1、1.27g·kg^-1·d^-1)四个剂量组开展对肝纤维化小鼠模型的实验研究，检测肝纤维化昆明小鼠模型的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，肝组织Hyp含量水平，小鼠脾脏、肝脏和胸腺脏器指数，肝纤维化指标HA、LN、PCIII、CⅣ含量水平，肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白水平，肝组织超微结构及其昆明小鼠体重，以期为临床上治疗肝纤维化提供理论依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种治疗肝纤维化的中药组合物。

本发明上述目的是通过如下技术方案实现的：

一种治疗肝纤维化的中药组合物，由以下重量份的原料药组成：北豆根10-20份、天南星5-15份、通天草10-20份。

优选的，由以下重量份的原料药组成：北豆根15份、天南星9份、通天草15份。

本发明的中药组合物中：

北豆根，又称蝙蝠葛根，属于防己科的植物，味苦、性寒。有小毒。归肺、胃、大肠经。善降泄。具有清热、解毒、祛风、消炎、止痛的作用，可以治疗咽喉疼痛、肠炎痢疾以及风湿痹痛等病症。现代药理学研究表明，北豆根具有抑菌、清热、镇痛、消炎和抗心律失常等方面的作用。

天南星属于天南星科、天南星属的多年生草本植物之一，天南星味苦、性温。归肺、肝、脾经。天南星的药理作用广泛，包括抗肿瘤作用、镇静镇痛作用、杀日本血吸虫宿主钉螺的作用、抗惊厥作用、抗凝血作用、祛痰作用、抗炎作用等。

通天草，也称为荸荠苗、地栗梗或者荸荠梗，为荸荠的地上部分。味苦、性凉。归脾经、肾经。通天草可以利尿、清热、通淋、治疗呃逆、治疗小便不利。现代医学指出，通天草具有防治阿尔茨海默病的作用，包括改善白介素-1β(IL-1β)作用、保护神经元作用、抗氧化作用、改善5-羟色胺(5-HT)蛋白表达作用、改善白介素-6(IL-6)和肿瘤坏死因子-α(TNF-α)蛋白表达作用、改善核转录因子-κB(NF-κB)蛋白表达作用等。

基于北豆根、天南星、通天草的中药组合物配伍，国内外尚无文献报道，本发明北豆根、天南星、通天草配伍合理。此北豆根、天南星、通天草的中药组合物配伍组合后，具有清热、利尿、消炎、止痛、抗肿瘤、抗氧化、保护神经元、杀死钉螺等诸多的作用，显示北豆根、天南星、通天草的中药组合物的药理作用广泛，应用前景非常广阔。

祖国医药在抗肝纤维化实践中积累了丰富的临床经验，抗纤维化植物药材具有独特优势，几千年来，中医秉承神农尝百草的传统来发现新药，海量筛选自然界中的药用植物。大量人群的长期服用，相当于大规模的药效学观察和安全性评价。现代中医药研究者对中药有效成份的药理学研究，又为中西医提供了相互沟通的语言，从天然祖国药物中挖掘和寻找抗肝纤维化药物是人们研究的热点。

本发明开展以昆明小鼠为研究对象，采用CCI₄腹腔注射小鼠建立肝纤维化小鼠模型，应用本发明的中药组合物高、中、低、极低剂量(10.14g·kg^-1·d^-1、5.07g·kg^-1·d^-1、2.57g·kg^-1·d^-1、1.27g·kg^-1·d^-1)四个剂量组开展对肝纤维化小鼠模型的治疗研究，检测肝纤维化昆明小鼠模型的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，肝组织Hyp含量水平，小鼠脾脏、肝脏和胸腺脏器指数，肝纤维化指标HA、LN、PCIII、CⅣ含量水平，肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白水平，肝组织超微结构及其昆明小鼠体重。结果表明，本发明的中药组合物可以改善肝纤维化昆明小鼠的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，改善肝组织Hyp含量水平，改善肝纤维化小鼠脾脏、肝脏和胸腺的脏器指数，改善肝纤维化HA、LN、PCIII、CⅣ水平，改善肝纤维化肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白水平，改善肝纤维化肝组织超微结构，并且对肝纤维化模型昆明小鼠体重无明显的影响。

因此，进一步的，本发明提供了上述中药组合物在制备治疗肝纤维化药物中的用途。

本发明所用到的原料药均可从普通医药商店购买得到，其规格符合国家医药标准。

所述的原料药粉碎后加入制备不同剂型时所需的辅料，按照药物制剂常规方法制成临床上适宜的制剂。其中，所述的制剂包括散剂、水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。本发明制剂的制备方法属于常规制剂方法，在此无庸赘述。

本发明的中药组合物经过药理学实验的验证，使用安全，对肝纤维化的治疗效果明显，无副作用。

附图说明

图1为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型ALT含量的影响图；

图2为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型AST含量的影响图；

图3为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型AKP含量的影响图；

图4为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型Hyp含量的影响图；

图5为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型HA含量的影响图；

图6为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型LN含量的影响图；

图7为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型PCIII含量的影响图；

图8为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型CIV含量的影响图；

图9为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型脾脏脏器指数的影响图；

图10为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型肝脏脏器指数的影响图；

图11为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型胸腺脏器指数的影响图；

图12为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型TGF-β1的影响图；

图13为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型RLX的影响图；

图14为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型TIMP-1的影响图；

图15为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠肝细胞超微结构的影响图(电镜，×6500)，其中A.对照组；B.模型组；C.秋水仙碱0.00039g·kg^-1·d^-1组；D.本发明中药组合物10.14g·kg^-1·d^-1组；E.本发明中药组合物5.07g·kg^-1·d^-1组；F.本发明中药组合物2.54g·kg^-1·d^-1组；G.本发明中药组合物1.27g·kg^-1·d^-1组；

图16为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠肝细胞质超微结构的影响图(电镜，×16500)，其中A.对照组；B.模型组；C.秋水仙碱0.00039g·kg^-1·d^-1组；D.本发明中药组合物10.14g·kg^-1·d^-1组；E.本发明中药组合物5.07g·kg^-1·d^-1组；F.本发明中药组合物2.54g·kg^-1·d^-1组；G.本发明中药组合物1.27g·kg^-1·d^-1组；

图17为本发明中药组合物对肝纤维化小鼠模型体重的影响图。

具体实施方式

下面通过实验并结合实施例对本发明做进一步说明，应该理解的是，这些实施例仅用于例证的目的，决不限制本发明的保护范围。

实施例1本发明中药组合物的制备

由以下重量的各原料药组成：北豆根10g，天南星5g，通天草10g。

实施例2本发明中药组合物的制备

由以下重量的各原料药组成：北豆根15g，天南星9g，通天草15g。

实施例3本发明中药组合物的制备

由以下重量的各原料药组成：北豆根20g，天南星15g，通天草20g。

实施例4本发明中药组合物的制备

由以下重量的各原料药组成：北豆根10g，天南星10g，通天草17g。

试验例1药理学实验

所用的中药组合物按照以下方法制备：

按以下重量称取的各原料药：北豆根15g，天南星9g，通天草15g。药材总量39g，按照同样的配制方法配制10副此药材，得到390g的药材总量，将北豆根和天南星粉碎，通天草切碎。

将390g药材放入10000ml高颈圆底烧瓶中，加入4000ml 80％乙醇溶液，封口膜封好高颈圆底烧瓶，药材浸泡2h，加热煎煮2h，同时冷凝管冷水回流，减少乙醇的损失。多层纱布过滤药材，得到第一次滤液。将药物残渣放到高颈圆底烧瓶中，加入4000ml 80％乙醇溶液，药材浸泡2h，加热煎煮2h，多层纱布过滤药材，得到第二次滤液。

合并中药组合物滤液经过RE-52A旋转蒸发仪70℃浓缩，得到中药组合物干膏，将中药组合物干膏放在粉碎机内粉碎，进行研磨，粉碎机内粉碎后得到中药组合物干粉32.19g，中药组合物的出粉率为干粉/中药药材×100％＝8.25％。实际使用的药材是390g，得到的干粉是32.19g，1g中药组合物干粉相当于原药药材12.12g。

中药组合物干粉密封放置在-80℃冰箱内长期保存，制成散剂，用于以下研究。使用中药组合物给予小鼠灌胃治疗的时候，需要将药材配制成相当于原药材10.14g·kg^-1·d^-1、5.07g·kg^-1·d^-1、2.54g·kg^-1·d^-1、1.27g·kg^-1·d^-1四个剂量的中药组合物，给予灌胃治疗，开展肝纤维化小鼠模型的治疗研究。

1材料和仪器

1.1动物

清洁级昆明小鼠56只、雄性、8周龄、体重25±3g，黑龙江中医药大学实验动物中心提供，动物的质量合格证书为SCXK(黑)2013-004。昆明小鼠在齐齐哈尔医学院实验动物中心常温、常湿的适当条件下饲养，给予昆明小鼠足够食物和饮用水，随时观察昆明小鼠一般状态，包括昆明小鼠的毛发、活动度、精神状态、排泄物，并随时对昆明小鼠的健康状态进行评价。

1.2药物

秋水仙碱购买于西双版纳版纳药业有限责任公司，批号：140808。

中药北豆根批号100826，天南星批号1306047，药材生产厂家为江阴天江药业有限公司。

实验药材通天草购买于黑龙江哈尔滨市药材公司，参照有关药材通天草的各项规定检查，鉴定通天草的结果均符合规定。

血清透明质酸(HA)、层黏连蛋白(LN)、三型前胶原(PCIII)、四型胶原(CⅣ)试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，批号：20150110。

谷丙转氨酶(ALT)、谷草转氨酶(AST)、碱性磷酸酶(AKP)、羟脯氨酸(Hyp)试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，批号：20150309。

肝组织TGF-β1、TIMP-1、松弛素(RLX)酶联免疫试剂盒购买于南京建成生物工程研究所，批号：20140401。

蒸馏水购买于哈尔滨市文景蒸馏水厂。

CCI₄及其他试剂均为国产分析纯。

1.3仪器

电子天平(沈阳龙腾电子称量仪器有限公司)；CM1900冰冻切片机(Leica公司)；HMIAS高清晰度彩色医学图文分析系统(武汉千屏影像技术有限公司)；SIM-F124制冰机(日本三洋公司)；TGL-16G台式离心机(上海安亭科学仪器厂)；6010型可见紫外分光光度计(美国安捷伦上海分析仪器厂)；超净工作台(中国上海精密仪器仪表公司)；高压灭菌器(上海医用核子仪器厂)；6100型RT-雷杜酶标仪(美国RT公司)；酒精计(河北省河间市玻璃厂)；RE-52A旋转蒸发仪(上海亚荣生化仪器厂)；101-0AB型电热恒温鼓风干燥箱(天津市泰斯特仪器有限公司)等。

2方法

2.1实验分组

实验将56只昆明小鼠按照随机数字表的排列顺序随机分组，分为对照组8只、模型组8只、秋水仙碱组8只、中药组合物高剂量组8只、中药组合物中剂量组8只、中药组合物低剂量组8只，中药组合物极低剂量组8只。

2.2肝纤维化小鼠模型复制

本实验参考文献(孙晓飞，邓文升，徐庆.不同浓度CCl₄对小鼠肝纤维化模型建立及IL-6和TGF-β1表达的影响[J].肝胆胰外科杂志，2014，26(1)：48-54；赖文芳，陈燕，贾铷，等.筋骨草总黄酮对小鼠肝纤维化的影响[J].福建中医药大学学报，2012，22(5)：46-47.)制备肝纤维化小鼠模型。模型制备前需要观察昆明小鼠的一般状态，小鼠正常饲养一周后开始制备肝纤维化小鼠模型。选择模型组、秋水仙碱组、中药组合物高剂量组、中药组合物中剂量组、中药组合物低剂量组、中药组合物极低剂量组昆明小鼠制备肝纤维化小鼠模型。采用30％CCl₄制成橄榄油剂，按1μl/g比例小鼠腹腔注射，每周注射2次，共8周。注意采用无菌注射器，让小鼠充分休息，防止感染。于第8周后，各组小鼠随机尾静脉采血进行化验，确认肝纤维化小鼠模型制备成功。同时对照组采用同样的方法在小鼠的腹腔注射等量的100％橄榄油。各组小鼠腹腔注射相应的药物后，小鼠全部存活，模型稳定，可以进行后续的实验研究。

2.3实验给药

北豆根临床患者标准体重的剂量选择15g，天南星临床患者标准体重的剂量选择9g，通天草临床患者标准体重的剂量选择15g，共计每副药材北豆根、天南星、通天草的中药组合物39g。

实验根据人与小鼠的体表面积比值是1：0.0026的换算关系，确定每20g小鼠的剂量是39×0.0026＝0.1014g，通过换算成kg，得到每kg标准体重小鼠的给药剂量是5.07g·kg^-1·d^-1，选择5.07g·kg^-1·d^-1为中药组合物的中剂量，选择10.14g·kg^-1·d^-1为中药组合物的高剂量，选择2.54g·kg^-1·d^-1为中药组合物的低剂量，选择1.27g·kg^-1·d^-1为中药组合物的极低剂量，即设定高、中、低、极低剂量(10.14、5.07、2.54、1.27g·kg^-1·d^-1)四个剂量开展肝纤维化小鼠模型的实验研究。

选择西药秋水仙碱治疗肝纤维化小鼠模型，秋水仙碱成人的每d剂量是3mg，确定每20g小鼠的剂量是3×0.0026＝0.0078mg，通过换算成kg，得到每kg标准体重小鼠的给药剂量是0.39mg·kg^-1·d^-1，即0.00039g·kg^-1·d^-1为每kg标准体重小鼠秋水仙碱的给药量。

对照组、模型组小鼠给予等量的生理盐水灌胃，秋水仙碱组给予秋水仙碱0.00039g·kg^-1·d^-1灌胃，中药组合物高剂量组给予中药组合物10.14g·kg^-1·d^-1灌胃、中药组合物中剂量组给予中药组合物5.07g·kg^-1·d^-1灌胃、中药组合物低剂量组给予中药组合物2.54g·kg^-1·d^-1灌胃，中药组合物极低剂量组给予中药组合物1.27g·kg^-1·d^-1灌胃，灌胃持续时间为30d。

2.4检测血清ALT、AST、AKP含量

实验结束后，眼科镊子摘除小鼠眼球，眼球采血，静置，3000rpm·min^-1离心10min，取上清液，分装，-80℃冰箱保存备用。血清生化指标ALT、AST、AKP分别按照试剂盒说明书进行操作，其中ALT采用金氏法进行测定，AST采用赖氏法进行检测。实验采用医院全自动生化分析仪器进行测定ALT、AST、AKP，得到实验数据，进行统计分析。

2.5检测肝组织Hyp含量

实验结束后，取材各组小鼠肝右叶的相同部位0.1g，按照试剂盒方法消化，匀浆、离心、制备样本。采用6010型可见紫外分光光度计测定Hyp蛋白的含量。

2.6检测肝纤维化密切相关指标HA、LN、PCIII、CⅣ含量

实验结束后，眼球采血，静置，3000rpm·min^-1离心10min，取上清液，分装，-80℃冰箱保存备用。HA、LN、PCIII、CⅣ按照试剂盒的说明书采用放射性免疫法进行检测，得到数据进行统计分析。

2.7检测脾脏、肝脏、胸腺的脏器指数

实验结束后，超净工作台上放置冰台进行操作，迅速断头处死各组昆明小鼠，取材各组小鼠的脾脏、肝脏、胸腺器官，电子天平精确称取小鼠脾脏、肝脏、胸腺的脏器质量，计算小鼠脾脏、肝脏、胸腺器官的脏器指数。

脏器指数(mg·g^-1)＝脏器质量(mg)/体重(g)

2.8检测肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白水平

肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白水平检测采用酶联免疫法进行检测，具体原理是酶标记抗体可与吸附在固相载体上的抗原或抗体发生特异性结合，滴加底物溶液后，底物可在酶作用下使其所含的供氢体由无色的还原型变成有色的氧化型，这样就会出现颜色反应，通过颜色的深浅来评价蛋白表达水平。

实验结束后，各组小鼠断头处死，迅速取肝组织，生理盐水洗涤，剪碎，匀浆，然后转入EP管，4℃冰箱静置30min，离心30min，取上清，进行分装、低温保存。按酶联免疫试剂盒说明书进行操作，使用6100型RT-雷杜酶标仪450nm波长处测定培养板各孔吸光度(A)，根据标准曲线求得肝脏组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白的含量。

2.9电镜观察肝组织形态学

实验结束后将小鼠采用水合氯醛进行麻醉，固定小鼠四肢和头部，剪开皮肤、剪开腹腔、剪开胸腔、寻找心脏，确定小鼠心脏左心室跳动最活跃的心尖处。剪开小鼠的右心耳，使用输液器的输液针头扎入小鼠的左心室心尖处，缓慢匀速点滴50ml的生理盐水，冲刷小鼠的循环系统，直到小鼠的肝脏变白后，停止输入生理盐水，改用2.5％戊二醛缓慢匀速灌注小鼠左心室心尖处，直到小鼠的四肢出现明显的僵硬。

寻找昆明小鼠腹腔内的肝脏组织，选取肝脏组织的肝右叶同一部位，剪成1-2mm³的小块，放入2.5％戊二醛中，经过2.5％戊二醛预固定2h、继续用四氧化锇固定、脱水、包埋、切片、染色、观察肝右叶同一部位组织结构。

2.10测定体重

实验结束前最后测定昆明小鼠体重，以最后称量昆明小鼠体重为实验统计数据，计算比较各组小鼠的体重差异。

2.11统计分析

采用SPSS19.0软件进行统计学处理，实验数据采用表示，多组间比较采用单因素方差分析实验数据。

3结果

3.1中药组合物对肝纤维化小鼠模型ALT含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型ALT的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表1、图1)。

表1 中药组合物对肝纤维化小鼠模型ALT含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.2中药组合物对肝纤维化小鼠模型AST含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型AST的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型AST的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型AST的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表2、图2)。

表2 中药组合物对肝纤维化小鼠模型AST含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.3中药组合物对肝纤维化小鼠模型AKP含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型AKP的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型AKP的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型AKP的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表3、图3)。

表3 中药组合物对肝纤维化小鼠模型AKP含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

通过测定肝纤维化昆明小鼠模型血清的ALT、AST、AKP水平，以此来评价肝脏基本功能。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型ALT、AST、AKP的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明模型组肝细胞遭到破坏，存在肝细胞内的大量因子通过破坏的肝细胞膜进入到血清中，从而导致血清中与肝脏功能相关的生化指标增加，显示模型组肝功能的相关指标异常，模型组肝组织损伤严重，肝功能低下。与模型组比较，中药组合物高、中、低剂量组(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)肝纤维化昆明小鼠模型ALT、AST、AKP的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明经过北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量的治疗后，肝细胞膜的通透性下降，肝细胞内部的相关因子ALT、AST、AKP释放减少，至此血清中ALT、AST、AKP的含量下降，显示肝纤维化模型小鼠肝组织的基本功能不同程度的恢复，随着北豆根、天南星、通天草中药组合物剂量的增加，则肝细胞内部的相关因子ALT、AST、AKP改善愈加明显，说明肝组织的恢复程度与北豆根、天南星、通天草中药组合物的剂量呈现正相关。而与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型ALT、AST、AKP的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义，说明北豆根、天南星、通天草中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)治疗肝纤维化无效。以上表明通过ALT、AST、AKP的含量来进行肝脏功能的评价，北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)对肝纤维化的治疗效果很好，并且出现随着用药剂量的增加，则治疗效果越好。

3.4中药组合物对肝纤维化小鼠模型Hyp含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表4、图4)。

表4 中药组合物对肝纤维化小鼠模型Hyp含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

Hyp是一种机体的非必需氨基酸之一，但是Hyp是构成胶原的成分之一，Hyp的含量一般相对稳定，通过测定Hyp的含量可以评价肝组织纤维化的增生程度。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量明显升高(P＜0.05)，说明模型组Hyp的含量增加，肝细胞和肝细胞之间胶原纤维增生，肝组织明显肝纤维化，显示肝纤维化模型稳定，肝纤维化小鼠模型复制成功，可以进行后续的实验研究。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量明显降低(P＜0.05)，说明北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)可以减少肝细胞之间胶原的含量，同时也显示肝组织纤维化不同程度地得到恢复，并且肝组织肝纤维化的改善程度与北豆根、天南星、通天草中药组合物的剂量相关，北豆根、天南星、通天草中药组合物的剂量越大，则肝纤维化的恢复程度越好。而与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型Hyp的含量改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)效果很差，不适合开展小鼠肝纤维化的治疗。以上结果综合显示北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)对肝纤维化的治疗效果很好，并且随着药物剂量的增加治疗效果越好。

3.5中药组合物对肝纤维化小鼠模型HA含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型HA的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型HA的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型HA的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表5、图5)。

表5 中药组合物对肝纤维化小鼠模型HA含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.6中药组合物对肝纤维化小鼠模型LN含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型LN的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型LN的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型LN的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表6、图6)。

表6 中药组合物对肝纤维化小鼠模型LN含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.7中药组合物对肝纤维化小鼠模型PCIII含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型PCIII的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型PCIII的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型PCIII的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表7、图7)。

表7 中药组合物对肝纤维化小鼠模型PCIII含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.8中药组合物对肝纤维化小鼠模型CIV含量的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型CIV的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型CIV的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型CIV的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表8、图8)。

表8 中药组合物对肝纤维化小鼠模型CIV含量的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

HA、LN、PCIII、CIV是机体细胞外基质组织的主要降解产物，是评价肝纤维化的重要指标之一，可以综合评价机体肝纤维化肝细胞外基质的变化水平。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型HA、LN、PCIII、CIV的含量明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明肝组织肝细胞外基质的胶原纤维明显增加，III型胶原增加，肝小叶之间胶原纤维增加，肝纤维化模型稳定，可以开展后续的实验研究。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型HA、LN、PCIII、CIV的含量明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)可以不同程度地改善小鼠模型肝组织门管区及其肝血窦毛细血管肝纤维化程度，减少肝细胞外的细胞基质，减少III型胶原，具有明显的抗纤维化作用，并且随着北豆根、天南星、通天草中药组合物剂量的增加，则肝纤维化改善的程度越好。与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型HA、LN、PCIII、CIV的含量改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义，说明中药组合物极低剂量组III型胶原等改变不明显，提示极低剂量的中药组合物治疗肝纤维化无效。

3.9中药组合物对肝纤维化小鼠模型脾脏脏器指数的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型脾脏脏器指数明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型脾脏脏器指数明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型脾脏脏器指数改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表9、图9)。

表9 中药组合物对肝纤维化小鼠模型脾脏脏器指数的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.10中药组合物对肝纤维化小鼠模型肝脏脏器指数的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型肝脏脏器指数明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型肝脏脏器指数明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型肝脏脏器指数改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表10、图10)。

表10 中药组合物对肝纤维化小鼠模型肝脏脏器指数的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

3.11中药组合物对肝纤维化小鼠模型胸腺脏器指数的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型胸腺脏器指数明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型胸腺脏器指数明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型胸腺脏器指数改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表11、图11)。

表11 中药组合物对肝纤维化小鼠模型胸腺脏器指数的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

通过测定肝纤维化小鼠模型的脾脏、胸腺和肝脏的脏器指数，评价肝纤维化小鼠模型的脾脏淤血、肝脏损伤及其免疫力。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型脾脏脏器指数明显升高(P＜0.05)，肝脏脏器指数明显升高(P＜0.05)，胸腺脏器指数明显降低(P＜0.05)，说明肝纤维化模型小鼠肝脏质量和脾脏质量增加，而胸腺质量减轻，提示肝纤维化模型小鼠肝组织损伤明显，脾脏出现淤血，同时肝纤维化模型小鼠的免疫力明显降低。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠脾脏脏器指数明显降低(P＜0.05)，肝脏脏器指数明显降低(P＜0.05)，胸腺脏器指数明显升高(P＜0.05)，说明经过中药组合物治疗后，肝纤维化模型小鼠肝脏质量和脾脏质量减轻，胸腺质量增加，提示北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)可以不同程度地增加对肝脏的保护作用，可以不同程度地减轻脾脏淤血的程度，提高动物的免疫力。与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠脾脏脏器指数、肝脏脏器指数、胸腺脏器指数改变不明显(P＞0.05)，说明北豆根、天南星、通天草中药组合物剂量较低无法改善肝纤维化小鼠模型脾脏、胸腺和肝脏的脏器指数，提示对肝纤维化小鼠模型无治疗作用。以上也综合显示中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)对肝纤维化昆明小鼠的脏器指数有明显的改善作用，对肝纤维化昆明小鼠的脏器有保护作用，并且这些作用与北豆根、天南星、通天草中药组合物剂量呈现一定的正相关。

3.12中药组合物对肝纤维化小鼠模型TGF-β1蛋白的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型TGF-β1蛋白明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型TGF-β1蛋白明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型TGF-β1蛋白改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表12、图12)。

表12 中药组合物对肝纤维化小鼠模型TGF-β1蛋白的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

动物肝组织发生纤维化的时候，可以在促肝组织纤维化因子TGF-β1的作用下，刺激成纤维细胞增生，增加和合成肝细胞之间的胶原纤维，加速肝细胞之间的细胞外基质沉积，最终加重机体的肝纤维化程度。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠TGF-β1蛋白明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明模型组成纤维细胞的数量增加，肝细胞之间的细胞外基质增加，出现小鼠肝组织纤维化，提示肝纤维化小鼠模型稳定。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠TGF-β1蛋白明显降低(P＜0.05)，说明北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)可以不同程度地改善促进小鼠肝纤维化因子的生成，干扰成纤维细胞的生成，减少肝细胞之间细胞外基质的含量，减轻小鼠的肝纤维化水平，提示中药组合物高、中、低剂量治疗效果良好，且存在一定的剂量相关性。与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠TGF-β1蛋白改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)无法影响TGF-β1蛋白的含量，不影响成纤维细胞的生成，对肝纤维化小鼠模型无效。以上也综合显示北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)通过改善TGF-β1蛋白表达来发挥对肝纤维化的治疗作用。

3.13中药组合物对肝纤维化小鼠模型RLX的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型RLX明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型RLX明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型RLX改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表13、图13)。

表13 中药组合物对肝纤维化小鼠模型RLX的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

动物体内存在抗纤维化因子RLX，RLX通过抑制TGF-β1蛋白的含量及其增加肝细胞外基质的降解来发挥抗纤维化作用，另外RLX还可以减少肝星状细胞中肌动蛋白的水平，减少胶原的生成，从而发挥抗纤维化的作用。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠RLX明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明模型组抗纤维化因子水平下降，肝组织纤维化明显。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠RLX明显升高(P＜0.05)，说明经过北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)的治疗后，抗纤维化因子明显增加，则细胞外基质的胶原纤维减少，肝组织纤维化程度就会明显改善，且存在一定的剂量相关性。与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠RLX改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)无法影响RLX蛋白的含量。以上综合显示中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)的治疗效果良好，而中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)的治疗较差。

3.14中药组合物对肝纤维化小鼠模型TIMP-1的影响

实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠模型TIMP-1明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型TIMP-1明显降低(P＜0.05)，差异有统计学意义；与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠模型TIMP-1改变不明显(P＞0.05)，差异无统计学意义(见表14、图14)。

表14 中药组合物对肝纤维化小鼠模型TIMP-1的影响

注：与对照组比较：^*P＜0.05；与模型组比较：^**P＜0.05，^#P＞0.05.

肝组织发生纤维化的时候，肝细胞之间会出现大量的细胞外基质，而细胞外基质的主要成分是I、III型胶原。而肝纤维化相关因子TIMP-1是参与肝纤维化I、III型胶原重要的降解因子之一，因此研究TIMP-1对于肝纤维化非常重要。实验结果表明，与对照组比较，模型组肝纤维化昆明小鼠TIMP-1明显升高(P＜0.05)，差异有统计学意义，说明模型组TIMP-1增加会引起I、III型胶原的积聚，造成肝细胞细胞外基质的成分增加，从而加重的肝组织纤维化。与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组肝纤维化昆明小鼠TIMP-1明显降低(P＜0.05)，说明经过北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)的治疗后，TIMP-1含量降低，减少I、III型胶原的积聚，减少肝细胞外基质，从而减轻肝组织纤维化，且存在一定的剂量相关性。与模型组比较，中药组合物极低剂量组肝纤维化昆明小鼠TIMP-1改变不明显(P＞0.05)，说明中药组合物极低剂量(1.27g·kg^-1·d^-1)无法影响TIMP-1蛋白的含量。以上说明中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)治疗有效，说明TIMP-1因子是肝纤维化评价的重要的相关因子，同时也说明肝纤维化小鼠TIMP-1蛋白与TGF-β1、RLX蛋白存在一定的相关性。

3.15电镜观察中药组合物对肝纤维化小鼠模型肝组织的影响

电子显微镜下可见对照组肝细胞形态规则，细胞质内细胞器丰富，线粒体形态正常，线粒体未见肿胀，溶酶体形态正常，肝细胞边界清楚，肝细胞核大，肝细胞核染色质正常，显示肝细胞结构正常(见图15A、图16A)。

模型组肝细胞边界不清，微绒毛较少，糖原减少，线粒体减少，细胞器的数量较少，有脂滴，细胞器较少，显示肝细胞功能低下，防御和解毒能力较弱(见图15B、图16B)。

秋水仙碱组肝细胞多边形，微绒毛丰富，细胞器较多，线粒体丰富，溶酶体形态正常，粗面内质网清晰可见(见图15C、图16C)。

高剂量组肝细胞形状圆形，肝细胞核和核膜清晰，细胞核染色质清晰，细胞核圆形，细胞器丰富，溶酶体较多，粗面内质网未见肿胀(见图15D、图16D)。

中剂量组肝细胞多边形，肝细胞核大而圆形，细胞器丰富，粗面内质网未见肿胀，线粒体形态正常，溶酶体形态正常(见图15E、图16E)。

低剂量组肝细胞多边形，细胞器比较丰富，细胞中见脂滴，溶酶体较多，肝细胞线粒体较少(见图15F、图16F)。

极低剂量组肝细胞核形态不规则，肝细胞线粒体肿胀，细胞核染色质清晰，糖原减少，粗面内质网减少，脂滴较多，细胞器的数量较少(见图15G、图16G)。

电子显微镜下可见对照组肝细胞边界清楚，核大，说明肝组织结构正常，适合作为对照组开展实验研究。模型组肝细胞边界不清，糖原减少，线粒体减少，细胞器的数量较少，显示肝细胞的功能低下，防御和解毒的能力较弱，肝组织损伤较重，模型稳定。秋水仙碱组、高剂量组、中剂量组、低剂量组肝细胞的细胞器比较丰富，细胞中脂滴少，细胞中线粒体较少，说明西药和中药组合物均可以改善肝纤维化小鼠模型的组织病变。极低剂量组肝细胞的线粒体不清晰，糖原减少，线粒体减少，细胞器的数量较少，说明中药组合物剂量较低对肝纤维化模型影响不明显。综合显示北豆根、天南星、通天草中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)治疗肝纤维化小鼠模型有效。

3.16中药组合物对肝纤维化小鼠模型体重的影响

表15 中药组合物对肝纤维化小鼠模型体重的影响

注：与对照组比较：^*P＞0.05；与模型组比较：^**P＞0.05，与秋水仙碱组比较：^#P＞0.05.

结果表明，与对照组比较，模型组小鼠的体重改变不明显(P＞0.05)；与模型组比较，秋水仙碱组、中药组合物高、中、低剂量组的小鼠模型体重改变不明显(P＞0.05)；与秋水仙碱组比较，中药组合物高、中、低剂量组的小鼠模型体重改变不明显(P＞0.05)(见表15、图17)。说明北豆根、天南星、通天草中药组合物治疗肝纤维化的同时不会改变昆明小鼠的体重，表明北豆根、天南星、通天草中药组合物无副作用，适合开展针对肝纤维化的治疗。

综上所述，祖国医药北豆根15g，天南星9g，通天草15g中药组合物高、中、低剂量(10.14、5.07、2.54g·kg^-1·d^-1)可以改善肝纤维化昆明小鼠的血清生化指标ALT、AST、AKP含量水平，改善肝组织Hyp含量水平，改善肝纤维化小鼠模型脾脏、肝脏和胸腺的脏器指数，改善肝纤维化小鼠模型HA、LN、PCIII、CⅣ含量水平，改善肝纤维化肝组织TGF-β1、RLX、TIMP-1蛋白表达水平，改善肝纤维化肝组织超微结构，并且对小鼠体重无明显的影响。

因此，北豆根15g，天南星9g，通天草15g中药组合物可以治疗肝纤维化昆明小鼠模型，并且无副作用。

以上所述仅为本发明的优选实施例，对本发明而言仅是说明性的，而非限制性的；本领域普通技术人员理解，在本发明权利要求所限定的精神和范围内可对其进行许多改变，修改，甚至等效变更，但都将落入本发明的保护范围内。

Claims (5)

1.一种治疗肝纤维化的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：北豆根10-20份、天南星5-15份、通天草10-20份。

2.根据权利要求1所述的中药组合物，其特征在于，由以下重量份的原料药组成：北豆根15份、天南星9份、通天草15份。

3.根据权利要求1或2所述的中药组合物，其特征在于，所述的原料药粉碎后加入制备不同剂型时所需的辅料，按照药物制剂常规方法制成临床上适宜的制剂。

4.根据权利要求3所述的中药组合物，其特征在于，所述的制剂包括散剂、水煎剂、胶囊剂、丸剂、颗粒剂、片剂或口服液。

5.权利要求1-4任一项所述的中药组合物在制备治疗肝纤维化药物中的用途。