CN109985180B - 一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途。本发明的中药复方组合物具有显著的抗肝纤维化的作用，对肝纤维化疾病具有较好的改善和治疗作用，该中药复方组合物是通过抑制胶原纤维增生、肝脏炎症、肝生长因子及核转录因子NF‑B p65的表达来抗肝纤维化，降低肝组织中胶原含量，改善肝纤维化程度，为肝纤维化患者提供一种治疗效果显著，副作用小的新药物，可以大大的减轻肝纤维化患者的痛苦。

Description

一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途
技术领域
本发明属于医药技术领域，具体涉及一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的新用途。
背景技术
唐草片是一种纯中药制剂，其由老鹳草、金银花、瓜蒌皮、柴胡、香薷、石榴皮、黄芪、甘草、木棉花等中药组成。具有清热解毒、活血益气的功效。目前临床运用于艾滋病毒感染者及艾滋病患者，有提高CD4淋巴细胞计数作用，可改善乏力、脱发、食欲减退和腹泻等症状。贾海盼等发表的题目为《唐草片抗艾滋病的药理作用研究》发现：唐草片具有免疫调节、抗氧化和抗病毒的作用，能够减轻人类免疫缺陷病毒感染以及艾滋病患者的乏力、脱发、食欲减退和腹泻等症状，并改善患者的活动功能。
临床药理实验也表明，唐草片对HIV合并HCV共感染的艾滋病患者具有一定的抑制HIV和HCV的作用，可促进TH1型细胞因子的分泌功能，提高T细胞免疫功能。体外实验结果表明，唐草片具有抑制病毒HIV-1复制作用。目前对于唐草片的应用潜能还在不断的研究开发中，以期可以研究开发出治疗更多的重大疾病，可以解决人民的痛苦。
肝纤维化(HF)是指肝脏细胞外基质弥散性的过度沉积。它不是一个独立的疾病，而是许多慢性肝病的共同病理过程。几乎各种慢性肝脏疾病均可引起肝纤维化，其病因主要包括感染性肝病：如慢性乙型、丙型和丁型病毒性肝炎、血吸虫病等，先天性代谢缺陷肝病：如肝豆状核变性、血色病和α1-抗胰蛋白酶缺乏症等，化学损伤性肝病：如慢性酒精性、药物性及其他化学毒物所致肝病及自身免疫性肝病：如自身免疫性肝炎、原发性胆汁性肝硬化和原发性硬化性胆管炎等。另外，近年来也有文献报道非酒精性脂肪性肝炎也可引起肝纤维化甚至肝硬化，例如巫协宁等发表的题目为《非酒精性脂肪性肝炎肝纤维化的发生机制及其诊断的生物标志》的论文，该论文中提及非酒精性脂肪性肝炎是非酒精性脂肪性肝病的发展阶段，它可发展至进展肝纤维化和肝硬化。
而肝硬化是肝纤维化的终末进展阶段，其具有致病高和死亡率高的特征。肝硬化的致死并发症包括肝功能失代偿、门脉高压致静脉曲张出血、肝性脑病、全身细菌感染和肝癌，特别是肝细胞癌(HCC)。每年单单在肝硬化病人关护上的花费就超过120亿美元。虽然被许可的直接针对和逆转进展性肝纤维化的治疗方案仍很匮乏，但临床研究发现肝纤维化甚至肝硬化可通过针对原始病因的治疗而发生逆转。
因此，研究和开发出一种可以应用于治疗肝纤维化的新药物，可以有效的解决肝纤维化患者的痛苦仍是目前研究的重点和难点。
发明内容
为了更好的治疗肝纤维化疾病，减轻肝纤维患者的痛苦。本发明提供了一种中药复方组合物的新用途，具体地，是在制备抗肝纤维化药物中的新用途。该中药复方组合物是由上海百岁行药业有限公司生产的，产品名为唐草片，批准文号为国药准字Z20050291的纯中药制剂。本发明是对该现有产品进行二次研发，意外地发现，该唐草片具有一定的抗肝纤维化的作用。
本发明的具体技术方案为：
本发明提供了一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途，所述中药复方组合物由以下重量份数的成分组成：老鹳草120～150份、黄芪120～150份、龙葵120～200份、金银花120～200份、木棉花60～100份、诃子40～60份、白花蛇舌草80～150份、石榴皮40-60 份、糯稻根150～200份、菱角80～150份、瓜蒌皮40～60份、柴胡60～100份、香薷40-60 份、甘草60-80份、鸡血藤120～150份、红花40～60份、银杏叶40～60份、马齿苋60～120份、胡黄连40～60份、全蝎28～40份。
进一步地，所述中药复方组合物制成包括片剂、胶囊剂、散剂和颗粒剂常规口服剂型。
进一步地，所述中药复方组合物制成薄膜衣片。
进一步地，所述中药复方组合物给药剂量根据患病程度、有无既往病史因素综合考虑进行调整。
本发明的唐草片具有显著的抗肝纤维化的作用，对肝纤维化疾病具有较好的改善和治疗作用，该唐草片是通过抑制胶原纤维增生、肝脏炎症、肝生长因子及核转录因子NF-Bp65 的表达来抗大鼠肝纤维化，降低肝组织中胶原含量，改善肝纤维化程度。为肝纤维化患者提供一种治疗效果显著，副作用小的新药物，可以大大的减轻肝纤维化患者的痛苦。
附图说明：
图1为HE染色结果图(HE，100×)，其中：A为正常对照组大鼠肝脏病理形态学，B 为模型对照组大鼠肝脏病理形态学，C为秋水仙碱组大鼠肝脏病理形态学，D为唐草片高剂量组大鼠肝脏病理形态学，E为唐草片中剂量组大鼠肝脏病理形态学，F为唐草片低剂量组大鼠肝脏病理形态学。
图2为Masson染色结果图(Masson染色，×100)，其中：a为正常对照组大鼠肝组织病理形态学，b为模型对照组大鼠肝组织病理形态学，c为秋水仙碱组大鼠肝组织病理形态学， d为唐草片高剂量组大鼠肝组织病理形态学，e为唐草片中剂量组大鼠肝组织病理形态学， f为唐草片低剂量组大鼠肝组织病理形态学。
图3为大鼠肝脏α-SMA水平图。
图4为大鼠肝脏TNF-α水平图。
图5为大鼠肝脏IL-6水平图。
图6为大鼠肝脏IL-1β水平图。
图7为各组大鼠肝脏蛋白WB图，其中：1为正常对照组；2为模型对照组；3为秋水仙碱组；4为唐草片高剂量组；5为唐草片中剂量组；6为唐草片低剂量组。
具体实施方式：
以下通过具体实施方式的描述对本发明作进一步说明，但这并非是对本发明的限制，本领域技术人员根据本发明的基本思想，可以做出各种修改或改进，但是只要不脱离本发明的基本思想，均在本发明的范围之内。
实施例1、肝纤维化大鼠模型的建立
1、实验材料：
SPF级SD大鼠，72只，雌雄各半，体重100～130克，(广东省医学实验动物中心)，许可证号SCXK(粤)2013-0002，实验动物质量合格证号：№44007200053321；
YJ-875医用净化工作台，苏州净化设备厂；压力蒸汽灭菌器，上海南华医疗器械厂；超纯水器，millipore；超低温水箱，日本Sanyo；精密电子分析天平，FA/JA系列，上海良平仪器仪表有限公司；猪血清：广州未来生物科技有限公司，批号：180516；四氯化碳(CCl4)：广州化学试剂厂，批号：20090303；10％酒精：山东利尔康医疗科技股份有限公司，批号： 180807；食用花生油：金龙鱼花生油，南海油脂工业(赤湾)有限公司。
2、实验方法：
2.1、大鼠的饲养及造模：
大鼠在广州中医药大学热带医学研究所动物房饲养，室温23±2℃，相对湿度为50±10％，每12hr光暗循环。大鼠购入后饲养两周给予正常水及正常饲料喂养，适应环境。两周后开始造模，注射第一天除正常组外其余各组均按照5ml/kg的比例皮下注射20％CCl4(V/V) 花生油混合溶液，此后，按照3ml/kg体重比例间隔3天进行皮下注射。在造模开始后第2 天按照3ml/kg比例对大鼠进行腹腔注射猪血清，此后则按照1ml/kg比例进行腹腔注射，每隔3天注射一次。从造模第3周开始，每周注射20％CCl4花生油混合溶液及猪血清各一次。实验过程中正常组给予正常饮食喂养，其余各组均饮用10％食用乙醇，饲用高脂玉米粉(795g/kg玉米粉+200g/kg猪油+5g/kg胆固醇)。
2.2、分组及给药：
按上述方法给予大鼠造模，于造模后的第四周结束后称重，按体重按随即区间分组法分组，每组12只，雌雄各半。正常对照组、模型对照组、秋水仙碱阳性药物组(0.12mg/kg)、唐草片高中低剂量组(2g/kg、1g/kg及0.5g/kg)。从第5周开始对各实验组进行灌胃干预，正常组与模型组以同等容积蒸馏水灌胃；早晚各组定时、定量，持续灌胃8周。
实施例2、唐草片对大鼠实验性肝纤维化病理组织学变化的影响
1、实验材料：
唐草片：上海百岁行药业有限公司，批号：Z20050291；秋水仙碱片：西双版纳药业有限责任公司，批号：H53021369；LEICA-RM2015型切片机，德国徕卡有限公司；BK-DM500 型数码生物显微镜，重庆奥特光学显微镜有限公司；甲醛溶液：天津大茂化学试剂厂，批号：20161006。
2、实验方法：
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，最后一次灌胃结束后禁食24小时，取1％戊巴比妥钠，按6mL/kg体重给予大鼠腹腔注射，麻醉10分钟后，大鼠周身放松，痛觉丧失，针刺、夹尾无反应，视为麻醉成功。麻醉成功后，迅速解剖，剥离肝脏，取部分放入10％甲醛液固定48h，逐级酒精脱水，二甲苯透明、浸蜡，石蜡包埋，常规切片5m， HE染色。用Qlympus显微镜分别在低倍镜、高倍镜下观察HE染色的大鼠肝组织切片，比较不同组间肝细胞坏死、脂肪浸润、汇管区炎细胞浸润、小叶间纤维增生情况，并使用显微摄像系统拍照。Masson染色后，观察肝组织中胶原纤维沉积情况。
具体步骤如下：(1)石蜡切片脱蜡至水；(2)依次自来水和蒸馏水洗；(3)用苏木精染液染核5min；(4)盐酸酒精分化；(5)蒸馏水洗；(6)用Masson丽春红酸性复红液染10min；(7)以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(8)1％磷钼酸水溶液分化5min；(9)用苯胺蓝液染5min；(10)以 0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻；(11)95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
3、实验结果：
3.1、HE染色显示(具体如图1所示)：
(1)正常对照组大鼠肝小叶中央静脉周围肝细胞排列成板层状，肝板细胞排列规则整齐，肝板之间的肝窦中可见少量炎性细胞，肝细胞未见肿胀或坏死性改变，小叶结构完整，未见假小叶形成，也未见纤维增生。
(2)模型对照组大鼠出现不同程度的肝纤维化增生(+～+++)，肝组织中肝细胞发生明显的脂肪变性，肝细胞中充满了大的脂肪空泡，细胞核被挤压至一侧，肝板结构排列紊乱，小叶周围部分肝细胞发生坏死，纤维组织增生明显，小叶结构不完整，形成假小叶，发生肝硬化。
(3)秋水仙碱组大鼠可见部分肝小叶中肝细胞发生明显的脂肪变性，肝细胞中可见大的脂肪空泡，细胞核被挤压至一侧，小叶周围肝细胞发生坏死，周围纤维组织增生明显，可见假小叶形成，发生轻微的肝硬化改变。
(4)唐草片高、中剂量组大鼠未见明显的肝纤维化病变，肝小叶周围少量肝细胞发生轻微的脂肪变性，肝细胞中可见小的脂肪小滴，肝细胞未见明显的坏死性改变，小叶周围也未见纤维组织增生，小叶结构完整，未见假小叶形成。而唐草片低剂量组有少部分出现轻微肝硬化现象，肝小叶周围肝细胞发生明显的脂肪变性，肝细胞中可见大的脂肪空泡，肝细胞体积明显变大，细胞核被挤压至一侧，小叶周围可见纤维组织增生，有假小叶形成。发生轻微的肝硬化。
3.2、Masson染色显示(具体如图2所示)：
正常对照组肝组织肝索排列整齐，呈条索状向四周放射状排列，小叶结构清晰，仅在汇管区见少量胶原纤维；模型对照组大鼠肝细胞排列紊乱，汇管区和中央静脉之间胶原纤维明显增多，形成纤维纵隔，交结形成完全或不完全假小叶，同时可见细胞变性、坏死；秋水仙碱组、唐草片高、中剂量组未见明显胶原纤维，胶原纤维沉积减少，唐草片低剂量组可见少部分胶原纤维沉积，具体胶原蛋白产物沉积水平如表1所示。
表1各组大鼠胶原蛋白产物沉积水平(x±s)
Figure BDA0002047588380000051
Figure BDA0002047588380000061
与模型对照组相比，*p<0.05；**p<0.01。
注：读片时每张片子取5个区域拍照，应用IPP6.0病理图象分析软件测定各组纤维化产物的光密度值(OD值)，然后作为该样本的OD值。
实施例3、唐草片对肝组织Ⅰ、Ⅲ型胶原蛋白COL-Ⅰ、ⅢmRNA的表达的影响
1、实验材料：
Applied Biosystems ViiA 7TM Real-Time PCR System，美国ABI公司；B960基因扩增仪，杭州晶格科学仪器有限公司。
2、实验方法：
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，末次给药后禁食不禁水12h，处死取肝脏，以生理盐水按1:10进行匀浆，3000r/min离心15min，分取上清于-80℃低温冰箱保存。使用RT PCR法检测肝组织中COL-Ⅰ、ⅢmRNA的表达。Trizol(Invitrogen)提取肝脏总RNA，用紫外分光光度仪行RNA浓度及纯度测定，A260/A280为1.8-2.0才可用于荧光定量检测，并将总RNA调至相同浓度。使用Reverse Transcriptase M-MLV(RNase H-) 试剂盒将总RNA逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增。以18SsrRNA为内参(引物见表2)。利用荧光染料SYBRGreen I方法，其反应组成为：正向引物、反向引物各0.5μl， AceQTMqPCR
Figure BDA0002047588380000062
GreenMaster Mix 10μl，cDNA 2μl(cDNA稀释10倍)，ddH2O 7μl。使用ViiA7TM System software软件设定反应程序，95℃1min；95℃10s，59℃20s(此步骤收集荧光信号)，45个循环；60℃to95℃进行溶解曲线分析。采用Applied Biosystems ViiA 7TM Real-Time PCR System检测各个基因的Ct值，所有反应均设3个复孔。根据Comparative Delta-delta Ct法△△Ct＝(Ct基因-Ct内参基因)-(Ct基因-Ct内参基因) 对照组，利用2-△△CT计算各个基因相对于对照组的表达量。
3、实验结果
与正常对照组相比，模型对照组ColⅠmRNA表达明显升高，而唐草片中剂量组Col ⅠmRNA表达均较模型对照组降低(p<0.05)。与正常对照组相比，模型对照组ColⅢmRNA 表达明显升高，而秋水仙碱组、唐草片高、中剂量组ColⅢmRNA表达均较模型对照组降低 (p<0.05～0.01)。具体大鼠肝脏胶原蛋白COL-Ⅰ、ⅢmRNA的变化如表3所示。
表2引物信息
Figure BDA0002047588380000071
表3各组大鼠肝脏胶原蛋白COL-Ⅰ、ⅢmRNA的变化(x±s)
组别 动物数 RQ(ColI/18SrRNA，2-ΔΔCт) RQ(ColIII/18SrRNA，2-ΔΔCт)
正常对照组 5 1.09±0.61<sup>*</sup> 1.01±0.11<sup>*</sup>
模型对照组 5 3.33±1.07 1.57±0.43
秋水仙碱组 5 3.08±0.60 1.02±0.24<sup>**</sup>
唐草片高剂量组 5 2.93±0.81 0.93±0.46<sup>*</sup>
唐草片中剂量组 5 2.20±0.68<sup>*</sup> 0.84±0.44<sup>*</sup>
唐草片低剂量组 5 3.02±0.88 1.23±0.30
与模型对照组相比，*p<0.05；**p<0.01。
实施例4、唐草片对肝纤维化大鼠血清肝纤四项水平的影响
1、实验材料
酶标仪：Rayto，RT-6100；大鼠PCIII试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181103-30095A；大鼠HA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号E20181105-30811A；大鼠LN试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181015-30254A；大鼠IV-C试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181023-30096A；
2、实验方法
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，末次给药后禁食不禁水12h，腹主动脉采血，3000r/min离心15min，分取上层血清于-80℃低温冰箱保存。ELISA法检测肝纤四项(Ⅲ型前胶原PCⅢ、透明质酸酶HA、层粘连蛋白LN和IV型胶原IV-C)水平，采用酶标仪于450nm处测定吸光度(A)值。
ELISA操作步骤为：
(1)标准品的加样：设置标准品孔和样本孔，标准品孔各加不同浓度的标准品50μl；
(2)加样：分别设空白孔(空白对照孔不加样品及酶标试剂，其余各步操作相同)、待测样品孔。在酶标包被板上待测样品孔中先加样品稀释液40μl，然后再加待测样品10μl(样品最终稀释度为5倍)。加样将样品加于酶标板孔底部，尽量不触及孔壁，轻轻晃动混匀。
(3)加酶：每孔加入酶标试剂100μl，空白孔除外。
(4)温育：用封板膜封板后置37℃温育60分钟。
(5)配液：将20倍浓缩洗涤液用蒸馏水20倍稀释后备用。
(6)洗涤：小心揭掉封板膜，弃去液体，甩干，每孔加满洗涤液，静置30秒后弃去，如此重复5次，拍干。
(7)显色：每孔先加入显色剂A50μl，再加入显色剂B50μl，轻轻震荡混匀，37℃避光显色15分钟。
(8)终止：每孔加终止液50μl，终止反应(此时蓝色立转黄色)。
(9)测定：以空白孔调零，450nm波长依序测量各孔的吸光度(OD值)。测定应在加终止液后15分钟以内进行。
3、实验结果
与正常对照组相比，模型对照组大鼠血清肝纤四项水平均明显升高，差别有统计学显著性意义(p<0.01)。与模型对照组相比，秋水仙碱组，唐草片各剂量组血清肝纤四项水平明显降低，差别有统计学显著性意义(p<0.01)，具体大鼠血清肝纤四项水平如表4所示。
表4唐草片对肝纤维化大鼠血清肝纤四项水平的影响
Figure BDA0002047588380000081
Figure BDA0002047588380000091
与模型对照组相比，*p<0.05；**p<0.01。
实施例5、唐草片对肝纤维化大鼠血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)与转化生长因子β1(TGF-β1)水平的影响
1、实验材料
酶标仪：Rayto，RT-6100；低温冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司；微型离心机(BMJ，BMJ0826)；微量分光光度计(Nano100)，杭州奥盛仪器有限公司；大鼠TGF- β1试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181110-31073A；大鼠TIMP-2试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181010-30475A；大鼠MMP-2试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，上海酶联生物科技有限公司批号：E20181008-30468A。
2、实验方法
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，末次给药后禁食不禁水12h，腹主动脉采血，3000r/min离心15min，分取上层血清于-80℃低温冰箱保存。ELISA法检测血清基质金属蛋白酶-2(MMP-2)及基质金属蛋白酶组织抑制物-2(TIMP-2)与转化生长因子β1(TGF-β1)水平，采用酶标仪于450nm处测定吸光度(A)值。
3、实验结果
各组大鼠血清MMP-2水平未见明显升高，差别没有统计学意义(p>0.05)。与正常对照组相比，模型对照组大鼠TIMP-2、TGF-β1水平均明显升高，差别有统计学显著性意义 (p<0.01)。与模型对照组相比，秋水仙碱组，唐草片各剂量组血清TIMP-2、TGF-β1水平明显降低，差别有统计学显著性意义(p<0.01)，说明唐草片能够降低TIMP-2、TGF-β1水平，减少肝组织中胶原蛋白含量，改善肝纤维化程度，具体数据如表5所示。
表5唐草片对肝纤维化大鼠血清MMP-2、TIMP-2、TGF-β1的影响
Figure BDA0002047588380000092
Figure BDA0002047588380000101
与模型对照组相比，**p<0.01。
实施例6、唐草片对肝纤维化大鼠肝脏α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TNF-α、IL-6、IL-1β的影响
1、实验材料
酶标仪：Rayto，RT-6100；低温冷冻离心机，珠海黑马医学仪器有限公司；微型离心机(BMJ，BMJ0826)；微量分光光度计(Nano100)，杭州奥盛仪器有限公司；酶标仪：Rayto，RT-6100；大鼠α-SMA试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181021-30151A；大鼠TNF-α试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181017-31063A；大鼠IL-6试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181022-30219A；大鼠IL-1β试剂盒，上海酶联生物科技有限公司，批号：E20181108-30206A；。
2、实验方法
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，每组12只，末次给药后禁食不禁水12h，处死取肝脏，以生理盐水按1:10进行匀浆，3000r/min离心15min，分取上清于-80℃低温冰箱保存。ELISA法检测肝脏α平滑肌肌动蛋白(α-SMA)、TNF-α、IL-6、IL-1β水平，采用酶标仪于450nm处测定吸光度(A)值。
3、实验结果
实验结果如图3～图6所示：
与正常对照组相比，模型对照组大鼠肝脏α-SMA水平均明显升高，差别有统计学显著性意义(p<0.01)。与模型对照组相比，秋水仙碱组，唐草片各剂量组血清α-SMA水平明显降低，差别有统计学显著性意义(p<0.01)。与正常对照组相比，模型对照组大鼠肝脏TNF-α、IL-6、IL-1β水平均明显升高，差别有统计学显著性意义(p<0.01)。与模型对照组相比，秋水仙碱组，唐草片各剂量组血清TNF-α、IL-6、IL-1β水平明显降低，差别有统计学显著性意义(p<0.01)。说明唐草片能够降低肝脏炎性细胞因子水平，减轻肝脏炎症，改善肝纤维化程度。
实施例7、唐草片对肝纤维化大鼠肝脏IKBα、NF-KB P65表达水平的影响
1、实验材料
IKBα，博奥森Bioss，bs-1287R；NF-B p65，博奥森Bioss，bs-0465R。
2、实验方法
采用实施例1的建模方法建立72只肝纤维化大鼠，每组12只，末次给药后禁食不禁水12h，处死取肝脏，放置于无菌5ml离心管中，-80℃低温冰箱保存。裂解后的样品放入离心管内，12000转离心20分钟，取上清液，用BCA蛋白定量检测试剂盒进行组织蛋白定量，将定量裂解后的样品取100ul加入5×蛋白上样缓冲液25ul混匀。电磁炉煮沸处理15 分钟，冷却后待用。电泳时总上样量为50ug总蛋白。
BCA蛋白测定步骤：
(1)根据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA 工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。(2)将标准品按0，2，4，8，16， 20μl加到96孔板的标准品孔中，加用于稀释标准品的溶液补足到20μl。(3)加适当体积样品到96孔板的样品孔中，加用于稀释标准品的溶液到20μl。(4)各孔加入200μl BCA工作液，37℃放置30分钟。注：也可以室温放置2小时，或60℃放置30分钟。BCA法测定蛋白浓度时，吸光度会随着时间的延长不断加深。并且显色反应会因温度升高而加快。如果浓度较低，适合在较高温度孵育，或延长孵育时间。(5)测定A562，540-595nm之间的波长也可接受。根据标准曲线计算出蛋白浓度。
免疫印迹(Western Blotting)步骤：
(1)上样与电泳。取煮沸后的样品，用微量加样器把变性后的蛋白样品滴加到凝胶孔内，开启电泳电源，浓缩胶电压是60V，电泳时间为25分钟，待样品溴酚蓝跑成一条直线的时候，换电泳的电压至120V.电泳时间为1小时。电泳溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳。(2)转膜。将胶取下。根据预染Marker分子量范围，剪切目的表达区域，PVDF膜预先浸泡甲醇5分钟。将膜与胶片及滤纸等叠加在一起，转膜350毫安，转膜1小时。(3)封闭。转膜结束后，将膜取出，放入浓度为5％的脱脂奶粉里面，常温孵育2个小时。期间不停的水平摇动，充分封闭好所有的位点。封闭结束后，用PBST洗膜，5分钟每次，洗膜3次。 (4)一抗孵育。分别加入一抗常温孵育2h，1：1000稀释，一抗用PBS含1％的BSA做为稀释液(IKB alpha，博奥森Bioss，bs-1287R；NF-B p65，博奥森Bioss，bs-0465R)。摇床振荡孵育。内参抗体GAPDH、β-tubulin或者β-actin适量稀释后1h反应。一抗孵育结束后，PBST洗膜5次，每次间隔5分钟。(5)二抗孵育。加入HRP标记的二抗(博士德公司)1:2500 稀释，常温孵育1h，振荡孵育，孵育结束后用PBST洗膜5次，每次间隔5分钟。(6)发光显影。用ECL发光液凯基生物1ml。孵育膜5分钟，将膜拿至暗房进行孵育反应。加入胶片富士感光胶片，压片2分钟，显影3分钟，定影10分钟。使用ImageJ软件分析各个条带的灰度值，以便进行统计分析。
3、实验方法：
实验结果如图7所示：
与正常对照组相比，模型对照组IBα蛋白表达水平无明显升高。与正常对照组相比，模型对照组NF-B P65表达明显升高，而秋水仙碱组、唐草片各剂量组NF-B P65表达均较模型对照组降低(p<0.01)。说明秋水仙碱及唐草片均能抑制NF-B P65蛋白的表达。

Claims (4)

1.一种中药复方组合物在制备抗肝纤维化药物中的用途，所述中药复方组合物由以下重量份数的成分组成：老鹳草120～150份、黄芪120～150份、龙葵120～200份、金银花120～200份、木棉花60～100份、诃子40～60份、白花蛇舌草80～150份、石榴皮40-60份、糯稻根150～200份、菱角80～150份、瓜蒌皮40～60份、柴胡60～100份、香薷40-60份、甘草60-80份、鸡血藤120～150份、红花40～60份、银杏叶40～60份、马齿苋60～120份、胡黄连40～60份、全蝎28～40份。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药复方组合物制成片剂、胶囊剂、散剂或颗粒剂。
3.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药复方组合物制成薄膜衣片。
4.如权利要求1所述的用途，其特征在于，所述中药复方组合物给药剂量根据患病程度、有无既往病史因素综合考虑进行调整。
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