CN112891545B - 一种抗肝纤维化组合物及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种抗肝纤维化组合物及其应用，属于医药技术领域。黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的组合物能够改善硫代乙酰胺肝纤维化模型中小鼠肝纤维化状况。本发明更好地治愈肝纤维化或为治疗肝纤维化提供另一种可行的选择，提高患者的预后或者生活质量。

Description

一种抗肝纤维化组合物及其应用

技术领域

本发明属于医药技术领域，具体涉及一种药物组合物及其在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

背景技术

肝脏疾病是世界范围内的主要健康问题，在2015年，占全球人口一半以上的亚太地区因肝脏疾病死亡人数占比为4.6％，占全球因肝病死亡人数的62.6％。多种肝脏疾病(包括由慢性乙型肝炎病毒感染、慢性丙型肝炎病毒感染以及酒精、非酒精性脂肪肝)均可导致肝损伤。肝纤维化由肝损伤后修复过程中的肝内纤维性结缔组织异常增生与沉积导致，沉积的胶原纤维构成药物递送的屏障，阻止药物递送至损伤细胞而难以进行损伤修复，导致肝纤维化进一步发展为肝硬化甚至恶化为肝癌。肝星状细胞(Hepatic Stellatecell，HSC)激活是肝纤维化进程的关键环节，在肝脏受损时，HSC通过TGF-β/Smad3等通路激活，从而增加α-平滑肌肌动蛋白、I型胶原蛋白和基质金属蛋白酶抑制剂等促纤维化分子的转录，生成大量纤维状和非纤维状基质蛋白，进而影响肝脏功能。黄酮木脂素是自然界中广泛分布的一类黄酮化合物，其结构由黄酮和苯丙素类衍生物缩合而成，该类化合物具有抗氧化、保肝护肝等作用，是传统的保肝药物，代表化合物有水飞蓟宾(silybin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟亭(silychristin)、水飞蓟宁(silidianin)、2,3-脱氢水飞蓟宾(2,3-dehydrosilybin)等。研究表明，该类化合物可通过作用于HSC降低TGF-β所诱导的Ⅰ型胶原蛋白合成等途径直接或间接的发挥抗肝纤维化作用。但是随着肝纤维化机制的逐步深入研究，发现若想实现在肝纤维化阶段阻断甚至逆转肝纤维化进程的发展，仅仅一种手段或是针对一种致病通路是无法实现的，导致临床单独应用黄酮木脂素类药物需要长期服用而造成胃肠道反应等一些副反应。

目前国际上尚无公认的安全有效、肝脏靶向性及长期耐受的药物被FDA批准应用于肝纤维化治疗，针对肝纤维化的治疗仅仅局限于控制病因，包括以乙型丙型肝炎为主的抗病毒治疗和持续性抗炎治疗等。

发明内容

本发明的目的是提供一种药物组合物及其在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

为了实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：

黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用。

进一步地，所述黄酮木脂素化合物选自水飞蓟宾(silybin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟亭(silychristin)、水飞蓟宁(silidianin)或2,3-脱氢水飞蓟宾(2,3-dehydrosilybin)；所述可溶性鸟苷酸环化酶激动剂选自维利西呱(vericiguat)、普拉西呱(praliciguat)、利奥西呱(riociguat)、奥林西呱(olinciguat)利那洛肽(linaclotide)。

一种肝纤维化治疗药物，包括黄酮木脂素化合物和sGC激动剂，黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的质量比为1～10:1～5。

进一步地，所述黄酮木脂素化合物选自水飞蓟宾(silybin)、异水飞蓟宾(isosilybin)、水飞蓟亭(silychristin)、水飞蓟宁(silidianin)或2,3-脱氢水飞蓟宾(2,3-dehydrosilybin)；所述可溶性鸟苷酸环化酶激动剂选自维利西呱(vericiguat)、普拉西呱(praliciguat)、利奥西呱(riociguat)、奥林西呱(olinciguat)利那洛肽(linaclotide)。

进一步地，所述肝纤维化治疗药物还包括药学上可接受的载体。

与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：

(1)本发明中黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂组合物不仅能够显著降低肝纤维化程度，逆转肝纤维化进程，药物组合物可显著降低促肝纤维化因子α-SMA、collagenⅠ表达，促进肝纤维化恢复，因此二者联合应用具有优异的协同抗肝纤维化作用，可为临床上治疗肝纤维化提供一种新的联合治疗策略。

(2)黄酮木脂素化合物单独治疗肝纤维化的临床效果不理想且需长期服用，而长期服用黄酮木脂素化合物会造成胃肠道反应等一些副反应。本发明中可溶性鸟苷酸环化酶激动剂可以提高磷酸化AMPK和Smad3负调节因子Smad7的表达，通过非经典TGF-β信号通路发挥作用，因此作为肝纤维化治疗中黄酮木脂素化合物的敏化剂，与作用于经典TGF-β1/Smad3信号通路的黄酮木脂素化合物协同作用，增强肝纤维化治疗效果。

(3)本发明中的药物组合物通过作用于经典与非经典TGF-β1/Smad3信号通路，是一种疗效可靠、机制明确的组合物，克服以往治疗肝纤维化中药复方药物的药效成分不明确、机制不清楚的问题。

附图说明

图1是实施例1中空白对照组经生理盐水处理后的肝脏组织天狼星红(Siriusred)染色结果。

图2是实施例1中小鼠肝纤维化模型对照组经生理盐水处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图3是实施例1中小鼠肝纤维化模型经水飞蓟宾处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图4是实施例1中小鼠肝纤维化模型经利奥西呱处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图5是实施例1中小鼠肝纤维化模型经水飞蓟宾/利奥西呱组合物处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图6是实施例2中经不同剂量水飞蓟宾/利奥西呱药物组合物处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图7是实施例3中小鼠肝纤维化模型经水飞蓟宾/利奥西呱PAMAM胶束组合物处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图8是实施例3中小鼠肝纤维化模型经水飞蓟宾/利奥西呱mPP胶束组合物处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

图9是实施例3中小鼠肝纤维化模型经水飞蓟宾/利奥西呱DOPC脂质体组合物处理后的肝脏组织天狼星红染色结果。

具体实施方式

下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步详细说明，但不应理解为对本发明的限制。在不背离本发明精神和实质的情况下，对本发明方法、步骤或条件所作的修改或替换，均属于本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法及未说明配方的试剂均为按照本领域常规条件。

本发明所采用的肝纤维化模型小鼠由硫代乙酰胺诱导构建，具体过程如下：

C57BL/6J小鼠，适应性饲养一周。实验造模共8周，造模前4周，各实验组均腹腔注射200mg/kg的硫代乙酰胺生理盐水溶液，每周2次，空白对照组(Blank-control)给予生理盐水。连续腹腔注射4周后，考察模型建立是否成功。随机选取对照组小鼠和造模小鼠各3只，检测血清谷草转氨酶与谷丙转氨酶水平及羟脯氨酸(Hyp)含量，剥离肝大叶，观察新鲜样本后4％多聚甲醛固定，HE染色判断其病理改变。

判定造模成功的标准：与对照组小鼠相比，造模小鼠血清转氨酶及Hyp的含量升高，切片显示造模小鼠肝脏开始出现肝纤维化病理改变。造模小鼠出现精神不振，活动性降低，毛色变暗，以上结果提示硫代乙酰胺模型造模成功。第5周至第8周实验完毕收样前，各实验组硫代乙酰胺造模溶液量不变，造模频次依然为每周2次。

实施例1

水飞蓟宾和利奥西呱组合物治疗肝纤维化模型小鼠

除正常对照组外，造模成功的小鼠随机分为模型对照组(Model-control)、水飞蓟宾组(6mg/kg,iv)、利奥西呱组(1mg/kg,iv)、水飞蓟宾和利奥西呱组合物组，各实验组每组6只小鼠，每天给一次药，给药4周，共计给药28次，实验过程中记录小鼠体重变化。组合物组给药剂量与单药治疗组中各个药物剂量一致。各组小鼠均给药至实验最后一天，提前12h称重后禁食不禁水。剥离肝大叶后用预冷的生理盐水清洗，取大致相同部位于4％多聚甲醛溶液中固定后，进行包埋、切片和天狼星红染色。

如图1-5所示，空白对照组的天狼星红在普通光学显微镜下观察，背景偏黄色，被染成红色部分面积很少；模型对照组被天狼星红染成红色区域较多，且分布在肝小叶六边形边缘交汇处，切片显示造模小鼠肝脏出现肝纤维化病理特征；与模型对照组相比，水飞蓟宾和利奥西呱组合物治疗组给药后胶原纤维沉积大幅度减少，并且治疗效果优于水飞蓟宾或利奥西呱单独治疗组。

实施例2

水飞蓟宾与利奥西呱抗肝纤维化剂量筛选研究

将肝纤维化造模4周后的造模组动物随机分为4组，造模组、水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱0.5mg/kg组、水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱1mg/kg组、水飞蓟宾1mg/kg+利奥西呱1mg/kg组，每组6只小鼠，分别配制浓度为水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱0.5mg/kg、水飞蓟宾1mg/kg+利奥西呱1mg/kg、水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱1mg/kg三组混悬药物溶液，尾静脉给药，每3天给药1次，共计给10次。给药结束后剥离肝大叶后用预冷的生理盐水清洗，取大致相同部位于4％多聚甲醛溶液中固定后，进行包埋、切片和天狼星红染色，并采用ImageJ进行阳性面积分析。

结果如图6所示，上述各组天狼星红染色结果的统计学分析，水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱1mg/kg组、水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱0.5mg/kg组和水飞蓟宾1mg/kg+利奥西呱1mg/kg组的天狼星红染色阳性面积与模型对照组相比均显著性减少，其中水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱1mg/kg比其他两个组合物治疗组的天狼星红染色阳性面积减少更加显著，表明水飞蓟宾6mg/kg+利奥西呱1mg/kg具有更好的抗肝纤维化效果。

实施例3

药物载体负载的水飞蓟宾和利奥西呱组合物治疗肝纤维化

水飞蓟宾的PAMAM胶束制备：称取水飞蓟宾6mg，加甲醇0.6mL，超声溶解制成水飞蓟宾的甲醇溶液，将PAMAM 15mg溶于1.5mL双蒸水形成载体溶液，将水飞蓟宾的甲醇溶液滴加入载体溶液，滴加完成后搅拌3h。于透析袋(MWCO＝1000)中透析24h，3000rpm离心10min，取上清冻干，即得水飞蓟宾的PAMAM胶束。

利奥西呱的PAMAM胶束制备：按水飞蓟宾的PAMAM胶束制备方法，将“水飞蓟宾6mg”替换为“利奥西呱1mg”即得利奥西呱的PAMAM胶束。

水飞蓟宾的mPP胶束制备：称取水飞蓟宾6mg，加甲醇0.6mL，超声溶解制成水飞蓟宾的甲醇溶液，将mPP 20mg溶于2mL双蒸水形成载体溶液，将水飞蓟宾的甲醇溶液滴加入载体溶液，滴加完成后搅拌3h。于透析袋(MWCO＝1000)中透析24h，3000rpm离心10min，取上清冻干，即得水飞蓟宾的mPP胶束。

利奥西呱的mPP胶束制备：按水飞蓟宾的mPP胶束制备方法，将“水飞蓟宾6mg”替换为“利奥西呱1mg”即得利奥西呱的mPP胶束。

水飞蓟宾的DOPC脂质体制备：将3mg水飞蓟宾溶解于0.5mL甲醇中，称取DOPC 9mg溶于适量丙酮中，搅拌混匀15min后，减压蒸馏去除有机溶剂，真空干燥8h，加10mL双蒸水剧烈水化薄膜3h，超声30min，于透析袋(MWCO＝1000)中透析24h，过0.8μm滤膜，即得水飞蓟宾的DOPC脂质体。

利奥西呱的DOPC脂质体制备：按水飞蓟宾的DOPC脂质体制备方法，将“3mg水飞蓟宾”替换为“0.5mg利奥西呱”即得利奥西呱的DOPC脂质体。

称取MPP 9mg溶于1mL蒸馏水中，超声溶解，将3mg SIL溶于适量甲醇中，将SIL溶液缓慢滴加到MPP水溶液中，滴加完成后加水补足10mL。剧烈搅拌8h，冰浴超声30min后透析24h，透析后3500rpm离心10min取上清，过0.8μm滤膜，冻干即得载药后的SIL-MPP纳米胶束。

除正常对照组外，造模成功的小鼠随机分为模型对照组(Model-control)、水飞蓟宾组(6mg/kg,iv)、利奥西呱组(1mg/kg,iv)、水飞蓟宾和利奥西呱组合物组，各实验组每组6只小鼠，每2天给一次药，给药4周，共计给药14次，实验过程中注意记录小鼠体重变化。组合物治疗组给药剂量与单药治疗组中各个药物剂量一致，治疗药物剂型见表1。各组小鼠均给药至实验最后一天，提前12h称重后禁食不禁水。剥离肝大叶后用预冷的生理盐水清洗，取大致相同部位于4％多聚甲醛溶液中固定后，进行包埋、切片和天狼星红染色，并采用ImageJ进行阳性面积分析。

表1黄酮木脂素化合物水飞蓟宾、sGC激动剂利奥西呱剂型、给药剂量与给药途径

结果由图7-9可见，对各组天狼星红染色结果的统计学分析，模型对照组较空白对照组天狼星红染色阳性区域显著增多。与模型对照组相比，各剂型的水飞蓟宾和利奥西呱组合物治疗组给药后天狼星红染色阳性区域大幅降低，表明治疗后胶原纤维沉积大幅度减少。值得注意的是，组合物天狼星红染色阳性区域显著低于水飞蓟宾或利奥西呱单独治疗组，表明各纳米制剂组合物的治疗效果优于相同制剂的水飞蓟宾或利奥西呱单独治疗组。

实施例4

水飞蓟宾和利奥西呱组合物对肝脏TGF-β1和Smad7表达水平影响

称取实施例3中各组小鼠大致相同部位的肝脏组织，按照每20mg组织100μL裂解液的比例加入含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA组织裂解液，震荡匀浆90s，12000g，4℃离心10min。取上清液EP管分装，取100μL上清液进行聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninicacid，BCA)定量，定量完成后按样品蛋白浓度比例加入上样缓冲液。蛋白样品采用10％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，设定恒定电压60V，30min后电压改为90V，溴酚蓝到达分离胶底部时，结束电泳，安装转膜装置。接通电源，设定恒定电流，100mA，1.5h。转膜后，Quickblock封闭液室温孵育封闭30min，TGF-β1或Smad 7的一抗(1:1000)溶液4℃孵育过夜，PVDF膜(聚偏二氟乙烯膜，polyvinylidene fluoride)经TBST缓冲液洗涤，再与相应标记的TGF-β1或Smad 7对应的二抗(1：5000)溶液反应1h，用TBST缓冲液洗涤，在暗室中将ECL试剂以1：1混合后滴加适量在PDVF膜蛋白面上进行显影操作，保存显影结果后续灰度值半定量。蛋白质印迹半定量结果见表2。

表2治疗后肝脏TGF-β1和Smad7表达水平变化

表2中，ns、*、**、***表示与空白对照组相比P>0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.001；ns、#、##、###表示与模型对照组相比P>0.05、P<0.05、P<0.01、P<0.001。

模型对照组与空白对照组比较可见，经肝纤维化造模后TGF-β1表达大度升高，Smad3的负调节因子Smad 7表达显著下降。不同剂型的水飞蓟宾和利奥西呱组合物既可抑制TGF-β1，又能够提高Smad 7表达，并且各制剂的水飞蓟宾+利奥西呱组TGF-β1表达水平显著显著降低，这是由于水飞蓟宾显著直接抑制TGF-β1表达作用于经典的TGF-β通路，而利奥西呱则显著提高了Smad 7表达作用于非经典TGF-β通路，使利奥西呱发挥了对水飞蓟宾的增敏作用，提高了治疗效果。因此不同剂型的水飞蓟宾和利奥西呱组合物协同抑制TGF-β1/Smad3信号通路发挥抗肝纤维化疗效。

实施例5

黄酮木脂素化合物和sGC激动剂组合物对肝纤维化指标α-SMA和collagenⅠ表达的影响

除正常对照组外，造模成功的小鼠随机分为模型对照组(Model-control)、黄酮木脂素化合物组、sGC激动剂组、黄酮木脂素化合物和sGC激动剂组合物治疗组，按表3所示剂量及途径进行给药治疗。

表3黄酮木脂素化合物、sGC激动剂药物名称、给药剂量和给药途径

各实验组每组6只小鼠，每天给一次药，实验过程中注意记录小鼠体重变化。组合物治疗组给药剂量与游离组中各个药物剂量一致。各组小鼠均给药至实验最后一天，提前12h称重后禁食不禁水。称取大致相同部位肝脏组织，按照每20mg组织100μL裂解液的比例加入含有蛋白酶抑制剂(PMSF)的RIPA组织裂解液，震荡匀浆90s，12000g，4℃离心10min。取上清液EP管分装，取100μL上清液进行聚氰基丙烯酸正丁酯(bicinchoninic acid，BCA)定量，定量完成后按样品蛋白浓度比例加入上样缓冲液。蛋白样品采用10％浓度的SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，接通电源，设定恒定电压60V，30min后电压改为90V，溴酚蓝到达分离胶底部时，结束电泳，安装转膜装置。接通电源，设定恒定电流，100mA，1.5h。转膜后，Quickblock封闭液室温孵育封闭30min，α-SMA或collagenⅠ的一抗(1:1000)溶液4℃孵育过夜，聚偏二氟乙烯膜膜(polyvinylidene fluoride，PVDF)经TBST缓冲液洗涤，再与相应标记的α-SMA或collagenⅠ对应的抗小鼠的二抗(1：5000)溶液进行反应1h，用TBST缓冲液洗涤，在暗室中将ECL试剂以1：1混合后滴加适量在PDVF膜蛋白面上进行显影操作，保存显影结果后续灰度值半定量。

表4治疗后小鼠肝脏组织纤维化指标α-SMA/GAPDH和collagenⅠ/GAPDH值

表4中，***表示与空白对照组相比P<0.001；##、###表示与模型对照组相比P<0.01、P<0.001。

由表4结果可见，各实验组中，空白对照组肝脏表现同正常小鼠肝脏相同，与空白对照组肝脏相比，模型对照组α-SMA/GAPDH和collagenⅠ/GAPDH明显升高，而组合物给药组α-SMA/GAPDH和collagenⅠ/GAPDH值较模型对照组和单独给药组均显著降低，表明不同黄酮木脂素化合物和sGC激动剂组合物经不同途径给药均对肝纤维化具有良好治疗效果，且组合物效果优于单独治疗组。

Claims (3)

1.黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂在制备肝纤维化治疗药物中的应用；

所述黄酮木脂素化合物选自水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭或水飞蓟宁；所述可溶性鸟苷酸环化酶激动剂选自维利西呱、普拉西呱、利奥西呱或利那洛肽。

2.一种肝纤维化治疗药物，其特征在于：包括黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂，黄酮木脂素化合物和可溶性鸟苷酸环化酶激动剂的质量比为1~10:1~5；

所述黄酮木脂素化合物选自水飞蓟宾、异水飞蓟宾、水飞蓟亭或水飞蓟宁；所述可溶性鸟苷酸环化酶激动剂选自维利西呱、普拉西呱、利奥西呱或利那洛肽。

3.根据权利要求2所述的肝纤维化治疗药物，其特征在于：所述肝纤维化治疗药物还包括药学上可接受的载体。

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