JP2020504714A - ペプチドwkdeagkplvkを含む組成物 - Google Patents
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Abstract
Description
好ましくは、組成物は、局所組成物である。
典型的に、組成物は、配列番号1のアミノ酸配列またはその変異体を含む、化粧有効量のペプチドを含む化粧品組成物でありうる。
適切には、組成物は、薬学的有効量の、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはその変異体を含む医薬組成物でありうる。
好ましくは、前記ペプチドは、生体活性ペプチドである。
適切には、組成物は、複数のペプチドを含む。
典型的に、組成物は、少なくとも1つの、化粧にまたは薬学的に許容される賦形剤または添加剤をさらに含む。
典型的に、組成物は、少なくとも1つの、化粧にまたは薬学的に許容される有効成分をさらに含む。
適切には、ペプチドは、配列番号1からなるアミノ酸配列を含む。
典型的に、前記ペプチドは、約3から50アミノ酸の長さを含む。好ましくは、約5から約20アミノ酸の長さ、好ましくは、約11アミノ酸の長さを含む。
好ましくは、前記断片は、少なくとも4、5、6、7、8、9、10、または11、アミノ酸の長さを有する。
好ましくは、前記ペプチドまたは断片は、抗老化活性、グルコース輸送促進活性、細胞増殖促進活性、または同化活性のうちの1つまたは複数から選択される活性を有する。活性は、化粧活性(すなわち、非治療的活性)、治療的活性、またはこれらの両方でありうる。
適切には、ペプチドまたは断片は、アンチエイジング活性を有する。
適切には、ペプチドまたは断片は、グルコース輸送促進活性を有する。
適切には、ペプチドまたは断片は、細胞増殖促進活性を有する。
適切には、ペプチドまたは断片は、同化活性を有する。典型的に、同化活性は、筋肉増殖活性である。ペプチドまたは断片は、哺乳動物における同化代謝を刺激する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらからなり)、この場合、ペプチドは、典型的に、グルコース輸送促進活性を有する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらからなり)、この場合、ペプチドは、典型的に、細胞増殖促進活性を有する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらからなり)、この場合、ペプチドは、典型的に、同化活性を有する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらから本質的になり)、この場合、ペプチドは、典型的に、GLUT4移動促進活性を呈する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらから本質的になり)、この場合、ペプチドは、典型的に、タンパク質合成の増大(同化代謝活性の刺激)を呈する。
さらに好ましくは、ペプチドは、配列番号1から85のうちのいずれか1つのアミノ酸配列を含み(またはこれらから本質的になり)、この場合、ペプチドは、典型的に、細胞増殖促進活性を呈する。
本発明はまた、上皮組織の増殖を促進するための方法における使用のための、本発明のペプチドまたは組成物も提供する。
本発明はまた、皮膚の増殖を促進するための方法における使用のための、本発明のペプチドまたは組成物も提供する。
本発明はまた、臓器の増殖を促進するための方法における使用のための、本発明のペプチドまたは組成物も提供する。
本発明はまた、生物の増殖を促進するための方法における使用のための、本発明のペプチドまたは組成物も提供する。
好ましくは、細胞、組織、または生物は、正常な病態(例えば、老化皮膚)を有する。典型的に、細胞、組織、または皮膚は、異常な病態(例えば、外傷、薬物使用に起因して損傷した組織、または炎症性障害に起因して損傷した消化管内上皮組織)を有する。
増殖を促進する使用は、in vivoまたはin vitroにおける使用でありうる。増殖を促進する使用は、哺乳動物の外部(すなわち、皮膚)、または内部(すなわち、消化管)への投与を伴いうる。
一実施形態では、本発明の使用は、治療有効量の本発明のペプチドを投与するステップを含む。
一実施形態では、本発明の組成物を、全身投与する。
一実施形態では、本発明の組成物(とりわけ、医薬組成物)を、経口投与または非経口投与のために製剤化する。本明細書では、他の投与方法についても記載される。
一実施形態では、本発明の組成物は、配列番号1から85のペプチドの実質的に全てを含む。
好ましくは、組成物または製品は、人工である。
本明細書で言及される、全ての刊行物、特許、特許出願、および他の参考文献は、各個別の刊行物、特許、または特許出願が、参照および完全に列挙されたその内容により組み込まれることが、具体的かつ個別に指し示された場合と同様に、参照によりそれらの全体において、全ての目的で、本明細書に組み込まれる。
・DNAに対する酸化的損傷を減少させ、
・細胞分裂の異常な増大を減少させること
により、それらの保護効果を及ぼす。
・アルツハイマー病
・パーキンソン病
・認知症など
を含む。
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Muscaritoli A, Lucia S, Molfino A, Cederholm MT, Rossi Fanelli F, Muscle atrophy in aging and chronic diseases: is it sarcopenia or cachexia? Intern Emerg Med 2013;8: 553-560。
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組成物は、局所組成物でありうる。
組成物は、化粧有効量の、配列番号1のアミノ酸配列またはその変異体を含むペプチドを含む化粧品組成物でありうる。
組成物は、薬学的有効量の、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドまたはその変異体を含む医薬組成物でありうる。
組成物は、化粧効果、すなわち、非治療的効果、または治療的効果を及ぼしうることが理解されるであろう。組成物は、化粧効果および治療的効果を及ぼしうる。
WKDEAGKPLVKを有する。
1、2、または3箇所の保存的アミノ酸置換、1、2から3箇所の非保存的アミノ酸、1、2、または3箇所のアミノ酸付加、1、2、または3箇所のアミノ酸欠失を有する変異体を含む、配列番号1(WKDEAGKPLVK)の変異体を、下記に提示する:
1箇所の保存的アミノ酸置換:
WKEEAGKPLVK(配列番号2);FKDEAGKPLVK(配列番号3);
WKDEAGKPMVK(配列番号4);WKDEAGRPLVK(配列番号5);
WRDEAGKPLVK(配列番号6);WKDEAGKPLMK(配列番号7);
WKDQAGKPLVK(配列番号8);WKDEATKPLVK(配列番号9)
2箇所の保存的アミノ酸置換:
YKNEAGKPLVK(配列番号10);WKNESGKPLVK(配列番号11);WKDEAGKTLVR(配列番号12);FKDEATKPLVK(配列番号13);FKDEAGKPLIK(配列番号14);WKDEAGKTLLK(配列番号15);WKNEAGKPVVK(配列番号16);WKDEAGRTLVK(配列番号17)
3箇所の保存的アミノ酸置換:
WEDESGKPLLK(配列番号18);WKEEAGKPIVQ(配列番号19);YKNEAGKPLVR(配列番号20);WKDQATRPLVK(配列番号21);WKDESGKPVLK(配列番号22);WQDDSGKPLVK(配列番号23);WKNEAGKTLLK(配列番号24);WKDKAGEPLVR(配列番号25)
1箇所の非保存的アミノ酸置換:
WKDEAGNPLVK(配列番号26);CKDEAGKPLVK(配列番号27);WKDEAGKPLGK(配列番号28);WKDENGKPLVK(配列番号29);WKDEARKPLVK(配列番号30);WKDEAGKPLVT(配列番号31);WKDEAGKRLVK(配列番号32);WKWEAGKPLVK(配列番号33)
2箇所の非保存的アミノ酸置換:
WKDEAGFPTVK(配列番号34);WYDMAGKPLVK(配列番号35);WKDYEGKPLVK(配列番号36);WKREAGKPGVK(配列番号37);WKLEKGKPLVK(配列番号38);WKDEAGKPCVK(配列番号39);WKKEAPKPLVK(配列番号40);SKDEAGPPLVK(配列番号41)
3箇所の非保存的アミノ酸置換:
WKHEPGKPLAK(配列番号42);WKDEREKPFVK(配列番号43);WKQEAGKPWRK(配列番号44);VKDEAKKPLVH(配列番号45);NWDEAGKMLVK(配列番号46);IKDEDGPPLVK(配列番号47);LKDEYGKPLVN(配列番号48);WKDRAGKELTK(配列番号49)
アミノ酸付加
WKDEAGKPLPVK(配列番号50);
WKGDENYAGKPLVK(配列番号51);
LWKDEAGRKYPLVK(配列番号52);
WKDCEGAGKPLVK(配列番号53);
WKDEPAGKPLVVK(配列番号54);
WKDEAGPKPLVK(配列番号55);
WKDEAGWADKPLVK(配列番号56);
WKNDEAGKPLVK(配列番号57)
アミノ酸欠失
WKDAKPLVK(配列番号58);WKEAGKPVK(配列番号59);
WKDEAKPLVK(配列番号60);WDEAGKPV(配列番号61);
WKDEAGKPVK(配列番号62);WDAGKPLVK(配列番号63);
WKDEAGKPLV(配列番号64);WEAGKPLV(配列番号65)
WKDEAG(配列番号66);WKDEA(配列番号67);KDEAGKPL(配列番号68);KDEAG(配列番号69);DEAGKPL(配列番号70);GKPLV(配列番号71);DEAGK(配列番号72);WKDEAGKPL(配列番号73);WKD(配列番号74);KDE(配列番号75);KPLVK(配列番号76);WKDE(配列番号77);AGKPL(配列番号78);EAG(配列番号79);AGK(配列番号80);KPL(配列番号81);LVK(配列番号82);GKP(配列番号83);DEA(配列番号84);PLV(配列番号85)
一実施形態では、本発明のペプチド(ペプチド断片およびペプチド変異体を含む)は、修飾ペプチドでありうる。「修飾ペプチド」という用語は、ペプチドの誘導体という用語と互換的に使用される。一実施形態では、「修飾ペプチド」という用語は、非修飾ペプチドと比較して、以下の特性の1つまたは複数を呈するように修飾されたペプチドを意味する:血漿半減期の延長;ペプチドの親油性の増大;修飾ペプチドの腎クリアランスの増大;修飾ペプチドの活性の増大、およびタンパク質分解(すなわち、哺乳動物、とりわけ、ヒトの消化管プロテアーゼによる)に対する、修飾ペプチドの耐性の増大。本明細書では、これらの特性を呈するように、本発明のペプチドを修飾する多様な方法が開示され、それら方法は、ペプチドを、結合パートナー(例えば、低分子に結合するアルブミン、大型ポリマー、長寿命の血漿タンパク質、または抗体もしくは抗体断片)とコンジュゲートさせること、環化、N末端保護基もしくはC末端保護基、または側鎖保護基の付加、1つまたは複数のL−アミノ酸を、D−異性体で置きかえること、アミノ酸修飾、血漿タンパク質結合の増大、アルブミン結合の増大を含む。修飾ペプチドは、本明細書で規定される、1つもしくは複数の基で置換されるか、または結合パートナーとコンジュゲートさせるか、または環化させたペプチドを含むがこれらに限定されない。一般に、ペプチドは、動物のin vivoにおける半減期を延長するように修飾される。多様な修飾方法を、下記に提示する。
R2は、−NR3R4、−OR3、および−SR3[式中、R3およびR4は、独立に、H、非環状で置換または非置換の脂肪族基、置換または非置換の環状脂肪族基、置換または非置換のヘテロ環基、置換または非置換のヘテロアリールアルキル、置換または非置換のアリール、および置換または非置換のアラルキルにより形成される基から選択される]により形成される基から選択され;かつ、R1およびR2は、α−アミノ酸ではないことを条件とする。
構造修飾を介して、ペプチドの安定性を増強するのに、多くの手法が利用可能である。一部の手法は、安定性を改善するだけでなく、他のADME特性もまた増強し、例えば、環化は、安定性および透過性を増大させることが可能であり、高分子とのコンジュゲーションは、安定性を改善し、腎クリアランスを低減しうる。ペプチドの効力を維持し、毒性を回避する一方で、安定性およびADME特性を改善することが重要である。
血液/血漿、肝臓、または腎臓における、多数のタンパク質分解酵素は、エクソペプチダーゼ、アミノペプチダーゼ、およびカルボキシペプチダーゼであり、ペプチド配列を、N末端およびC末端から分解する。N末端または/およびC末端の修飾は、ペプチド安定性を改善しうることが多い。多くの例が、N−アセチル化およびC−アミド化が、タンパク質分解に対する耐性を増大させることを報告している。
天然L−アミノ酸の、天然D−アミノ酸による置換は、タンパク質分解性酵素の基質認識および結合アフィニティーを低下させ、安定性を増大させる。1つの例は、L−Argを含有し、ヒトにおいて、10〜35分間の半減期を有する、バソプレッシンである。D−Arg類似体であるデスモプレシンは、健常ヒトボランティアにおいて、3.7時間の半減期を有する。がん関連プロテアーゼである、ウロキナーゼ型プラスミノーゲンアクチベーター(uPA)の二環式ペプチド阻害剤についての研究において、特定のグリシンのD−セリンによる置換は、効力を、1.8倍に改善するだけでなく、マウス血漿中の安定性もまた、4倍に増大させる。
天然アミノ酸の修飾は、立体障害を導入するか、または酵素認識を混乱させることにより、ペプチドの安定性を改善しうる。例えば、ゴナドトロピン放出ホルモンは、極めて短い半減期(数分間)を有するが、1つのGlyをt−ブチル−D−Serで置換し、別のGlyをエチルアミドにより置換したブセレリンは、ヒトにおいて、はるかに長い半減期を有する。
環化は、配座拘束を導入し、ペプチドの可撓性を低減し、安定性および透過性を増大させる。官能基に応じて、ペプチドは、頭−尾、頭/尾−側鎖、または側鎖−側鎖で環化させることができる。環化は、一般に、ラクタム化、ラクトン化、およびスルフィドベースの架橋により達せられる。ジスルフィド架橋は、効力、選択性、および安定性を改善しうる、フォールディングおよび配座拘束を創出する。多数のジスルフィド結合豊富ペプチド、例えば、リナクロチド、レピルジン、およびジコノチドが、市販されているか、または前臨床開発もしくは臨床開発中である。
高分子とのコンジュゲーション(例えば、ポリエチレングリコール(PEG)、アルブミン)は、ペプチドの安定性を改善し、腎クリアランスを低減するのに有効な戦略である。
多くのペプチドは、有望なin vitro薬理学的活性を呈するものの、極めて短いin vivo半減期(数分間)のために、in vivoにおける有効性を実証することに失敗している。ペプチドの急速なクリアランスおよび短い半減期は、それらの成功する薬物への開発を妨げる。体循環によるペプチドの急速なクリアランスの主要な原因は、酵素的タンパク質分解または/および腎クリアランスである。糸球体は、約8nmの小孔サイズを有し、MW<2〜25kDaの親水性ペプチドは、腎臓の糸球体を通した急速な濾過を受けやすい。ペプチドは腎尿細管によって容易には再吸収されないので、ペプチドは、しばしば大きな腎クリアランス、および短い半減期を有する。ペプチドクリアランスの、他の副次的な経路は、エンドサイトーシス、およびプロテアソームおよび肝臓による分解である。動物モデルにおける、全身クリアランスと腎クリアランスとの比較は、腎クリアランスが、主要な排出経路であるのかどうかについての有用な情報をもたらす。
ペプチドの腎クリアランスは、それらを、膜タンパク質または血清タンパク質に結合させると低減される。例は、リポタンパク質との結合に起因して、ヒトにおいて約100分間(非結合画分:0.65分間)の半減期を有する、内分泌腫瘍の処置である、環状ペプチド薬オクトレオチドである。
ペプチドに対するアルブミン結合性低分子の共有結合的接合は、高度に結合した低分子を介してアルブミンと間接的に相互作用することにより、糸球体濾過を低減し、タンパク質分解に対する安定性を改善し、半減期を延長しうる。
ペプチドの、大型の合成もしくは天然ポリマーまたは炭水化物とのコンジュゲーションは、それらの分子量および流体力学容量を増大させ、これにより、それらの腎クリアランスを低減することができる。ペプチドコンジュゲーションのために使用される一般的なポリマーは、PEG、ポリシアル酸(PSA)、およびヒドロキシエチルデンプン(HES)である。
アルブミンおよび免疫グロブリン(IgG)断片などの血漿タンパク質は、ヒトにおいて、19〜21日間の、長い半減期を有する。高MW(67〜150kDa)のために、これらのタンパク質は、腎クリアランスが小さく、新生児Fc受容体(FcRn)に対するそれらの結合は、血管上皮による飲細胞作用を介する排出を低減する。アルブミンまたはIgG断片に対するペプチドの共有結合的連結は、腎クリアランスを低減し、半減期を延長しうる。
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Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B et al. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Curr Opin Drug Discov Devel. 2008; 11(2): 242-50
By Dr Ronald V. Swanson-Long live peptides evolution of peptide half-life extension technologies and emerging hybrid approaches. From Drug Discovery World on line. Spring 2014
PEG化(目的の分子に対する、親水性ポリマーであるポリエチレングリコールの長鎖の接合)は、元来、免疫系による外来タンパク質の認識を防止し、これにより、治療剤としてのそれらの有用性を可能とする修飾であると考えられた。ひとたび形成されると、非修飾薬物に対する抗体は、タンパク質薬物を急速に中和し、除去しうる。予測外にも、PEG化は、抗薬物抗体の非存在下であってもなお、タンパク質の薬物動態を改善した。単に、薬物分子を大型とすることにより、PEG化は、腎臓による濾過が緩徐な薬物をもたらした。次いで、サイズまたは流体力学半径を増大させることにより、腎クリアランスの低減および半減期の延長がもたらされるという経験的な観察は、タンパク質薬およびペプチド薬のPEG化の主要な根拠となった。PEG化は、分子に対して様々な効果を有することができ、その効果は、タンパク質またはペプチドの水溶性を増大させ、それらをタンパク質分解酵素による分解から保護することを含む。PEG化は、治療的タンパク質の、それらのコグネイト細胞受容体への結合にもまた影響を与え、通例、アフィニティーを低減する。PEGポリマーのサイズ、構造、および接合方式の変化は、接合させた薬物の生物学的活性に影響を及ぼしうる。
ペプチド半減期を延長する第2の主要な化学的修飾方法は、ペプチド側鎖に対する脂肪酸の共有結合を伴う脂質化である。元来、インスリンの半減期を延長する方法として考案および開発された脂質化は、PEG化と同じ、半減期延長の基礎的機構、すなわち、流体力学半径を増大させて、腎濾過を低減する機構を共有する。しかし、脂質部分自体は、比較的小型であり、効果は、循環アルブミンに対する脂質部分の非共有結合を介して、間接的にもたらされる。大型(67KDa)であり、ヒト血清中の存在度(35〜50g/L)が大きなタンパク質であるアルブミンは、本来的に、体全体にわたって、分子(脂質を含む)を輸送する機能を有する。これもまたPEG化に関して見られたことだが、血漿タンパク質への結合は、立体障害を介して、ペプチダーゼによる攻撃からペプチドを保護する。脂質化の1つの帰結は、それが、ペプチドの水溶性を低減することであるが、ペプチドと脂肪酸との間のリンカーを操作することにより、例えば、リンカー内におけるグルタミン酸またはミニPEGの使用により、この効果を調整することができる。リンカーの操作および脂質部分の変更は、アルブミンに依存せずに生体内分布を遅らせることにより半減期の延長に寄与しうる自己凝集に影響を及ぼしうる。
長寿命の血清タンパク質との古典的な遺伝子融合体は、PEGまたは脂質との化学的コンジュゲーションとは異なる半減期延長の代替法をもたらす。2つの主要なタンパク質:抗体Fcドメインおよびヒト血清アルブミン(HAS)が、融合パートナーとして使用されている(図2)。Fc融合体は、抗体のFc部分に対する、ペプチド、タンパク質、または受容体細胞外ドメインの融合を伴う。Fc融合体およびアルブミン融合体のいずれも、ペプチド薬物のサイズを増大させることのみならず、体内の天然の循環機構:新生児Fc受容体であるFcRnもまた利用して、半減期の延長を達成する。FcRnに対するこれらのタンパク質のpH依存性結合は、エンドソームにおける融合タンパク質の分解を防止する。これらのタンパク質に基づく融合体は、典型的なPEG化ペプチドまたは脂質化ペプチドよりはるかに長い、3〜16日間の範囲の半減期を有しうる。抗体Fcとの融合は、ペプチド薬またはタンパク質薬の可溶性および安定性を改善しうる。ペプチドFc融合体の例は、現在、後期臨床試験中のGLP−1受容体アゴニストであるデュラグルチドである。脂肪酸アシル化ペプチドにより利用される同じタンパク質であるヒト血清アルブミンは、他の一般的な融合パートナーである。アルビグルチドは、このプラットフォームに基づくGLP−1受容体アゴニストである。Fcとアルブミンとの主要な差違は、HASの単量体的構造に対するFcの二量体的性格であり、融合パートナーの選択に応じて、二量体または単量体としての融合ペプチドの表現をもたらす。標的受容体が十分に近接した離間しているか、またはそれら自体が二量体である場合、ペプチド−Fc融合体の二量体的性格は、アビディティー効果をもたらしうる。これは、標的に応じて、所望されうるか、または所望されえない。
組換え融合のコンセプトの興味深い変化形は、融合パートナーとしてデザインされた、低複雑性配列の開発であった(図1)。その配列は、PEGの機能的な類似体である、基本的に構造化されていない、親水性アミノ酸ポリマーである。ポリペプチドプラットフォームの固有の生体分解性は、これを、PEGの潜在的により良好な魅力的な代替物にする。別の利点は、PEGの多分散性と対照的な、組換え分子の正確な分子構造である。融合パートナーの三次元フォールディングを維持することを必要とするHSAペプチド融合体およびFcペプチド融合体と異なり、非構造化パートナーとの組換え融合体は、多くの場合、高温、またはHPLC精製などの過酷な条件下に置くことができる。
遺伝子融合体は、歴史的に、より大きな半減期延長に対する潜在的可能性をもたらしてきたが、それらは、接合部位、およびペプチド骨格に対する非天然アミノ酸または修飾の組込みの柔軟性の点で、化学的コンジュゲーション(PEG化および脂質化)を用いる方法により与えられる利点を欠く。半減期延長のために、遺伝子融合体の利点を、化学的コンジュゲーションと統合しようとする、第1の取組みのうちの1つは、後に、バイオテック企業であるCovXのための基盤を形成した技術により、La Jollaの、Scripps Research Instituteにおける研究者らにより実行された。触媒性アルドラーゼ抗体を使用して、これらの研究者らは、抗体の活性部位リジンが、ペプチドまたは低分子へと組み込まれたβ−ジケトンと、可逆性の共有結合的エナミン結合を形成するプラットフォームを開発した。結果として得られた複合体を、CovXBody(商標)と称する。この手法は、遺伝子融合を介するのではなく、化学的連結を介して、ペプチド薬または低分子の機能的品質を、抗体の長い血清半減期と組み合わせる。初期の技術実証の後、研究者らは、インテグリンをターゲティングするペプチド模倣ファーマコフォアに基づき、CovX−Body(商標)試作品の使用へと拡張した。このアーキテクチャーに基づく、少なくとも3つの分子:Glp−1RアゴニストであるCVX−096;アンジオポエチン2結合ペプチドであるCVX−060;およびトロンボスポンジン模倣体であるCVX−045が、臨床開発に入った。
1つまたは複数の本発明のペプチドを含む薬学的に許容される組成物を調製する状況において、本発明のペプチド(変異体および修飾ペプチドを含む)を、1つまたは複数の意図される投与経路に適する1つまたは複数の担体(希釈剤、賦形剤など)と組み合わせることができる。
上記で指し示した通り、本発明のペプチドまたは組成物は、個別的に、または他の薬理学的な活性薬剤と組み合わせて投与することができる。このような組合せ療法は、異なる治療レジメンを包含することが理解されるであろう。治療レジメンは、単一の剤形中に一緒にされた複数の薬剤の投与、または別個の独立した剤形中の複数の薬剤の投与を含むが、それらに限定されるものではない。薬剤が、異なる剤形中に存在する場合、投与は、同時的もしくはほぼ同時的でありうるか、または異なる薬剤の投与を包含する、任意の所定のレジメンに従いうる。
上記で記載した通り、本発明の組成物は、「治療有効量」または「予防有効量」の本発明のペプチド(または本発明のペプチドと、第2の成分とを含む組合せ組成物の場合における、第1の量および第2の量;2つの本発明のペプチドと、副次的薬剤とを含むか、または本発明のペプチドと、2つの副次的薬剤とを含む組合せ組成物の場合における、第1、第2、および第3の量など)を含みうる。より良好に特定の態様を例示するために、投与量原則についての詳細な議論を、ここでさらに提示する。
細胞増殖アッセイ
研究の説明
BrDuを、活発に増殖する細胞の、新たに合成されるDNA鎖へと組み込む。二本鎖DNAの部分的変性の後、BrDuを免疫化学的に検出し、DNAを合成しつつある細胞集団についての評価を可能とする。
ヒト皮膚線維芽細胞(HDF−Sigma 10605a)を、96ウェルプレート内、10%ウシ胎仔血清(FCS)、1%Pen/strep、1%L−グルタミンを含有するDMEM中に、ウェル1つ当たりの細胞10,000個で播種し、24時間にわたり接着させた。
結果は、非処置対照に対する百分率として計算した。図1(HDF細胞)および図2(HACAT細胞)により例示される通り、光学濃度読取値の増大は、BrDuの組込みの増大、および細胞増殖の増大を示す。図1および図2により例示される通り、本発明のペプチドで刺激された試料は、非処置対照と比較した、細胞増殖の増大を示した。
これらの結果は、細胞増殖を容易とするペプチドの有効性を裏付ける。
コラーゲン産生アッセイ
研究の説明
組織調製物中のヒドロキシプロリンは、存在するコラーゲンの量についての直接的な尺度である。FIRELISAヒトヒドロキシプロリンELISAキットアッセイをデザインして、組織組成またはペプチド組成におけるヒドロキシプロリンを測定する。
方法
結果は、非処置対照に対する百分率として計算した。光学濃度読取値の増大は、コラーゲン含量の増大を示す。図3により例示される通り、非処置対照と比較したコラーゲン産生の増大が見られた。
これらの結果は、コラーゲン産生を容易とするペプチドの有効性を裏付ける。
エラスチン産生アッセイ
研究の説明
エラスチンとは、結合組織内の高弾性タンパク質であり、体内の多くの組織が、伸縮の後に、それらの形状を旧復させることを可能とする。FIRELISAヒトエラスチンELISAキットアッセイをデザインして、組織組成またはタンパク質/ペプチド組成物におけるエラスチンを測定する。
方法
結果は、非処置対照に対する百分率として計算した。光学濃度読取値の増大は、エラスチン含量の増大を示す。図4により例示される通り、本発明のペプチドで刺激された試料は、非処置対照と比較してエラスチン産生の増大を示した。
これらの結果は、エラスチン産生を容易とするペプチドの有効性を裏付ける。
グルコース取込み
研究の説明
2−デオキシグルコース(2−DG)を使用して、骨格筋細胞内のグルコース取込みを測定した。2−DGは、グルコース輸送体により取り込まれ、2−DG−6−リン酸(2−DG6P)へと代謝される。非代謝性の2−DG6Pの蓄積量は、細胞によるグルコース取込みと比例する。
方法
結果は、非処置対照に対する百分率として計算した。光学濃度読取値の増大は、2−DG6Pの組込みの増大、およびグルコース取込みの増大を示す。全ての実験を、3つのプレート上、二連(状態1つ当たり6つのウェル)で実行した。スチューデントのt検定(*対照と比較してp<0.05、**対照と比較してp<0.01、***対照と比較してp<0.001)を使用して、有意性を決定した。図6は、0.5μg/mlの合成ペプチドについての結果を例示し、図7は、5μg/mlの合成ペプチドについての結果を例示する。図5は、HACAT細胞についての結果を表示する。これらの図により例示される通り、本発明のペプチドで刺激された試料は、非処置対照と比較した、グルコース取込みの増大を示した。
これらの結果は、骨格筋内のグルコース取込みを容易とするペプチドの有効性を裏付ける。
GLUT−4移動
方法
HSKMC細胞を、6ウェルプレート内で培養し、次いで、0.5μg/mlおよび5μg/mlの濃度のペプチド/加水分解物で、2時間にわたり処置した。処置が完了したら、細胞膜タンパク質を回収した。略述すると、細胞クレーパーにより、ウェルから細胞を採取し、300×gで5分間にわたり遠心分離した。細胞ペレットを、300μlの細胞洗浄液で洗浄し、次いで、300×gで5分間にわたり再び遠心分離した。上清を廃棄し、細胞を、1.5mlの細胞洗浄液中に再懸濁させ、2mlの遠心管へと移した。次いで、細胞を、300×gで5分間にわたり遠心分離し、上清を廃棄した。細胞ペレットに対して150μlの透過化緩衝液を添加し、短時間にわたり渦撹拌(vortex)して、均質な細胞懸濁液を得た。次いで、懸濁液を、定常的に混合しながら、4℃で10分間にわたりインキュベートした。次いで、透過化された細胞を、16000×gで15分間にわたり遠心分離し、細胞質ゾルタンパク質を含有する上清を、未使用のチューブへと移した。100μlの可溶化緩衝液を、ペレットへと添加し、静かにピペッティングすることにより再懸濁させた。次いで、試料を、定常的に混合しながら、4℃で10分間にわたりインキュベートした。次いで、試料を、16000×gで、15分間にわたり、4℃で、10分間にわたり遠心分離した。可溶化させた膜および膜関連タンパク質画分を含有する上清を、未使用のチューブへと移し、評価の準備ができるまで、−80℃で保存した。
図8により例示される通り、0.5μg/mlおよび5μg/mlのペプチドの両方により刺激された試料中で、GLUT4移動の増大が見られた。
ペプチドは、骨格筋GLUT4移動に対する刺激効果についての傾向、および骨格筋内のグルコース輸送を容易とするその能力を示した。
筋肉タンパク質合成(ホスホmTORアッセイ)
研究の説明
哺乳動物におけるラパマイシンの標的(mTOR)は、ATPおよびアミノ酸センサーとして機能して、栄養物質のアベイラビリティーおよび細胞増殖を平衡させる、Ser/Thrタンパク質キナーゼである。mTORの活性は、インスリン、アミノ酸、身体運動、酸化ストレス、および増殖因子により調節され、一貫して、そのリン酸化が、タンパク質合成経路を促進する。しかし、mTORの調節異常は、他の多くの病態の中でも、老化の加速を引き起こす。筋肉内で、mTORは、活性化(リン酸化)されると、骨格筋肥大をもたらす。この事実は、齧歯動物およびヒトの両方において、文献的に広く報告されている。ロイシンなどのアミノ酸は、mTORのリン酸化を増強し、その活性化は、真核生物開始因子4E結合性タンパク質1(4E−BP1)およびリボソームタンパク質S6キナーゼ(S6K)のリン酸化を介して、タンパク質翻訳を上方調節し、細胞増殖(growthおよびproliferation)をもたらす。
第1日:HSkMC細胞を、ウェル1つ当たり500uLのHSkMC増殖培地中に播種し、16〜24時間にわたり、ウェルに対してそれらを接着させる。
第2日:増殖培地を除去し、ウェル1つ当たり500uLのHSkMC分化培地を添加して、それらを、5〜7日間にわたり分化させる。
第7日:細胞を、2時間にわたり処置する。細胞溶解物を、溶解緩衝液中に回収する。
第8日:BCA(タンパク質決定)を実施し、アッセイを行う。第1のインキュベーションステップでは、ELISAマイクロウェル上に被覆されたmTOR抗体を使用して、細胞溶解物からmTOR(ホスホおよび非ホスホ)を捕捉する。次いで、十分な洗浄の後、特異的ホスホmTOR検出抗体を添加して、既に捕捉されたホスホmTORタンパク質だけを検出する。最後に、HRP連結抗体を使用して、検出抗体を認識し、TMB(HRP基質)の添加により、Ser2448においてリン酸化されたmTORの数量に比例して発色させる。
結果を、図9により例示する。0.5μg/mlおよび5μg/mlで刺激された試料は、mTORの増大を示した。
これらの結果は、筋タンパク質合成および筋肉増殖活性を容易とするペプチドの有効性を裏付ける。
製剤
実施形態では、組成物を、局所組成物として製剤化する。一実施形態では、それは、エマルジョンもしくはクリーム、または筋肉ラブなどのラブでありうる。
例示的なラブまたはエマルジョンは、実施例7においては、以下の通りである。
実施例8における以下の組成物は、エマルジョンまたはクリームまたはラブの例である。
実施例9における以下の組成物は、エマルジョンまたはクリームの例である。実施形態では、エマルジョンまたはクリームは、抗妊娠線クリームである。
実施例10における以下の組成物は、ゲルの例である。実施形態では、ゲルは、保湿ゲルである。
この製剤は、実施例11で一般に概括される手順に従い作ることができる。
実施例12における以下の組成物は、クリームまたはラブの例である。
実施例13における以下の組成物は、ラブまたはトニックの例である。
実施例14における以下の組成物は、クリームまたはラブの例である。
実施例15における以下の組成物は、ゲルまたはラブの例である。
ピューロマイシンELISA
研究の説明
ピューロマイシンは、細菌ストレプトマイセス・アルボニガー(Streptomyces alboniger)により産生される、アミノヌクレオシド抗生剤である。それは、アミノアシル転移RNAの構造的類似体であり、したがって、ペプチド結合の形成を介して、伸長しつつあるペプチド鎖へと組み込まれうる。しかしながら、アミノアシルtRNAが、加水分解可能なエステル結合を含有するのに対し、ピューロマイシンは、同等な位置にこれを有さない。したがって、ピューロマイシンの、成長しつつあるペプチド鎖への結合は、次のアミノアシルtRNAにより新たなペプチド結合が形成されることを妨げる。帰結として、ピューロマイシン結合は、ペプチド伸長の終結を結果としてもたらし、ピューロマイシンが結合して切断されたペプチドのリボソームからの放出をもたらす。極めて高濃度では、ピューロマイシンは、翻訳の伸長期を、有効に遮断し、したがって、タンパク質合成を阻害する。しかしながら、極めて低濃度では、全体的な翻訳速度を抑制せず、ピューロマイシンで標識化されたペプチドが形成される速度は、全体的なタンパク質合成速度を反映する。この後者の特性は、ピューロマイシンを、タンパク質合成速度の変化を測定するための潜在的なツールとする。
1.ウェル1つ当たり100μlずつのコーティング緩衝液を、96ウェルELISAプレート内の、要求された数のウェルに分注する。タンパク質抽出物を、5μg/μlへと希釈および混合する(試料を入れる同じ緩衝液中で)。直ちに、ウェル1つ当たり1μLずつを、プレートに分注する。
2.プレートを、4℃で、16〜24時間にわたりインキュベートする。
3.内容物を、強く振盪する。200μlのPBSにより、1回にわたり洗浄する。
4.200μlのブロッキング液(PBS中の5%BSA)を添加する。室温で、4〜6時間にわたりインキュベートする。
5.ピューロマイシン抗体を、ブロッキング液中で希釈し、4℃で、一晩にわたりインキュベートする。
8.200μlのPBSにより、2回にわたり洗浄する。
9.ブロッキング液中、1:1000に希釈された二次抗体100μlを添加する。室温で、1時間にわたりインキュベートする。
10.200μlのPBSにより、4回にわたり洗浄する。内容物を、強く振盪する。
11.100μlのTMB基質を添加し、15〜20分間にわたりインキュベートする。
12.停止液を添加し、プレートを、450nmで読み取る。
図10は、タンパク質合成の増大を例示する。
毒性
方法
100μlのHSkMC細胞を、コラーゲンでプレコーティングされた96ウェルプレート内、ウェル1つ当たりの細胞1×104個の濃度で播種した。細胞を、37℃、5%CO2で、一晩にわたり接着させ、翌日、増殖培地を、100μlの細胞分化培地で置きかえ、37℃、5%CO2のインキュベーターへと戻した。HSkMC細胞が筋管へと完全に分化するまで、6日間にわたり、2日ごとに、細胞分化培地を交換した。7日目に、細胞分化培地を、100μlの基礎培地で置きかえ、37℃、5%CO2で、一晩にわたり飢餓させた。
この実験のセットは、配列番号1のペプチドの作用機構を理解するために企図された。
方法
ホスホアセチルCoAカルボキシラーゼ(Ser79)サンドイッチELISAキットは、Ser79においてリン酸化された場合のアセチルCoAカルボキシラーゼ(ACC)の内因性レベルを検出する、固相サンドイッチ酵素免疫測定アッセイ(ELISA)である。ホスホACC(Ser79)ウサギ抗体を、マイクロウェルへとコーティングした。細胞溶解物を伴うインキュベーションの後、ホスホACCタンパク質を、コーティングされた抗体により捕捉した。十分な洗浄の後、ACCマウス検出mAbを添加して、捕捉されたACCタンパク質を検出した。次いで、抗マウスIgG HRP連結抗体を使用して、結合した検出抗体を認識した。HRP基質であるTMBを添加して、発色させた。発色についての吸光度の大きさは、Ser79でリン酸化されたACCの数量と比例した。これらの結果を、図12により例示する。
方法
ホスホAkt1(Ser473)サンドイッチELISAキットは、ホスホAkt1(Ser473)タンパク質の内因性レベルを検出する、固相サンドイッチ酵素免疫測定アッセイ(ELISA)である。ホスホAkt(Ser473)ウサギmAbを、マイクロウェルへとコーティングした。細胞溶解物を伴うインキュベーションの後、ホスホAkt(Ser473)タンパク質を、コーティングされた抗体により捕捉した。十分な洗浄の後、Akt1マウス抗体を添加して、捕捉されたホスホAkt1(Ser473)タンパク質を検出した。次いで、抗マウスIgG HRP連結抗体を使用して、結合した検出抗体を認識した。HRP基質であるTMBを添加して、発色させた。この発色についての吸光度の大きさは、ホスホAkt1(Ser473)タンパク質の数量と比例する。
方法
ホスホAMPKα(Thr172)サンドイッチELISAキットは、Thr172においてリン酸化された場合の、AMPKαの内因性レベルを検出する、固相サンドイッチ酵素免疫測定アッセイ(ELISA)である。AMPKαウサギ抗体を、マイクロウェルへとコーティングした。細胞溶解物を伴うインキュベーションの後、AMPKα(ホスホおよび非ホスホ)を、コーティングされた抗体により捕捉した。十分な洗浄の後、ホスホAMPKα(Thr172)マウス検出抗体を添加して、捕捉されたAMPKαタンパク質の、Thr172におけるリン酸化を検出した。次いで、抗マウスIgG HRP連結抗体を使用して、結合した検出抗体を認識した。HRP基質であるTMBを添加して、発色させた。この発色についての吸光度の大きさは、Thr172においてリン酸化されたAMPKαの数量と比例した。結果を、図14により例示する。
配列番号1の配列を伴うペプチドは、AMPK経路を介して働いている。骨格筋では、AMPKの活性化(リン酸化)は、脂肪酸酸化を促進する、リン酸化ACCをもたらす。これは、下記で記載される、骨格筋細胞内の遺伝子発現プロファイルにおいて示される通り、インスリンの経路とは、極めて異なる経路である。
遺伝子発現研究
方法
インスリンおよび配列番号1のペプチドに対して、陰性対照に対する過剰および過小な遺伝子発現を示す、上位50の遺伝子を探索した。
ABCA9、ACIN1、ADAP2、AKIRIN2、ALG3、AMN、ANKS3、ANP32A−IT1、ARGLU1、ARHGEF35、ARPC5L、ASAP1−IT1、ATP5H、ATP8、AURKAPS1、BMS1P6、BOD1L1、BRD3、BROX、C12orf65、C14orf169、C20orf96、C21orf59、C4orf33、C5orf24、C5orf58、C6orf47、CACNA1A、CASC15、CATSPER2P1、CBX5、CCDC102B、CCNL1、CCNT2−AS1、CD86、CDK11B、CENPC、CFAP36、CHD3、CIAO1、CLASRP、CMTM8、COPG2IT1、CRHR1−IT1、CWC22、DKFZP586B0319、DKFZp686M1136、DPP9−AS1、DRAP1、DRD4、DYX1C1、EIF4G3、EIF5、EPSTI1、EXOC1、FAM127C、FAM155A−IT1、FAM173A、FAM212A、FAM71F1、FASTKD1、FIP1L1、FLJ11292、FLJ13773、FTSJ3、GABPB1−AS1、GADD45B、GATA2、GBP2、GOLGA2P6、GOLGA6L4、GPATCH11、GPR135、GRIN2D、GSK3A、HEBP2、HMGB1、HMGB3P1、HNRNPA1L2、HOXB−AS1、HOXC9、HOXD8、ID1、IER2、IFI44、IFT172、IGF1R、IGF2BP2、KANK3、KCTD3、KIAAI654、K1Z、KLF17、KRTAP19−2、KRTAP4−11、LDHAL6A、LINC00083、LINC00504、LRRC37A2、MALAT1、MAP3K10、MAP3K3、MBNL1、MIDN、MIR22HG、MIR612、MPV17L2、MRE11A、MTA2、MYO1C、MZF1、NAMPT、NBPF8、ND4L、NF1P2、NIPBL、NOL8、NOP58、NPIPB5、NR2C1、OLA1、PAK1IP1、PCDHGA2、PDCD6IP、PDGFRB、PFDN4、PGBD2、PGF、PGM5P2、PMAIP1、PNPLA8、POU2F1、PP12719、PPIG、PPP6R1、PRKAG2、PRO2852、PRPF40A、PRR4、PSMA4、PTMA、RALBP1、RC3H2、RCC1、REP15、RHOB、RN7SL1、ROM1、RPLP1、RPS6KC1、SAMD11、SFSWAP、SH3KBP1、SLC25A34、SLFN5、SMARCC1、SMCR6、SMIM11、SNAI1、SNAR−A3、SNAR−B2、SNAR−D、SNAR−F、SNAR−G2、SNAR−H、SNHG9、SNORA10、SNORD97、SNORD99、SOCS3、SOX8、SRP19、SRSF11、SSC5D、STAR、TAB2、TAF3、TCEAL7、TCF7L1、TFPI2、THOC2、TINAGL1、TNFAIP8L1、TOPORS、TRANK1、TRAPPC10、TXLNG、UBE2Q2P1、UBN2、VASP、VHL、VPS37D、YBX3、ZBTB2、ZCCHC17、ZMYND11、ZNF503−AS2、ZSWIM4、ZSWIM6
ABHD2、ACTA2、ACVR1、ADAMTS9、ADCY6、ADD3、ADPRHL2、AGTRAP、ALAD、AMZ2P1、ANXA2P1、AP2B1、ARMCX6、ATP5A1、ATP5B、ATP5G1、ATP6V0E1、ATRAID、AXL、BFAR、BOD1、BRF2、C1orf43、C5orf15、C9orf78、CA12、CAV1、CD47、CD82、CD9、CDC123、CDC42BPA、CDC42EP4、CHST14、CHST3、CHSY3、CLMP、CLPTM1L、CLU、CNPPD1、COLGALT1、COPG1、COPZ2、CRISPLD2、CRTC3、CSRP1、CTSLP8、CYB5D2、CYB5R1、DAG1、DANCR、DEK、DENND4C、DFNA5、DHRS1、DLST、DNAJB9、DNASE1L1、DNASE2、DPAGT1、EBF2、EI24、EIF2B4、EIF3I、EIF3K、EIF3L、EMC3、ENDOD1、ENO2、ENPP4、EPRS、ESYT1、ESYT2、EXT1、EZH1、FAF1、FAM57A、FAM96A、FAS、FHOD1、FKBP14、FLII、FLNB、FN3KRP、G6PD、GABARAP、GALM、GARS、GBA、GBAP1、GDE1、GJA1、GOLM1、GPRC5A、GPX3、GREM1、GSTM2、HDDC2、HEPH、HEXB、HLA−A、HLA−DMA、HLA−DPA1、HLA−DPB1、HLA−DRB4、HOOK2、HTRA2、IDH1、IDS、IFIT3、IGF2R、IGFBP6、IL10RB、IL11RA、ILK、ITGA3、ITGAE、JKAMP、KIF3B、KLHDC2、LAMA2、LAPTM4B、LASP1、LUM、MAGED1、MAN2A1、MAN2B2、MANBA、MANSC1、MAP2K1、MFSD5、MKNK1、MLEC、MMGT1、MPHOSPH8、MRPL17、MRPL37、MRPS18A、MTFR1L、MTHFD1L、MUL1、MYD88、NBAS、NDRG1、NDUFA9、NIF3L1、NLRP1、NME6、NPC1、NSMCE1、NUDT2、OAT、OLFML3、OXA1L、P4HA2、P4HTM、PAMR1、PARP6、PCYOX1、PDE6D、PDLIM1、PDXP、PEA15、PEAR1、PEF1、PELO、PGAM1、PGM1、PGRMC1、PHB2、PIGH、PLEKHG4、PLP2、PLS3、PPAP2B、PPIAL4B、PPL、PRKAB1、PRMT5、PRNP、PRPF8、PRPS1、PRRC1、PSAP、PSMB8、PSMD10、PTGS1、QSOX2、RAB11FIP5、RAF1、RARG、RBM23、RER1、RHBDD2、RP9、RPL29P2、RPL5、RPRD1B、RPUSD4、RTCB、SCAMP2、SCG2、SDC4、SDHB、SEC22C、SEC23A、SEC63、SENP3、SEP15、SERINC1、SERINC3、SF3B2、SFXN3、SGCE、SIAE、SLBP、SLC12A4、SLC1A1、SLC35B1、SLC35E2、SLC35E3、SLC39A1、SLC39A7、SMPD1、SNORA70F、SNX11、SNX19、SPPL2A、SPRED2、SRPR、STAU1、STEAP1B、STIM1、STK38、STX18、SYPL1、SYT11、TAF11、TAPBPL、TBC1D22B、TCN2、TCTA、TES、TFG、TFRC、TGFB3、TM7SF2、TM9SF1、TMBIM1、TMCO1、TMCO3、TMED10、TMEM138、TMEM179B、TMEM185A、TMEM216、TMEM50A、TNS1、TNS3、TPI1P2、TRAM2、TRIM16L、TSPAN9、TUB、TUBA1A、UBAC2、UBE2E3、UNC50、USO1、USP24、VCL、VOPP1、VPS25、VPS33B、WAS、WBP1、WNT5B、ZCCHC24、ZFP91、ZMAT3、ZMYM6NB、ZNF384、ZNF667−AS1
ACAA2、ACSL1、ACVR1、ADAR、ADD3、ADIPOR2、ADPRM、AGTR1、AKR1B10、AKR1B15、ALAD、ALG14、AMZ2、AMZ2P1、ANKHD1、APOL6、ASCC1、ASH2L、ATF5、ATG3、ATP5A1、ATP5C1、ATP5J2、ATP6V0E1、ATP6V1B2、ATXN7L3B、B2M、B4GALT5、BBS4、BIRC5、BLMH、BOD1、BRK1、BST1、BTF3、C11orf73、C16orf58、C17orf62、C19orf52、C1orf43、C4orf3、C5orf15、C5orf58、C7orf25、C8orf33、CALM1、CCNB1IP1、CCNG2、CD47、CDCA8、CFDP1、CHAMP1、CHCHD3、CHURC1、CISD3、CKAP5、CLMP、CLTA、COA1、COG3、COG8、COPS8、COX14、CPD、CSTF1、CSTF2T、CTCF、CYB5R3、CYCS、CYTB、DCTN6、DCTPP1、DDX21、DDX5、DDX60、DECR1、DERL1、DFNA5、DHX15、DHX32、DRG1、DSTYK、EFNB3、EMCN、EMG1、ENDOD1、ENPP2、ERICH1、ETFA、EZH1、F8A2、FAM96A、FH、FOS、FOSB、FUCA2、FUNDC2、GABARAPL2、GADD45B、GALNT15、GAS1、GATS、GBF1、GBP1、GDE1、GGA3、GJA1、GLB1、GLUL、GOLM1、GPR89B、GRAMD3、GSTA4、GTF2E2、H2AFZ、HES1、HEXB、HIBADH、HIST1H4F、HIST2H2AA4、HMGN3、HMGN4、HNRNPM、HOOK2、HSPB8、IDH1、IER3、IFI44L、IFIT1、IFT88、IMMP2L、IMPA2、INTS12、KAT7、KCTD10、KDELR3、KIAA0196、KIF2C、KIFAP3、KLF10、KLHL18、LAP3、LAPTM4B、LDHA、LDLR、LETMD1、LMAN2L、LMO4、LOXL4、LRP10、LSM1、LTBP2、LYPD6B、LYSMD2、MAD2L1BP、MANBA、MAT2A、MCL1、MEDAG、MFAP1、MIF−AS1、MIOS、MKKS、MMGT1、MRFAP1、MROH5、MRPL20、MRPL33、MYD88、NDN、NDRG1、NDUFV2、NKAP、NOLC1、NT5C3B、NT5E、OAS1、OAT、OAZ2、ODF3L2、OLFML1、OLFML2B、OSBP、OSTC、OTUD1、OXCT1、PAIP2、PARL、PARP9、PATL1、PCED1A、PDE1A、PEAR1、PELO、PFKL、PFKM、PGAM1、PGK1、PGM1、PIGH、PLEKHJ1、POGK、POLD2、POLR2B、POLR3F、PPA2、PPAP2B、PPAPDC2、PPL、PPP2CB、PPP2R2A、PQLC2L、PRC1、PRDM4、PSMA2、PSMA5、PSMD10、PSME4、PTGS1、PTP4A1、PTTG2、RAB31、RAB32、RAB9BP1、RABEP1、RAC1、RASL11B、RCN1、RHOA、RIOK1、RNASEL、RNF121、RNF146、RNLS、RPA2、RPL15、RPL21P44、RPP38、RTCB、SEC22C、SEC23IP、SENP2、SEP15、SERP2、SERTAD4、SETX、SFRP1、SFT2D1、SGCE、SIAE、SLBP、SLC25A12、SLC25A25、SLC30A9、SLC35B1、SLC44A1、SLC9A3R1、SMAD7、SMIM19、SNAPC5、SNHG3、SNORD116−19、SNORD96A、SNX19、SRRD、SRSF2、STARD7、STK16、STOM、STOML2、SUCLA2、SUCLG1、SYNGR4、SYT11、TASP1、TCP1、TFRC、TGFBR2、TIMM17A、TIMMDC1、TINF2、TMCO1、TMEM173、TMEM203、TMEM230、TMEM50A、TMEM50B、TMEM60、TMX2、TNC、TNS3、TOMM22、TOR1A、TOR3A、TP53I3、TPBG、TPI1、TRIB1、TRIL、TUBB3、TUG1、TUSC3、UBE2C、UBE2E3、UBE2L3、UGCG、UNC119、UQCRFS1、USP18、USP24、USP34、VAMP7、VDAC3、VIM−AS1、VOPP1、WARS、WDR36、WDR48、WDR61、WDYHV1、WLS、WRB、XPNPEP1、XRCC6BP1、YIPF6、ZFP91、ZMAT2、ZNF157、ZNF281、ZNF384、ZNF426、ZNF564、ZNF696、ZNF75D、ZSCAN32
ABLIM1、ACTR2、ADAM20、AHSA2、ALDH1L2、AMN、APC、APOLD1、ARGLU1、ARPC5、ASAP1−IT1、ATXN2、ATXN3、AURKAPS1、BCL2L11、BCLAF1、BRD1、BTG3、C14orf169、C1QTNF5、C20orf141、C20orf96、C5orf28、C6orf203、CACNA2D1、CCDC102B、CCDC125、CCDC6、CCNG1、CCNL1、CD46、CEACAM19、CENPC、CHML、CIRBP、CN2、COL1A1、COL4A1、CRYBG3、CWC22、DDX3X、DEND4B、DHRS3、DIAPH2、DLG1、DNAJB4、DNAJC3、DOCK6、DPEP3、DSE、DST、DYNLT3、DZIP3、EDIL3、EGLN1、EIF4G3、ELF2、ELP2、EPC1、FAM111A、FAM177A1、FBXO32、FERMT2、FGF7、FNIP1、FOSL2、FOXN2、FRYL、GABPB1−AS1、GABRE、GLS、GOLGA6L4、GOLGA8R、GOLIM4、GPATCH11、GPR135、GTF2H5、HCG11、HCG18、HIF1A、HNRNPA1、HOOK3、HOXC6、HSP90AA1、HSP90AA2P、HSPA1B、HSPA4、HSPH1、HTT、IGF2R、ITGB3、JMJD4、KCNMB2−AS1、KCTD3、KDM2A、KIAA1143、KIZ、KRAS、KRT8P12、LCE1D、LINC01506、LOX、LPGAT1、LPP、LRP12、LRRC3C、MACF1、MAMDC2、MAP1B、MAP2K3、MAP3K10、MATR3、MBNL1、MBTPS2、MDM2、MDM4、MED15、METTL15、MGC24103、MUSTN1、MYH3、MYH8、MYLPF、MYO6、MZF1、NAB1、NADK、NADK2、NBEAL1、NCKAP5、ND6、NEK7、NKTR、NR2C1、NRN1、OFD1、PAPOLA、PAWR、PAXBP1、PBRM1、PCDHGA2、PDE1C、PDZD8、PEAK1、PFDN2、PGBD2、PHF1、PJA2、PLOD3、POLR2J2、PPME1、PPP1R14A、PPP1R16B、PPP1R2、PPP1R3B、PRO2852、PRPF40A、PRUNE2、PTPN11、PUM2、PXK、RAB12、RAB2A、RBM10、RCN2、REEP3、REST、RHOBTB3、RHOQ、RIOK3、RNF19B、RNF215、RNPC3、ROBO1、ROCK1、RPL26L1、SAMD14、SDPR、SEPT7P2、SERP1、SFSWAP、SGIP1、SH3KBP1、SKI、SLC35A5、SLC46A3、SLC7A5、SMARCC1、SMARCC2、SMN1、SNAR−H、SNORA16A、SNORD89、SOX6、SPHAR、SREK1、SRSF11、STT3B、STX2、TAB2、TFPI、THBS1、THOC2、TINAGL1、TMA16、TMEM106C、TMEM26−AS1、TNFAIP8、TOB1、TTC28、TXLNG、UBE2D1、UBE2Q2P1、UBL3、UCHL5、UPF2、UPF3A、USP15、USP33、UTRN、UVSSA、WHAMMP1、WNT3、YBX3、YWHAZ、ZBTB2、ZFC3H1、ZMYND11、ZNF22、ZNF37A、ZNF429、ZNF525、ZNF532、ZNF626、ZRANB2、ZSWIM8
プロテオミクス
方法
LC/MS/MSを使用して、タンパク質レベルを得た。タンパク質カウントに関する統計学的解析は、存在度が過小なタンパク質および存在度が過大なタンパク質をもたらした。0.379を超える、絶対タンパク質レベル倍数変化値だけを保持した。これらのタンパク質全てについて、マイクロアレイ解析により、関連する転写物倍数変化を提示する。
・25mMの重炭酸アンモニウムに続き、アセトニトリルで洗浄した。
・60℃、10mMのジチオトレイトールで還元した後、RTにおいて、50mMのヨードアセトアミドによるアルキル化を行った。
・トリプシン(Promega)により、37℃で、4時間にわたり消化した。
・ギ酸でクエンチし、さらに加工せずに、上清を直接解析した。
酵素:トリプシン;データベース:Swissprot Human(一般的な夾雑配列を付加したフォワードおよびリバース);固定修飾:カルバミドメチル(C);可変修飾:酸化(M)、アセチル(タンパク質N末端)、Pyro−Glu(N末端Q)、脱アミド化(NQ);質量値:モノアイソトピック
ペプチド質量許容差:10ppm;断片質量許容差:0.02Da;最大誤切断:2
検証、フィルタリング、および試料1例当たりの非冗長リストの作成のために、Mascot DATファイルを、Scafoldソフトウェアへと送った。データは、フィルタリングされた1%のタンパク質およびペプチドレベルfalse discovery rate(FDR)であり、タンパク質1つ当たり、少なくとも2つの固有のペプチドを要求した。次いで、上方調節および下方調節されたタンパク質を推定した。
消化物は、ThermoFisher Q Exactiveへとインターフェース接続された、Waters NanoAcquity HPLCシステムを伴うナノLC/MS/MSにより解析した。ペプチドを、捕捉カラムにロードし、350nL/分で、75μmの解析カラム上で溶出させたが、いずれのカラムにも、Luna CI 8樹脂(Phenomenex)を充填した。30分間の勾配を利用した(試料1例当たり、のべ10時間)。質量分析計は、データ依存モードで作動させ、MSおよびMS/MSを、それぞれ、70,000FWHMおよび17,500FWHMの分解能で、Orbitrapにより実施した。15の最も存在量が多いイオンを、MS/MSのために選択した。
目的の特異的遺伝子についてのQPCRおよびそれらの倍数変化
実験手順
定量的PCRは、標的mRNA発現を、B2Mハウスキーピング遺伝子の発現と比べて定量化する、TaqManプローブベースの方法を使用して実施した。プライマー/プローブと、Taqman(登録商標)Gene Expression Master Mix(ABI Biosystems, CA, USA)とを含有するマスターミックスを、1μlのcDNA鋳型へと添加した。10μlの最終容量を、96ウェルLightcyclerプレート(Sarstedt, Numbrecht, Germany)のウェルへと、二連でピペッティングし、リアルタイムPCRは、Roche Lightcycler 96(Roche Diagnostics, Basal, Switzerland)リアルタイムサーマルサイクラー上で実施した。各ウェルの閾値サイクル(Ct)は、測定器ソフトウェアを使用して計算した。データ解析は、プレート上に組み入れたB2Mハウスキーピング遺伝子により正規化された生データでのΔΔCt法に基づいた。結果は、対照に対する倍数変化として表す。
肥満および糖尿病のマウスモデルにおける、合成ペプチド(配列番号1)の、血中グルコース管理に対する効果の探索
実験手順
動物記載:
・種:KK.Cg−Ay/J(KKAYマウス)
・供給元:Jackson Laboratories
・週齢:12週齢
・性別:雄
・無作為化:ベースライン空腹時血糖に基づく
・馴致:5日間以上
・飼育:マウスは、12時間明暗周期で飼育される
:サイズに応じて、ケージ1つ当たりのマウス4匹以下とする
:有換気のケージラックシステム
・飼料:標準的な齧歯動物食および水(不断供給(ad libitum))
・投与経路:皮下注射
・投与容量:10mL/kg
・用量レベル:被験薬:100μM/kg、メトホルミン:250mg/kg
・群1つ当たりの数:10
・動物の合計数:30
OGTTでは、30分前に、ベースライングルコースおよびインスリンについて、マウスから採血した(ベースライン)。この直後に、被験薬投与を行った。30分間後、すなわち、0分において、全てのマウスに、強制経口投与を介して、グルコース溶液(2g/kg)を投与した。グルコース追加投与の後、血中グルコースレベルを、下記のスケジュールに従い測定した。
配列番号1のペプチドによる処置は、7日間にわたる処置の後で、血糖を著明に低減した。配列番号1のペプチドによる処置は、多くの抗糖尿病処置のように、体重の増大を引き起こさなかった。配列番号1は、処置群における体重を、非処置群と比べて低減した。
抗酸化アッセイ(DPPHラジカル捕獲活性アッセイ)
Lin SY, Wang J, Zhao P, Pang Y, Ye HQ, Yuan Y, Liu JB and Jones G, Optimized antioxidant peptides fractions preparation and secondary structure analysis by MIR. Int J Biol Macromol 59: 151-157 (2013)に記載されている方法を使用して、DPPH試験を行った。
96ウェル−プレート内で、試料を、以下の通りに調製した:0.1mMのDPPH溶液100μL、ペプチド溶液100μL、およびエタノール100μLを、ウェルごとに混合した。
アスコルビン酸は、以下の通りに調製した:0.1mMのDPPH溶液100μL、アスコルビン酸100μL、およびエタノール100μLを、ウェルごとに混合した。
ブランクは、以下の通りに調製した:0.1mMのDPPH溶液100μL、エタノール200μLを、ウェルごとに混合した。
3つのウェルを、被験状態ごとに使用した。
DPPHラジカル捕獲活性(%)
=[1−(試料における吸光度/ブランクにおける吸光度)]×100
の通りに計算した。
炎症応答アッセイ
TNFαは、リポ多糖(LPS)などの内毒素による刺激に応答して、マクロファージにより分泌される。TNFαは、全身性炎症に関与すると考えられ、TNFα産生の調節異常は、多くの疾患に関与すると考えられる。Biolegendアッセイとは、細胞培養物上清、血清、または血漿に由来するヒトTNFαの正確な定量化のためにデザインされたサンドイッチELISAキットである。
均等物
Claims (35)
- 最大で50アミノ酸のペプチドを含む組成物であって、前記ペプチドは配列番号1のアミノ酸配列を含む、組成物。
- 配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドを化粧有効量で含む局所的化粧品組成物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、生体活性ペプチドである、請求項1または2に記載の組成物。
- 複数のペプチドを含む、請求項1から3のいずれかに記載の組成物。
- 少なくとも1つの化粧に許容される賦形剤または添加剤をさらに含む、請求項1から4のいずれかに記載の組成物。
- 少なくとも1つの化粧に許容される有効成分をさらに含む、請求項1から5のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、抗老化活性、細胞増殖促進活性、グルコース輸送促進活性、同化活性、またはタンパク質合成活性のうちの1つまたは複数を有する、請求項1から6のいずれかに記載の組成物。
- 化粧品としての、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- ヒト皮膚の老化の緩徐化または阻害または防止における、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- 哺乳動物における筋肉状態の改善における、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- 前記筋肉状態は、典型的には身体運動後における筋肉の回復の促進、哺乳動物における筋肉健康(例えば、除脂肪組織量)の維持または回復、および/または身体能力の増強である、請求項10に記載の使用。
- 組織の増殖の促進における、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- 前記組織の増殖は、上皮組織の増殖の促進、皮膚の増殖の促進、臓器の増殖の促進、および/または生物の増殖の促進におけるものである、請求項12に記載の使用。
- 筋肉の増殖の促進における、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- タンパク質合成の増大における、請求項1から7のいずれかに記載の組成物の非治療的使用。
- 前記組成物は、クリーム、多重エマルジョン、無水組成物、水性分散液、オイル、ミルク、バルサム、フォーム、ローション、ゲル、クリームゲル、水アルコール溶液、水グリコール溶液、化粧品、パーソナルケア製品、ハイドロゲル、リニメント、セラム、石鹸、ダスティングパウダー、ペースト、半固体製剤、リニメント、セラム、シャンプー、コンディショナー、軟膏、任意のすすぎ製剤、タルク、ムース、パウダー、スプレー、エアゾール、溶液、懸濁液、エマルジョン、シロップ、エリキシル、多糖フィルム、パッチ、ゲルパッチ、包帯、接着剤系、油中水エマルジョン、水中油エマルジョン、およびシリコーンエマルジョンからなる群から選択される製剤中に存在する、請求項1から7のいずれか一項に記載の組成物、または請求項8から15のいずれか一項に記載の使用。
- 請求項1から7または16のいずれかに記載の組成物を含む医療器具。
- 適切な医薬担体と組み合わせて、5から50アミノ酸を有し、および配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチドを治療有効量で含む医薬組成物である、請求項1に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、配列番号1から本質的になる、請求項18に記載の組成物。
- 患者への経口投与または非経口投与のために製剤化された、請求項18または19に記載の組成物。
- 前記ペプチドは、修飾ペプチドである、請求項18から20のいずれかに記載の組成物。
- 前記ペプチドは、その血漿中半減期を延長するように修飾されている、請求項18から21のいずれか一項に記載の組成物。
- 糖尿病または前糖尿病を処置または防止する方法における使用のための、請求項18から22のいずれか一項に記載の組成物。
- サルコペニアまたは悪液質を含む、異化による消耗により特徴付けられる疾患または状態を処置または防止する方法における使用ための、請求項18から23のいずれか一項に記載の組成物。
- 酸化ストレスにより媒介される疾患または状態を処置または防止する方法における使用ための、請求項18から24のいずれか一項に記載の組成物。
- 前記酸化ストレスにより媒介される疾患または状態は、アテローム性動脈硬化およびがんから選択される、請求項25に記載の使用。
- 最大で50アミノ酸からなり、配列番号1のアミノ酸配列を含むペプチド。
- 修飾されている、請求項27に記載のペプチド。
- 保護基で修飾されている、請求項28に記載のペプチド。
- N末端保護基またはC末端保護基で修飾されている、請求項29に記載のペプチド。
- 少なくとも1つのL−アミノ酸を、D−異性体で置きかえることにより修飾されている、請求項28に記載のペプチド。
- ポリエチレングリコール(PEG)、モノメトキシポリエチレングリコール、デキストラン、ポリ(N−ビニルピロリドン)ポリエチレングリコール、プロピレングリコールホモポリマー、ポリ(プロピレンオキシド/エチレンオキシド)コポリマー、ポリプロピレングリコール、ポリオキシエチル化ポリオール(例えば、グリセロール)およびポリビニルアルコール、コロミン酸、または他の炭水化物ベースのポリマー、アミノ酸のポリマー、ならびにビオチン誘導体から選択される修飾基で修飾されている、請求項28に記載のペプチド。
- 少なくとも1つのアミノ酸を、アミノ酸類似体で置きかえることにより修飾されている、請求項28に記載のペプチド。
- 哺乳動物の消化管プロテアーゼによるタンパク質分解に対する修飾ペプチドの耐性を増大させるように修飾されている、請求項28に記載のペプチド。
- 医薬としての使用のための、請求項28から34のいずれかに記載のペプチドまたは修飾ペプチド。
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