BR112019011394A2 - composições compreendendo peptídeo wkdeagkplvk - Google Patents

Abstract

a presente invenção refere-se a uma composição compreendendo uma quantidade cosmeticamente, farmaceuticamente ou terapeuticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da sequência id no. 1. peptídeos modificados e usos terapêuticos e cosméticos do peptídeo são também descritos.

Description

Relatório Descritivo da Patente de Invenção para ’’COMPOSIÇÕES COMPREENDENDO PEPTÍDEO

WKDEÂGKPLVK”.

CAMPO DA INVENÇÃO [001] A presente invenção refere-se a composições cosméticas e farmacêuticas.

ANTECEDENTES DA INVENÇÃO [002] Muitas composições foram descritas. Melhorias são sempre desejáveis.

[003] Atualmente, existem diferentes abordagens para melhorar a saúde muscular ou captação de glicose muscular. No entanto, encontrar uma alternativa que ajude a recuperação muscular, manutenção e/ou crescimento muscular é desejável.

[004] De fato, a crescente vontade de manter uma aparência jovem está levando a mais e mais pesquisas de novos procedimentos cosméticos e dermatológicos para o tratamento de envelhecimento da pele, particularmente porque as pessoas atualmente estão vivendo mais e de forma mais saudável. Recentemente, houve um crescente entusiasmo por tratamentos minimamente invasivos e técnicas destinadas a lidar com problemas como rugas, perda de volume e outros danos de pele. As soluções antienvelhecimento tópicas mais comuns são cremes e séruns.

[005] US2004/0132667 descreve composições compreendendo peptídeos, opcionalmente em combinação com um ou mais ingredientes adicionais. As composições descritas fornecem alívio de uma ou mais condições de pele, incluindo aquelas causadas por diversas fontes de estresse, poluição e envelhecimento geral.

[006] A US2014/0120141 descreve composições cosméticas e farmacêuticas contendo peptídeos para uso no tratamento e/ou cuidado de condições, distúrbios e/ou doenças da pele e/ou membranas

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2/146 mucosas.

[007] É um objetivo da invenção superar pelo menos um dos problemas acima referenciados e fornecer uma composição.

SUMÁRIO DA INVENÇÃO [008] Um primeiro aspecto da invenção fornece um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 (doravante peptídeo da invenção).

[009] Um segundo aspecto da invenção fornece uma composição (doravante composição da invenção) compreendendo uma quantidade eficaz de um peptídeo da invenção.

[0010] Preferencialmente, a composição é tópica.

[0011] Tipicamente, a composição pode ser uma composição cosmética compreendendo uma quantidade cosmeticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 ou uma variante dela.

[0012] Adequadamente, a composição pode ser uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 ou uma variante dela.

[0013] Preferencialmente, o referido peptídeo é um peptídeo bioativo.

[0014] Adequadamente, a composição compreende uma pluralidade de peptídeos.

[0015] Tipicamente, a composição ainda compreende pelo menos um excipiente ou aditivo cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitável.

[0016] Tipicamente, a composição ainda compreende um ativo cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitável.

[0017] Adequadamente, o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos que consiste na SEQUÊNCIA ID NO. 1.

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3/146 [0018] Tipicamente, o referido peptídeo compreende de cerca de 3 a 50 aminoácidos de comprimento. Preferencialmente, de cerca de 5 a cerca de 20 aminoácidos de comprimento, preferencialmente, cerca de 11 aminoácidos de comprimento.

[0019] A invenção também se refere a um fragmento da SEQUÊNCIA ID NO. 1 compreendendo pelo menos três aminoácidos de comprimento. Tipicamente, o referido fragmento é bioativo.

[0020] Preferencialmente, o referido fragmento tem pelo menos 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10 ou 11 aminoácidos de comprimento.

[0021] Preferencialmente, o referido peptídeo ou fragmento tem uma atividade selecionada de uma ou mais de atividade antienvelhecimento, atividade de promoção do transporte de glicose, atividade de promoção do crescimento celular ou atividade anabólica. A atividade pode ser cosmética, isto é, não terapêutica, terapêutica ou ambas.

[0022] Adequadamente, o peptídeo ou fragmento tem atividade antienvelhecimento.

[0023] Adequadamente, o peptídeo ou fragmento tem atividade de promoção do transporte de glicose.

[0024] Adequadamente, o peptídeo ou fragmento tem atividade de promoção do crescimento celular.

[0025] Adequadamente, o peptídeo ou fragmento tem atividade anabólica. Tipicamente, a atividade anabólica é o crescimento muscular. O peptídeo ou fragmento estimula o metabolismo anabóllco em um mamífero.

[0026] Preferencialmente, o referido peptídeo ou fragmento apresenta atividade de promoção da translocação de GLUT4. Preferencialmente, o referido peptídeo ou fragmento apresenta síntese de proteína aumentada (estimulação da atividade do metabolismo anabóllco).

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4/146 [0027] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente tem atividade antienvelhecimento, [0028] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente tem atividade de promoção do transporte de glicose.

[0029] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente tem atividade de promoção do crescimento celular.

[0030] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente tem atividade anabólica.

[0031] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste essencialmente em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente apresenta atividade de promoção da translocação de GLUT4.

[0032] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste essencialmente em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente apresenta síntese de proteína aumentada (estimulação da atividade do metabolismo anabólico).

[0033] Ainda preferido, o peptídeo compreende (ou consiste essencialmente em) uma sequência de aminoácidos de qualquer uma das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85, em que o peptídeo tipicamente apresenta atividade de promoção do crescimento celular.

[0034] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um uso não terapêutico da composição da invenção como um cosmético.

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5/146 [0035] Um aspecto adicional da presente invenção fornece uma composição da invenção como um medicamento.

[0036] Os seguintes aspectos podem ser cosméticos, isto é, não terapêuticos, ou terapêuticos.

[0037] Um aspecto da presente invenção fornece uma composição para uso em um método para antienvelhecimento.

[0038] Um aspecto adicional da presente invenção fornece uma composição da invenção para uso como um medicamento.

[0039] A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para retardar ou inibir ou prevenir o envelhecimento da pele humana. Tipicamente, a administração pode ser por meio de um penso ou emplastro ou formulação adequada para aplicação tópica.

[0040] Um aspecto adicional da invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para o uso em um método de promoção do crescimento de tecido.

[0041] A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para promoção do crescimento de tecido epitelial.

[0042] A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para promoção do crescimento de pele.

[0043] A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para a promoção do crescimento de um órgão.

[0044] A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para promoção do crescimento de um organismo.

[0045] Preferencialmente, a célula, o tecido ou organismo tem uma patologia normal (por exemplo, pele envelhecida). Tipicamente, a

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6/146 célula, tecido ou pele tem patologia anormal (por exemplo, tecido danificado devido a trauma, uso de drogas ou tecido epitelial no trato Gl danificado devido a um distúrbio inflamatório).

[0046] Os usos de promoção do crescimento podem ser in vivo ou in vitro. Os usos de promoção do crescimento podem envolver a administração a mamífero externamente (isto é, à pele) ou internamente (isto é, ao trato Gl).

[0047] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para melhorar o estado muscular em um mamífero.

[0048] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para promoção da recuperação do músculo, tipicamente após exercício.

[0049] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para manutenção ou restauração da saúde muscular (por exemplo, massa de tecido magra) em um mamífero.

[0050] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para melhorar o desempenho físico por administração tópica.

[0051] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por letargia ou baixos níveis de energia.

[0052] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método para crescimento muscular ou construção muscular. A composição da invenção pode ser usada em um método para aumentar a massa muscular magra em gado de corte e outros animais de criação.

[0053] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um

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7/146 peptideo ou composição da invenção para uso em um método para aumentar a síntese de proteína.

[0054] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptideo ou composição da invenção para uso em um método para o tratamento de perda muscular.

[0055] Outro aspecto da invenção fornece o peptideo ou composição da invenção para o uso em um método para o tratamento de um ferimento em um mamífero.

[0056] Um aspecto adicional da invenção fornece um peptideo ou composição da invenção para uso em um método para o tratamento ou prevenção de dor em um mamífero.

[0057] Outro aspecto da invenção fornece o peptideo ou composição para uso em um método para o tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por tecido ou células epiteliais danificadas e/ou tecido ou células dérmicas ou epiteliais danificadas. Preferencialmente, a doença ou condição é caracterizada por tecido ou células dérmicas ou epiteliais danificadas e é selecionada de câncer, trauma.

[0058] Um aspecto adicional da invenção refere-se a um método de tratamento, prevenção ou cuidado de qualquer uma das doenças condições e/ou distúrbios descritos aqui, compreendendo uma etapa de administração do peptideo ou composição da invenção. A composição pode ser administrada topicamente.

[0059] Os usos da invenção podem ser terapêuticos ou cosméticos, isto é, não terapêuticos.

[0060] Um aspecto adicional da invenção fornece um peptideo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento ou prevenção de um distúrbio metabólico em um paciente. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é uma doença ou síndrome caracterizada por uma resposta ou produção de insulina reduzida no

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8/146 paciente. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é selecionado de diabetes e pré-diabetes. A invenção também fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição selecionada de hiperlipidemia, obesidade, hipertensão, síndromes relacionadas ao apetite, síndromes relacionadas ao diabetes ou condições associadas ao diabetes (por exemplo, redução da taxa de acidente vascular cerebral, doença cardíaca, doença renal, cegueira e/ou perda de sensibilidade nos membros relacionados ao nível de glicose e/ou relacionados ao diabetes) e Síndrome X.

[0061] Um aspecto adicional da invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento de uma doença ou condição caracterizada por desgaste muscular, perda de massa muscular magra, metabolismo anabólico reduzido, desgaste catabólico ou síntese de proteína reduzida. Em uma modalidade, a doença ou condição é selecionada de sarcopenia ou caquexia. Em uma modalidade, o paciente que está sendo tratado é idoso (ou seja, maior que 60 anos) e a doença é sarcopenia ou caquexia relacionada à idade. Em uma modalidade, o paciente tem câncer. Em uma modalidade, o paciente tem letargia.

[0062] Um aspecto adicional da invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por células ou tecido epitelial danificado e/ou células ou tecido dérmico ou epitelial danificado. Preferencialmente, a doença ou condição é caracterizada por células ou tecido epitelial danificado é selecionada de câncer, tecido danificado devido a trauma, uso de drogas ou tecido epitelial no trato Gl danificado devido a um distúrbio inflamatório.

[0063] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de

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9/146 manutenção ou restauração da saúde muscular (por exemplo, massa de tecido magra) em um mamífero.

[0064] Um aspecto adicional da presente invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por letargia ou baixos níveis de energia.

[0065] Outro aspecto da invenção fornece o peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento de um ferimento em um mamífero.

[0066] Outro aspecto adicional da invenção fornece um peptídeo ou composição da invenção para uso em um método de tratamento ou prevenção de dor em um mamífero.

[0067] Outro aspecto refere-se a uma composição tópica da invenção para uso em tratamento ou prevenção de um distúrbio metabólico em um mamífero. O distúrbio metabólico pode ser diabetes. [0068] Em uma modalidade, os usos da invenção incluem uma etapa de administração de uma quantidade terapeuticamente eficaz do peptídeo da invenção.

[0069] Em uma modalidade, a composição da invenção é administrada sistemicamente.

[0070] Em uma modalidade, a composição da invenção (especialmente uma composição farmacêutica) é formulada para administração oral ou parenteral. Outros métodos de administração são descritos aqui.

[0071] Um aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição compreendendo um ou mais dos peptídeos selecionados das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85.

[0072] Em uma modalidade, a composição da invenção compreende substancialmente todos os peptídeos das SEQUÊNCIA ID NOs. 1 a 85.

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10/146 [0073] Um aspecto adicional da presente invenção refere-se a uma composição de tratamento produzida pelo homem compreendendo a composição da invenção. Preferencialmente, a composição de tratamento é uma composição antienvelhecimento. Preferencialmente, o tratamento é uma composição de tratamento muscular. Em uma modalidade, a composição é tópica. Em uma modalidade, a composição compreende um creme, gel, loção, produto de massagem (rub), pó. Preferencialmente, o tratamento é uma composição de tratamento de ferimento.

[0074] A invenção refere-se também a um penso, bandagem ou curativo adequado para aplicação no tecido queratinoso ou em um ferimento e compreende o peptídeo ou composição da invenção.

[0075] Preferencialmente, a composição ou produto é produzido pelo homem.

DEFINIÇÕES [0076] Todas as publicações, patentes, pedidos de patente e outras referências mencionadas aqui são incorporadas pela presente invenção por referência, em sua totalidade, para todas as finalidades, como se cada publicação, patente ou pedido de patente individual fosse especificamente e individualmente indicado para ser incorporado por referência e o seu conteúdo citado na íntegra.

[0077] Quando usados aqui e a menos que especificamente indicado de outra forma, os seguintes termos devem ter os seguintes significados além de quaisquer significados mais amplos (ou mais estreitos) que os termos possam desfrutar na técnica.

[0078] A menos que seja exigido de outra forma pelo contexto, o uso aqui do singular deve ser lido para incluir o plural e vice-versa. O termo um(a) usado em relação a uma entidade deve ser lido para se referir a uma ou mais da entidade. Dessa forma, os termos iim(a), um(a) ou mais e pelo menos um(a) são usados indistintamente aqui.

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11/146 [0079] Como usado aqui, o termo compreendem ou suas variações, tais como compreende ou compreendendo, deve ser lido para indicar a inclusão de qualquer item citado (por exemplo, um recurso, elemento, característica, propriedade, etapa de método/processo ou limitação) ou grupo de itens (por exemplo, recursos, elemento, características, propriedades, etapas de método/processo ou limitações), mas não a exclusão de qualquer outro item ou grupo de itens. Dessa forma, como usado aqui, o termo compreendendo é inclusivo ou aberto e não exclui itens adicionais não citados ou etapas de método/processo.

[0080] Como usado aqui, o termo doença é usado para definir qualquer condição anormal que prejudique a função fisiológica e esteja associada a sintomas específicos. O termo é usado de forma ampla para abranger qualquer distúrbio, enfermidade, anormalidade, patologia, moléstia, condição ou síndrome em que a função fisiológica é prejudicada independentemente da natureza da etiologia (ou mesmo se a base etiológica para a doença for estabelecida). Portanto, abrange condições decorrentes de infecção, trauma, lesão, cirurgia, ablação radioiógica, envenenamento ou deficiências nutricionais.

[0081] Como usado aqui, o termo tratamento ou tratar refere-se a uma intervenção (por exemplo, a administração de um agente a um indivíduo) que cura, melhora ou diminui os sintomas de uma doença ou remove (ou diminui o impacto de) sua(s) causa(s) (por exemplo, a redução na acumulação de níveis patológicos de enzimas lisossômicas). Nesse caso, o termo é usado sinonimamente com o termo terapia.

[0082] Adicionalmente, os termos tratamento ou tratar referemse a uma intervenção (por exemplo, a administração de um agente a um indivíduo) que previne ou retarda o início ou progressão de uma doença ou reduz (ou erradica) a sua incidência dentro uma população tratada.

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Nesse caso, o termo tratamento é usado sinonimamente com o termo profilaxia.

[0083] Como usado aqui, uma quantidade eficaz ou uma quantidade terapeuticamente eficaz de um agente define uma quantidade que pode ser administrada a um indivíduo sem toxicidade excessiva, irritação, resposta aiérgica ou outro probiema ou complicação, proporcional a uma relação benefício/risco razoável, mas que suficiente para fornecer o efeito desejado, por exemplo, o tratamento ou profilaxia manifestada por uma melhoria permanente ou temporária na condição do indivíduo. A quantidade variará de sujeito para sujeito, dependendo da idade e condição geral do indivíduo, modo de administração e outros fatores. Dessa forma, embora não seja possível especificar uma quantidade eficaz exata, os versados na técnica serão capazes de determinar uma quantidade eficaz apropriada em qualquer caso individual usando experimentação de rotina e conhecimento geral de histórico. Um resultado terapêutico nesse contexto inclui erradicação ou redução dos sintomas, redução da dor ou desconforto, sobrevida prolongada, melhora da mobilidade e outros marcadores de melhora clínica. Um resultado terapêutico não precisa ser uma cura completa.

[0084] Nesse relatório descritivo, o termo composição deve ser entendido como significando algo produzido pela mão do homem, e não incluindo composições de ocorrência natural.

[0085] O termo bioativo, quando usado aqui, refere-se a um peptídeo ou fragmento que tem atividade biológica. Por exemplo, a atividade biológica pode ser uma ou mais de atividade de promoção do transporte de glicose, atividade de promoção do crescimento, atividade antienvelhecimento, atividade anabóiica, atividade de promoção do metabolismo anabólico, atividade de promoção da translocação de GLUT4 e atividade de promoção da síntese de proteína. A atividade

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13/146 pode ser atividade anti-inflamatória ou atividade antibacteriana. A atividade pode ser antioxidants.

[0086] O termo promoção do transporte de glicose ou atividade de promoção do transporte de glicose, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa um peptídeo, variante ou fragmento que é capaz de aumentar a captação celular de glicose no ensaio de captação de glicose descrito abaixo.

[0087] O termo promoção da translocação de GLUT4 ou atividade de promoção da translocação de GLUT4, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa um fragmento de peptídeo que é capaz de aumentar a translocação de GLUT4 no músculo esquelético em comparação com um controle não tratado no ensaio in vitro descrito abaixo.

[0088] O termo antienvelhecimento significa inibir ou retardar a aparência de envelhecimento de uma pele humana e/ou reverter a aparência de envelhecimento. Retardar ou inibir o envelhecimento da pele significa retardar ou inibir o processo de envelhecimento da pele e/ou reverter a aparência de envelhecimento. Em uma modalidade, antienvelhecimento ou atividade antienvelhecimento, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa ser capaz de aumentar a produção de colágeno ou produção de elastina em Fibroblastos Dérmicos Humanos em comparação com um controle não tratado quando testado em um ensaio in vitro como descrito abaixo e/ou ser capaz de aumentar a proliferação celular no ensaio de proliferação celular descrito abaixo.

[0089] O termo promoção do crescimento celular, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa um peptídeo, variante ou fragmento que é capaz de aumentar a produção de elastina ou produção de colágeno ou proliferação celular em um ensaio como descrito abaixo. Os peptídeos que aumentam a proliferação celular ou têm atividade de

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14/146 promoção do crescimento celular são peptídeos ou variantes antienvelhecimento.

[0090] O termo aumentar a síntese de proteína, quando aplicado a um peptídeo da invenção, significa um peptídeo que é capaz de aumentar significativamente o grau de fosforilação de MTOR no ensaio Fosfo-MTOR descrito abaixo ou aumentar significativamente o grau de síntese de proteína no ensaio de puromicina descrito abaixo. Peptídeos e composições que aumentam a síntese de proteína podem ser empregados para estimular o metabolismo anabólico em um mamífero e/ou tratar doenças ou condições caracterizadas por desgaste cata bó li co.

[0091] O termo anti-inflamatório, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa um peptídeo ou fragmento que é capaz de reduzir significativamente a secreção de TNFa por macrófagos J774.2 estimulados por LPS (em comparação com macrófagos J774.2 estimulados por LPS não tratados) quando os macrófagos são tratados com 100μΜ do peptídeo, variante ou fragmento. Os macrófagos J774.2 foram tratados com 100μΜ de peptídeo sintético por 24 horas e, então, estimulados com (A) LPS (10ng/ml) por cinco horas ou (B) LPS (10ng/ml) por 5 horas seguido por ATP (5mM) por uma hora. O sobrenadante foi coletado e os níveis de TNFa foram determinados por ELISA.

[0092] O termo antibacteriano(a) ou atividade antibacteriana, quando aplicado a um peptídeo ou fragmento, significa um peptídeo, variante ou fragmento que é capaz de inibir visivelmente o crescimento de uma bactéria no seguinte ensaio de inibição do crescimento com base em placa de ágar: Peptídeo stock ™ 5 mg/mi dissolvido em DMSO. Os inóculos bacterianos foram ajustados para padrão McFarland 0,5 e esfregados em placas de MHA. Discos em branco foram colocados nas placas e 10 pL de cada composto (a 64 pg/mi - concentração máxima

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15/146 testada) foram adicionados. As placas foram incubadas a 37°C por 1618 horas. Os controles apropriados (DIVISO; meio de Mueller-Hinton sozinho; e dois discos de antibiótico - ciprofloxacína e tetraciclina) também foram realizados.

[0093] O termo atividade antioxidante, quando aplicado a um peptídeo da invenção, significa um peptídeo que apresenta atividade antioxidante, conforme determinado pelo ensaio de sequestro do radical de DPPH descrito abaixo. A invenção refere-se ao uso de peptídeos ou composições da invenção como um antioxidante e no tratamento ou prevenção ou retardo da progressão de doenças ou condições caracterizadas por estresse oxidativo (ou desequilíbrios entre fatores pró-oxidantes e antioxidantes). Exemplos incluem doença cardiovascular (especialmente aterosclerose), câncer, doença neurodegenerativa (isto é, mal de Parkinson, mal de Alzheimer e ALS), formação de catarata, diabetes, artrite reumatoide. A oxidação, a mesma reação química que faz com que o ferro enferruje, desempenha um papel similarmente corrosivo em nossos corpos. O processo é chamado estresse oxidativo. Existem vários estudos que provam que, uma vez que essas doenças são mediadas por estresse oxidativo e desequilíbrio entre fatores pró-oxidantes e antioxidantes, os antioxidantes podem desempenhar um papel fundamental na prevenção ou retardo da progressão dessas condições. Vários estudos mostram uma associação entre a baixa ingestão de antioxidantes na dieta e a frequência elevada de doenças cardíacas. Por outro lado, aqueles com altos níveis de antioxidantes no sangue têm menor risco de doença cardíaca. Por exemplo, os humanos que tomaram mais vitamina E regularmente tiveram incidência 41% menor de doença cardíaca do que aqueles que tomaram menores quantidades, como observado em um estudo sobre hospedeiros. Aumentos na dieta da ingestão de vitaminas antioxidantes podem reduzir o risco de doença

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16/146 cardíaca em 20-30%.

[0094] O câncer mata milhões em todo o mundo. A dieta pode ser a causa do câncer em até 35% de todos os cânceres humanos. Baixa ingestão de antioxidantes na dieta também pode ser responsável.

[0095] Os pró-oxidantes, ou aqueles que geram radicais livres, estimulam a divisão celular e formam o princípio da mutagênese e formação de tumores. Quando uma célula com uma fita de DNA danificada se divide, ela dá origem a grupos desordenados e deformados de células que formam o câncer.

[0096] Os antioxidantes exercem seu efeito protetor por:

® diminuição do dano oxidativo ao DNA e ® diminuição dos aumentos anormais na divisão celular.

[0097] Além disso, o tabagismo e a inflamação crônica levam a forte geração de radicais livres que parece ser a razão para muitos cânceres. Algumas pesquisas indicaram que as pessoas que fumam tendem a ter níveis mais baixos de antioxidantes do que os não fumantes, e isso faz com que os fumantes tenham mais risco de cânceres.

[0098] O sistema respiratório é um alvo bem conhecido para dano de radicais livres. Isso vem de fatores endógenos, bem como a exposição a poluentes do ar e toxinas, fumaça de cigarro etc. Estudos recentes sugerem que os radicais livres podem estar envolvidos no desenvolvimento de distúrbios pulmonares, tais como asma. Observouse que os antioxidantes reduzem o desenvolvimento de sintomas asmáticos. Suplementação de vitamina C, vitamina E e beta caroteno tem sido associada à melhora da função pulmonar.

[0099] Os radicais livres também podem danificar os nervos e o cérebro. O tecido neural pode ser particularmente suscetível a danos oxidativos. Isso porque o cérebro recebe uma porcentagem desproporcionalmente grande de oxigênio e tem grandes quantidades de ácidos graxos poli-insaturados, que são altamente propensos à

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17/146 oxidação e ao dano oxidativo.

[00100] Doenças implicadas no estresse oxidativo incluem:

® mal de Alzheimer, ® mal de Parkinson, ® demência etc.

[00101] Acredita-se que a formação de catarata envolva danos à proteína do cristalino por radicais livres. Isso leva à opacidade do cristalino. A formação de catarata pode ser retardada com o consumo regular de antioxidantes suplementares, tais como vitamina E, vitamina C e os carotenoides. Outras doenças como Diabetes, Artrite Reumatoide etc. também estão associadas aos baixos níveis de antioxidantes no sangue.

[00102] O termo composição tópica” refere-se a uma composição que é formulação para administração tópica. O termo administração tópica refere-se à aplicação ao tecido queratinoso, tal como pele, cabelos e unhas. Distribuição tópica geralmente significa distribuição à pele, mas também pode significar distribuição a um lúmen corporal revestido com células epiteliais, por exemplo, os pulmões ou vias aéreas, o trato gastrointestinal, a cavidade bucal. Em particular, as formulações para distribuição tópica são descritas em Topical Drug Delivery Formulations, editado por David Osborne e Antonio Aman, Taylor & Francis, o conteúdo completo do qual é incorporado aqui por referência. As composições ou formulações para distribuição às vias aéreas são descritas em O’Riordan et al. (Respir Care, 2002, Nov. 47), EP2050437, W02005023290, US2010098660 e US20070053845. A composição e formulações para distribuir agentes ativos ao lúmen, especialmente ao lúmen proximal, incluem micropartículas e microencapsulados em que o agente ativo é encapsulado dentro de uma matriz protetora formada de polímero ou proteína láctea que é resistente a ácido, mas propensa à dissolução no ambiente mais alcalino do íleo.

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Exemplos de tais sistemas de distribuição estão descritos em EP1072600.2 e EP13171757.1. Um meio alternativo de administração transdérmica é através do uso de um emplastro dérmico. Por exemplo, o ingrediente ativo pode ser incorporado em um creme consistindo em uma emulsão aquosa de polietileno glicóis ou parafina líquida. O ingrediente ativo pode também ser incorporado, em uma concentração dentre 1 e 10% em peso, em uma pomada consistindo em uma base de cera branca ou parafina mole branca juntamente com estabilizantes e conservantes que possam ser necessários. As formas injetáveis podem conter entre 10-1000 mg, preferencialmente entre 10-250 mg, de ingrediente ativo por dose.

[00103] As composições podem ser formuladas em forma de dosagem unitária, isto é, na forma de porções discretas contendo uma dose unitária ou um múltiplo ou subunidade de uma dose unitária.

[00104] O termo composição cosmética, quando usado aqui, refere-se a uma composição que pode ser usada para fins cosméticos, cuidados pessoais e/ou para fins de higiene. Será apreciado que a composição pode ter mais do que uma finalidade cosmética e pode ser usada para mais de uma dessas finalidades ao mesmo tempo. Um cosmético, quando usado aqui, pode incluir, mas sem limitação, batom, rímel, rouge, base, blush, delineador de olhos, pó facial e corporal, protetor solar, bloqueador solar, esmalte para unhas, compactos, sólidos, lápis.

[00105] Composições farmacêuticas: um aspecto adicional da invenção refere-se a uma composição farmacêutica compreendendo um peptídeo da invenção ou uma composição de peptídeos da invenção, misturada com um ou mais diluentes, excipientes ou veículos farmaceuticamente aceitáveis. Embora os peptídeos e composições da presente invenção possam ser administrados isoladamente, eles geralmente serão administrados em mistura com um veículo, excipiente

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19/146 ou diluente farmacêutico, particularmente para terapia humana. As composições farmacêuticas podem ser para uso ser humano ou animal em medicina humana e veterinária. Exemplos de tais excipientes adequados para as várias formas diferentes de composições farmacêuticas descritas aqui podem ser encontrados em Handbook of Pharmaceutical Excipients, 2nd Edition, (1994), editado por A Wade e PJ Weller. Em particular, as formulações para distribuição tópica são descritas em Topical Drug Delivery Formulations, editado por David Osborne e Antonio Aman, Taylor & Francis, o conteúdo completo dos quais está incorporado aqui por referência. Veículos ou diluentes aceitáveis para uso terapêutico são bem conhecidos na técnica farmacêutica e são descritos, por exemplo, em Remington’s Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Co. (A.R. Gennaro edit. 1985). Exemplos de veículos adequados incluem lactose, amido, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e semelhantes. Exemplos de diluentes adequados incluem etanol, glicerol e água. A escolha do veículo, excipiente ou diluente farmacêutico pode ser selecionada com relação à via de administração pretendida e à prática farmacêutica padrão. As composições farmacêuticas podem compreender como, ou além de, o veículo, excipiente ou diluente, qualquer(quaisquer) aglutinante(s), lubrificante(s), agente(s) de suspensão, agente(s) de revestimento, agente(s) solubilizante(s) adequado(s). Exemplos de aglutinantes adequados incluem amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, adoçantes de milho, gomas naturais e sintéticas, tais como acácia, tragacanto ou alginate de sódio, carboximetil celulose e polietiieno glicol. Exemplos de lubrificantes adequados incluem oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio, cloreto de sódio e semelhantes. Conservantes, estabilizantes, corantes e até agentes

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20/146 aromatizantes podem ser fornecidos na composição farmacêutica. Exemplos de conservantes incluem benzoato de sódio, ácido sórbico e ésteres de ácido p-hidroxibenzoico. Antioxidantes e agentes de suspensão também podem ser usados.

[00106] O termo mamífero deve ser entendido como significando um mamífero superior, especialmente um ser humano. No entanto, o termo também inclui animais não mamíferos, tais como peixes. O ser humano pode ser um iactente, bebê, criança, adolescente, adulto ou idoso. Em uma modalidade da invenção, o ser humano é uma pessoa idosa, por exemplo, com 55 anos ou mais. Em uma modalidade, o ser humano é uma pessoa idosa que sofre deterioração da massa de tecido magra. Em uma modalidade, o ser humano é um esportista. Em uma modalidade, o ser humano é uma mulher grávida. Em uma modalidade, o ser humano sofre de letargia ou percebe falta de energia.

[00107] O termo dermatologicamente aceitável, como usado aqui, significa que a(s) composição(ões) tópica(s) ou componente(s) da(s) composição(ões) é(são) adequado(s) para uso em contato com pele humana ou tecido queratinoso sem risco de toxicidade, incompatibilidade, instabilidade e/ou resposta alérgica e similares.

[00108] O termo liberação sustentada é usado em um sentido convencional relacionado a um sistema de distribuição de um composto ou ativo, que fornece a liberação graduai desse composto ou ativo durante um período de tempo e, preferencialmente, embora não necessariamente, com níveis de liberação do composto relativamente constantes ao longo de um período de tempo.

[00109] O termo peptídeo, usado aqui, refere-se a um polímero composto de até 50 aminoácidos, por exemplo, 5 a 50 monômeros de aminoácido tipicamente ligados através de ligação (bond linkage) de peptídeo. Os peptídeos (incluindo fragmentos e suas variantes) da e para uso na invenção podem ser gerados totalmente ou parcialmente

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21/146 por síntese química ou por expressão de ácido nucleico. Por exemplo, os peptídeos da e para uso na presente invenção podem ser prontamente preparados de acordo com métodos de síntese de peptídeo líquido ou, preferencialmente, em fase sólida bem estabelecidos conhecidos na técnica (ver, por exemplo, J. M. Stewart and J. D. Young, Solid Phase Peptide Synthesis, 2nd edition, Pierce Chemical Company, Rockford, Illinois (1984), em M. Bodanzsky and A. Bodanzsky, The Practice of Peptide Synthesis, Springer Verlag, New York (1984). Quando necessário, qualquer um dos peptídeos empregados na invenção pode ser quimicamente modificado para aumentar sua estabilidade. Um peptídeo ou análogo de peptídeo quimicamente modificado inclui qualquer equivalente químico funcional do peptídeo caracterizado por sua estabilidade e/ou eficácia elevada in vivo ou in vitro em relação à prática da invenção. O termo análogo de peptídeo também se refere a qualquer derivado de aminoácido de um peptídeo como descrito aqui. Um análogo de peptídeo pode ser produzido por procedimentos que incluem, mas sem limitação, modificações de cadeias laterais, incorporação de aminoácidos não naturais e/ou seus derivados durante a síntese de peptídeo e o uso de reticulantes e outros métodos que imponham restrição conformacional sobre os peptídeos ou seus análogos. Exemplos de modificações de cadeia lateral incluem modificação de grupos amino, tal como por alquilação redutiva por reação com um aldeído seguida por redução com NaBHU; amidação com metilacetimidato; acetilação com anidrido acético; carbamilação de grupos amino com cianato; trinitrobenzilação de grupos amino com ácido 2, 4, 6, trinitrobenzeno sulfônico (TNBS); alquilação de grupos amino com anidrido succínico e anidrido tetrahidroftálico; e piridoxilação de lisina com piridoxa-5’-fosfato seguida por redução com NABh-U. O grupo guanidino de resíduos de arginina podem ser modificados pela formação de produtos de condensação

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22/146 heterocíclicos com reagentes, tais como 2,3-butanodiona, fenilglioxal e glioxal. O grupo carboxil pode ser modificado por ativação de carbodiimida através da formação de o-acilisoureia seguida por derivatização subsequente, por exemplo, a uma amida correspondente. Os grupos sulfidril podem ser modificados por métodos, tais como carboximetilação com ácido iodoacético ou iodoacetamida; oxidação de ácido perfórmico para ácido cisteico; formação de dissulfuretos mistos com outros compostos tiol; reação com maleimida; anidrido maleico ou outra maleimida substituída; formação de derivados de mercúrio usando 4-cloromercuribenzoato, ácido 4-cloromercurifenilsulfônico, cloreto de fenilmercúrio, 2Cloromercúrico-4-nitrofenol e outros mercúrios; carbamilação com cianato em pH alcalino. Os resíduos de triptofano podem ser modificados, por exemplo, por oxidação com Nbromossuccinimida ou alquilação do anel indol com brometo de 2hidróxi-5-nitrobenzil ou sulfonil halogenetos. Os resíduos de triosina podem ser alterados por nitretação com tetranitrometano para formar um derivado de 3-nitrotirosina. A modificação do anel imidazol de um resíduo de histidina pode ser realizada por alquilação com derivados de ácido iodoacético ou N-carbetoxilação com dietilpirocarbonato. Exemplos de incorporação de aminoácidos e derivados não naturais durante a síntese de peptídeo incluem, mas sem limitação, uso de norleucina, ácido 4-amino butírico, ácido 4“amino-3hidróxi“5“ fenilpentanoico, ácido 6-aminohexanoico, t-butilglicina, norvalina, fenilglicina, ornitina, sarcosina, ácido 4-amino~3~hidr0xi6metilheptanoico, 2-tienil alanina e/ou D-dsômeros de aminoácidos. A modificação de estrutura de peptídeo inclui a geração de peptídeos retroinversos compreendendo a sequência reversa codificada por Daminoácidos. As alterações podem ser aquelas que reduzem a suscetibilidade à proteólise, reduzem a susceptibilidade à oxidação, alteram a afinidade de ligação da sequência variante (tipicamente,

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23/146 desejavelmente aumenta a afinidade) e/ou conferem ou modificam outras propriedades físico-químicas ou funcionais no peptideo análogo/ variante.

[00110] O termo peptideo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 usado aqui refere-se a um polímero composto de até 50 aminoácidos, por exemplo, 5 a 50 monômeros de aminoácido tipicamente ligados através de ligação (bond linkage) de peptideo, que inclui SEQ ID NO: 1 ou a sequências de aminoácidos consistindo essencialmente na SEQUÊNCIA ID NO. 1, que são substancialmente idênticas a SEQUÊNCIA ID NO 1, mas alteradas em relação a um ou mais resíduos de aminoácido, por exemplo, alteração de 1, 2 ou 3 resíduos (doravante variantes ou variantes de peptideo). Preferencialmente, tais alterações envolvem a inserção, adição, eliminação e/ou substituição de 11 ou menos aminoácidos, mais preferencialmente de 10 ou menos, 9 ou menos, 8 ou menos, 7 ou menos, 6 ou menos, preferencialmente 5 ou menos, 4 ou menos, ainda mais preferencialmente de 3 ou menos, mais preferencialmente de 1 ou 2 aminoácidos apenas. Inserção, adição e substituição com aminoácidos naturais e modificados são previstas. O peptideo pode ter alterações de aminoácidos conservadoras, em que o aminoácido sendo introduzido é estrutural mente, quimicamente ou funcionalmente similar ao que está sendo substituído. Geralmente, o peptideo terá pelo menos 70% de identidade de sequência de aminoácidos, preferencialmente pelo menos 80% de identidade de sequência, mais preferencialmente pelo menos 90% de identidade de sequência e idealmente pelo menos 95%, 96%, 97% 98% ou 99% de identidade de sequência com a sequência principal.

[00111] O termo fragmento deve ser entendido como significando um segmento de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1. Tipicamente, o fragmento tem entre 3 e 10 aminoácidos contíguos de comprimento.

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Geralmente, o fragmento tem uma carga de -5 a +3. A carga de um peptídeo, fragmento ou região é determinada usando o método de Cameselle, J. C., Ribeiro, J.M., and Sillero, A. (1986). Derivation and use of a formula to calculate the net charge of acid-base compounds. Its application to aminoácidos, proteins and nucleotides. Biochem. Educ. 14, 131-136.

[00112] Nesse relatório descritivo, o termo identidade de sequência deve ser entendido como compreendendo tanto a identidade quanto a similaridade de sequência, isto é, uma variante (ou homólogo) que compartilha 70% de identidade de sequência com uma sequência de referência que é uma em que qualquer 70% de resíduos alinhados da variante (ou homólogo) são idênticos aos, ou substituições conservadoras dos, resíduos correspondentes na sequência de referência ao longo de todo o comprimento da sequência. Identidade de sequência é a quantidade de caracteres que correspondem exatamente a duas sequências diferentes. Por esse meio, as lacunas não são contadas e a medição é relacionai à menor das duas sequências.

[00113] Em termos de homologia de sequência, o termo deve ser entendido como significando que uma variante (ou homólogo) que compartilha uma similaridade ou identidade percentual definida com uma sequência de referência quando a porcentagem de resíduos alinhados da variante (ou homólogo) é ou idênticas aos, ou substituições conservadoras dos, resíduos correspondentes na sequência de referência e em que a variante (ou homólogo) compartilha a mesma função que a sequência de referência.

[00114] Esse alinhamento e a homologia ou identidade de sequência percentual podem ser determinados usando programas de software conhecidos na técnica, por exemplo, um programa de alinhamento é BLAST, usando parâmetros predefinidos. Os detalhes desses programas podem ser encontrados no seguinte endereço da Internet:

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25/146 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/Blast.cgi.

[00115] O termo distúrbio inflamatório significa uma condição inflamatória imunomediada que afeta os humanos e é geralmente caracterizada por expressão desregulada de uma ou mais citocinas. Exemplos de distúrbios inflamatórios incluem distúrbios inflamatórios da pele e distúrbios inflamatórios das articulações, distúrbios inflamatórios do sistema cardiovascular, certas doenças autoimunes, distúrbios inflamatórios pulmonares e das vias aéreas, distúrbios inflamatórios intestinais. Exemplos de distúrbios inflamatórios da pele incluem dermatite, por exemplo, dermatite atópica e dermatite de contato, acne vulgar e psoríase. Exemplos de distúrbios inflamatórios das articulações incluem artrite reumatoide. Exemplos de distúrbios inflamatórios do sistema cardiovascular são doença cardiovascular e aterosclerose. Exemplos de doenças autoimunes incluem Diabetes tipo 1, doença de Graves, sindrome de Guillain Barre, Lúpus, Artrite psoriática e Colite uicerativa. Exemplos de distúrbios inflamatórios pulmonares e das vias aéreas incluem asma, fibrose cística, COPD, enfisema e sindrome do desconforto respiratório agudo. Exemplos de distúrbios inflamatórios intestinais incluem colite e doença inflamatória intestinal. Outros distúrbios inflamatórios incluem câncer, febre do feno, periodontite, alergias, hipersensibilidade, isquemia, depressão, doenças sistêmicas, inflamação pós-infecção e bronquite. Os peptídeos e composições da invenção também podem ser empregados no tratamento não terapêutico da inflamação. Exemplos de tratamento não terapêutico da inflamação incluem o uso para aliviar a inflamação normal, não patológica, por exemplo, inflamação nos músculos e articulações após exercícios.

[00116] O termo doença ou condição caracterizada por células ou tecido dérmico ou epitelial danificado significa qualquer condição ou doença que resulte em tecidos ou células ou órgãos dérmicos ou

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26/146 epiteliais danificados. Um exemplo é trauma que muitas vezes resulta em pele danificada. Outro exemplo é uma condição inflamatória da pele, tal como psoríase ou eczema, que muitas vezes resulta em pele danificada. Outro exemplo é um distúrbio inflamatório do intestino inferior que pode resultar em células/tecido epitelial danificado que revesse o intestino delgado. Outro exemplo é células/tecido epitelial danificado que revesse o intestino inferior causado pela ingestão de uma substância tóxica ou nociva, por exemplo, substâncias químicas tóxicas ou drogas. Outro exemplo é câncer, por exemplo, câncer de intestino, que pode resultar em tecido epitelial danificado no intestino. Outra condição é um distúrbio inflamatório periférico, tal como dermatite atópica, que pode resultar em danos à pele em seres humanos.

[00117] Nesse relatório descritivo, o termo Distúrbio metabólico deve ser entendido como incluindo pré-diabetes, diabetes; Diabetes tipo 1; Diabetes tipo 2; síndrome metabólica; obesidade; dislipidemia diabética; hiperlipidemia; hipertensão; hipertrigliceridemia; altos níveis de ácidos graxos no sangue (hyperfattyacidemia); hipercolerterolemia; hiperinsulinemia e MODY.

[00118] O termo doença ou condição caracterizada por infecção bacteríana significa qualquer condição ou doença caracterizada porter uma patologia causada por crescimento de bactérias ou por infecção bacteríana, incluindo, por exemplo, MRSA, salmonela, pneumonia bacteríana por listeria, intoxicação alimentar estafilocócica, meningite bacteríana. Exemplos específicos são fornecidos em https://en.wikipedia.org/wiki/List__of_infectious_diseases.

[00119] O termo produzido(a/s) pelo homem, quando aplicado a produtos comestíveis, deve ser entendido como significando feito por um ser humano e não existente na natureza.

[00120] O termo melhorar o estado muscular significa melhorar a saúde muscular, por exemplo, promover a síntese de proteína músculo

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27/146 esquelética, captação de glicose esquelética, melhorar a massa de tecido magra em contexto terapêutico ou não terapêutico, promover a recuperação muscular geralmente após exercícios ou melhorar o desempenho muscular. Os métodos ou usos podem ser terapêuticos ou não terapêuticos. O termo melhorar o estado da massa de tecido magra deve ser entendido como significando o aumento da massa de tecido magra ou Inibição ou prevenção da taxa de degradação da massa de tecido magra.

[00121] O termo promover a recuperação muscular significa causar um aumento na captação de glicose no músculo esquelético em comparação com o músculo esquelético não tratado.

[00122] O termo doença ou condição caracterizada por letargia ou baixos níveis de energia significa qualquer condição ou doença caracterizada por uma sensação de cansaço ou baixa energia. Exemplos incluem alergias, asma, anemia, câncer e seus tratamentos, dor crônica, doença cardíaca, infecção, depressão, distúrbios alimentares, luto, distúrbios do sono, problemas de tireoide, efeitos colaterais de medicamentos, uso de álcool ou uso de drogas.

[00123] O termo desgaste catabólico engloba tanto a sarcopenia quanto a caquexia. (O termo catabólico refere-se a quebra de tecido; é o oposto de anabólico, que significa construção de tecido.) [00124] A perda de tecido muscular e adiposo devido a doenças crônicas é chamada de caquexia. A perda geral de peso e massa muscular que ocorre com o avanço da idade é chamada de sarcopenia. Tanto na caquexia quanto na sarcopenia, a perda muscular pode levar à fragilidade e afetar adversamente uma variedade de resultados clínicos (Rolland 2011; Fearon 2013; Muscaritoli 2013). Indivíduos com caquexia e/ou sarcopenia têm risco aumentado de morte, infecção e quedas; cicatrização de ferimentos mais lenta; capacidade de exercício e respiração significativamente menor; e diminuição global da qualidade

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[00125] A caquexia geralmente causa redução de peso mais rápida e pronunciada do que a sarcopenia e é geralmente caracterizada como perda de tecido muscular e adiposo, totalizando mais de 5% do peso corporal, mas perdas superiores a 20% do peso corporal são comuns. Em muitos casos, uma pessoa com caquexia continua perdendo peso mesmo se estiver recebendo calorias suficientes. Doenças crônicas graves, tais como câncer, AIDS e doença pulmonar obstrutiva crônica (COPD) são causas conhecidas de caquexia entre 50% e 80% de todos os pacientes com câncer que sofrem de caquexia, e estima-se que a caquexia seja a principal causa de mais de 20% de todas as mortes relacionadas ao câncer. Caquexia em pacientes com HIV/AIDS é comum e ocorreu quase universalmente antes do advento das drogas antivirais para o HIV. A sarcopenia (do grego que significa pobreza de carne) geralmente refere-se à perda de massa e função muscular relacionada à idade. Aproximadamente 50% das pessoas com mais de 80 anos sofrem de sarcopenia. A sarcopenia também pode ocorrer como resultado de inatividade física, má nutrição ou doença. Alguns pesquisadores referem-se à perda muscular relacionada à idade não associada a uma causa subjacente como sarcopenia primária, e à que ocorre como consequência de uma ou mais de outras causas como sarcopenia secundária. Sarcopenia é associada a risco aumentado de resistência à insulina e diabetes tipo 2 em adultos não obesos com mais de 60 anos. O diagnóstico médico convencional, muitas vezes, falha em fornecer intervenção precoce agressiva para a caquexia, resultando em resultados clínicos ruins, incluindo morte prematura e incapacidade. Os tratamentos médicos padrão para a caquexia incluem o consumo encorajador de líquidos e alimentos e uso de certas drogas. No entanto, muitas terapias médicas padrão para tratar a sarcopenia e a caquexia apresentam o risco de efeitos adversos, tais como náuseas, edema e

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29/146 fadiga, e alguns deles não foram adequadamente testados em ensaios clínicos. Várias intervenções nutricionais, de estilo de vida e farmacológicas inovadoras podem ser úteis para prevenir e tratar o desgaste catabólico. Whey protein, creatina e os aminoácidos glutamina, arginina, leucina e hidroxi-metilbutirato ou HMB (um derivado de leucina) são especialmente importantes para a construção e manutenção de massa muscular magra. Ácidos graxos ômega-3, ácido linoleico conjugado e vitamina D também combatem a perda de tecido magro. Pesquisas sobre estratégias novas e emergentes para a prevenção de desgaste muscular são muito necessárias.

[00126] (Ribeiro S, Keheyias, J. Sarcopenia and the analysis of body composition. Adv Nutr 2014:5:260-267.

[00127] Muscaritoli A, Lucia S, Molfino A, Cederholm MT, Rossi Fanelli F, Muscle atrophy in aging and chronic diseases: is it sarcopenia or cachexia? Intern Emerg Med 2013;8: 553-560.

[00128] Rolland Y, VanKan GA, Gillette-Guyonnet S, Vellas B. Cachexia versus sarcopenia. Curr Opin Clin Nutr Metab Care. 2010;14(1): 15-21.

[00129] Evans WJ, Morley JE, Argiles JM, et al. Cachexia: a new definition. Clin Nutr 2008;27:793-799.

[00130] Fearon K, Arends J, Baracos V. Understanding the mechanisms and treatment options in cancer cachexia. Nat Rev Clin Oncol 2013; 10(2): 90-99 [00131] O termo manter ou restaurar a saúde muscular significa ajudar a reter ou restaurar a saúde muscular, resultante de danos ocorridos durante o exercício. Ao promover o transporte de glicose no músculo esquelético, os peptídeos promovem a recuperação do exercício e aliviam o sofrimento/dor muscular e lesão relacionada com exercício. Eles também podem ser usados para diminuir e evitar cãibras musculares e para permitir uma recuperação mais rápida das cãibras

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30/146 musculares. A cãibra pode resultar de estresse físico, estresse mental e/ou estresse por Lesão por Esforço Repetitivo. Ao promover o transporte de glicose, os peptídeos ajudam a reduzir a Miopatia do músculo e ajudam a prevenir a Sarcopenia em mamíferos, promover a recuperação de iesões durante o exercício e aliviar o sofrimento/dor muscular e lesão relacionada com o exercício. A invenção também se refere a um peptídeo ou composição da invenção para uso em manutenção ou restauração da saúde muscular em um mamífero.

[00132] Nesse relatório descritivo, o termo produto de higiene pessoal deve ser entendido como significando uma composição formulada para uso por humanos na limpeza ou tratamento do corpo ser humano, particularmente a pele, dentes, unhas, pés e cabelos. Exemplos incluem xampu, condicionador, cremes e loções para pele, pós, dentifrício, gel ou cremes de banho, gel de banheira ou chuveiro, tintura de cabelo, sabonete, esfoliante corporal, esfoliante, soluções anticaspa, loção corporal, soluções para barbear, hidratantes, limpadores, máscaras, óleos, soros e enxaguantes, desodorante e antitranspirante.

[00133] O termo envelhecimento da pele” é usado no sentido de que é geralmente e amplamente usado na técnica de produtos cosméticos e de higiene pessoal. Sinais de envelhecimento da pele incluem rugas, linhas, fendas, inchaços, manchas vermelhas, poros grandes, aspereza, secura, perda de elasticidade, flacidez, perda de estanqueidade, descoloração, formação de manchas, hiperpigmentação, sardas, queratose, inflamação, esgotamento de coiágeno e outras alterações histológicas nas camadas da pele, incluindo tecido subjacente. O termo sais cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitáveis significa um sal reconhecido para seu uso em animais e, mais especificamente, em seres humanos, e inclui sais usados para formar sais de adição de base, sejam inorgânicos, tais como, e não restritos a, lítio, sódio, potássio,

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31/146 cálcio, magnésio, manganês, cobre, zinco ou alumínio, entre outros, sejam orgânicos, tais como, e nâo restritos a, etilamina, dietilamina, etilenodiamina, etanolamina, dietanolamina, arginina, Usina, histidina ou piperazina, entre outros, ou sais de adição de ácido, sejam eles orgânicos, tais como, e não restritos a, acetato, citrato, lactato, malonato, maleato, tartarato, fumarato, benzoato, aspartato, glutamato, succinato, oleato, trifluoroacetato, oxalato, pamoato ou gluconato, entre outros, ou inorgânicos, tais como, e não restrito a, cloreto, sulfato, borato ou carbonato, entre outros. A natureza do sal não é crítica, desde que seja cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitável. Os sais cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitáveis dos peptídeos da invenção podem ser obtidos pelos métodos convencionais bem conhecidos na técnica anterior [Berge S. M. et al., Pharmaceutical Salts, J. Pharm. ScL, (1977), 66, 1-19].

[00134] O termo domínio C-terminal, quando aplicado a um fragmento, significa os três primeiros aminoácidos no C-terminal do fragmento.

[00135] O termo domínio N-terminal, quando aplicado a um fragmento, significa os três últimos aminoácidos no N-terminal do fragmento.

[00136] O termo homólogo de uma proteína de referência deve ser entendido como significando uma proteína de uma espécie diferente de planta tendo pelo menos 60%, 70%, 80%, 90%, 91%, 92%, 93%, 94%, 95%, 96%, 97%, 98%, 99% de homologia de sequência com a proteína de referência.

[00137] No relatório descritivo, os termos compreendem, compreende, compreendido(aZs) e compreendendo ou qualquer variação deles e os termos incluem, inclui, incluído(aZs) e incluindo ou qualquer variação deles são considerados totalmente intercambiáveis e a todos deve ser concedida a interpretação mais ampla possível e vicePetição 870190062478, de 04/07/2019, pág. 34/170

32/146 versa.

BREVE DESCRIÇÃO DOS DESENHOS [00138] A invenção será mais claramente entendida a partir da seguinte descrição de uma modalidade da mesma, dada apenas a título de exemplo, com referência aos desenhos anexos, nos quais: [00139] A Figura 1 ilustra os resultados de um ensaio de proliferação celular usando Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF) não tratados e tratados com peptídeo.

[00140] A Figura 2 ilustra os resultados de um ensaio de proliferação celular usando células HACAT não tratadas e tratadas com peptídeo.

[00141] A Figura 3 ilustra os resultados de um ensaio de expressão de colágeno usando Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF) não tratados e tratados com peptídeo.

[00142] A Figura 4 ilustra os resultados de um ensaio de expressão de elastina usando Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF) não tratados e tratados com peptídeo.

[00143] A Figura 5 ilustra os resultados de um ensaio de captação de glicose usando mioblastos esqueléticos humanos não tratados e tratados com peptídeo.

[00144] A Figura 6 ilustra os resultados de um ensaio de captação de glicose usando mioblastos esqueléticos humanos não tratados e tratados com peptídeo.

[00145] A Figura 7 ilustra os resultados de um ensaio de captação de glicose usando mioblastos esqueléticos humanos não tratados e tratados com peptídeo.

[00146] A Figura 8 ilustra os resultados de um ensaio de ensaio de translocação de GLUT4 usando mioblastos esqueléticos humanos não tratados e tratados com peptídeo.

[00147] A Figura 9 ilustra os resultados de um ensaio de síntese de proteína muscular (mTOR).

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33/146 [00148] A Figura 10 ilustra os resultados de um ensaio de síntese de proteína muscular (puromicina).

[00149] A Figura 11 ilustra os resultados do estudo de toxicidade celular em células HSKMC usando um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO.

1.

[00150] A Figura 12 ilustra os resultados de ELISA de Fosfo-AcetilCoA Carboxilato (Ser 79) (peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1).

[00151] A Figura 13 ilustra os resultados de ELISA de Fosfo-Akt 1 peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1).

[00152] A Figura 14 ilustra os resultados de ELISA de Fosfo-AMPK alfa (peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1).

[00153] A Figura 15 ilustra os níveis de glicose no sangue após 5 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 em camundongos KKAY.

[00154] A Figura 16 ilustra os níveis de glicose no sangue após 7 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 em camundongos KKAY.

[00155] A Figura 17 ilustra o peso corporal de camundongos KKAY após 13 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO.

1.

DESCRIÇÃO DETALHADA DOS DESENHOS [00156] A invenção será agora descrita com referência a exemplos específicos. Esses são meramente exemplificativos e apenas para fins ilustrativos: não se destinam a limitar de qualquer forma ao escopo do monopólio reivindicado ou à invenção descrita. Esses exemplos constituem o melhor modo atualmente contemplado para a prática da invenção.

[00157] No sentido mais amplo, o primeiro aspecto da invenção fornece um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 (doravante peptídeo da invenção).

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34/146 [00158] Em um segundo aspecto, a invenção fornece uma composição compreendendo uma quantidade eficaz de um peptídeo da invenção.

[00159] A composição pode ser tópica.

[00160] A composição pode ser uma composição cosmética compreendendo uma quantidade cosmeticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 ou uma variante dela.

[00161] Uma composição pode ser uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade farmaceuticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 ou uma variante dela.

[00162] Será entendido que a composição pode ter um efeito cosmético, isto é, não terapêutico ou um efeito terapêutico. A composição pode ter um efeito cosmético e terapêutico.

[00163] Exemplos de aplicações cosméticas incluem, mas sem limitação, antienvelhecimento, retardo ou inibição ou prevenção do envelhecimento da pele humana, promoção do crescimento de tecido, promoção do crescimento de tecido epitelial, promoção do crescimento de pelo, promoção do crescimento de um órgão, promoção do crescimento de um organismo, melhoria do estado muscular em um mamífero, promoção da recuperação do músculo, tipicamente após exercícios, manutenção ou restauração da saúde muscular em um mamífero, melhoria do desempenho físico, crescimento muscular ou construção muscular e tratamento de perda muscular.

[00164] A invenção também fornece usos/aplicações terapêuticas, especialmente aplicações terapêuticas não tópicas, da composição ou peptídeo da invenção.

[00165] Exemplos de aplicações terapêuticas incluem, mas sem limitação, promoção do crescimento de tecido, promoção do

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35/146 crescimento de tecido epitelial, promoção do crescimento de pele, promoção do crescimento de um órgão, promoção do crescimento de um organismo, melhoria do estado muscular em um mamífero, promoção da recuperação do músculo, manutenção ou restauração da saúde muscular em um mamífero, crescimento muscular ou construção muscular, tratamento da perda muscular, tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por desgaste muscular ou atividade anabólica reduzida ou síntese de proteína reduzida (desgaste catabólico), tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada ou mediada pelo estresse oxidativo, tratamento ou prevenção de uma doença metabólica, especialmente diabetes ou prédiabetes, tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por letargia ou baixos níveis de energia, tratamento de um ferimento em um mamífero, tratamento ou prevenção de dor em um mamífero, tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por células ou tecido epitelial danificado e/ou células ou tecido dérmico ou epitelial danificado e tratamento ou prevenção de um distúrbio metabólico em um mamífero, tal como diabetes.

[00166] SEQUÊNCIA ID NO. 1 tem a seguinte sequência: WKDEAGKPLVK [00167] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo é bioativo.

[00168] Em uma modalidade, o peptídeo tem atividade de promoção do transporte de glicose. Em uma modalidade, o peptídeo tem atividade de promoção do crescimento celular. Em uma modalidade, o peptídeo tem atividade antienvelhecimento. Em uma modalidade, o peptídeo tem atividade anabólica. Será apreciado que o peptídeo pode ter duas ou três de atividade de promoção do transporte de glicose, atividade de promoção do crescimento celular, atividade antienvelhecimento e atividade anabólica. O peptídeo pode ter atividade de promoção do transporte de glicose, atividade de promoção do crescimento celular,

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36/146 atividade antienvelhecimento e atividade anabólica.

[00169] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo compreende de cerca de 3 a 50 aminoácidos de comprimento, cerca de 14 a cerca de 50 aminoácidos de comprimento, preferencialmente cerca de 15, 20, 25, 30, 35, 40, 45 ou 49 aminoácidos de comprimento, preferencialmente cerca de 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20 aminoácidos de comprimento.

[00170] Em uma modalidade da invenção, o peptídeo compreende de cerca de 3 a cerca de 11 aminoácidos de comprimento, preferencialmente cerca de 4, 5, 6, 7, 8, 9 ou 10 aminoácidos de comprimento.

[00171] Em uma modalidade, o peptídeo tem 1 a 5 alterações de aminoácido em comparação com a SEQUÊNCIA ID NO. 1. Em uma modalidade, o peptídeo tem 1 a 4 alterações de aminoácido em comparação com a SEQUÊNCIA ID NO. 1. Em uma modalidade, o peptídeo tem 1 a 3 alterações de aminoácido em comparação com a SEQUÊNCIA ID NO. 1. Em uma modalidade, o peptídeo tem 1 a 2 alterações de aminoácido em comparação com a SEQUÊNCIA ID NO.

1. Em uma modalidade, a alteração de aminoácido é uma alteração de aminoácido conservadora. Em uma modalidade, a alteração de aminoácido é uma substituição de aminoácido. Em uma modalidade, a substituição de aminoácido é uma substituição conservadora. Em uma modalidade, a alteração de aminoácido é uma adição de aminoácido. Em uma modalidade, a alteração de aminoácido é uma deleção de aminoácido.

[00172] O peptídeo da invenção inclui os seguintes peptídeos variantes:

[00173] Variantes da SEQUÊNCIA ID NO. 1: Variantes da SEQUÊNCIA ID NO. 1 (WKDEAGKPLVK) incluindo variantes tendo 1, 2 ou 3 substituições de aminoácido conservadoras, 1, 2 a 3

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37/146 substituições de aminoácido não conservadoras, 1, 2 ou 3 adições de aminoácido, 1,2 ou 3 exclusões de aminoácido, são fornecidas abaixo: [00174] Uma substituição de aminoácido conservadora:

WKEEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 2); FKDEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 3); WKDEAGKPMVK (SEQUÊNCIA ID NO. 4); WKDEAGRPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 5); WRDEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 6); WKDEAGKPLMK (SEQUÊNCIA ID NO. 7); WKDQAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 8); WKDEATKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 9) [00175] Duas substituições de aminoácido conservadoras:

YKNEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 10); WKNESGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 11); WKDEAGKTLVR (SEQUÊNCIA ID NO. 12); FKDEATKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 13); FKDEAGKPLIK (SEQUÊNCIA ID NO. 14); WKDEAGKTLLK (SEQUÊNCIA ID NO. 15); WKNEAGKPWK (SEQUÊNCIA ID NO. 16); WKDEAGRTLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 17) [00176] Três substituições de aminoácido conservadoras:

WEDESGKPLLK (SEQUÊNCIA ID NO. 18); WKEEAGKPIVQ (SEQUÊNCIA ID NO. 19); YKNEAGKPLVR (SEQUÊNCIA ID NO. 20); WKDQATRPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 21); WKDESGKPVLK (SEQUÊNCIA ID NO. 22); WQDDSGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 23); WKNEAGKTLLK (SEQUÊNCIA ID NO. 24); WKDKAGEPLVR (SEQUÊNCIA ID NO. 25) [00177] Uma substituição de aminoácido não conservadora:

WKDEAGNPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 26); CKDEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 27); WKDEAGKPLGK (SEQUÊNCIA ID NO. 28); WKDENGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 29); WKDEARKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 30); WKDEAGKPLVT (SEQUÊNCIA ID NO. 31); WKDEAGKRLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 32); WKWEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 33)

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38/146 [00178] Duas substituições de aminoácido não conservadoras: WKDEAGFPTVK (SEQUÊNCIA ID NO. 34); WYDMAGKPLVK (SEQ NO. 35); WKDYEGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 36); WKREAGKPGVK (SEQ NO. 37); WKLEKGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 38); WKDEAGKPCVK (SEQ NO. 39); WKKEAPKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 40); SKDEAGPPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 41) [00179] Três substituições de aminoácido não conservadoras: WKHEPGKPLAK (SEQUÊNCIA ID NO. 42); WKDEREKPFVK (SEQUÊNCIA ID NO. 43); WKQEAGKPWRK (SEQUÊNCIA ID NO. 44); VKDEAKKPLVH (SEQUÊNCIA ID NO. 45); NWDEAGKMLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 46); IKDEDGPPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 47); LKDEYGKPLVN (SEQUÊNCIA ID NO. 48); WKDRAGKELTK (SEQUÊNCIA ID NO. 49) [00180] Adições de aminoácido

WKDEAGKPLPVK (SEQUÊNCIA ID NO. 50); WKGDENYAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 51); LWKDEAGRKYPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 52); WKDCEGAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 53); WKDEPAGKPLVVK (SEQUÊNCIA ID NO. 54); WKDEAGPKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 55); WKDEAGWADKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 56); WKNDEAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 57) [00181] Exclusões de aminoácido

WKDAKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 58); WKEAGKPVK (SEQUÊNCIA ID NO. 59); WKDEAKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 60); WDEAGKPV (SEQUÊNCIA ID NO. 61); WKDEAGKPVK (SEQUÊNCIA ID NO. 62); WDAGKPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 63); WKDEAGKPLV (SEQUÊNCIA ID NO. 64); WEAGKPLV (SEQUÊNCIA ID NO. 65) [00182] O peptídeo variante pode ser uma variante bioativa.

[00183] A invenção também fornece fragmentos da SEQUÊNCIA ID NO. 1 e peptídeos compreendendo um ou mais desses fragmentos.

[00184] O fragmento pode ser um fragmento bioativo. Em uma

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39/146 modalidade, o fragmento é um fragmento antienvelhecimento. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento de promoção do crescimento celular. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento de promoção do transporte de glicose. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento anabólico. Será apreciado que, em uma modalidade, o fragmento bioativo é dois ou mais de um fragmento mais antienvelhecimento, fragmento de promoção do transporte de glicose, fragmento de promoção do crescimento celular e um fragmento anabóllco. Em uma modalidade, o fragmento bioativo é um fragmento antienvelhecimento, fragmento de promoção do transporte de glicose, fragmento de promoção do crescimento celular e um fragmento anabóllco.

[00185] O fragmento pode ser um fragmento bioativo. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento de promoção do crescimento celular. Em uma modalidade, o fragmento é um fragmento de promoção da translocação de GLUT4. Em uma modalidade, o fragmento apresenta atividade estimulante do metabolismo anabólico. Em uma modalidade, o fragmento apresenta atividade antioxidante ou antiinflamatória.

[00186] Exemplos de fragmentos da SEQ ID NO: 1 são fornecidos abaixo:

WKDEAG (SEQUÊNCIA ID NO. 66); WKDEA (SEQUÊNCIA ID NO. 67); KDEAGKPL (SEQUÊNCIA ID NO. 68); KDEAG (SEQUÊNCIA ID NO. 69); DEAGKPL (SEQUÊNCIA ID NO. 70); GKPLV (SEQUÊNCIA ID NO. 71); DEAGK (SEQUÊNCIA ID NO. 72); WKDEAGKPL (SEQUÊNCIA ID NO. 73); WKD (SEQUÊNCIA ID NO. 74); KDE (SEQUÊNCIA ID NO. 75); KPLVK (SEQUÊNCIA ID NO. 76); WKDE (SEQUÊNCIA ID NO. 77); AGKPL (SEQUÊNCIA ID NO. 78); EAG (SEQUÊNCIA ID NO. 79); AGK (SEQUÊNCIA ID NO. 80); KPL (SEQUÊNCIA ID NO. 81); LVK (SEQUÊNCIA ID NO. 82); GKP (SEQUÊNCIA ID NO. 83); DEA

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40/146 (SEQUÊNCIA ID NO. 84); PLV (SEQUÊNCIA ID NO. 85) [00187] Será apreciado que a composição pode compreender uma pluralidade de peptídeos ou fragmentos. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos dois peptídeos da invenção.

[00188] Preferencialmente, a composição compreende pelo menos três peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos quatro peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos cinco peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos seis peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos sete peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos oito peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende menos nove peptídeos da invenção. Preferencialmente, a composição compreende pelo menos dez peptídeos da invenção. Em uma modalidade, a composição compreende substancialmente todos os peptídeos. Em uma modalidade, a composição compreende substancialmente todas as variantes. Em uma modalidade, a composição é substancialmente livre de outros peptídeos.

[00189] Em uma modalidade, o peptídeo ou composição da invenção tem uma atividade selecionada de uma ou mais de atividade antibacteriana, atividade anti-inflamatória e atividade antioxidante. A atividade pode ser cosmética, isto é, não terapêutica, terapêutica ou ambas. A invenção também fornece uma composição da invenção para uso em um método de manutenção ou restauração da saúde intestinal em um mamífero. A invenção também fornece uma composição da invenção para uso em um método para o tratamento de uma infecção bacteriana. Um aspecto adicional da invenção fornece uma composição da invenção para uso em um método para o tratamento ou prevenção de um distúrbio inflamatório e/ou inflamação em um mamífero.

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Preferencialmente, a inflamação é inflamação sintomática. Esse uso pode ser adicionai aos usos discutidos acima da invenção ou como uma alternativa.

[00190] Em uma modalidade, o peptídeo ou fragmento ou composição da invenção tem uma atividade selecionada de uma ou mais de atividade antibacteriana, atividade anti-inflamatória e atividade antioxidante.

[00191] A composição pode ser uma composição tópica. A composição tópica pode ser apresentada em uma formulação selecionada do grupo consistindo em cremes, emulsões múltiplas, composições anidras, dispersões aquosas, óleos, leites, bálsamos, espumas, loções, géis, géis em creme, soluções hidroalcoólicas, soluções hidroglicólicas, cosmético, produto de higiene pessoal, higrogéis, linimentos, soros, sabões, pó para polvilhar, pasta, formulações semissólidas, linimentos, soros, xampu, condicionador, pomadas, qualquer formulação de enxágue, talco, musses, pós, sprays, aerossóis, soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, filmes de polissacarídeo, emplastros, emplastros em gel, curativos, um sistema adesivo, emulsões de água em óleo, emulsão de óleo em água e emulsões de silicone.

[00192] Em uma modalidade da presente invenção, a emulsão contém um lipideo ou óleo. A emulsão pode ser, mas não se limita a, emulsões óleo em água, água em óleo, água em óleo em água e óleo em água em silicone. A emulsão pode conter um umectante. A emulsão pode conter um agente antiespumante, tal como silicone. A emulsão pode ter qualquer viscosidade adequada. Emulsões podem ainda conter um emulsificante e/ou um agente antiespumante. Os métodos de preparação de uma emulsão são conhecidos de um versado na técnica. [00193] A composição da invenção pode ser apresentada, preparada e/ou administrada em uma variedade de formas adequadas. Tais formas

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42/146 incluem, por exemplo, mas sem limitação, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, emulsões, microemulsões, comprimidos, pílulas, pós, Hpossomas, dendrímeros e outras nanopartículas, micropartículas e supositórios. Será apreciado que a forma pode depender do modo de administração pretendido, a natureza da composição ou combinação e aplicação terapêutica ou outro uso pretendido. As formulações também podem incluir, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (catiônicos ou aniônicos), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões, carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax.

[00194] Deve ser entendido que um ingrediente que é considerado como sendo um ingrediente ativo” em um produto pode ser um ingrediente funcional ou excipiente em outro e vice-versa. Será também apreciado que alguns ingredientes desempenham um papel duplo tanto como um ingrediente ativo quanto como um ingrediente funcional ou excipiente.

[00195] Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos e usos da invenção envolvem a administração de um peptídeo ou composição da invenção em combinação com um ou mais de outros agentes ativos, por exemplo, drogas promotoras do crescimento existentes ou potenciadores farmacológicos disponíveis no mercado. Em tais casos, os compostos da invenção podem ser administrados consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com o um ou mais de outros agentes ativos.

[00196] Em modalidades preferidas, o uso repetido da composição é fornecido.

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43/146 [00197] A composição da invenção pode ser incorporada em um dispositivo médico para administração. Tal dispositivo pode incluir, mas não está limitado a um tecido, emplastro, curativo, medidor, meia, fecho, roupa íntima, compressa, luva, máscara, emplastros adesivos, emplastros não adesivos, emplastros oclusivos e emplastros microelétricos ou sistema adesivo adequado. Em tal modalidade, o dispositivo está em contato direto com a camada queratinosa, tal como a pele, liberando, dessa forma, os peptídeos da invenção. Será entendido que a composição tópica pode ser incorporada em qualquer forma adequada como detalhado aqui. Por exemplo, a composição tópica ou peptídeos da invenção podem ser incorporados no dispositivo ou estar presentes na superfície do dispositivo ou pode estar em uma formulação de creme, gel ou cera ou qualquer formulação adequada definida aqui e incorporada ao dispositivo ou à superfície do dispositivo. [00198] O dispositivo pode ser adaptado para adesão ou fixação à pele. Em uma modalidade, o dispositivo é adaptado para liberar uma quantidade constante da composição ou dos peptídeos da invenção. Será entendido que a quantidade da composição contida no sistema de liberação sustentada dependerá, por exemplo, de onde a composição é administrada, da cinética e duração da liberação da composição da invenção, bem como da natureza da condição, distúrbio e/ou doença a ser tratada e/ou cuidada. O dispositivo pode ser tal que a composição seja liberada por biodegradação do dispositivo ou por fricção entre o dispositivo e o corpo, devido à umidade corporal, pH da pele ou temperatura corporal.

[00199] Em uma modalidade da invenção, a composição pode ainda compreender pelo menos um excipiente cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitável. O excipiente pode ser usado indistintamente com um ingrediente ou aditivo funcional. Deve ser entendido que, embora as composições tópicas da presente invenção

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44/146 possam ser administradas isoladamente, elas serão geralmente administradas em mistura com um excipiente cosmético ou farmacêutico. O excipiente cosmeticamente ou farmaceuticamente aceitável é bem conhecido na técnica, e qualquer excipiente conhecido pode ser usado, desde que seja adequado para administração tópica e seja dermatologicamente aceitável, sem toxicidade indevida, incompatibilidade e/ou reação alérgica.

[00200] Preferencialmente, qualquer excipiente incluído está presente em quantidades vestigiais. A quantidade de excipiente incluída dependerá de vários fatores, incluindo o tipo de excipiente usado, a natureza do excipiente, o(s) componente(s) da composição tópica, a quantidade de ativo ou peptídeo na composição tópica e/ou o uso pretendido da composição tópica. A natureza e quantidade de qualquer excipiente não deve alterar inaceitavelmente os benefícios dos peptídeos dessa invenção.

[00201] Em uma modalidade da invenção, o excipiente pode ser um diluente, veículo, aglutinante, lubrificante, agente de suspensão, agente de revestimento, conservante, estabilizantes, corantes, veículo, agente solubilizante, base, emoliente, agente emulsificante, fragrância, umectante e/ou tensoativos.

[00202] Exemplos de diluentes adequados incluem, mas sem limitação, qualquer diluente descrito na US2014120131 ou US2004132667. Exemplos incluem etanol, glicerol e água. Exemplos de veículos adequados incluem, mas sem limitação, lactose, amido, glicose, metil celulose, estearato de magnésio, manitol, sorbitol e qualquer veículo adequado descrito na US2014120131 ou US2004132667.

[00203] Exemplos de agiutinantes adequados incluem, mas sem limitação, amido, gelatina, açúcares naturais, tais como glicose, lactose anidra, lactose de fluxo livre, beta-lactose, adoçantes de milho, gomas

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45/146 sintéticas e naturais, tais como acácia, tragacanto ou alginato de sódio, carboxlmetil celulose e polietileno glicol e qualquer aglutinante adequado descrito na US2014120131 ou US2004132667.

[00204] Exemplos de lubrificantes adequados incluem, mas sem limitação, oleato de sódio, estearato de sódio, estearato de magnésio, benzoato de sódio, acetato de sódio e cloreto de sódio e qualquer lubrificante adequado descrito na US2014120131 ou US2004132667.

[00205] O veículo pode ser qualquer veículo adequado conhecido na técnica ou descrito na US2014120131 ou US2004132667. Em algumas modalidades, o veículo pode incluir, mas não está limitado a, um líquido, tal como água, óleos ou tensoativos, incluindo os de petróleo, origem animal, vegetal ou sintética, polímero, óleo, tal como óleo de amendoim, óleo mineral, óleo de mamona, óleo de soja, álcool, polissorbatos, ésteres de sorbitano, éter sulfates, sulfatos, betaínas, glicosídeos, maltosídeos, álcoois graxos, nonoxinois, poloxâmeros, polioxietilenos, políetileno glicóis, dextrose, glicerol ou digitonina. Será entendido que o veículo será dermatologicamente aceitável. Os veículos preferidos contêm uma emulsão, tal como emulsões óleo em água, água em óleo, água em óleo em água e óleo em água em silicone. Emulsões podem ainda conter um emulsificante e/ou um agente antiespumante.

[00206] Em uma modalidade da invenção, a composição pode ainda compreender um ou mais ingredientes adicionais. A composição da invenção pode ser administrada consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais de outros agentes adicionais. Tais ingredientes adicionais podem ser aqueles do beneficio de incluir uma composição tópica ou do benefício de depender do uso pretendido da composição tópica. O ingrediente adicional pode estar ativo ou funcional ou ambos.

[00207] Exemplos de tais ingredientes adicionais incluem, mas sem limitação, um ou mais de agentes de limpeza, agentes condicionantes,

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46/146 filtro solar, pigmento, hidratante, agentes espessantes, agentes gelificantes, óleo essencial, adstringentes, pigmentos, agente antiaglomerante, agente antiespumante, aglutinantes, aditivos, tampões, agentes quelantes, analgésicos externos, formadores ou materiais de filme, agentes de volume, polímeros, agentes opacificantes, ajustadores de pH, propelentes, agentes redatores, sequestrantes, agentes branqueadores e ciareadores de pele, agentes condicionantes da pele, aloe vera, agentes cicatrizantes, agentes calmantes, agentes suavizantes, ácido pantotênico, agentes de tratamento, espessantes, vitaminas, corantes, fármacos, agentes antissépticos, agentes antiespumantes, agentes tamponantes, adstringentes, polímeros, regulador de pH, desodorante ou qualquer outro veículo ou tensoativo dermatologicamente aceitável.

[00208] Deve ser entendido que ingredientes adicionais listados podem fornecer mais de um benefício. A classificação fornecida aqui é para clareza e conveniência apenas e não se destina a limitar o ingrediente adicional à aplicação particular ou categoria listada.

[00209] Quaisquer ingredientes adicionais devem ser adequados para aplicação à pele sem toxicidade indevida, incompatibilidade e/ou reação alérgica.

[00210] Em algumas modalidades, o ingrediente adicional tem atividade de transporte de glicose ou ajuda na atividade de transporte de glicose. Em algumas modalidades, o ingrediente adicional tem atividade anabólica. Em algumas modalidades, o ingrediente adicional tem atividade anti-inflamatória ou ajuda na atividade anti-inflamatória. Em algumas modalidades, o ingrediente adicional tem atividade antienvelhecimento ou ajuda na atividade antienvelhecimento. Em algumas modalidades, o ingrediente adicional é para saúde e/ou desenvolvimento da camada queratinosa, saúde e/ou desenvolvimento da pele e/ou saúde, recuperação e/ou desenvolvimento muscular. O

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47/146 agente ativo pode ser um potenciador farmacológico. Tais agentes ativos são conhecidos e disponíveis no mercado. Em tais casos, a composição tópica da invenção pode ser administrada consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com o um ou mais de outros agentes ativos.

[00211] Em algumas modalidades, o ingrediente adicional pode ser farnesol ([2E, 6E], -3, 7, 11, -trimetil^, 6, 10, dodecatrien-1-ol), fitantriol (3, 7, 11, 15, tetrametilexadecano-1,2, 3, -triol), ativos de descamação, enzimas, inibidores de enzimas, ativadores de enzimas, extratos botânicos e extratos marinhos, ativos antiacne, ativos antirrugas ou ativos antiatrofia, sequestrantes antioxidantes/radicais, quelantes, flavonoides, agentes anti-inflamatórios, agentes anticelulite, anestésicos tópicos, ativos bronzeadores, agentes clareadores de pele, agentes cicatrizantes de pele, bisabolol, ativos antimicrobianos ou antifúngicos, ativos de proteção solar, material particulado, agentes condicionantes, agentes estruturantes, agente espessante. O ativo de descamação pode ser qualquer agente adequado que melhore a aparência ou textura de pele da pele e é como descrito na US2014120131 ou US2004132667.

[00212] Exemplos de ativos antiacne são como descritos na US2014120131 ou US2004132667 e incluem resorcinol, ácido salicílico, eritromicina, zina, enxofre, peróxidos de benzoil.

[00213] Exemplos de agentes espessantes são os descritos na US2014120131 ou US2004132667 e incluem polímeros de ácido carboxílico, polímeros de poliacrilato reticulados, polímeros de poliacrilamida, polissacarídeos.

[00214] Exemplos de agentes condicionantes são como descritos na US2014120131 ou US2004132667 e incluem umectantes, hidratantes ou condicionador de pele.

[00215] Exemplos de agentes estruturantes são como descritos na

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US2014120131 ou US2004132667 e incluem qualquer agente que forneça características reológicas a uma composição e contribua para a estabilidade da composição.

[00216] Qualquer ativo antimicrobiano ou antifúngico adequado pode ser usado e os exemplos são como descritos na US2014120131 ou US2004132667. Tais ativos são capazes de destruir micróbios, prevenir o crescimento ou ação de micróbios. Exemplos incluem, mas sem limitação, drogas β-lactâmicas, drogas de quinolona, tetraciclina, eritromicina, sulfato de estreptomicina, ácido salicílico, peróxido de benzoil.

[00217] Exemplos de um material particulado incluem óxido metálico. [00218] Exemplos de agentes anticelulite incluem agentes xantina.

[00219] Exemplos de ativos de bronzeamento incluem 1, S-di-hidroxl· 2-propanona e os descritos na US2014120131 ou US2004132667.

[00220] Exemplos de anestésicos tópicos incluem benzocaina, lidocaína e bupivacaína e os descritos na US2014120131 ou US2004132667.

[00221] Exemplos de agentes clareadores de pele incluem qualquer agente conhecido na técnica, tais como ácido kójico, ácido ascórbico e os descritos na US2014120131 ou US2004132667.

[00222] Exemplos de ativos de proteção solar incluem qualquer ativo de proteção solar orgânico ou inorgânico adequado. Exemplos incluem óxidos metálicos, 2~θίΠΗβχΠ“Ρ“ΠΊβ1οχίαη3Γη3ίο e os descritos na US2014120131 ou US2004132667.

[00223] Exemplos de agentes cicatrizantes de pele incluem ácido pantenoico como descrito na US2014120131 ou US2004132667.

[00224] Exemplos de agentes anti-inflamatórios incluem qualquer agente que melhore a aparência, tom ou cor da pele e incluem, mas sem limitação, corticosteroides, hidrocortisona, agentes não esteroidais, tais como ibuprofeno e aspirina e os descritos na US2014120131 ou

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US2004132667.

[00225] Exemplos de flavonoides incluem flavanonas, metóxi flavononas, calconas não substituídas e suas misturas e as descritas na US2014120131 ou US2004132667.

[00226] Exemplos de enzimas incluem lipases, proteases, catalase, superóxido-dismutase, amilase, peroxidase, glucuronidase, ceramidases, hialuronidases. Exemplos de inibidores enzimáticos incluem inibidores de tripsina, inibidores de Bowmann Birk, inibidores de quimotripsina, extratos botânicos, flavonoides, quercetina calcona e os descritos na US2014120131 ou US2004132667 e suas misturas. Exemplos de ativadores enzimáticos incluem coenzima A, Q10 (ubiquinona), glicirrizina, berberina, crisina e os descritos na US2014120131 ou US2004132667 e suas misturas.

[00227] Exemplos de ativos antirrugas ou antiatrofia incluem enxofre contendo D e L aminoácidos, derivados N~acil particulares, tais como Nacetil-L-cisteína, ácidos hidroxílicos, ácido fítico, ácido lipoico, ácido lisofosfatidico, agentes de descamaçâo de pele, vitamina B3, retinoides e os descritos na US2014120131 ou US2004132667 e suas misturas.

[00228] O agente sequestrante antioxidante/radical pode ser qualquer agente que seja útil para fornecer proteção contra radiação UV ou outros agentes ambientais que possam causar danos à pele, tais como os descritos na US2014120131 ou US2004132667. Exemplos de sequestrantes antioxldantes/radicais incluem ácido ascórbico, seus sais e derivados (vitamina C), tocoferol, seus sais e derivados (vitamina E), ácidos hidroxil benzoicos butilados e seus sais, peróxidos, ácidos gálicos e ésteres alquílicos, ácido sórbico, ácido lipoico, aminas, pidolato de licina, pilolato de arginina, ácido nordihidroguaiarético, bioflavonoides, curcumina, lisina, metionina, prolina, superóxido dismutase, silimarina, extratos de chá e suas misturas.

[00229] Exemplos de quelantes incluem EDTA, NTA, ácidos

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50/146 hidoxâmicos, ácido fítico, lactoferrins e os descritos na US2014120131 ou US2004132667 e suas misturas. Um quelante significa um agente capaz de remover um íon metálico por formação de um complexo de modo que o íon metálico não possa participar de ou catalisar reações químicas. Um quelante é útil para proteção contra radiação UV ou outros agentes ambientais que podem causar danos à pele.

[00230] Será apreciado que uma pluralidade de ingredientes adicionais pode ser adicionada. A quantidade do ingrediente adicional pode ser de cerca de 0,001% a cerca de 50% em peso da composição, preferencialmente, cerca de 0,01% a cerca de 20%, preferencialmente cerca de 0,1% a cerca de 10%, cerca de 0,5% a cerca de 10%, cerca de 1% a cerca de 5%, preferencialmente 2% de peso da composição. A quantidade de ingrediente adicional incluído dependerá de vários fatores, incluindo o tipo de ingrediente adicional usado, a natureza do ingrediente adicional, o(s) componente(s) da composição tópica, a quantidade de ativo ou peptídeo na composição tópica e/ou o uso pretendido da composição tópica. A natureza e quantidade de qualquer ingrediente adicional não deve alterar inaceitavelmente os benefícios dos peptídeos dessa invenção.

[00231] A composição tópica pode ser livre de álcool.

[00232] Em algumas modalidades da invenção, a composição ainda compreende um ou mais agentes ativos adicionais, além do peptídeo da invenção (também conhecido como o ativo da composição). Além disso, ou alternativamente, a composição pode ser administrada com um ou mais de outros agentes ativos adicionais. O referido agente ativo adicional típico está presente em quantidades vestigiais apenas. Em algumas modalidades, pode não haver agente ativo adicional presente na composição. A quantidade de agente ativo adicional incluída dependerá de vários fatores, incluindo o tipo de agente ativo adicional usado, a natureza do agente ativo adicional, o(s) componente(s) da

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51/146 composição tópica, a quantidade de ativo ou peptídeo na composição tópica e/ou o uso pretendido da composição tópica. A natureza e quantidade de qualquer agente ativo adicional não deve alterar inaceitavelmente os benefícios dos peptídeos dessa invenção.

[00233] É entendido que um ingrediente que é considerado como sendo um ingrediente ativo em um produto pode ser um ingrediente funcional ou excipiente em outro e vice-versa. Será também apreciado que alguns ingredientes desempenham um papel duplo tanto como um ingrediente ativo quanto como um ingrediente funcional ou excipiente.

[00234] Exemplos dos agentes ativos adicionais incluem drogas de promoção do transporte de glicose, suplemento de pele, agente para tratamento e/ou cuidado da pele, agente anti-inflamatório, um agente antienvelhecimento, agentes anabólicos, um agente de promoção do crescimento celular e potenciadores farmacológicos. Tais agentes são bem conhecidos na técnica e será apreciado que qualquer agente ativo adicional adequado possa ser usado. Agentes ativos adicionais para tratamento e/ou cuidado da pele podem incluir agentes de síntese de colágeno, retinoides, agentes esfoliantes, agentes anticelulite, agentes inibidores de elastase, agentes estimulantes ou inibidores de síntese de melanina, agentes de autobronzeamento, agentes antienvelhecimento, agentes antimicrobianos, agentes antifúngicos, agentes fungistáticos, agentes bactericidas e agentes cicatrizantes. Agentes ativos também incluem agentes anti-inflamatórios.

[00235] Qualquer agente ativo adicional deve ser adequado para aplicação à pele sem toxicidade indevida, incompatibilidade e/ou reação alérgica. Será entendido que a classificação apresentada aqui é para clareza e conveniência apenas e nâo se destina a limitar o ingrediente, excipiente ou ativo adicional para à aplicação particular ou categoria listada.

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52/146 [00236] Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos e usos da invenção envolvem a administração de um peptídeo ou composição da invenção em combinação com um ou mais de outros agentes ativos, por exemplo, drogas de promoção do crescimento existentes ou potenciadores farmacológicos disponíveis no mercado. Em tais casos, os compostos da invenção podem ser administrados consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com o um ou mais de outros agentes ativos.

[00237] Em uma modalidade, o efeito da presente invenção é realizado por aplicação ou administração tópica da composição tópica da invenção descrita aqui a uma pessoa, animal ou um paciente em necessidade de tratamento ou cuidado. A liberação tópica preferencialmente significa liberação a uma camada queratinosa, tal como a pele, cabelos e/ou unhas, mas também pode significar liberação a um lúmen corporal revestido com células epiteliais, por exemplo, os pulmões ou vias aéreas, o trato gastrointestinal, a cavidade bucai. O efeito pode ser confinado à superfície da pele ou pode estar dentro da pele ou uma combinação de ambos.

[00238] A composição tópica da invenção é administrada em uma quantidade cosmeticamente ou farmaceuticamente eficaz. Em outras palavras, em uma quantidade que não é tóxica, mas suficiente para fornecer o efeito desejado. Será apreciado que uma pessoa versada na técnica seja capaz de determinar uma dose apropriada das composições tópicas da invenção para administrar sem experimentação indevida. Alternativamente, um médico determinará a dose real que é mais adequada para um paciente, dependendo da condição, doença ou distúrbio a ser tratado ou cuidado e a idade, peso corporal e/ou saúde da pessoa. Dependerá de uma variedade de fatores incluindo a atividade do composto específico empregado, a estabilidade metabólica e o comprimento de ação desse composto, a idade, peso corporal,

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53/146 saúde geral, sexo, dieta, modo e tempo de administração, taxa de excreção, combinação de drogas, a severidade da condição particular e a terapia submetida ao indivíduo. Podem, evidentemente, haver casos individuais em que faixas de dosagem mais altas ou mais baixas são merecidas e estão dentro do escopo dessa invenção. Por exemplo, a composição pode ser administrada em uma dose de 0,01 a 50 mg/kg de peso corporal, tal como de 0,1 a 30 mg/kg, mais preferencialmente de 0,1 a 20 mg/kg de peso corporal, mais preferencialmente de 0,1 a 10 mg/kg de peso corporal, preferencialmente 0,1 a 5 mg/kg de peso corporal. Em uma modalidade exemplificativa, uma ou mais doses de 10 a 300 mg/dia ou mais preferencialmente, 10 a 150 mg/dia serão administradas ao doente. A quantidade e a frequência é a que melhor se adequa ao propósito. A frequência de aplicação ou administração pode variar muito, dependendo das necessidades de cada indivíduo, com uma recomendação de uma faixa de aplicação ou administração de uma vez por mês a dez vezes por dia, preferencialmente de uma vez por semana a quatro vezes por dia, mais preferencialmente de três vezes por semana a três vezes por dia, ainda mais preferencialmente uma vez ou duas vezes por dia.

[00239] Em modalidades preferidas, o uso repetido da composição é fornecido.

[00240] A composição tópica pode ser aplicada, mas não se limita a, esfregar ou massagear o tecido queratinoso, pele ou área do corpo a ser tratada ou cuidada. Em algumas modalidades, a composição é deixada na ou não removida da área do corpo. Em outras modalidades, a composição é removida após um período de tempo, tal como, mas não limitado a, de cerca de 2 minutos a 60 minutos, de cerca de 5 minutos a cerca de 30 minutos, preferencialmente de cerca de 10 minutos a cerca de 20 minutos. A composição pode ser removida imediatamente após a aplicação. Em algumas modalidades da presente

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54/146 invenção, a composição da invenção pode ser aplicada a uma área a ser tratada para se obter uma maior penetração da composição e/ou peptídeo da invenção, tal como, mas não limitada a, iontoforese, sonoforese, eletroporação, emplastros microelétricos, pressão mecânica, gradiente de pressão osmótica, cura ociusiva, microinjeções ou injeções sem agulha por meio de pressão, tais como injeções por pressão de oxigênio ou qualquer combinação delas.

[00241] Os peptídeos ou fragmentos da invenção são usados na composição cosmética ou farmacêutica tópica dessa invenção em concentrações cosmeticamente ou farmaceuticamente ou terapeuticamente eficazes para alcançar o efeito desejado; de uma forma preferida em relação ao peso total da composição, entre 0,00000001% (em peso) e 20% (em peso); preferencialmente entre 0,000001% (em peso) e 15% (em peso), mais preferencialmente entre 0,0001% (em peso) e 10% (em peso) e ainda mais preferencialmente entre 0,0001% (em peso) e 5% (em peso). Idealmente, os peptídeos da presente invenção são preferencialmente usados de cerca de 0,00001 % p/p até cerca de 0,5% p/p, e mais preferencialmente de 0,00005 p/p a cerca de 0,05 p/p, e mais preferencialmente de cerca de 0,0001 p/p a cerca de 0,01 p/p da composição. Idealmente, os peptídeos da presente invenção são preferencialmente usados de cerca de 0,0001% p/p a cerca de 0,004% p/p da composição.

[00242] A composição da invenção pode ser administrada individualmente ou em combinação com outros agentes farmacologicamente ativos. Será entendido que tal terapia de combinação abrange diferentes regimes terapêuticos, incluindo, sem limitação, administração de múltiplos agentes em conjunto em uma forma de dosagem única ou em formas de dosagem individuais distintas. Se os agentes estiverem presentes em diferentes formas de dosagem, a administração pode ser simultânea ou quase simultânea ou

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55/146 pode seguir qualquer regime predeterminado que englobe a administração dos diferentes agentes. Os agentes ativos adequados podem ser como descritos aqui.

[00243] Em algumas modalidades da presente invenção, a composição pode ser liberada através de qualquer um de lipossomas, lipossomas mistos, oleossomas, niossomas, etossomas, millicápsulas, cápsulas, macrocápsulas, nanocápsulas, veículos de lipídeo nanoestruturados, esponjas, ciclodextrinas, vesículas, micelas, micelas mistas de tensoativos, micelas mistas de tensoativo-fosfolipídeo, milisferas, esferas, liposferas, partículas, nanoesferas, nanopartículas, milipartículas, nanopartículas sólidas, bem como microemulsões incluindo microemulsões água em óleo com uma estrutura interna de micela reversa e microesferas, micropartículas de nanoemulsões.

[00244] Uma variedade de métodos está disponível para a preparação de lipossomas. Ver, por exemplo, Szoka et al., Ann. Rev. Biophys. Bioeng. 9:467 (1980), Patente U.S. N°s. 4.186.183, 4.217.344, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.235.871, 4.261.975, 4.485.054, 4.501.728, 4.774.085, 4.837.028, 4.946.787, Publicação PCT N°. WO 91/17424, Deamer & Bangham, Biochim. Biophys. Acta 443:629-634 (1976); Fraley, et al., PNAS 76:3348-3352 (1979); Hope et al., Biochim. Biophys. Acta 812:55-65 (1985): Mayer et al., Biochim. Biophys. Acta 858: 161-168 (1986); Williams et al., PNAS 85:242-246 (1988); Liposomes (Ostro (ed.), 1983, Chapter 1); Hope et al., Chem. Phys. Lip. 40:89 (1986); Gregoriadis, Liposome Technology (1984) e Lasic, Liposomes: from Physics to Applications (1993)). Métodos adequados incluem, por exemplo, sonicação, extrusão, alta pressão/homogeneização, microfluidização, diálise com detergente, fusão induzida por cálcio de pequenos veículos de lipossomas e métodos de fusão de éter, todos os quais são bem conhecidos na técnica.

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56/146 [00245] Esses sistemas de liberação podem ser adaptados para alcançar uma maior penetração do composto e/ou peptídeos da invenção. Isto pode melhorar as propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas. O sistema de liberação pode ser um sistema de liberação sustentada em que o composto ou peptídeo da invenção é liberado gradualmente durante um período de tempo e preferencialmente com uma taxa de liberação constante ao longo de um período de tempo. Os sistemas de liberação são preparados por métodos conhecidos na técnica. A quantidade de peptídeo contida no sistema de liberação sustentada dependerá de onde a composição será liberada e a duração da liberação, bem como o tipo da condição, doença e/ou distúrbio a ser tratado ou cuidado.

[00246] O composto da invenção pode ser administrado por administração oral. O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser incluído em uma cápsula de envoltório gelatina dura ou mole, comprimido em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e semelhantes. O composto pode ser revestido, ou coadministrador do composto, com um material para prevenir sua inativação.

[00247] A composição da invenção pode ser um produto alimentício ou um produto de bebida. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de nutrição esportiva, por exemplo, uma bebida, lanche ou suplemento. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é uma bebida. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de padaria. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto lácteo. Em uma modalidade, o produto comestível produzido

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57/146 pelo homem é um produto para lanche. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto alimentício extrusado cozido. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é leite em pó. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de fórmula para lactentes. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de confeitaria. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um iogurte. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é uma bebida de iogurte. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de sorvete. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto alimentício congelado. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um cereal matinal. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um pão. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é uma bebida de leite aromatizada. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é uma barra de confeitaria. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de chá ou chá. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é com base em um produto de lanche extrusado. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto de lanche frito. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um suplemento nutricional. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto nutricional esportivo. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto alimentício para bebês. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um produto alimentício especializado para indivíduos imunocomprometidos. Em uma modalidade, o produto comestível produzido pelo homem é um alimento para pacientes geriátricos.

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58/146 [00248] Em uma modalidade, a composição é um produto alimentício vegetal. Em uma modalidade, a composição é um meio de cultura celular. Em uma modalidade, a composição é uma alimentação animal. Em uma modalidade, a composição é um suplemento alimentar animal. Em uma modalidade, a composição é um alimento médico.

[00249] Em uma modalidade, a composição da invenção pode ser administrada por administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, subcutânea, intraperitoneal e/ou intramuscular). Por exemplo, pode ser administrada por infusão intravenosa ou por injeção intramuscular ou subcutânea.

[00250] A composição da invenção pode ser para uso ser humano ou animal em medicina humana e veterinária.

[00251] A composição da invenção pode ser usada para usos farmacêuticos, pessoais e/ou cosméticos.

[00252] A composição pode ser usada para tratar ou cuidar de qualquer doença, distúrbio ou condição da pele, incluindo, mas não se limitando a, psoríase, dermatite, dermatite alérgica, eczema, espongiose, edema, câncer de pele, úlceras, acne, cicatrizes, celulite, elastose, queratose, rosácea, varizes, distúrbios inflamatórios.

[00253] A composição pode ser usada para tratamento não tópico de qualquer doença, distúrbio ou condição da pele, incluindo, mas não se limitando a, psoríase, dermatite, dermatite alérgica, eczema, espongiose, edema, câncer de pele, úlceras, acne, cicatrizes, celulite, elastose, queratose, rosácea, varizes, distúrbios inflamatórios.

[00254] A composição pode ser usada para tratamento não tópico de um ferimento em um mamífero. Em outra modalidade, a composição é para uso no tratamento não-tópico ou prevenção de uma doença caracterizada por células ou tecido epiteliai danificado e/ou células ou tecido dérmico ou epiteliai danificado. Uma doença pode ser, mas não se limita a, câncer e trauma.

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59/146 [00255] A composição pode ser usada para tratamento ou cuidado de sinais visíveis de envelhecimento, incluindo, mas não se limitando a, rugas, estrias e olheiras, secura, linhas finas, manchas senis, manchas vermelhas, pele flácida e condições causadas por exposição ao soi, incluindo queimaduras solares, estresse, poluição e dieta. A composição tópica também pode ser usada para retardar, desacelerar ou inibir as peles ou o começo do envelhecimento. A composição pode ser administrada por um dispositivo médico, tal como um emplastro como descrito aqui.

[00256] A composição pode ser usada para tratar ou cuidar de um ferimento em um mamífero. Em outra modalidade, a composição tópica é para uso no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por células ou tecido epitelial danificado e/ou células ou tecido dérmico ou epitelial danificado. A doença pode ser, mas não se limita a, câncer e trauma.

[00257] A composição pode ser usada para tratar ou cuidar de qualquer condição muscular, melhorar o estado muscular em um mamífero, promover a recuperação muscular, tipicamente após exercícios, manter ou restaurar a saúde muscular (por exemplo, massa de tecido magra) em um mamífero, melhorar o desempenho físico, no tratamento ou prevenção de uma doença ou condição caracterizada por letargia ou baixos níveis de energia.

[00258] A composição pode ser usada para aumentar ou estimular o crescimento muscular.

[00259] A composição pode ser usada para promover o crescimento de um tecido, promover o crescimento de tecido epitelial, promover o crescimento de pele, promover o crescimento de um órgão, promover o crescimento de um organismo. A pele pode ter uma patologia normal e/ou uma patologia anormal.

[00260] A composição também pode ser usada para tratar ou cuidar

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60/146 de qualquer distúrbio infiamatório. Em uma modalidade, o distúrbio inflamatório é um distúrbio infiamatório das articulações. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é um distúrbio infiamatório do sistema cardiovascular. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é uma doença autoimune. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é um distúrbio infiamatório pulmonar e das vias aéreas. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é um distúrbio infiamatório intestinal. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é dermatite. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é acne vulgar. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é psoríase. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é artrite reumatoide. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é doença cardiovascular. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é aterosclerose. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é Diabetes tipo I.

[00261] Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é doença de Graves. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é a síndrome de Guillain-Barre. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é Lúpus. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é a Artrite psoriática. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é Oolite ulcerativa. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é asma. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é fibrose cística. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é COPD. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é enfisema. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é a síndrome do desconforto respiratório agudo. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é colite. Em uma modalidade, o distúrbio infiamatório é doença infiamatória intestinal.

[00262] A composição também pode ser usada para tratar ou cuidar de um distúrbio metabólico. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é pré-diabetes. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é diabetes. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é Diabetes tipo 1. Em uma

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61/146 modalidade, o distúrbio metabólico é Diabetes tipo 2. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é síndrome metabólica. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é obesidade. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é a dislipidemia diabética. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é hiperlipidemia. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é hipertensão. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é hipertrigliceridemia. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é o aumento no nível de ácidos graxos no sangue (hyperfattyacidemia). Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é a hipercolerterolemia. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é a hiperinsulinemia. Em uma modalidade, o distúrbio metabólico é MODY. A composição da presente invenção também pode ser usada em um método para tratamento de um paciente que sofre de uma doença ou condição associada a ou causada por hiperinsulinemia, hipoglicemia, hipocalemia e/ou hipofosfatemia. A presente invenção ainda se refere ao método para tratamento de doenças ou distúrbios relacionados à glicemia, compreendendo a administração de derivados de insulina ou conjugados de insulina. Doenças ou distúrbios relacionados à glicemia incluem Diabetes tipo I e II e diabetes gestacional. Além disso, fibrose cística, síndrome dos ovários policísticos, pancreatite e outras doenças relacionadas ao pâncreas também podem ser tratadas.

[00263] Em uma modalidade da invenção, a composição é para uso na manutenção ou restauração da saúde intestinal.

[00264] Em uma modalidade da invenção, a composição é para uso em um método para o tratamento ou prevenção de dor sítio.

[00265] A composição tem um uso como produto de higiene pessoal, um suplemento, um cosmético, um produto farmacêutico.

[00266] Um método de tratamento, prevenção ou cuidado de qualquer uma das doenças, distúrbios ou condições descritas aqui é também fornecido, o referido método compreendendo uma etapa de

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62/146 administração da composição ou composição tópica da invenção. A composição pode ser administrada à pele, cabelos, unhas. A composição pode ser administrada em qualquer dose ou frequência, como descrito aqui, por qualquer método de administração ou qualquer método de aplicação tópica.

[00267] Em uma modalidade, a composição é uma composição cosmética. Em uma modalidade, a composição é uma composição farmacêutica. Será apreciado que a composição pode ter uma dupla função e ser tanto uma composição cosmética quanto farmacêutica.

[00268] Será apreciado que a composição pode ser uma composição terapêutica ou pode ser uma composição não terapêutica. A composição pode ter um papel duplo.

[00269] As composições podem ser formuladas em forma de dosagem unitária, isto é, na forma de porções discretas contendo uma dose unitária ou um múltiplo ou subunidade de uma dose unitária.

[00270] Em uma modalidade particularmente preferida, os métodos e usos da invenção envolvem a administração de um peptídeo ou composição da invenção em combinação com um ou mais de outros agentes ativos disponíveis no mercado. Em tais casos, os compostos da invenção podem ser administrados consecutivamente, simultaneamente ou sequencialmente com um ou mais de outros agentes ativos.

Peptídeo Modificados [00271] Em uma modalidade, o peptídeo da invenção (incluindo fragmentos de peptídeo e variantes) pode ser um peptídeo modificado. O termo peptídeo modificado é usado indistintamente com o termo derivado do peptídeo. Em uma modalidade, o termo peptídeo modificado significa um peptídeo que é modificado para exibir uma ou mais das seguintes propriedades comparadas com o peptídeo não modificado: aumentar a meia-vida plasmática; aumentar a lipofilicidade

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63/146 do peptídeo: aumentar a eliminação renal do peptídeo modificado; aumentar a atividade do peptídeo modificado e aumentar a resistência do peptídeo modificado à degradação proteolítica (isto é, por proteases gastrointestinais de mamíferos e especialmente humanos). Vários métodos de modificação de um peptídeo da invenção para exibir essas propriedades são descritos aqui, incluindo a conjugação do peptídeo com um parceiro de ligação (por exemplo, uma molécula pequena de ligação a albumina, polímero grande, proteína de plasma de vida longa ou anticorpo ou fragmento de anticorpo), ciclização, adição de N~ ou Cterminal ou cadeia lateral, grupo de proteção, substituição de um ou mais L-aminoácidos com D-isômeros, modificação de aminoácido, aumento de ligação de proteínas plasmáticas, aumento de ligação de albumina. O peptídeo modificado inclui, mas não é limitado a, um peptídeo que foi substituído por um ou mais grupos, como definido aqui, ou conjugado com um parceiro de iigação ou ciciizado. Geralmente, o peptídeo é modificado para aumentar sua meia-vida in vivo em um animal. Vários métodos de modificação são fornecidos abaixo.

[00272] Em uma modalidade, a modificação pode ser qualquer modificação que forneça os peptídeos e/ou a composição da invenção com uma capacidade aumentada de penetrar uma célula. Em uma modalidade, a modificação pode ser qualquer modificação que aumente a meia-vida da composição ou peptídeos da invenção. Em uma modalidade, a modificação pode ser qualquer modificação que aumente a atividade da composição ou peptídeos da invenção. Em uma modalidade, a modificação pode ser qualquer modificação que aumente a seletividade da composição ou peptídeos da invenção.

[00273] Em uma modalidade, o grupo é um grupo de proteção. O grupo de proteção pode ser um grupo de proteção N-terminal, um grupo de proteção C-termina! ou um grupo de proteção de cadeia lateral. O peptídeo pode ter um ou mais desses grupos de proteção.

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64/146 [00274] O versado na técnica está ciente de técnicas adequadas para reagir com aminoácidos com esses grupos de proteção. Esses grupos podem ser adicionados por métodos de preparação conhecidos na técnica, por exemplo, os métodos descritos nos parágrafos [0104] a [0107] da US2014120141. Os grupos podem permanecer no peptídeo ou podem ser removidos. O grupo de proteção pode ser adicionado durante a síntese.

[00275] Em uma modalidade da invenção, os peptídeos podem ser substituídos por um grupo selecionado de uma ou mais de cadeia linear ou cadeia ramificada, cadeia longa ou curta, saturada ou insaturada, substituída por grupo hidroxil, amino, amino acil, sulfato ou sulfureto ou não substituída tendo de 1 a 29 átomos de carbono. Derivados de Nacil incluem grupos acil derivados de ácido acético, ácido cáprico, ácido láurico, ácido mirístico, ácido octanoico, ácido palmítico, ácido esteárico, ácido beênico, ácido linoleico, ácido linolênico, ácido lipoico, ácido oleico, ácido isostérico, ácido elaidoico, ácido 2-etiihexanoico, ácido graxo de óleo de coco, ácido graxo de sebo, ácido graxo de sebo endurecido, ácido graxo de palmiste, ácido graxo de lanolina ou ácidos semelhantes. Esses podem ser substituídos ou não substituídos. Quando substituídos, são preferencialmente substituídos por grupos hidroxil ou contendo enxofre, tais como, mas não limitado a, SO3H, SH, ou S-S.

[00276] Em uma modalidade da presente invenção, 0 peptídeo é R1X-R₂.

[00277] Os grupos R1 e/ou R2, respectivamente, ligam-se ao aminoterminal (N-terminal) e carboxil-terminal (C-terminal) da sequência de peptídeos.

[00278] Em uma modalidade, 0 peptídeo é R1-X. Alternativamente, 0 peptídeo é X-Rz.

[00279] Preferencialmente, R1 é H, C1-4 alquil, acetil, benzoil ou

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65/146 trifluoroacetil; X é o peptídeo da invenção: Rz é OH ou NH2 [00280] Em uma modalidade, R1 é selecionado do grupo formado por H, um grupo alifático substituído ou não substituído não cíclico, aliciclil substituído ou não substituído, heterociclil substituído ou não substituído, heteroarilalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, aralquil substituído ou não substituído, Terc-butiloxicarbonil, 9-fluorenilrnetiloxicarbonil (Fmoc) e R5-CO-, em que R5 é selecionado do grupo formado por H, um grupo alifático substituído ou não substituído não cíclico, aliciclil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído, araiquil substituído ou não substituído, heterociclil substituído ou não substituído e heteroarilalquil substituído ou não substituído; R2 é selecionado do grupo formado por “NR3R4, OR3 e -SR3, em que R3 e R4 sâo, independentemente, selecionados do grupo formado por H, um grupo alifático substituído ou não substituído não cíclico, aliciclil substituído ou não substituído, heterociclil substituído ou não substituído, heteroarilalquil substituído ou não substituído, aril substituído ou não substituído e aralquil substituído ou não substituído; e com a condição que R1 e R2 não são a-aminoácidos.

[00281] De acordo com outra modalidade preferida, R2 é -NR3R4, OR3 ou SR3, em que R3 e R4 são, independentemente, selecionados do grupo formado por H, Ci-C24alquil substituído ou não substituído, Cs·· C24 alquenil substituído ou não substituído, terc-butiloxicarbonil, 9fluorenilmetiloxicarbonil (Fmoc), C2-C24 alquinil substituído ou não substituído, C3-C24 cicloalquil substituído ou não substituído, C5-C24 cicloalquenil substituído ou não substituído, C8-C24 cicloalquinil, substituído não substituído, C-6C30 aril substituído ou não substituído, C7-C24 aralquil substituído ou não substituído, anel de heterociclil substituído ou não substituído de 3-10 membros, e heteroarilalquil substituído ou não substituído de 2 a 24 átomos de carbono e 1 a 3

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66/146 átomos que não sejam carbono em que a cadeia alquil é de 1 a 6 átomos de carbono. Opcionalmente, R3 e R4 podem ser ligados por uma ligação carbono-carbono saturada ou insaturada, formando um ciclo com 0 átomo de nitrogênio. Mais preferencialmente R2 é -NR3R4 ou -OR3, em que R3 e R4 são, independentemente, selecionados do grupo formado por H, C1--C24 alquil substituído ou não substituído, C2-C24 alquenil substituído ou não substituído, C2-C24 alquinil substituído ou não substituído, C3-C10 cicloalquil substituído ou não substituído, Ce-C-ss aril substituído ou não substituído e heterociclil substituído ou não substituído de 3-10 membros, heteroarilalquil substituído ou não substituído por um anel de 3 a 10 membros e uma cadeia alquil de 1 a 6 átomos de carbono. Mais preferencialmente, R3 e R4 são selecionados do grupo formado por H, metil, etil, hexil, dodecil ou hexadecil. Ainda mais preferencialmente, R3 é H e R4 é selecionado do grupo formado por H, metil, etil, hexil, dodecil ou hexadecil. De acordo com uma modalidade ainda mais preferida, R2 é selecionado de -OH e -NHz.

[00282] De acordo com uma outra modalidade dessa invenção, R1 é selecionado do grupo formado por H, acetil, lauroil, miristoil ou palmitoil, e Rs é -NR3R4 ou -OR3 em que R3 e R4 são independentemente selecionados de H, metil, etil, hexil, dodecil e hexadecil, preferencialmente Raé -OH ou -NH2. Mais preferencialmente, R1 é acetil ou palmitoil e R2 é “NH2.

[00283] Em uma modalidade preferida, 0 grupo acil (ou acetil) é ligado à extremidade N-terminal de pelo menos um aminoácido do peptídeo.

[00284] Em uma modalidade da invenção, 0 peptídeo é modificado para compreender um grupo de proteção de cadeia lateral. O grupo de proteção de cadeia lateral pode ser um ou mais do grupo compreendendo benzil ou grupos com base em benzil, grupos com base em t-butil, grupo benzilóxi-carbonil (Z) e grupo de proteção

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67/146 aliloxicarbonil (alloc). O grupo de proteção de cadeia lateral pode ser derivado de um aminoácido aquiral, tal como glicina aquiral. O uso de um aminoácido aquiral ajuda a estabilizar o peptídeo resultante e também facilita a via de síntese fácil da presente invenção. Preferencialmente, o peptídeo ainda compreende um C-terminal modificado, preferencialmente um C-terminal amidado. O resíduo aquiral pode ser ácido alfa-aminoisobutírico (metilalaína). Será apreciado que os grupos de proteção de cadeia lateral específicos usados dependerão da sequência do peptídeo e do tipo de grupo de proteção N-terminal usado. Em uma modalidade da invenção, o peptídeo é conjugado, ligado ou fundido a um ou mais polímeros de polietileno glicol ou outros compostos, tais como compostos de aumento de peso molecular. O composto de aumento de peso molecular é qualquer composto que irá aumentar o peso molecular, tipicamente em 10% a 90%, ou 20% a 50% do conjugado resultante e pode ter um peso molecular de entre 200 e 20.000, preferencialmente entre 500 e 10.000. O composto de aumento de peso molecular pode ser PEG, qualquer porção de polímero (anfifílico ou hidrofílico) solúvel em água, homo ou copolímeros de PEG, um polímero de PEG monometil-substituído (mPEG) e polioxietileno glicerol (POG), poliaminoácidos, tais como polilisina, ácido poliglutâmico, ácido poliaspártico, em particular os de conformação em L, proteínas farmacologicamente inativas, tais como albumina, gelatina, um ácido graxo, olissacarídeo, um aminoácido lipídico e dextrano. A porção de polímero pode ser de cadeia linear ou ramificada e pode ter um peso molecular de 500 a 40000 Da, 5000 a 10000 Da, 10000 a 5000 Da. O composto pode ser qualquer composto de penetração celular adequado, tal como peptídeo tat, penetratina, pep-1. O composto pode ser uma molécula de anticorpo. O composto pode ser uma porção lipofílica ou uma porção polimérica.

[00285] Os substituintes lipofílicos e substituintes poliméricos são

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68/146 conhecidos na técnica. O substitute lipofílico inclui um grupo acil, um grupo suifonil, um átomo de N, um átomo de O ou um átomo de S que forma parte do éster, suifonil éster, tioéster, amida ou sulfonamida. A porção lipofílica pode incluir uma cadeia de hidrocarbonetos tendo 4 a 30 átomos de C, preferencialmente entre 8 e 12 átomos de C. Pode ser linear ou ramificada, saturada ou não saturada. A cadeia de hidrocarbonetos pode ainda ser substituída. Pode ser cicloalcano ou heterocicloalcano. O peptídeo pode ser modificado no N-terminal, Cterminal ou ambos. O polímero ou composto é preferencialmente ligado a um grupo amino, carboxil ou tio e pode ser ligado por N-terminais ou C-terminais de cadeias laterais de qualquer resíduo de aminoácido. O polímero ou composto pode ser conjugado com a cadeia lateral de qualquer resíduo adequado.

[00286] O polímero ou composto pode ser conjugado através de um espaçador. O espaçador pode ser um aminoácido natural ou não natural, ácido succínico, lisil, glutamil, asparagil, glicil, beta-alanil, gamaamino butanoil.

[00287] O polímero ou composto pode ser conjugado através de um éster, um suifonil éster, um tioéster, uma amida, um carbamato, uma ureía, uma sulfonamida.

[00288] Um versado na técnica está ciente de meios adequados para preparar o conjugado descrito.

[00289] Os peptídeos podem ser quimícamente modificados por conjugação covalente a um polímero para aumentar sua meia-vida circulante, por exemplo. Polímeros exempiificativos e métodos para anexar tais polímeros a peptídeos são ilustrados, por exemplo, na Pat. US N^os 4.766.106; 4.179.337; 4.495.285; e 4.609.546. Polímeros ilustrativos adicionais incluem porções de polois polioxietilados e polietileno glicol (PEG).

[00290] Os peptídeos da invenção podem ser submetidos a uma ou

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69/146 mais modificações para manipular estabilidade de armazenamento, farmacocinética e/ou qualquer aspecto da bioatividade do peptídeo, tal como, por exemplo, potência, seletividade e interação medicamentosa. A modificação química à qual os peptídeos podem ser submetidos inclui, sem limitação, a conjugação a um peptídeo de um ou mais de polietileno glicol (PEG), monometóxi-polietileno glicol, dextrano, poli-(N~vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polipropileno glicol, poliois polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool polivinílico, ácidos colomínicos ou outros polímeros à base de carboidrato, polímeros de aminoácidos e derivados de biotina. A conjugação de proteínas PEG em resíduos Cys é descrita, por exemplo, em Goodson, R. J. & Katre, N. V. (1990) Bio/Technology 8, 343 e Kogan, T. P. (1992) Synthetic Comm. 22, 2417.

[00291] Os peptídeos modificados também podem incluir sequências, em que um ou mais resíduos são modificados (isto é, por fosforilaçâo, sulfação, acilação, amidação, PEGuilação etc.), e mutantes compreendendo um ou mais resíduos modificados em relação a uma sequência parental. Sequências de aminoácidos também podem ser modificadas com um marcador capaz de fornecer um sinal detectável, direta ou indiretamente, incluindo, mas não limitado a, marcadores radioisótopos, fluorescentes e enzimáticos. Os marcadores fluorescentes incluem, por exemplo, Cy3, Cy5, Alexa, BODIPY, fluoresceína (por exemplo, FluorX, DTAF e FITC), rodamina (por exemplo, TRITC), auramina, Texas Red, AMCA blue e Lucifer Yellow. Os marcadores isótopos preferidos incluem ³H, ¹⁴C, ³²P, ³⁵S, ³⁶CI, ⁵¹Cr, ⁵⁷Co, ⁵⁸Co, ⁵⁹Fe, ⁹⁰Y, ¹²⁵l, ¹³¹l e ²⁸⁶Re. Os marcadores enzimáticos preferidos incluem peroxidase, β-glucuronidase, β-D-glucosidase, β-D'galactosidase, urease, glicose oxidase mais peroxidase e fosfatase alcalina (ver, por exemplo, Patentes US N^os 3,654,090; 3,850,752 e

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4,016,043). As enzimas podem ser conjugadas por reação com moléculas de ligação, tais como carbodiimidas, diisocianatos, glutaraldeído e semelhantes. Os marcadores enzimáticos podem ser detectados visualmente ou medidos por técnicas calorimétricas, espectrofotométricas, fluorospectrofotométricas, amperométricas ou gasométricas. Outros sistemas de marcação, tais como avidina/biotina, Amplificação de Sinal de Tiramlda (TSA™), são conhecidos na técnica e estão comercialmente disponíveis (ver, por exemplo, ABC kit, Vector Laboratories, Inc., Burlingame, Calif; NEN® Life Science Products, Inc., Boston, Mass.).

[00292] Em uma modalidade, o peptídeo, variante e/ou composição é/são modificado(s) para aumentar a capacidade de desempenho da droga. Em uma modalidade, o peptídeo, variante e/ou composição é/são modificado(s) para aumentar a estabilidade, permeabilidade, manter a potência, evitar toxicidade e/ou para aumentar a meia-vida. A modificação pode ser como descrita acima. Por exemplo, a modificação pode ser para proteger o N e C-terminal, pode ser um modificado aminoácido, ciclização, substituição de um aminoácido e/ou conjugação a macromoléculas ou polímeros grandes ou proteínas plasmáticas de vida longa. As estratégias para prolongar a meia-vida podem ser descritas por Strohl, et al. (BioDrugs, 2015), Schlapschy, et al. (Protein Eng Des Sei. 2013), Podust, VN, et al. (Protein Eng Des Sei. 2013), Zhang, L et al. (Curr Med Chem. 2012), Gaberc-Porekar, V, et al. (Curr Opin Drug Discov Devei. 2008). Exemplos incluem a utilização de PEGuilação, lipidação (ligação covalente de ácidos graxos às cadeias laterais de peptídeos), fusão a domínios Fc e albumina de soro ser humano, fusão com um polímero de aminoácido hidrofílico, por exemplo, XTEN ou PAS e/ou fusão com proteínas de extensão de meiavida.

[00293] Os peptídeos ou proteínas podem compreender sítios frágeis

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71/146 em sua sequência que são propensos a sofrer quebra proteolítica quando em um ambiente enriquecido proteolítico, por exemplo, no sangue ou no trato gastrintestinal. Em uma modalidade, o peptideo, variante e/ou composição compreende uma modificação de um ou mais sítios mais fracos, tais como o peptideo, variante e/ou composição que não sofre degradação/clivagem proteolítica ou sofre uma quantidade diminuída de degradação/clivagem proteolítica em comparação com um peptideo ou proteína não modificada. Dessa forma, o peptideo pode ser modificado para aumentar a resistência do peptideo modificado à degradação proteolítica às proteases gastrointestinais de mamíferos. Modificações adequadas são descritas em Diao et al. (Clinicai pharmacokinetics 52.10 (2013): 855-868).

[00294] Modificação de peptídeos para prolongar a meia-vida in vivo do peptideo é descrita na literatura, por exemplo: Strategies to improve plasma half life time of peptide and protein drugs. Werle M, BernkopSchnürch A. Amino Acids. 2006 Jun;30(4):351-67.

[00295] Devido às vantagens óbvias de drogas de peptídeos e proteínas de ação prolongada, as estratégias para prolongar o tempo de meia-vida plasmática de tais compostos são altamente requeridas. Tempos curtos de meia-vida plasmática são comumente devidos à eliminação renal rápida, bem como à degradação enzimática que ocorre durante a circulação sistêmica. Modificações do peptídeo/proteína podem levar a tempos prolongados de meia-vida plasmática. Ao encurtar a quantidade total de aminoácido de somatostatina e substituir os aminoácidos L: -análogos por D: -aminoácidos, o tempo de meia-vida plasmática do octreótido derivado foi de 1,5 horas em comparação com apenas alguns minutos de somatostatina. Um conjugado de PEG (2,40 K) de INF-aifa-2b apresentou um tempo de meia-vida plasmática prolongado 330 vezes em comparação com a proteína nativa. O objetivo dessa revisão foi fornecer uma visão geral das estratégias possíveis

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72/146 para prolongar o tempo de meía-vída plasmátíca, tal como a modificação de N- e C-terminal ou PEGuilação, bem como métodos para avaliar a eficácia das modificações de droga. Além disso, dados fundamentais sobre as enzimas proteolíticas mais importantes do sangue humano, fígado e rim, bem como sua especificidade de divagem e seus inibidores, são fornecidos para prever a divagem enzimática de drogas de peptídeos e proteínas durante a circulação sistêmica.

[00296] Strategic Approaches to Optimizing Peptide ADME Properties. Li Di AAPS J. 2015 Jan; 17(1): 134-143.

Estratégias para Estabilizar os Peptídeos de Proteólise [00297] Muitas abordagens estão disponíveis para melhorar a estabilidade de peptídeos através da modificação da estrutura. Algumas abordagens não apenas melhoram a estabilidade, mas também melhoram outras propriedades ADME, por exemplo, a ciclização pode aumentar a estabilidade e permeabilidade; a conjugação com macromoléculas pode melhorar a estabilidade e reduzir a eliminação renal. É importante manter a potência e evitar a toxicidade enquanto melhora a estabilidade e as propriedades ADME de peptídeos.

Proteção N- e C-terminal [00298] Um número de enzimas proteolíticas no sangue/plasma, fígado ou rim são exopeptidases, aminopeptidases e carboxipeptidases e elas quebram sequências de peptídeos dos N- e C-terminais. A modificação dos N- e/ou C-terminais pode frequentemente melhorar a estabilidade do peptídeo. Muitos exemplos relataram que N~acetilação e C-amidação aumentam a resistência à proteólise.

Substituição de L-aminoácidos por D-aminoácidos [00299] A substituição de L-amínoácídos naturais por D-amínoácídos não naturais diminui o reconhecimento do substrato e a afinidade de ligação das enzimas proteolíticas e aumenta a estabilidade. Um exemplo é a vasopressina, que contém um L-Arg e tem uma meia-vida

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73/146 de 10-35 min em seres humanos. O análogo D-Arg, desmopressina, tern uma meia-vida de 3,7 h em voluntários humanos saudáveis. No estudo de um inibidor de peptídeo bicíclico do ativador de plasminogênio tipo uroquinase protease relacionado ao câncer (uPA), a substituição de uma glicina específica por uma D-serina não apenas melhora a potência em 1,8 vezes, mas também aumenta a estabilidade em 4 vezes no plasma de rato.

Modificação de aminoácidos [00300] A modificação de aminoácidos naturais pode melhorar a estabilidade dos peptídeos pela introdução do impedimento esférico ou pela quebra do reconhecimento da enzima. Por exemplo, o hormônio liberador de gonadotrofina tem uma meia-vida muito curta (minutos), enquanto a buserelina, na qual um Gly é substituído por um t-butil-DSer e outro Gly é substituído por etilamida, tem uma meia-vida muito mais longa em seres humanos.

Ciclização [00301] A ciclização introduz restrição de conformação, reduz a flexibilidade de peptídeos e aumenta a estabilidade e permeabilidade. Dependendo dos grupos funcionais, os peptídeos podem ser ciclizados da cabeça para a cauda, da cabeça/cauda para a cadeia lateral ou da cadeia lateral para a cadeia lateral. A ciclização é comumente realizada através de lactamização, lactonização e pontes à base de sulfeto. As pontes dissulfeto criam restrições conformacionais e flexíveis que podem melhorar a potência, seletividade e estabilidade. Um número de peptídeos ricos em ligação dissulfeto estão no mercado ou em desenvolvimento pré-clínico ou clínico, por exemplo, linaclotídeo, lepirudina e ziconotida.

Conjugação a Macromoléculas [00302] A conjugação a macromoléculas (por exemplo, polietileno glicol (PEG), albumina) é uma estratégia eficaz para melhorar a

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74/146 estabilidade dos peptídeos e reduzir a eliminação renal.

Eliminação Renal [00303] Muitos peptídeos apresentam atividade farmacológica in vitro promissora, mas falham em demonstrar a eficácia in vivo devido à meia-vida in vivo muito curta (minutos). A eliminação rápida e a curta meia-vida dos peptídeos dificultam seu desenvolvimento em drogas de sucesso. As principais causas de rápida eliminação de peptídeos da circulação sistêmica são a proteólise enzimática e/ou a eliminação renal. Os glomérulos têm um tamanho de poro de ~8 nm, e os peptídeos hidrofílicos com PM <2-25 kDa são suscetíveis à fiitração rápida através dos glomérulos do rim. Como os peptídeos não são facilmente reabsorvidos através do túbulo renal, eles frequentemente têm alta eliminação renal e meia-vida curta. Outras pequenas rotas de eliminação de peptídeos são a endocitose e a degradação por proteassoma e o fígado. A comparação entre eliminação sistêmica e renal em modelos animais fornece informações úteis sobre se a eliminação renal é provável ser uma via de eliminação principal.

[00304] Para pacientes com insuficiência renal, o ajuste da dose pode ser necessário para as drogas de peptídeos para evitar o acúmulo e a exposição mais alta à droga, pois dosagens inadequadas em pacientes com disfunção renal podem causar toxicidade ou terapia ineficaz. Diversas estratégias foram desenvolvidas para reduzir a eliminação renal de peptídeos e prolongar a meia-vida. Essas serão revistas a seguir.

Aumento da ligação de proteínas plasmáticas [00305] A eliminação renal de peptídeos é reduzida quando estão ligados a proteínas de membrana ou proteínas séricas. Um exemplo é o octreotídeo de droga de peptídeos cíclico, um tratamento para tumores endócrinos, que tem cerca de 100 min de meia-vida em seres humanos devido à ligação a lipoproteínas (fração não ligada a 0,65)

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Ligação Covalente a Pequenas Moléculas de Ligação à Albumina [00306] A ligação covalente de moléculas pequenas de ligação à albumina a peptídeos pode reduzir a filtração glomerular, melhorar a estabilidade proteolítica e prolongar a meia-vida ao interagir indiretamente com a albumina através das pequenas moléculas altamente ligadas.

Conjugação a Polímeros Grandes [00307] A conjugação de peptídeos a grandes polímeros sintéticos ou naturais pode aumentar seu peso molecular e volume hidrodinâmico, reduzindo, dessa forma, sua eliminação renal. Os polímeros comuns usados para a conjugação de peptídeos são PEG, ácido polissiálico (PSA) e hidroxletil amido (HES).

Fusão a Proteínas Plasmáticas de Vida Longa [00308] As proteínas plasmáticas, tais como os fragmentos de albumina e imunoglobulina (IgG), têm meias-vidas longas de 19-21 dias em seres humanos. Devido ao alto PM (67-150 kDa), essas proteínas têm baixa eliminação renal e sua ligação ao receptor Fc neonatal (FcRn) reduz a eliminação através de pinocitose pelo epitélio vascular. A ligação covalente de peptídeos à albumina ou fragmentos de IgG pode reduzir a eliminação renal e prolongar a meia-vida.

[00309] Fusion Proteins for Half-Life Extension of Biologies as a Strategy to Make Biobetters William R. Strohl BioDrugs. 2015; 29(4): 215-239.

[00310] Schlapschy, M, Binder, U, Borger, C et al. PASYIation: a biological alternative to PEGylation for extending the plasma half-life of pharmaceutically active proteins. Protein Eng Des Sei. 2013;26(8):489501.

[00311] Podust, VN, Sim, BC, Kothari, D et al. Extension of in vivo half-life of biologically active peptides via chemical conjugation to XTEN protein polymer. Protein Eng Des Sei. 2013;26(11):743-53.

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76/146 [00312] Zhang, L, Bulaj, G. Converting Peptides into Drug Leads by Lipidation. Curr Med Chem. 2012; 19(11):1602-18.

[00313] Gaberc-Porekar, V, Zore, I, Podobnik, B et al. Obstacles and pitfalls in the PEGylation of therapeutic proteins. Curr Opin Drug Discov Devel. 2008; 11(2):242-50.

[00314] By Dr Ronald V. Swanson - Long live peptides evolution of peptide half-life extension technologies and emerging hybrid approaches. From Drug Discovery World on line. Spring 2014 PEGuilação [00315] A ligação de cadeias longas do polímero hidrofilico polietileno glicol a moléculas de interesse, PEGuilação, foi originalmente concebida como uma modificação para prevenir o reconhecimento de proteínas estranhas pelo sistema imune e, desse modo, possibilitar sua utilidade como terapêutica. Uma vez formados, os anticorpos contra drogas não modificadas podem neutralizar rapidamente as drogas de proteínas claras. Inesperadamente, a PEGuilação melhorou a farmacocinética das proteínas mesmo na ausência de anticorpos antidroga 1. Simplesmente tornando as moléculas de droga maiores, a PEGuilação levou a droga a ser filtrada mais lentamente pelos rins. A observação empírica de que o aumento do tamanho ou raio hidrodinâmico levou à redução da eliminação renal e aumentou a meiavida, tornou-se então a razão dominante para a PEGuilação de drogas de proteínas e peptídeos. A PEGuilação pode ter uma variedade de efeitos sobre a molécula incluindo proteínas ou peptídeos mais solúveis em água e protegendo-os da degradação por enzimas proteolíticas. A PEGuilação também pode impactar a ligação de proteínas terapêuticas aos seus receptores celulares cognatos, geralmente reduzindo a afinidade. Alterações no tamanho, estrutura e modo de ligação de polímeros PEG podem afetar a atividade biológica da droga ligada.

[00316] Os métodos de PEGuilação de primeira geração foram

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77/146 depositados com desafios. No entanto, a química de PEGuilação é bastante simples. O processo envolve a ligação covalente de cadeias de polietileno glicol a cadeias laterais reativas de uma proteína ou peptídeo. Por exemplo, o PEG é facilmente ligado aos grupos -amino de Usina na superfície de proteínas ou peptídeos 2. A reação é dependente do pH. A um pH elevado (8,0 ou superior), os grupos amino da cadeia lateral da lisina são ligados covalentemente ao PEG através de N-hidróxi succinimidas. Esse método tipicamente resulta em uma família de produtos contendo números diferentes de cadeias de PEG ligadas em diferentes sítios em uma proteína, em vez de um único produto discreto 3. Os primeiros fármacos PEGuilados aprovados foram Pegademase bovina (adenosina deamidase bovina PEGuilada) como terapia de substituição enzimática para imunodeficiência combinada severa e Pegaspargase (asparaginase PEGuilada) para tratamento de leucemia linfoblástica aguda 1. Essas drogas eram misturas complexas de várias espécies PEGuiladas, mas com propriedades melhoradas para terapia sobre enzimas nativas, incluindo aumento da meia-vida sérica e diminuição da imunogenicidade das proteínas. Devido à polidispersidade inerente do PEG, a qualidade e a reprodutibilidade lotea-lote eram difíceis. Apesar dessa limitação, dois interferons PEGuilados, (Peginterferon alfa~2b e Peginterferon alfa~2a) que são populações heterogêneas de vários Isômeros posicionais monoPEGuilados, foram aprovados pelo FDA para o tratamento de hepatite C. Essas drogas foram introduzidas no mercado em 2001 e 2002, respectivamente.

[00317] Uma variedade de melhorias e variações foram feitas à tecnologia de PEGuilação fundamental. Os processos de PEGuilação de segunda geração introduziram o uso de estruturas ramificadas, bem como químicas alternativas para a ligação de PEG. Em particular, os PEGs com grupos reativos de cisteína, tais como a maleimida ou

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78/146 iodoacetamida, permitem o direcionamento da PEGuilação a um único resíduo dentro de um peptídeo ou proteína reduzindo a heterogeneidade do produto final, mas não eliminando-o devido à polidispersidade do próprio PEG.

[00318] Embora o raciocínio original para a PEGuilação tenha sido reduzir a imunogenicidade; contudo, existem poucos exemplos de proteínas PEGuiladas imunogênicas. Um exemplo é a urato oxidase PEGuilada, uma enzima que diminui o nível de urato no plasma em pacientes com gota. Em ensaios clínicos, uma porcentagem relativamente alta de pacientes com gota não respondeu à terapia e desenvolveu anticorpos específicos para o PEG, mas não para a proteína da uricase 2. Os lipossomas PEGuilados, também geralmente considerados nâo imunogênicos, foram considerados imunogênicos em alguns estudos. Os lipossomas PEGuilados desencadeam uma resposta forte à imunoglobulina M (IgM) anti-PEG. Além disso, várias injeções de PEG-giucuronidase apresentaram desencadear a geração de anticorpos IgM anti-PEG específicos, acelerando, dessa forma, a eliminação de proteínas PEG-modificadas do corpo.

[00319] Uma desvantagem potencial principal do uso do PEG como modificador é que ele não é biodegradável. O Food and Drug Administration (FDA) dos EUA aprovou o PEG para uso como um veículo em fármacos, incluindo formulações injetáveis, tópicas, retais e nasais. O PEG mostra pouca toxicidade e é eliminado do corpo intacto pelos rins (para PEGs <30 kDa) ou nas fezes (para PEGs> 20 kDa) 1. A administração repetida de algumas proteínas PEGuiladas a animais resultou em observações de vacuolização celular tubular renal. Recentemente, a vacuolização de células epiteliais do plexo coroide também foram observadas em estudos de toxicidade com proteínas conjugadas com pEGs maiores (> 40 kDa). As células epiteliais do plexo coroide produzem fluido cérebro-espinhal e formam a barreira CSF do

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79/146 sangue. As consequências negativas a longo prazo da vacuolização celular nâo são daras, mas representam uma consequência indesejável para algumas terapias potenciais. Uma possível alternativa seria a substituição de um polímero biodegradável no lugar de PEG. Polímeros, tais como o hidroxietil amido (HES), são uma alternativa possível. HES é não-tóxico e biodegradável e usado como um expansor de sangue. Um processo de HESilação funcionaria de forma semelhante à PEGuilação na redução da eliminação renal através do aumento de um raio hidrodinâmico de um peptídeo, mas pode conferir uma menor propensão à acumulação devido à biodegradabilidade. No entanto, o HES e outras alternativas de PEG de polímero biodegradável propostas são, como o PEG, polidisperso, dificultando a caracterização do produto final e metabolites. Uma solução emergente que mitiga ambas as preocupações é usar polipeptídeos definidos como o componente de polímero; essa abordagem será discutida mais adiante no relatório descritivo.

Lipidação [00320] Um segundo método de modificação química principal para aumentar a meia-vida do peptídeo é a lipidação, que envolve a ligação covalente de ácidos graxos às cadeias laterais de peptídeo 4. Originalmente concebido de e desenvolvido como um método para estender a meia-vida de insulina, a lipidação compartilha o mesmo mecanismo básico de extensão de meia-vida que a PEGuilação, ou seja, aumenta o raio hidrodinâmico para reduzir a filtração renal. No entanto, a própria porção lipídica é relativamente pequena e o efeito é mediado indiretamente através da ligação não covalente da porção lipídica à albumina circulante. Uma grande (67 KDa) e altamente abundante proteína no soro ser humano (35-50 g/L), a albumina funciona naturalmente para transportar moléculas, incluindo lipídeos, por todo o corpo. A ligação às proteínas plasmáticas também pode

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80/146 proteger o peptídeo de ataques por peptidases através de impedimento estérico, mais uma vez semelhante ao que é visto com PEGuilação. Uma consequência da lipidação é que ela reduz a solubilidade em água do peptídeo, mas a engenharia do ligante entre o peptídeo e o ácido graxo pode modulá-lo, por exemplo, pelo uso de glutamato ou mini PEGs dentro do ligante. Engenharia ligante e variação da porção lipídica podem afetar a autoagregação que pode contribuir para a meia-vida aumentada pela desaceleração da biodistríbuição, independente de albumina 5.

[00321 ] Após o trabalho pioneiro com insulina 6, a lipidação de uma variedade de peptídeos tem sido explorada, particularmente, peptídeos dentro do espaço do diabetes incluindo análogos peptídeo-1 semelhante ao glucagon humano (GLP-1), polipeptídeo insulinotrópico dependente de glicose e coagonistas receptores de GLP-1 R/glucagon, entre outros. Duas drogas de lipídeos lipidadas são atualmente aprovadas pelo FDA para uso em seres humanos. Esses são ambos antidiabéticos de ação prolongada, a liraglutida análoga ao GLP-1 e insulina detemir.

[00322] Uma diferença potencialmente farmacologicamente relevante entre a PEGuilação e a lipidação é que o peptídeo terapeuticamente ativo é covalentemente ligado ao PEG muito maior, enquanto o conjugado de acil-peptídeo graxo menor é associado não covalentemente à albumina maior, formas ligadas e não ligadas existentes em equilíbrio. Isso pode resultar em diferenças na biodistríbuição que podem resultar em farmacologia diferente, já que o acesso a receptores localizados em diferentes tecidos pode desencadear efeitos diferenciais. Em alguns casos, a biodistríbuição mais restrita pode ser desejável, enquanto em outros, a maior penetração do tecido pode ser importante. Uma interessante variação da abordagem do PEG, que trata desse problema, foi desenvolvida por

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Santi et al·, na qual conjugados de PEG liberáveis com taxas de divagem previsíveis são utilizados 7.

[00323] Tanto a PEGuilação quanto a lipidação conferem proteção contra proteases e peptidases protegendo-as através de impedimento estérico e prolongam a meia-vida circulante através do aumento do raio hidrodinâmico, diretamente ou indiretamente. Ambos os métodos utilizam conjugação química e são flexíveis por serem agnósticos aos meios usados para gerar o peptídeo que estão modificando, seja biologicamente ou sinteticamente produzido. Uma vantagem do uso de peptídeos sintéticos é que eles podem incorporar aminoácidos nãonaturais projetados para resolver várias questões específicas incluindo a instabilidade devido a conhecidos passivos de divagem proteolítica. Eles também podem ser mais flexíveis em termos da escolha do sítio de ligação que é crítico se a atividade ou potência é altamente dependente dos terminais livres de um resíduo modificado como uma amida C-terminaí.

Fusões genéticas clássicas: Fc e HSA [00324] As fusões genéticas clássicas a proteínas séricas de vida longa oferecem um método alternativo de extensão de meia-vida distinto da conjugação química a PEG ou lipídeos. Duas proteínas principais têm sido tradicionalmente usadas como parceiros de fusão: domínios Fc de anticorpo e albumina do soro ser humano (HAS) (Figura 2). As fusões Fc envoivem a fusão de exodomínios de peptídeos, proteínas ou receptores à porção Fc de um anticorpo. Ambas as fusões Fc e albumina alcançam meias-vidas prolongadas não apenas aumentando o tamanho da droga de peptídeos, mas ambas também tiram proveito do mecanismo de reciclagem natural do corpo: o receptor Fc neonatal, FcRn. A ligação dependente do pH dessas proteínas ao FcRn previne a degradação da proteína de fusão no endossoma. As fusões com base nessas proteínas podem ter meias-vidas na faixa de 3-16 dias, muito

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82/146 mais longas do que os peptídeos PEGuilados ou lipidados típicos. A fusão ao anticorpo Fc pode melhorar a solubilidade e estabilidade do peptídeo ou droga de proteínas. Um exemplo de uma fusão Fc de peptídeo é a duiaglutida, um agonista do receptor de GLP-1 atualmente em ensaios clínicos de estágio final. A albumina do soro ser humano, a mesma proteína explorada pelos peptídeos acilados graxos, é o outro parceiro de fusão popular. Albigiutida é um agonista do receptor de GLP-1 com base nessa plataforma. Uma diferença principal entre Fc e albumina é a natureza dimérica de Fc versus a estrutura monomérica de HAS que leva à apresentação de um peptídeo fundido como um dímero ou um monômero dependendo da escolha do parceiro de fusão. A natureza dimérica de uma fusão Fc de peptídeo pode produzir um efeito de avidez se os receptores alvo estiverem espaçados próximos o suficiente ou se eles mesmos forem dímeros. Isso pode ser desejável ou não dependendo do alvo.

Fusões de polipeptídeo projetadas: XTEN e PAS [00325] Uma variação intrigante do conceito de fusão recombinante tem sido o desenvolvimento de sequências de baixa complexidade projetadas como parceiros de fusão, polímeros de aminoácidos hidrofílicos basicamente não estruturados que são análogos funcionais de PEG (Figura 1). A biodegradabilidade inerente da plataforma de polipeptídeo a torna atraente como uma alternativa potencialmente mais benigna ao PEG. Outra vantagem é a estrutura molecular precisa da molécula recombinante em contraste com a polidispersidade de PEG. Ao contrário das fusões de peptídeo HSA e Fc, em que a dobra tridimensional do parceiro de fusão precisa ser mantida, as fusões recombinantes para parceiros não estruturados podem, em muitos casos, ser submetidas a temperaturas mais altas ou a condições difíceis, tais como a purificação por HPLC.

[00326] O mais avançado dessa classe de polipeptídeos é

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83/146 denominado XTEN (Amunix) e tem 864 aminoácidos de comprimento e é composto por seis aminoácidos (A, E, G, P, S e T) (Figura 1) 8. Ativado pela natureza biodegradável do polímero, esse é muito maior que os PEGs de 40 KDa tipicamente usados e confere uma extensão de meiavida concomitantemente maior. A fusão de XTEN em drogas de peptídeos resulta em uma extensão de meia-vida de 60 a 130 vezes sobre as moléculas nativas. Dois produtos XTENilados totalmente recombinantemente produzidos entraram na clínica, ou seja, VRS-859 (Exenatide-XTEN) e VRS-317 (hormônio do crescimento ser humanoXTEN). Em estudos de Fase 1a, o VRS-859 foi verificado ser bem tolerado e eficaz em pacientes com Diabetes tipo 2. O VRS-317 relatou propriedades farmacocinéticas e farmacodinâmicas superiores comparadas com os produtos de rhGH previamente estudados e ter o potencial de dosagem uma vez por mês.

[00327] Um segundo polímero com base em considerações conceituais semelhantes é o PAS (XL-Protein GmbH) 9. Um polímero espiral aleatório composto por um conjunto ainda mais restrito de apenas três pequenos aminoácidos não carregados, prolina, alanina e serina (Figura 1). A possibilidade de diferenças nas propriedades biofísicas de PAS e no XTEN altamente carregado negativamente contribuírem para diferenças na biodistribuição e/ou atividade in vivo ainda é desconhecida, mas será revelado como esses polipeptídeos são incorporados em mais terapêuticas e será caracterizado o comportamento das fusões.

[00328] Todas as fusões de proteína de peptídeo, se o parceiro for Fc, HSA, XTEN ou PAS, são geneticamente codificadas e consequentemente sofrem de restrições similares. Uma limitação é que apenas aminoácidos de ocorrência natural são incorporados, ao contrário dos métodos empregando conjugação química que permitem o uso de peptídeos sintéticos incorporando aminoácidos não naturais.

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Embora os métodos para superar isso através da expansão do código genético estejam sendo desenvolvidos por empresas, tais como a Ambrx ou Sutro, eles ainda não são amplamente usados. Uma segunda limitação é que o N- ou C-terminal do peptideo precisa ser fundido ao parceiro. Muitas vezes, os terminais do peptideo estão envolvidos nas interações do receptor e a fusão genética em um ou ambos terminais pode prejudicar bastante a atividade. Como o sítio de PEG ou a conjugação lipídica pode estar em qualquer lugar no peptideo, pode ser otimizado para maximizar a atividade biológica da terapêutica resultante.

Métodos híbridos de fusão de peptídeos sintéticos com proteínas de extensão de meia-vida [00329] Embora as fusões genéticas tenham historicamente oferecido o potencial para uma maior extensão de meia-vida, elas não possuem as vantagens fornecidas pelos métodos que utilizam conjugação química, PEGuilação e lipidação, em termos de flexibilidade de sítios de ligação e incorporação de aminoácidos não naturais ou modificações em estrutura principal do peptideo. Um dos primeiros esforços para unir as vantagens das fusões genéticas à conjugação química para a extensão de meia-vida foi realizado por pesquisadores do Scripps Research Institute em La Jolla com a tecnologia que mais tarde formou a base para a empresa de biotecnologia CovXIO, 11. Usando um anticorpo de aldolase catalítico, esses pesquisadores desenvolveram uma plataforma através da qual a lisina de sítio ativo do anticorpo forma uma ligação enamina covalente reversível com uma beta-dicetona incorporada em um peptideo ou molécula pequena. O complexo resultante é denominado CovXBody™. Essa abordagem combina as qualidades funcionais de uma droga de peptídeos ou pequena molécula com a longa meia-vida sérica de um anticorpo, não através de uma fusão genética, mas através de uma ligação química.

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Após a demonstração inicial da tecnologia, os pesquisadores expandiram o uso do protótipo CovX-Body ™ que é com base em um farmacóforo peptidomimético direcionado à integrina. Pelo menos três moléculas com base nessa arquitetura entraram em desenvolvimento clínico: CVX-096, um agonista de Glp-IR; CVX--Q60, um peptídeo de ligação de Angiopoietina~2; e CVX-045, uma trombospondina mimética. [00330] Recentemente, o polipeptideo XTEN tem também sido usado em um modo de conjugação química 12 tomando-o ainda mais diretamente análogo ao PEG. O primeiro exemplo de um peptídeo XTENilado que foi criado usando esse método é GLP2-2G-XTEN em que o peptídeo é conjugado quimicamente ao polímero de proteína XTEN usando a química maleimida-tiol. As moléculas de GLP22GXTEN quimicamente conjugadas apresentaram atividade in vitro comparável, estabilidade de plasma in vitro e farmacocinética em camundongos comparáveis a GLP2-2G-XTEN recombinantemente fundido.

[00331] O número e espaçamento de grupos reativos, tais como as cadeias laterais de iisina ou cisteína, nas sequências completamente projetadas de polipeptídeos XTEN ou PAS, podem ser controlados com precisão através de alterações dirigidas ao sítio, devido aos conjuntos de aminoácidos restritos a partir dos quais são compostos. Isso fornece um grau adicional de flexibilidade em relação aos métodos que podem utilizar Fc ou albumina cujas sequências contêm naturalmente muitos grupos reativos e contrasta com a tecnologia CovX, que se baseia em um resíduo reativo em um sítio ativo altamente especializado. Além disso, a falta de estrutura terciária de XTEN ou PAS deve fornecer mais flexibilidade sobre as condições e químicas usadas no acoplamento e na purificação de conjugados.

[00332] Em resumo, os métodos de extensão da meia-vida do peptídeo híbrido que estão surgindo combinam as vantagens e superam

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86/146 as limitações individuais dos métodos de conjugação química e fusão genética. Esses métodos possibilitam a criação de moléculas com base em parceiros com base em polipeptídeos recombinantes que conferem meia-vida mais ionga, mas liberam as porções terapêuticas de peptídeo das limitações de serem compostas exclusivamente de L-aminoacidos naturais ou configuradas apenas como polipeptídeos unidirecionais lineares fundidos tanto no N- quanto no C-terminal, abrindo, dessa forma, a porta para uma ampla faixa de drogas com base em peptídeos de ação prolongada.

Composições Farmacêuticas [00333] Um peptídeo da invenção (incluindo peptídeos variantes e modificados) pode ser combinado com um ou mais veículos (diluentes, excipientes e semelhantes) apropriados para uma ou mais das rotas de administração pretendidas para fornecer composições que sejam farmaceuticamente aceitáveis no contexto de preparar uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um ou mais peptídeos da invenção.

[00334] Um peptídeo da invenção pode ser, por exemplo, misturado com lactose, sacarose, pós (por exemplo, pó de amido), ésteres de celulose de ácidos alcanoicos, ácido esteárico, talco, estearato de magnésio, oxido de magnésio, sais de sódio e cálcio de ácidos fosfórico e sulfúrico, acácia, gelatina, alginato de sódio, polivinilpirrolidina e/ou álcool polivinílico, e opcionalmente ainda comprimido ou encapsulado para administração convencional. Alternativamente, um peptídeo da invenção pode ser dissolvido em solução salina, água, poiietileno glicol, propileno glicol, soluções coloidais de carboximetil celulose, etanol, óleo de milho, óleo de amendoim, óleo de semente de algodão, óleo de sésamo, goma de tragacanto e/ou vários tampões. Outros veículos, adjuvantes e modos de administração são bem conhecidos nas técnicas farmacêuticas. Um veículo ou diluente pode incluir material retardador

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87/146 de tempo, tal como monoestearato de gliceril ou diestearato de gllceril sozinho ou com uma cera ou outros materiais funcionalmente similares. [00335] Os veículos farmaceuticamente aceitáveis geralmente incluem também qualquer e todos os solventes adequados, meios de dispersão, revestimentos, agentes antibacterlanos e antifúngicos, agentes retardantes de absorção e isotônicos e semelhantes que são fisiologicamente compatíveis com um análogo de insulina. Exemplos de veículos farmaceuticamente aceitáveis incluem água, solução salina, solução salina tamponada com fosfato (PBS), dextrose, glicerol, etanol e semelhantes, bem como combinações de qualquer desses. Em muitos casos, pode ser desejável incluir agentes isotônicos, por exemplo, açúcares, poliálcoois, tais como manitol, sorbitol ou cloreto de sódio em tal composição. Substâncias farmaceuticamente aceitáveis, tais como agentes umectantes ou quantidades menores de substâncias auxiliares, tais como agentes umectantes ou agentes emulslficantes, conservantes ou tampões, que desejavelmente podem aumentar o prazo de validade ou eficácia do análogo da insulina, composição ou combinação relacionada. A adequabilidade para veículos e outros componentes de composições farmacêuticas pode ser determinada com base na falta de impacto negativo significativo sobre as propriedades biológicas desejadas do análogo da insulina, composição ou combinação relacionada (por exemplo, menos de cerca de 20%, 15%, 10%, 5% ou 1% na ligação e/ou ativação de IR; ou capacidade de reduzir a glicose no sangue em um hospedeiro alvo).

[00336] As composições, composições relacionadas e combinações de acordo com a invenção podem ser apresentadas, preparadas e/ou administradas em uma variedade de formas adequadas. Tais formas incluem, por exemplo, formas de dosagem líquidas, semissólidas e sólidas, tais como soluções líquidas (por exemplo, soluções injetáveis e infusíveis), dispersões ou suspensões, emulsões, microemulsões,

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88/146 comprimidos, pílulas, pós, lipossomas, dendrímeros e outras nanopartículas (ver, por exemplo, Baek et al., Methods Enzymol. 2003; 362: 240-9; Nigavekar et al., Pharm Res. 2004 March; 21 (3): 476-83), micropartículas e supositórios. A forma ideal para qualquer peptídeo da composição associada à invenção depende do modo de administração pretendido, da natureza da composição ou combinação, da aplicação terapêutica ou outro uso pretendido. As formulações também podem incluir, por exemplo, pós, pastas, pomadas, geleias, ceras, óleos, lipídeos, vesículas contendo lipídeos (catiônicos ou aniônicos), conjugados de DNA, pastas de absorção anidra, emulsões óleo em água e água em óleo, emulsões, carbowax (polietileno glicóis de vários pesos moleculares), géis semissólidos e misturas semissólidas contendo carbowax. Quaisquer das misturas anteriores podem ser apropriadas em tratamentos e terapias de acordo com a presente invenção, desde que a ligação do peptídeo aos IRs cognatos não seja significativamente inibida pela formulação e a formulação seja fisiologicamente compatível e tolerável com a via de administração. Ver também, por exemplo, Powell et al. Compendium of excipientes for parenteral formulations PDA J Pharm Sei Technol. 52: 238-311 (1998) e as citações dele para informações adicionais relacionadas a excipientes e veículos bem conhecidos dos químicos farmacêuticos. [00337] Em um aspecto particular, um peptídeo da invenção é administrado em lipossomas. Em outro aspecto, um peptídeo da invenção é administrado em lipossomas com um ou mais agentes secundários, tais como uma ou mais drogas antidiabetes.

[00338] As composições da invenção também incluem composições compreendendo qualquer combinação adequada de um peptídeo da invenção e um sal adequado para esse fim. Qualquer sal adequado, tal como um sal de metal alcalino-terroso em qualquer forma adequada (por exemplo, um sal tampão), pode ser usado na estabilização do

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89/146 peptídeo da invenção (preferencialmente, a quantidade de sal é tal que a oxidação e/ou precipitação do peptídeo é evitada). Sais adequados incluem tipicamente cloreto de sódio, succinato de sódio, sulfato de sódio, cloreto de potássio, cloreto de magnésio, sulfato de magnésio e cloreto de cálcio. Composições compreendendo uma base e um ou mais peptídeos da invenção também são fornecidos.

[00339] Um modo típico de liberação de composições da invenção é por administração parenteral (por exemplo, administração intravenosa, subcutânea, intraperitoneal e/ou intramuscular). Em um aspecto, uma composição ou peptídeo da invenção é administrado a um paciente humano por infusão intravenosa ou injeção. Em outro aspecto, uma composição ou peptídeo da invenção é administrado por injeção intramuscular ou subcutânea. Como indicado acima, a administração intratumoral também pode ser útil em certos regimes terapêuticos.

[00340] Dessa forma, os peptídeos da invenção podem ser formulados em, por exemplo, formulações sólidas (incluindo, por exemplo, grânulos, pós, partículas de projétil ou supositórios), formas semissólidas (géis, cremes etc.) ou em formas líquidas (por exemplo, soluções, suspensão ou emulsões). Uma composição ou peptídeo da invenção pode ser aplicada em uma variedade de soluções. As soluções adequadas para uso de acordo com a invenção são tipicamente estéreis, dissolvem quantidades suficientes do peptídeo da invenção e outros componentes da composição, estáveis sob condições de fabricação e armazenamento e não são prejudiciais ao indivíduo para a aplicação proposta. Um peptídeo da invenção pode ser submetido a operações farmacêuticas convencionais, tais como esterilização e/ou pode conter adjuvantes convencionais, tais como conservantes, estabilizadores, agentes umectantes, emulsificantes, tampões etc. Uma composição também pode ser formulada como uma solução, microemulsão, dispersão, pó, macroemulsão, lipossoma ou outra

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90/146 estrutura ordenada adequada à alta concentração de droga. As propriedades de fluidez desejáveis de uma solução podem ser mantidas, por exemplo, pelo uso de um revestimento, tal como lecitina, pela manutenção do tamanho de partícula requerido no caso de dispersão e pelo uso de tensoativos. A absorção prolongada de composições injetáveis pode ser causada pela inclusão na composição de um agente que retarde a absorção, por exemplo, sais de monoestearato e gelatina. Esses e outros componentes de uma composição farmaceuticamente aceitável da invenção podem conferir propriedades vantajosas, tais como transferência, liberação, tolerância melhorada e semelhantes.

[00341] Uma composição para uso farmacêutico pode incluir vários diluentes, enchimentos, sais, tampões, detergentes (por exemplo, um detergente não iônico, tal como Tween-80), estabilizadores (por exemplo, açúcares ou aminoácidos livres de proteína), conservantes, fixadores de tecidos, solubilizantes e/ou outros materiais adequados para inclusão em uma composição para uso farmacêutico. Exemplos de componentes adequados também são descritos em, por exemplo, Berge et al., J. Pharm. Sei., 6661), 1-19 (1977): Wang and Hanson, J. Parenteral. Sei. Tecnologia: 42, S4-S6 (1988); Patentes U.S. N°s. 6,165,779 e 6,225,289; e outros documentos citados aqui. Tal composição farmacêutica também pode incluir conservantes, antioxidantes ou outros aditivos conhecidos dos versados na técnica. Veículos farmaceuticamente aceitáveis adicionais são conhecidos na técnica e descritos em, por exemplo, Urquhart et al., Lancet, 16, 367 (1980), Lieberman et aL, Pharmaceutical Dosage Forms— Disperse Systems (2nd ed., Vol. 3, 1984); Ansel et al., Pharmaceutical Dosage Forms & Drug Delivery Systems (7th ed., 2000); Martindale, The Extra Pharmacopeia (31st edition), Remington’s Pharmaceutical Sciences (16th-2th editions); The Pharmacological Basis Of Therapeutics,

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Goodman and Gilman, Eds. (9th ed., 1996); Wilson and Gisvolds’ TEXTBOOK OF MEDICINAL AND PHARMACEUTICAL CHEMISTRY, Delgado and Remers, Eds. (10th ed., 1998) e Patentes U.S. N°s. 5,708,025 e 5,994,106. Princípios de formulação de composições farmaceuticamente aceitáveis também são descritos em, por exemplo, Platt, Clin. Lab Med., 7:289-99 (1987), Aulton, Pharmaceutics: The Science of Dosage Form Design, Churchill Livingstone (New York) (1988), EXTEMPORANEOUS ORAL LIQUID DOSAGE PREPARATIONS, CSHP (1998), e Drug Dosage, J. Kans. Med. Soc, 70 (I), 30-32 (1969). Outros veículos farmaceuticamente aceitáveis particularmente adequados para a administração de peptídeo ou composições da invenção e composições relacionadas (por exemplo, composições compreendendo ácidos nucleicos codificando peptídeos da invenção ou vetores compreendendo ácido nucleico que codificando peptídeo da invenção) são descritos em, por exemplo, Pedido de Patente Internacional WO 98/32859.

[00342] Os peptídeos ou composições da invenção podem ser preparados com um veículo que protegerá o composto contra a liberação rápida, tal como uma formulação de liberação controlada, incluindo implantes, emplastros transdérmicos e sistemas de liberação microencapsulados. Polímeros biocompatíveis biodegradáveis podem ser usados, tais como etiieno vinil acetato, polianidridos, ácido poliglicólico, colágeno, poliortoésteres e ácido polilático e combinações de qualquer um deles, de modo a fornecer tal composição. Métodos para a preparação de tais composições são conhecidos. Ver, por exemplo, Sustained and Controlled Release Drug Delivery Systems, J. R. Robinson, ed., Marcel Dekker, Inc., New York, 1978.

[00343] Em outro aspecto, as composições da invenção administradas oralmente, por exemplo, com um diluente inerte ou um veículo comestível assimilável (formulações de administração oral

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92/146 específicas e métodos são também descritos separadamente em outro sítio aqui). O composto (e outros ingredientes, se desejado) pode também ser incluído em uma cápsula de gelatina dura ou mole, comprimido em comprimidos ou incorporado diretamente na dieta do indivíduo. Para administração terapêutica oral, os compostos podem ser incorporados com excipientes e usados na forma de comprimidos ingeríveis, comprimidos bucais, trociscos, cápsulas, elixires, suspensões, xaropes, pastilhas e semelhantes. Para administrar um composto da invenção por outra administração que não seja parenteral, pode ser necessário revestir o composto com, ou coadministrar o composto com, um material para prevenir a sua inativação.

[00344] A preparação de composições farmacêuticas que contêm peptídeos como ingredientes ativos é bem compreendida na técnica. Tipicamente, tais composições são preparadas como injetáveis, seja como soluções líquidas ou suspensões, no entanto, formas sólidas adequadas para solução em, ou suspensão em, líquido antes da injeção também podem ser preparadas. A preparação também pode ser emulsionada. O ingrediente terapêutico ativo é frequentemente misturado com excipientes que são farmaceuticamente (isto é, fisiologicamente) aceitáveis e compatíveis com o ingrediente ativo. Excipientes adequados são, por exemplo, água, solução salina, dextrose, glicerol, etanol ou semelhantes e suas combinações. Além disso, se desejado, a composição pode conter quantidades menores de substâncias auxiliares, tai como agentes umectantes ou emulsificantes, agentes tamponantes de pH, que aumentam a eficácia do ingrediente ativo.

[00345] Um peptídeo da invenção pode ser formulado em uma composição farmacêutica como formas de sal fisiologicamente aceitáveis neutralizadas. Sais adequados incluem os sais de adição de ácido (isto é, formados com os grupos amino livres da molécula de

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93/146 peptídeo) e que são formados com ácidos inorgânicos, tais como, por exemplo, ácidos clorídrico ou fosfórico, ou tais ácidos orgânicos como acético, oxálico, tartárico, mandélico e o semelhantes. Os sais formados a partir dos grupos carboxil livres podem também ser derivados de bases inorgânicas, tais como, por exemplo, hidróxidos de sódio, potássio, amônio, cálcio ou férricos e tais bases orgânicas como isopropilamina, trimetiiamina, 2-etiiamino etanol, histidina, procaína e semelhantes.

[00346] No caso de composições de combinação (discutido ainda aqui), um peptídeo da invenção pode ser coformulado com e/ou coadministrado com um ou mais agentes terapêuticos adicionais (por exemplo, um agente antidiabético, tal como uma insulina, um análogo de insulina, metformina ou outra biguanida antidiabética, um antagonista do receptor de glucagon, sulfonilureia, uma tiazolidinediona, um inibidor de alfa-glicosidase, uma meglitinida, um peptídeo-1 semelhante a glucagon (GLP-1), como análogo de GLP-1 etc.). Tais terapias de combinação podem requerer dosagens mais baixas do peptídeo da invenção e/ou dos agentes coadministrados, de modo a evitar possíveis toxicidades ou complicações associadas às várias monoterapias.

Aplicações Terapêuticas [00347] Como indicado acima, um peptídeo ou composição da invenção pode ser administrada individualmente ou em combinação com outros agentes farmacologicamente ativos. Será entendido que tal terapia de combinação abrange diferentes regimes terapêuticos, incluindo, sem limitação, a administração de múltiplos agentes em conjunto em uma forma de dosagem única ou em formas de dosagem individuais distintas. Se os agentes estiverem presentes em diferentes formas de dosagem, a administração pode ser simultânea ou quase simultânea ou pode seguir qualquer regime predeterminado que abranja

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94/146 a administração dos diferentes agentes.

[00348] Por exemplo, quando usado para tratar diabetes ou outras doenças ou síndromes associadas com uma resposta ou produção de insulina diminuída, hiperlipidemia, obesidade, síndromes relacionadas com o apetite e semelhantes, os peptídeos da invenção podem ser vantajosamente administrados em um regime de tratamento de combinação com um ou mais agentes, incluindo, sem limitação, insulina, análogos de insulina, derivados de insulina, peptídeo-1 ou -2 (GLP-1, GLP-2) semelhante a glucagon, derivados ou análogos de GLP-1 ou GLP -2 (tal como descrito, por exemplo, em WO 00/55119). Será entendido que um análogo de insulina, GLP-1 ou GLP-2, como usado aqui, refere-se a um peptídeo contendo uma ou mais substituições de aminoácido em relação à sequência de insulina nativa, GLP-1 ou GLP2, conforme aplicável; e derivado de insulina, GLP-1 ou GLP-2, como usado aqui, refere-se a um peptídeo nativo ou análogo de insulina, GLP1 ou GLP-2, que sofreu uma ou mais modificações químicas adicionais da sequência de aminoácidos, em particular em relação à sequência natural. Derivados e análogos de insulina são descritos, por exemplo, nas Patentes U.S. N^os 5,656,722, 5,750,497, 6,251,856 e 6,268,335. Em algumas modalidades, o agente de combinação é um de insulina humana LysB29(8-miristoil)des(B30), insulina humana LysB29(8tetradecanoil)des(B30) e B29-N8-(N-litocolil-Y-glutamil)-des(B30). Também adequados para terapia de combinação são agentes antihiperglicêmicos não peptídicos, agentes anti-hiperlipidêmicos e semelhantes, tais como os bem conhecidos na técnica.

[00349] Em uma modalidade, a invenção abrange métodos de tratamento de diabetes ou síndromes relacionadas ou condições associadas (por exemplo, redução de taxa de relacionada ao nível de glicose e/ou acidente vascular cerebral relacionados a diabetes, doença cardíaca, doença renal, cegueira e/ou perda de sensibilidade nos

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95/146 membros), compreendendo a liberação de uma quantidade eficaz de pelo menos um peptídeo da invenção (por expressão gênica, pela liberação de um peptídeo homogêneo ou tipicamente pela administração de uma composição farmaceuticamente aceitável compreendendo um ou mais peptídeos e um ou mais veículos farmaceuticamente aceitáveis como descrito acima. Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um peptídeo ou composição da invenção (tal como uma composição de combinação) na fabricação de um medicamento usado no tratamento de diabetes do tipo 1 ou tipo 2.

[00350] Um peptídeo da invenção pode geralmente ser usado no tratamento tanto do diabetes mellitus tipo 1 quanto do tipo 2, isto é, dependente de insulina (IDDM) e diabetes mellitus não dependente de insulina (NIDDM).

[00351] Em um aspecto de terapia de combinação exemplificative, a invenção fornece um método de tratamento de diabetes (por exemplo, redução de um ou mais sintomas associados com isso em um hospedeiro e/ou fornecendo a um hospedeiro uma quantidade de uma composição que tem sido demonstrada como sendo terapeuticamente eficaz em pelo menos uma proporção substancial de uma população de hospedeiros similares), compreendendo a liberação de uma primeira quantidade de um peptídeo ou composição da invenção e uma segunda quantidade de um análogo de insulina de longa ação, tal como, por exemplo, Insulina humana LysB29(S~rninstoil)des(B30), insulina humana LysB29(8~tetradecanoil) des (B30) ou insulina humana B29Nε-(Nlitocolil·γ“glutamil)“des(B30), em que a primeira e a segunda quantidade juntas são eficazes para o tratamento de síndrome. Como usado aqui, um análogo de insulina de longa ação é um que apresenta um perfil de ação prolongado em relação à insulina humana nativa, como descrito, por exemplo, na Pat. N° 6,451,970. Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de uma composição de combinação

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96/146 compreendendo uma combinação terapeuticamente eficaz de pelo menos um peptídeo ou composição da invenção e pelo menos uma insulina ou análogo da insulina na fabricação de um medicamento usado no tratamento de doença, tal como no tratamento de diabetes tipo 1 ou tipo 2. Composições similares compreendendo combinações de um ou mais peptídeos ou composições da invenção e um ou mais análogos de insulina de longa e/ou curta ação também podem ser adequados para métodos terapêuticos, tais como o tratamento de diabetes.

[00352] Em um aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de sintomas e/ou condições subjacentes associadas ao Diabetes tipo 2 em um paciente em necessidade deste (devido ao diagnóstico da doença e/ou risco substancial de desenvolvimento dela) compreendendo liberação ao paciente de uma quantidade terapeuticamente e/ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção, de modo a tratar tais sintomas e/ou condições. Em um aspecto particular, a invenção fornece um método de tratamento de um paciente com Diabetes tipo 2 e níveis elevados de insulina no sangue (hiperinsulinemia). Em tal aspecto, o paciente é obeso. Em outro aspecto, o paciente também ou aiternativamente compreende um genótipo/mutação resistente à insulina.

[00353] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de redução da pressão sanguínea em um paciente com alta pressão sanguínea associada à insulina/IR, compreendendo administração ou, de outra forma, liberação de uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção de modo a reduzir a pressão sanguínea no paciente.

[00354] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento dos sintomas e/ou condições subjacentes de Síndrome X ou um aspecto deles em um paciente (por exemplo, hiperlipidemia, hipertensão e/ou obesidade), compreendendo administração ou, de

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97/146 outra forma, liberação de uma quantidade terapeuticamente e/ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente, de modo a tratar Síndrome X ou uma condição da Síndrome

X.

[00355] Em ainda outro aspecto, a invenção fornece um método de tratamento de uma condição, distúrbio ou doença mediada por IR não diabética em um paciente, tal como uma doença neurodegenerativa associada à IR; uma doença autoimune associada à IR não diabética etc., compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente para tratar tais condições/sintomas.

[00356] Em outro aspecto, a invenção fornece um método de prevenção do ganho de peso em um paciente com necessidade disso compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente, de modo a evitar o ganho de peso associado à IR.

[00357] Em um aspecto relacionado, a invenção fornece um método de tratamento de obesidade compreendendo a administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente para tratar a obesidade (por estabilização e/ou redução do peso do paciente) ou uma condição relacionada a ela.

[00358] Em outro aspecto, a presente invenção fornece um método de tratamento de um paciente que sofre de uma condição de doença associada à, ou causada por, hiperinsulinemia, hipoglicemia, hipocalemia e/ou hipofosfataemia compreendendo a administração (ou de outra forma liberação - como é o caso completamente) de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente para tratar tais

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98/146 condições/sintomas. A presente invenção ainda se refere ao método para tratamento de doenças ou distúrbios relacionados à glicemia, compreendendo a administração de derivados de insulina ou conjugados de insulina. Doenças ou distúrbios relacionados à glicemia incluem Diabetes do tipo I e II e diabetes gestacional. Também, fibrose cística, sindrome do ovário poHcístico, pancreatite e outras doenças relacionadas ao pâncreas que podem também ser tratadas peia administração de derivados de insulina ou conjugados de insulina da presente invenção. A insulina também é conhecida como um fator de crescimento e, portanto, os derivados de insulina ou conjugados de insulina da presente invenção podem ser úteis na administração tópica para cicatrização de ferimentos e outras indicações relacionadas.

[00359] Em um outro aspecto, a invenção fornece o uso de um peptídeo ou composição da invenção (tal como uma composição de combinação) na fabricação de um medicamento usado no tratamento de qualquer das condições precedentes.

[00360] Em um aspecto geral, a invenção fornece um método de modulação dos níveis de glicose em um indivíduo compreendendo a administração de uma quantidade fisioiogicamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção, de modo a modular, de forma detectável, os níveis de glicose no paciente. Em outro aspecto, a invenção fornece o uso de um peptídeo ou composição da invenção (tal como uma composição de combinação) na fabricação de um medicamento usado na redução dos níveis de glicose no sangue.

[00361] Em outro aspecto geral, a invenção fornece um método de mediação da atividade da IR, compreendendo administração de uma quantidade fisioiogicamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção, de tal modo que células apresentando IR ou IR responsiva estejam ligadas em uma quantidade e sob condições suficientes para induzir, promover, melhorar e/ou modular de outra forma uma atividade

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99/146 ou resposta mediada por IR. Por exemplo, um peptídeo da invenção pode ser administrado a um hospedeiro para se ligar ao Sítio 1 ou Sítio 2, de modo a dirigiras moléculas de insulina ou análogo de insulina para outro sítio de modo a modificar o perfil de um tratamento de insulina ou análogo de insulina.

[00362] Em ainda uma faceta adicional, a invenção fornece um método de modulação dos níveis de produção de oxido nítrico em um paciente, tal como nas células endoteliais de um paciente; mediação de RAS, RAF, MEK e/ou vias de proteína quinase ativada por mitogênio (MAP); modulação do crescimento de tecido vascular e/ou células musculares lisas, crescimento e/ou migração de células de monócito, macrófago e/ou endoteliais; estimulação da produção de inibidor de ativador de plasminogênio tipo 1 (PAI-1); modulação da produção de endotelina; modulação de eventos biológicos da via pró-aterosclerótica associada à IR; modulação de inflamação associada à IR; tratamento e/ou redução do risco de lesão arterial; tratamento e/ou prevenção de aterosclerose e/ou redução de moléculas de inflamação associadas à IR, tal como o colesterol LDL nas paredes dos vasos sanguíneos de um paciente por liberação ou, de outra forma, administração de uma quantidade terapeuticamente ou profilaticamente eficaz de um peptídeo ou composição da invenção ao paciente para induzir, promover e/ou melhorar tais respostas fisiológicas.

[00363] Os peptídeos e composições da invenção também podem ser empregados para tratar o desgaste catabólico (por exemplo, caquexia e sarcopenia) e para uso não terapêutico no aumento da massa muscular, por exemplo, em um atleta, esportista ou fisiculturista. Os peptídeos também são usados pelo seu efeito anabólico na massa muscular de um atleta. (GHRP significa hexapeptídeo liberador hormônio do crescimento, um tipo de hormônio liberador do hormônio do crescimento).

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100/146 [00364] Isso pode ser útil de diversas maneiras. Obviamente, um atleta precisará se recuperar rapidamente e ser produtivo logo após uma lesão. Os peptídeos ajudarão o músculo ou tecido mole nesse processo de recuperação reconstrutivo. Suplementos que fornecem um efeito anabólico também podem ser usados durante a pré-temporada e outros períodos em que a construção de massa muscular é importante. A massa muscular pode ser construída rapidamente, porque o atleta pode fazer pequenas lesões em um músculo e recuperá-lo em um rápido cronograma para repetir continuamente o processo - o efeito final sendo a massa muscular aumentada e gordura corporal reduzida em um prazo mais curto. A comunidade de fisiculturismo usa peptídeos que são mais eficazes nesse segundo sentido, pois os peptídeos mais novos não têm os efeitos colaterais dos esteróides anabolizantes.

Dosagens Exemplificativas e Estratégias de Administração [00365] Como descrito acima, as composições da invenção podem incluir uma quantidade terapeuticamente eficaz” ou uma quantidade profilaticamente eficaz de um peptídeo da invenção (ou primeira e segunda quantidades no caso de uma composição de combinação compreendendo um peptídeo da invenção e um segundo componente; primeira, segunda e terceira quantidades no caso de uma combinação de combinação compreendendo dois peptídeos da invenção e um agente secundário ou um peptídeo da invenção e dois agentes secundários etc.). Para melhor ilustrar aspectos particulares, uma discussão detalhada de princípios de dosagem é ainda fornecida aqui. [00366] Na prática da invenção, a quantidade ou faixa de dosagem do peptídeo da invenção empregada tipicamente é uma que eficazmente induza, promova ou melhore uma resposta fisiológica associada à ligação do peptídeo da invenção a uma IR cognata. Em um aspecto, a faixa de dosagem é selecionada de tal forma que o peptídeo da invenção empregado induza, promova ou melhore um efeito

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101/146 medianamente significativo em um paciente que sofra de, ou esteja em risco substancial de desenvolver, uma condição associada que é pelo menos modulada em parte por atividade de IR, tal como, por exemplo, uma forma de diabetes, cujo efeito está associado à ativação, sinalização e/ou modificação biológica (por exemplo, fosforilação) da IR cognata.

[00367] Ainda em outro aspecto, uma dosagem diária de ingrediente ativo (por exemplo, peptídeo da invenção) de cerca de 0,01 a 100 miligramas por quilograma de peso corporal é fornecida a um paciente. Tipicamente, cerca de 1 a cerca de 5 ou cerca de 1 a cerca de 10 miligramas por quilograma por dia dados em doses divididas de cerca de 1 a cerca de 6 vezes por dia ou em forma de liberação sustentada podem ser eficazes para obter os resultados desejados.

[00368] Como um exemplo não limitative, o tratamento de patologias associadas à IR em seres humanos ou animais pode ser fornecido pela administração de uma dosagem diária de peptídeo da invenção em uma quantidade de cerca de 0,1-100 mg/kg, tal como 0,5, 0,9, 1,0, 1,1, 1,5, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21,22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 40, 45, 50, 60, 70, 80, 90 ou 100 mg/kg, por dia, em pelo menos um de dia 1,2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 24, 25, 26, 27, 28, 29, 30, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 39 ou 40, ou alternativamente, pelo menos uma de semana 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 ou 20, ou qualquer combinação desses, usando doses únicas ou divididas de cerca de 24, 12, 8, 6, 4 ou 2 horas, ou qualquer combinação dessas. [00369] Em um aspecto, os métodos inventivos compreendem administração ou, de outra forma, liberação de dois peptídeos diferentes da invenção ao longo de um período de um mês, o início da terapia envolvendo o segundo peptídeo da invenção, ou em qualquer momento, quando uma resposta imune significativa ao primeiro peptídeo da

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102/146 invenção se desenvolve no hospedeiro, de tal modo que o uso continuado do primeiro peptideo da invenção tem se tomado prejudicial para o paciente.

EXEMPLOS [00370] O peptideo referido nos Exemplos é um peptideo tendo uma sequência da SEQUÊNCIA ID NO. 1.

EXEMPLO 1

Ensaio de Proliferação Celular

Descrição do estudo [00371] BrDu é incorporado em fitas de DNA recém-sintetizadas de células ativamente proliferativas. Após desnaturação parcial do DNA de fita dupla, o BrDu é detectado imunoquimicamente permitindo a avaliação da população de células que sintetizam DNA.

Metodologia [00372] Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF - Sigma 10605a) foram semeados em uma placa de 96 cavidades a 10.000 células por cavidade em DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de Pen/strep, 1% de L-glutamina e foram permitidos aderir por 24h.

[00373] Após a incubação inicial de 24 h, as células foram incubadas com 5 pg/ml, 0,5 pg/ml ou 0,05 pg/ml de peptideo sintético por 24h, respectivamente.

[00374] Após 18 h de incubação com peptídeos sintéticos, 20 μΙ de reagente de BrDu foram adicionados a cada cavidade. Às 24h de incubação, as células foram fixadas e a quantidade de 2-DG6P foi medida usando o Ensaio de Proliferação Celular de BrdU, todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

[00375] Essa experiência foi então repetida usando células HACAT.

Resultados [00376] Os resultados foram calculados como uma porcentagem do controle não tratado. Um aumento na leitura da densidade óptica indica

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103/146 uma maior incorporação de BrDu e aumenta a proliferação celular como ilustrado pelas Figuras 1 (células HDF) e 2 (células HACAT). Como ilustrado pelas Figuras 1 e 2, as amostras estimuladas com o peptídeo da invenção apresentaram um aumento na proliferação celular em comparação com o controle nâo tratado.

Conclusão [00377] Esses resultados demonstram a eficácia do peptídeo para facilitar a proliferação celular.

EXEMPLO 2

Ensaio de Produção de Colágeno

Descrição do Estudo [00378] A hidroxiprolina nas preparações de tecido é uma medida direta da quantidade de colágeno presente. O ensaio de kit ELISA de Hidroxiprolina Humana FIRELISA foi projetado para medir a hidroxiprolina em composições de tecido ou peptídeo.

Metodologia [00379] Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF Sigma 10605a) foram semeados em placas de 24 cavidades a 50.000 células por cavidade em DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de Pen/strep, 1% de L-glutamina e foram deixados aderir por 24 horas.

[00380] Após a incubação inicial de 24h, as células foram incubadas com 5 pg/ml, 1 pg/ml ou 0,1 pg/ml de peptídeo sintético por 96h, respectivamente.

[00381] Após o tratamento, o sobrenadante celular foi removido e centrifugado. 50 μΙ de cada sobrenadante foram testados usando o kit ELISA de Hidroxiprolina Humana FIRELISA. Todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados [00382] Os resultados foram calculados como uma porcentagem do controle não tratado. Um aumento na leitura da densidade óptica indica

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104/146 um aumento no conteúdo de colágeno. Um aumento na produção de colágeno em comparação com controle nâo tratado foi visto como ilustrado pela Figura 3.

Conclusão [00383] Esses resultados demonstram a eficácia do peptídeo para facilitar a produção de colágeno.

EXEMPLO 3

Ensaio de Produção de Elastina

Descrição do estudo [00384] A elastina é uma proteína altamente elástica em tecido conjuntivo e permite que muitos tecidos do corpo retomem sua forma após o estiramento ou contração. O ensaio de kit ELISA de Elastina Humana FIRELISA foi projetado para medir a elastina em tecido ou composições de proteína/peptídeo.

Metodologia [00385] Fibroblastos Dérmicos Humanos (HDF) foram semeados em placas de 24 cavidades a 50.000 células por cavidade em DMEM contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de Pen/strep, 1% de L-glutamina e foram deixados aderir por 24 horas.

[00386] Após a incubação inicial de 24h, as células foram incubadas com 5 pg/ml, 1 pg/ml ou 0,1 pg/ml de peptídeo sintético por 96h, respectivamente.

[00387] Após o tratamento, as células foram lisadas usando tampão de lise celular e sonicadas por 10 segundos. As células lisadas foram centrifugadas e o sobrenadante foi removido de cada amostra. A concentração total de proteína foi determinada usando um ensaio BCA. Cada amostra foi diluída em tampão de ensaio para conter 10 pg de proteína total. 50 μI de cada amostra foram então testados usando o kit ELISA de Elastina Humana FIRELISA. Todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante.

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Resultados [00388] Os resultados foram calculados como uma porcentagem do controle não tratado. Um aumento na leitura da densidade óptica indica um aumento no conteúdo de elastina. Como ilustrado pela Figura 4, as amostras estimuladas com o peptídeo da invenção apresentaram um aumento na produção de elastina em comparação com o controle não tratado.

Conclusão [00389] Esses resultados demonstraram a eficácia do peptídeo para facilitar a produção de elastina.

EXEMPLO 4

Captação de Glicose

Descrição do estudo [00390] A captação de glicose nas células do músculo esquelético foi medida usando 2~desoxiglicose (2-DG). O 2-DG é captado por transportadores de glicose e metabolizado em 2-DG-6-fosfato (2DG6P). A quantidade de 2--DG6P não metabolizado acumulado é proporcional à captação de glicose pelas células.

Metodologia [00391] Mioblastos esqueléticos humanos (Sigma 150-05a) foram semeados em uma placa de 96 cavidades a 10.000 células por cavidade em meio de Diferenciação de Músculo Esquelético e deixados para diferenciação por 72 horas antes do experimento.

[00392] As células diferenciadas foram privadas de soro por 24h antes da estimulação com insulina ou peptídeos sintéticos. Após a privação, o meio livre de soro foi removido, as células foram enxaguadas com Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS) e os meios foram substituídos por 100 pl de Krebs-Ringer-Fosfato-HEPES (KRPH) e incubados por 1h.

[00393] As células foram então estimuladas com 100 nM de insulina

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106/146 por 30 minutos ou 5 pg/ml, 0,5 pg/ml ou 0,05 pg/ml de peptídeo sintético por 3h, respectivamente.

[00394] Após a estimulação, as células foram incubadas com 10 pg/cavldade de solução de 2-DG por 40 min e a captação de glicose foi medida usando o ‘PrismColor Glicose Uptake Assay Kit’ (Molecutools), todas as etapas foram realizadas de acordo com as instruções do fabricante. O experimento foi repetido usando células HACAT. Resultados [00395] Os resultados foram calculados como uma porcentagem do controle não tratado. Um aumento na leitura da densidade óptica indica maior incorporação de 2-DG6P e aumento na captação de glicose. Todos os experimentos foram realizados em duplicata em três placas (6 cavidades/condição). A significância foi determinada usando o teste t de Student (*p<0,05 comparado ao controle, '^A'*p<0,01 comparado ao controle, ***p<0,001 comparado ao controle). A Figura 6 ilustra os resultados para 0,5 pg/ml de peptídeo sintético e a Figura 7 ilustra os resultados para 5 pg/ml de peptídeo sintético. A Figura 5 apresenta os resultados para células HACAT. Como ilustrado por essas Figuras, as amostras estimuladas com o peptídeo da invenção apresentaram um aumento na captação de glicose em comparação com o controle não tratado.

Conclusão [00396] Esses resultados demonstram a eficácia do peptídeo para facilitar a captação de glicose no músculo esquelético.

EXEMPLO 5

Translocação de GLUT-4

Metodologia [00397] Células HSKMC foram cultivadas em placas de 6 cavidades e então tratadas com peptídeos/hidrolisados por 2 horas, nas concentrações de 0,5 pg/ml e 5 pg/ml. Após a conclusão do tratamento,

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107/146 as proteínas da membrana celular foram coletadas. Brevemente, as células foram coletadas das cavidades com um raspador de células e centrifugadas a 300 x g por 5 min. O pélete celular foi lavado com 300 pl de solução de lavagem celular e depois recentrifugado a 300 x g por 5 min. O sobrenadante foi descartado e as células foram ressuspensas em 1,5 ml de solução de lavagem celular e transferidas para um tubo de centrífuga de 2 ml. As células foram então centrifugadas a 300 x g por 5 min e o sobrenadante foi descartado. 150 μΙ de tampão de permeabilização foram adicionados ao pélete celular e vortexados brevemente para obter uma suspensão celular homogênea. A suspensão foi então incubada a 4°C por 10 min com misturação constante. As células permeabilizadas foram então centrifugadas a 16000 x g por 15 min e o sobrenadante contendo as proteínas citosólicas foi transferido para um novo tubo. 100 μΙ de tampão de solubilização foram adicionados ao pélete e ressuspensos por pipetagem suave. As amostras foram então incubadas a 4°C por 10 min com misturação constante. As amostras foram então centrifugadas a 16000 x g por 15 min a 4°C por 10 min. O sobrenadante contendo a membrana solubilizada e as frações de proteínas associadas à membrana foi transferido para um novo tubo e armazenado a -80°C até estar pronto para avaliação.

[00398] GLUT-4 foi avaliado nas frações de membrana celular usando um ELISA em sanduíche da LSBio. 10 pg de proteína de cada amostra foram carregados em uma cavidade individual em uma placa de 96 cavidades para um volume final de 100 pl. Padrões de GLUT-4 (0,3 ng/ml-20 ng/ml) foram também adicionados às placas a um volume idêntico. As placas foram então vedadas e Incubadas a 37°C por 1 hora. O líquido foi aspirado de cada cavidade e depois 100 pl de um reagente de detecção A foram adicionados a cada cavidade, em cujo ponto as placas foram vedadas, suavemente agitadas para assegurar a

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108/146 misturação e depois incubadas por 1 hora a 37°C. O líquido foi aspirado de cada cavidade e as cavidades foram lavadas 3 vezes usando 350 μΙ de tampão de lavagem. 100 μΙ de reagente de detecção B foram adicionados a cada cavidade, em cujo ponto as placas foram vedadas e incubadas a 37°C por 30 min. As cavidades foram lavadas 5 vezes, conforme descrito anteriormente, e 90 μΙ de substrato TMB foram adicionados a cada cavidade. As placas foram vedadas, protegidas da luz e incubadas a 37°C por 10 minutos para garantir o desenvolvimento ideal da cor. 50 μΙ de solução de paragem foram adicionados a cada cavidade e a densidade óptica da amostra foi determinada usando um leitor de microplacas configurado para 450 nm. A concentração de GLUT-4 nas amostras foi calculada a partir da curva padrão após a geração de um ajuste de curva logístico de quatro parâmetros (4-PL). A leitura da concentração da amostra da curva foi então ajustada pela multiplicação dos resultados pelo fator de diluição.

Resultados [00399] Como ilustrado pela Figura 8, houve um aumento na translocação de GLUT4 em amostras estimuladas com ambos 0,05 pg/ml e 5 pg/ml de peptídeo.

Conclusão [00400] O peptídeo mostrou uma tendência para o efeito estimulante sobre a translocação de GLUT4 do músculo esquelético e sua capacidade de facilitar o transporte de glicose no músculo esquelético. EXEMPLO 6

Síntese de Proteína Muscular (ensaio de Fosfo-mTOR)

Descrição do estudo [00401] O alvo mamífero de rapamicina (mTOR) é uma proteína quinase Ser/Thr que funciona como um sensor de ATP e aminoácido para equilibrar a disponibilidade de nutrientes e o crescimento celular. A atividade de mTOR é regulada por insulina, aminoácidos, exercício,

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109/146 estresse oxidativo e fatores de crescimento que, ao longo de sua fosforilaçâo, promovem vias de síntese de proteína. No entanto, o mTOR desregulado causa o envelhecimento aceierado dentre muitas outras patologias. No músculo, quando mTOR é ativado (fosforilado), leva à hipertrofia muscular esquelética. Esse fato tem sido amplamente relatado, tanto em roedores quanto em seres humanos, na literatura. Aminoácidos, tais como a leucina, aumentam a fosforilaçâo de mTOR e sua ativação sobrerregula a tradução de proteína através da fosforilaçâo da proteína de ligação do fator de iniciação eucariótica 4E (4E-BP1) e da proteína ribossômica S6 quinase (S6K), levando ao crescimento e proliferação celular.

[00402] O ELISA em sanduíche de Fosfo-mTOR detecta os níveis endógenos de mTOR fosforilado em Ser2448.

Metodologia [00403] Dia 1: Semear células HSkMC em 500 pL/cavidade de Meio de Crescimento de HSkMC e deixá-las aderir às cavidades por 16-24h. [00404] Dia 2: Remover o meio de crescimento e adicionar 500 pL/cavidade de Meio de Crescimento de HSkMC para diferenciá-los por

5-7 dias.

[00405] Dia 7: Trataras céluias por2 horas. Coletar lisados celulares em tampão de lise.

[00406] Dia 8: Realizar BCA (determinação de proteína) e executar o ensaio. Em uma primeira etapa de incubação, um anticorpo de mTOR revestido sobre as microcavidades ELISA é usado para capturar mTOR (fosfo e não fosfo) dos lisados celulares. Então, após extensa lavagem, um anticorpo específico de detecção de fosfo-mTOR é adicionado para detectar apenas a proteína de fosfo-mTOR capturada anteriormente. Finalmente, um anticorpo ligado a HRP é usado para reconhecer o anticorpo de detecção e, através da adição de TMB (substrato de HRP), desenvolver a cor proporcionalmente à quantidade de mTOR fosforilado

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110/146 em Ser2448.

Resultados [00407] Os resultados são ilustrados pela Figura 9. Amostras estimuladas com 0,5 pg/ml e 5 pg/ml exibiram aumento em mTOR, Conclusão [00408] Esses resultados demonstram a eficácia do peptídeo para facilitar a síntese de proteína muscular e o crescimento muscular, EXEMPLOS 7 a 15: Formulações [00409] Em uma modalidade, a composição é formulada como uma composição tópica. Em uma modalidade, ela pode ser uma emulsão ou um creme ou produto para massagem (rub), tal como um produto para massagem muscular.

[00410] Em uma modalidade, o creme compreende um excipiente ou diluente, um agente de suspensão, um conservante e uma quantidade de pelo menos um peptídeo da invenção.

[00411] Em uma modalidade, o creme compreende um álcool, um carbômero, um sorbato, água e pelo menos um peptídeo da invenção. [00412] Preferencialmente, o álcool é butileno glicol (1,3-butanodiol). O álcool pode estar presente em uma quantidade dentre 1 e 10% da composição, preferencialmente entre 2 e 6%, preferencialmente 4%. O sorbato pode ser polissorbato-20. O sorbato pode estar presente em uma quantidade dentre 0,01 e 1% da composição, preferencialmente entre 0,05 e 0,5%, preferencialmente 0,10%. A água está presente em uma quantidade dentre 10% e 90%, preferencialmente 30% a 75%. O carbômero pode estar presente em uma quantidade de 0,05% a 1%, preferencialmente 0,1% a 0,5%, preferencialmente, 0,15%. O carbômero pode ser Ultrez 10.

[00413] O peptídeo da invenção pode estar presente em uma quantidade de 0,5% a 10%, preferencialmente de 1% a 5%, preferencialmente 3%.

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111/146 [00414] A composição pode ainda compreender um ou mais de álcool de açúcar, tal como glicerina, parabenos, silício, tal como ciclohexasslloxano, um álcool graxo ou ácido fosfórico ou uma mistura de álcool graxo e ácido fosfórico, tal como álcool cetearílico, fosfato de dicetil e fosfato Cereth 10 ou suas combinações, polioxietileno estearil éteres, tais como Steareth 2 e 10, e uma fragrância.

[00415] Um exemplo de produto para massagem ou emulsão é apresentado no Exemplo 7.

Ingrediente	% (p/p) exemplificative
Fase A Água Carbômero	70,95 0,15
Fase B Glicerina	3,5
Fase C Steareth 2 Dicetil fosfato de álcool cetearílico e fosfato Cereth 10 Ciclohexsiloxano Succinato de dioctila Steareth 10 Parabeno misto	0,40 4 2 7 1,2 0,30
Fase D Sorbato	0,10
Fase E Água Hidróxido de sódio	2,50 0,30
Fase F Fragrância	0,10
Fase G Peptídeo(s) da invenção	3

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112/146 [00416] A emulsão resultante é adequada como produto para massagem. Além disso, o produto para massagem é adequado para peles envelhecidas frágeis. A emulsão é adequada para melhorar linhas finas, rugas, secura reduzindo a vermelhidão e a irritação.

[00417] As porcentagens são exemplos apenas e será apreciado que qualquer porcentagem adequada pode ser usada dependendo do uso. [00418] A emulsão é preparada do seguinte modo: Fase A: dispersar Ultrez 10 (carbômero) em água e deixar inchar por 20 minutos, depois adicionar a fase B; aquecer para 75°C. Aquecer a Fase C separadamente para 75°C. Misturar as duas fases sob agitação, homogeneizar, adicionara Fase D, neutralizar com a Fase E, esfriar até atingir 30°C, depois adicionar a Fase F e a Fase G; ajustar para pH 6 com -NaOH. Será entendido que isto é apenas um exemplo e qualquer método adequado conhecido na técnica pode ser usado.

[00419] Em uma modalidade adicional, a composição pode compreender um ou mais de água, um carbômero, um sorbato, tal como sorbato de potássio, um álcool de açúcar, tal como glicerina, um álcool, tal como 2-(2~Etoxietoxi)etanol, polioxietileno estearil éteres, tais como Steareth 2, um álcool graxo ou ácido fosfórico ou uma mistura de álcool graxo e ácido fosfórico, tal como álcool cetearílico, fosfato de dicetil e fosfato Cereth 10 ou suas combinações, um siloxano, tal como ciclometicona, Triglicerídeos Cápricos Caprílicos, um Estearato de sorbitano, Parabenos, Hidróxido de sódio, um agente ativo, tal como um agente clareador de pele, tal como uma mistura de licerina (e) Butileno Glicol (e) Extrato de Folha de Uva Ursi Arcostaphylus (e) Extrato de Mitracarpus Scaber (ETIOUNE®), ou um agente de saúde muscular e peptídeo da invenção.

[00420] A composição a seguir no Exemplo 8 é um exemplo de uma emulsão ou creme ou um produto para massagem.

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113/146

Ingrediente	% (P/P) exemplificativa
Água Desionizada	qs 100
Carbômero	0,10
Sorbato de Potássio	0,10
Transcutol	3,00
Glicerina	8,00
Volpo S2 [Steareth 2]	0,60
Crodafos CES [Álcool Cetearílico (e) Fosfato de	4,00
Dicetil (e) Fosfato Ceteth 10]
DC 344 [Ciclometicona]	2,00
Crodamol GTCC [Triglicerídeo caprílico/cáprico]	10,00
Crill 3 (Estearato de sorbitano)	1,60
Parabenos mistos	0,30
Hidróxido de Sódio 30%	0,35
Água Desionizada	3,50
Peptídeo	3,00
Ativo	3,00

[00421] O ativo pode ser ETIOLINE (R) [Glicerina (e) Etileno Glico (e) Extrato de folha de uva Arcostaphylus e extrato de Mitracarpus Scaber] ETIOLINE ® é um ingrediente de clareamento de pele comercializado pela SEDERMA (WO 98/05299 de 19 de novembro de 1996).

[00422] Será entendido que ETIOLINE pode ser substituído por quaiquer agente ativo, tal como um agente que auxilie a saúde, desenvolvimento ou recuperação muscular.

[00423] Essa formulação pode ser feita de acordo com os

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114/146 procedimentos geralmente descritos no Exemplo 7. A composição pode ser uma emulsão ou creme ou produto para massagem compreendendo um ou mais de água, um carbômero, tal como Ultrez 10, um álcool de açúcar, tal como glicerina, um álcool, tal como fenova (fenoxietanol e parabenos mistos), um éster de ácido graxo, tal como etilhexii palmitato, um álcool graxo, tal como álcool cetearílico, um éster de ácido láctico, tal como um lactato de miristil, um sorbato, tal como polissorbato 20 e/ou sorbato de potássio, um emulsificante polimérico, tal como Acrilato (Cw30 alquil acrilato) e um polímero cruzado, um siloxano, tal como ciclometicona, hidróxido de sódio, pelo menos um agente ativo, tal como um agente de saúde muscular ou um agente para o tratamento de estrias, tal como o extrato de siegesbeckia Orientalis (Darutoside) e um peptídeo.

[00424] A composição a seguir no Exemplo 9 é um exemplo de uma emulsão ou creme. Em uma modalidade, a emulsão ou creme é um creme antiestrias.

Ingrediente	% (p/p) exemplificativa
Parte A
Água Desionizada	qs 100
Ultrez 10 [Carbômero]	0,40
Parte B
Glicerina	5,00
Fenova [Fenoxietanol (e) Parabenos Mistos]	0,80
Parte C
Crodamol OP [Palmitato de Etilhexii	4,00
Crodacol CS90 [Álcool Cetearílico]	0,50
Crodamol ML [Lactato de Miristil]	0,30

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115/146

Crillet 1 [Polissorbato 20]	1,00
Parte D Pemulen TR2 [Acrilatos/C 10-30 Alquil Acrilato (e) Polímero cruzado]	0,20
DC 345 [Ciclometicona]	2,00
Parte E	0,10
Sorbato de Potássio
Parte F
Água	6,00
Hidróxido de Sódio 38%	0,60
Parte G
Peptídeo	3,00
Ativo	2,00

[00425] O ativo pode ser Darutoside (Extrato de Siegesbeckia orientalis). Darutoside é uma molécula comercializada por SEDERMA para o tratamento de estrias. Será entendido que Darutoside pode ser substituído por qualquer agente ativo, tal como qualquer agente que auxilie a saúde, desenvolvimento ou recuperação muscular.

[00426] Essa emulsão ou produto para massagem é preparado da seguinte maneira: Fase A, dispersar LJItrez 10 (carbômero) em água e deixar inchar por 20 minutos, depois adicionar a fase B; aquecer para 75°C. Aquecer a Fase C separadamente para 75°C. Misturar as duas fases sob agitação, homogeneizar, adicionar a Fase D, neutralizar com a Fase E, resfriar até atingir 30°C, depois adicionar a Fase F e a Fase G, ajustar o pH para -6 com NaOH.

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116/146 [00427] Em uma modalidade da invenção, a composição pode ser uma emulsão, um creme ou um gel, preferencialmente um gel, compreendendo um ou mais de água, um carbômero, tal como Ultrez 10, um álcool de açúcar, tal como glicerina, um álcool, tal como fenova (fenoxietanol e parabenos mistos), um sorbato, tal como polissorbato 20 e/ou sorbato de potássio, um emulsificante polimérico, tal como Acrilato (Cw-30 alquil acrilato), um siloxano, tal como ciclometicona, hidróxido de sódio, um peptídeo e pelo menos um agente, tal como um agente para a saúde, recuperação ou desenvolvimento muscular, ou um agente hidratante adequado, tal como um agente compreendendo extrato de Imperata Cylindrica (raiz), água, glicerina, PEG-8 e carbômero (MOIST 24). Em uma modalidade, o gel é um gel hidratante.

[00428] A composição a seguir no Exemplo 10 é um exemplo de um gel. Em uma modalidade, o gel é um gel hidratante.

Ingrediente	% (p/p) exemplificativa
Parte A Ultrez 10 [Carbômero] Água Desionizada	0,20 qs 100
Parte B Glicerina Fenova [Fenoxietanol (e) Parabenos Mistos]	3,00 0,80
Parte C Crillet 1 [Polissorbato 20]	0,50
Parte D Sorbato de Potássio	0,10
Parte E

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117/146

Pemulen TR1 [Acrilatos/C 10-30 Alquil Acrilato (e)	0,20
Polímero cruzado]	3,00
DC 345 [Ciclometicona]	2,00
Parte F
Água	4,00
Hidróxido de Sódio 38%	0,40
Parte G
Peptídeo	3,00
Ativo	5,00
MOIST-24 em um extrato vegetal hidratante
comercializado por SEDERMA (WO 01/62218 de 30
de agosto de 2001)

[00429] Essa formulação pode ser feita de acordo com os procedimentos geralmente descritos no Exemplo 11.

[00430] O ativo pode ser MOIST-24 (R) [Extrato de Imperata Cylindrica (raiz) (e) água (e) Glicerina (e) PEG-8 (e) Carbômero]. Será entendido que qualquer agente pode ser usado para substituir MOIST24. Por exemplo, qualquer agente que auxilie a saúde, desenvolvimento ou recuperação muscular.

[00431] Em uma modalidade da invenção, a composição pode ser uma emulsão, creme ou produto para massagem compreendendo um ou mais de água, um carbômero, tal como Ultrez 10, um sorbato, tal como polissorbato 20, polissorbato 60 e/ou sorbato de potássio, um álcool, tal como fenova (fenoxietanol e parabenos mistos), butileno glicol (1,3-butanodiol), álcool de lanolina e/ou álcool cetearílico, estearato de sorbitano, Polidimetilsiloxano, tal como dimeticona, um isononanoato de isotridetil, um triglicerídeo caprílico/cáprico, um cetil éster, hidróxido de sódio, água, um agente para a saúde, recuperação e/ou desenvolvimento muscular, ou um agente antienvelhecimento, tal como

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118/146 um agente compreendendo butileno glicol, água, laureth-3, hidroxietilcelulose e acetil-dipeptídeo-l-cetiléster (CALMOSENSINE®). [00432] A composição a seguir no Exemplo 11 é um exemplo de um creme ou um produto para massagem.

Ingrediente	% (p/p) exemplifícativa
Parte A
Água Desionizada	qs 100
Ultrez 10 [Carbômero]	0,20
Parte B
Sorbato de Potássio	0,10
Parte C
Butileno Glicol	2,00
Fenova [Fenoxietanol (e) Parabenos Mistos]	0,80
Parte D
Crill 3 [Estearato de Sorbitano]	1,00
Crillet 3 [Polissorbato 60]	2,50
DC 200 [Dimeticona]	2,50
Crodamol TN [Isononanoato de Isotridetil]	5,00
Crodamol GTCC [Triglicerídeo Caprílico/Cáprico]	5,00
Crodamol SS [Cetii Esteres]	1,00
Super Hartolan [Álcool de Lanolina]	0,50
Super Sterol Éster [C10-30 Colesterol/Lanosterol	0,30
ésteres]
Crodacoi CS90 [Álcool Cetearílico]	3,00
Parte E
Água Desionizada	2,50
Hidróxido de Sódio 38%	0,25

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119/146

Parte F Peptídeo Agente ativo

3,00 4,00

[00433] Essa formulação pode ser feita de acordo com os procedimentos geralmente descritos no Exemplo 9. O ativo pode ser CALMOSENSINE (R) [Butileno glicol (e) água (e) Laureth-3 (e) Hidroxietilcelulose (e) Acetil-Dipeptídeo-l-cetiléster]. Calmosensine (R) é um peptídeo analgésico fornecido por SEDERMA (WO 98/07744 de 26 de fevereiro de 1998). Será entendido que qualquer agente pode ser usado para substituir CALMOSENSINE. Por exemplo, qualquer agente que auxilie a saúde, desenvolvimento ou recuperação muscular.

[00434] Em uma modalidade da invenção, a composição pode ser uma emulsão, creme ou produto para massagem compreendendo um ou mais de água, um carbômero, tal como Ultrez 10, um álcool de açúcar, tal como glicerina, um sorbato, tal como sorbato de potássio, um estearato, tal como Steareth 10, um álcool graxo ou ácido fosfórico ou uma mistura de álcool graxo e ácido fosfórico, tal como o álcool cetearílico, fosfato de dicetil e fosfato Cereth 10 ou suas combinações, succinato de dietilhexil, parabenos mistos, Estearato de Sorbitano, Hidróxido de Sódio, água, um peptídeo e um agente ativo, tal como um agente para a saúde, recuperação e/ou desenvolvimento muscular de um agente para peles maduras, tal como um Extrato de Flor Trifolium Pratense (Trevo) (e) Glicerina (e) Butileno Glicol (e) Lecitina (TEROCARE®).

[00435] A composição a seguir no Exemplo 12 é um exemplo de um creme ou um produto para massagem.

Ingrediente	% (p/p) exempHficativa
Parte A Ultrez 10 [Carbômero]	0,20

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120/146

Água	qs 100
Parte B
Glicerina	3,50
Parte C
Sorbato de Potássio	0,10
Parte D
Volpo S10 [Steareth 10]	1,50
Crodafos CES [Álcool Cetearílico, Fosfato de	3,50
Dicetil (e) Fosfato Ceteth-10]
DC 200 [Dimeticona]	2,00
Succinato de Dietilhexil	7,00
Parabenos Mistos	0,30
Crill 3 [Estearato de Sorbitano]	0,40
Parte E
Hidróxido de Sódio 38%	0,20
Água	4,00
Parte F
Agente ativo	3,00
Peptídeo	3,00

[00436] Essa formulação pode ser feita de acordo com os procedimentos geralmente descritos no Exemplo 9. O agente ativo pode ser STEROCARE (TM) [Extrato de Flor Trifolium Pratense (Trevo) (e) Glicerina (e) Butileno Glicol (e) Lecitina. Sterocare (R) é fornecido por SEDERMA como um ingrediente ativo para peles maduras (FR 2769502

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121/146 de 14 de abril de 2000, WO 99/18927 de 22 de abril de 1999). Será entendido que qualquer agente pode ser usado para substituir STEROCARE®. Por exemplo, qualquer agente que auxilie a saúde, desenvolvimento ou recuperação muscular.

[00437] A composição a seguir no Exemplo 13 é um exemplo de um produto para massagem ou um tônico.

Ingrediente	% (p/p) exemplificativa
Parte A
Água desionizada	qs 100
Parte B
Parabenos Mistos	0,14
Butileno Glicol	2,00
Parte C
Peptídeo	0,0008
Etanol	10,00
Parte D
Crillet 1 (Polissorbato 20)	1,50
Fragrância	0,10

00438] A composição a seguir no Exemplo 14 é um exemplo de um creme ou um produto para massagem.

Ingrediente	% (p/p) exemplificativa
Parte A Ultrez 10 [Carbômero] Água desionizada Parte B	0,20 qs 100

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122/146

glicerina	3,00
Parte C
Sorbato de Potássio	0,10
Parte D
Volpo S10 [Steareth 10]	1,50
Crodafos CES [Álcool Cetearílico,	3,00
Fosfato de Dicetil (e) Fosfato Ceteth-10]
DC200 [Dimeticona]	2,00
Crodamol OSU [Succinato de Dietilhexil]	5,00
Parabenos Mistos	0,30
Crill 3 [Estearato de Sorbitano]	0,40
Parte E
Hidróxido de Sódio 38%	0,20
Água Desionizada	4,00
Parte F
Água	10,0
Peptideo	0,00075
Agente	0,001
Agente	0,002

[00439] O agente pode ser Deferoxamina e/ou Berberina. Esses são usados como espessantes de pele. A deferoxamina e berberina podem ser substituídas por outro agente ativo, tal como um agente para a saúde, recuperação e desenvolvimento muscular.

[00440] A composição a seguir no Exemplo 15 é um exemplo de um

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123/146 gel ou produto para massagem.

Ingrediente	% (p/p) exemplificative
Parte A
Água Desionizada	qs 100
Parte B
Butlleno Glicol	5,00
Fenova [Fenoxietanol (e) Parabenos Mistos]	0,80
Parte C
Crill 3 [Estearato de Sorbitano]	1,20
Crillet 3 [Polissorbato 60]	3,00
DC 200 [Dimeticona]	2,00
Crodamol IPM [Miristato de Isopropil]	5,00
Crodamol W [Heptanoato de Estearil]	0,30
Crodamol GTCC [Triglicerídeo Caprílico/Cápríco]	5,00
Crodacol CS90 [Álcool Cetearílico]	2,00
Parte D
Carbopol 980 a 2% [Carbômero]	10,00
Parte E
Sorbato de Potássio	0,10
Parte F
Água	2,00
Hidróxido de Sódio Parte G	0,20

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124/146

Água	10,0
Peptídeo	0,00045
Agente ativo	0,1
Agente ativo	0,0001

[00441] Esse gel pode ser preparado da seguinte maneira: Homogeneizar a Parte B e despejá-la na Parte A. Aquecer a Parte (A + B) para 75°C. Aquecer a Parte Cea Parte D para 75°C. Despejar a Parte C na Parte (A + B) com a agitação de hélice; depois, despejar a parte D na parte (A*B-hC). Adicionar a Parte F e a Parte E. Despejar a Parte G a cerca de 35°C.

[00442] O ativo pode ser Rutina ou Inibidor de Birk Bowman. Esses agentes são usados para regeneração de tecidos. Rutina e Inibidor de Birk Bowman podem ser substituídos por outro agente ativo, tal como um agente para a saúde, recuperação e desenvolvimento muscular. EXEMPLO 16

ELISA de Puromicina

Descrição do estudo [00443] A puromicina é um antibiótico de aminonucleosídeo produzido pela bactéria Streptomyces alboniger. É um análogo estrutural de RNA de transferência de aminoacil e, dessa forma, pode ser incorporado em cadeias de peptídeo alongadas através da formação de uma ligação de peptídeo. No entanto, enquanto aminoacil-tRNAs contêm uma ligação de éster hidrolisável, a puromicina não a tem na posição equivalente. Dessa forma, a ligação de puromicina a uma cadeia de peptídeo em crescimento previne que uma nova ligação de peptídeo seja formada com o próximo aminoacil-tRNA. Como consequência, a ligação de puromicina resulta na terminação do alongamento de peptídeo e leva à liberação do peptídeo ligado à puromicina truncada do ribossomo. Em concentrações muito elevadas, a puromicina efetivamente encerra a fase de alongamento da tradução

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125/146 e inibe, dessa forma, a síntese de proteína; no entanto, em concentrações muito baixas, que não inibem a taxa global de tradução, a taxa na qual os peptídeos marcados com puromicina são formados reflete a taxa global de síntese de proteína. Essa propriedade posterior torna a puromicina uma ferramenta potencial para a medição de alterações nas taxas de síntese de proteína.

Metodologia

1. Dispensar 100 μΙ de Tampão de Revestimento por cavidade no número necessário de cavidades em uma placa ELISA de 96 cavidades. Diluir e misturar o extrato de Proteína (no mesmo tampão em que a amostra está) para 5 μί. Imediatamente dispensar 1 μΙ/cavidade na placa.

2. Incubar a placa a 4°C por 16-24 h.

3. Agitar vigorosamente o conteúdo. Lavar 1x com 200 μΙ de PBS.

4. Adicionar 200 μΙ de Solução de Bloqueio (5% de BSA em PBS). Incubar ao longo do dia por 4-6 h à RT.

5. Diluir o anticorpo de Puromicina na Solução de bloqueio e incubar durante a noite a 4°C.

8. Lavar 2X com 200 μί de PBS.

9. Adicionar 100 μΙ de Anticorpo Secundário diluído 1:1000 em Solução de Bloqueio. Incubar por 1 h à RT.

10. Lavar 4X com 200 μΙ de PBS. Agitar os conteúdos vigorosamente.

11. Adicionar 100 μΙ de Substrato de TMB e incubar por 15 a 20 min.

12. Adicionar Solução de paragem e fazer a leitura da placa a 450 nm.

Resultados [00444] A Figura 10 ilustra um aumento na síntese de proteína.

EXEMPLO 17

Toxicidade

Metodologia [00445] 100 μΙ de células HSkMC foram semeados em uma placa de

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126/146 cavidades, pré-revestidos com colágeno, em uma concentração de 1x10^Λ4 células/cavidade. As células foram deixadas aderir durante a noite a 37°C a 5% de CO2 e, no dia seguinte, 0 meio de crescimento foi substituído por 100 μί de meio de diferenciação celular e voltou para a incubadora a 37°C a 5% de CO2. O meio de diferenciação celular foi alterado a cada 2 dias por um período de 6 dias, até as céiulas HSkMC serem totalmente diferenciadas em miotubos. No dia 7, 0 meio de diferenciação celular foi substituído por 100 μΙ de meio basal e secou durante a noite a 37°C a 5% de CO2.

[00446] No dia do ensaio de MTT, 0 meio de secagem foi retirado e substituído por 100 μΙ de meio basal contendo 0 peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1. As células foram incubadas nesse tratamento por um período de 20 min a 37°C a 5% de CO2, ponto no qual 0 meio de tratamento foi removido e substituído por 100 μί de solução de MTT e incubado por 2h a 37°C a 5% de CO2. Após essa etapa de incubação, a solução de MTT foi removida e substituída por 110 μΙ de DMSO. A placa foi coberta em folha de alumínio e colocada em um agitador à RT por 5 min. A placa foi lida usando um espectrofotômetro (SpectraMax M3, Molecular devices, Sunnyvale, CA 94089 USA) ajustado para 570 nm e a citotoxicidade do peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 foi avaliada com base na densidade óptica das amostras. Os resultados são ilustrados pela Figura 11.

EXEMPLO 18 [00447] Esse conjunto de experimentos foi realizado para entender 0 mecanismo de ação de um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1.

Fosfo-Âcetll CoA

Metodologia [00448] O kit ELISA em Sanduíche de Fosfo-Acetil-CoA Carboxilase (Ser79) é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima em sanduíche de fase sólida (ELISA) que detecta níveis endógenos de acetil-CoA

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127/146 carboxilase (ACC) quando fosforilada em Ser79, Um anticorpo de coelho de fosfo-ACC (Ser79) foi revestido nas microoavidades. Após incubação com lisados celulares, a proteína de fosfo-ACC foi capturada pelo anticorpo revestido. Após lavagem extensiva, um mAb de detecção de ACC de camundongo foi adicionado para detectar a proteína de ACC capturada. O anticorpo ligado a HRP de IgG de anticamundongo foi, então, usado para reconhecer o anticorpo de detecção ligado. O substrato de HRP, TMB, foi adicionado para desenvolvimento de cor. A magnitude da absorbância para a cor desenvolvida foi proporcional à quantidade de ACC fosforilada em Ser79. Esses resultados são ilustrados pela Figura 12.

[00449] A acetil-CoA carboxilase (ACC) catalisa a carboxilação de acetil-CoA em malonil-CoA. Ela é a enzima chave na biossíntese e oxidação de ácidos graxos. Em roedores, a forma de ACC1 de 265 kDa (ACCa) é expressa principalmente em tecidos lipogênicos, enquanto ACC2 de 280 kDa (ACCp) é a principal isoforma em tecidos oxidativos. No entanto, em seres humanos, o ACC2 é a isoforma predominante em ambos os tecidos lipogênicos e oxidativos. A fosforilaçâo por AMPK em Ser79 ou por PKA em Serl200 inibe a atividade enzimática de ACC. ACC é um alvo potencial de drogas antiobesidade.

Fosfo-Akt1

Metodologia [00450] O kit ELISA em Sanduíche Fosfo-Akt1 (Ser473) é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima em sanduíche de fase sólida (ELISA) que detecta níveis endógenos da proteína fosfo-Akt1 (Ser473). O mAb de coelho de fosfo-Akt (Ser473) foi revestido nas microcavidades. Após a incubação com lisados celulares, a proteína fosfo-Akt (Ser473) foi capturada pelo anticorpo revestido. Após lavagem extensiva, o Anticorpo de Camundongo Akt1 foi adicionado para detectar a proteína fosfo-Akt1 (Ser473) capturada. O Anticorpo ligado a HRP de IgG

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128/146 anticamundongo foi, então, usado para reconhecer o anticorpo de detecção ligado. O substrato de HRP, TMB, foi adicionado para desenvolvimento de cor. A magnitude de absorção para essa cor desenvolvida é proporcional à quantidade de proteína fosfo-Aktl (Ser473).

[00451] Os resultados são ilustrados pela Figura 13.

[00452] A Akt, também referida como PKB ou Rac, desempenha um papel crítico no controle da sobrevivência e apoptose. Essa proteína quinase é ativada pela insulina e vários fatores de crescimento e sobrevivência para funcionar em uma via sensível à wortmanina envolvendo PI3 quinase. A Akt é ativada pela ligação de fosfolipídeos e fosforilação de ciclo de ativação em Thr308 por PDK1 e por fosforilação dentro do carbóxi terminal em Ser473. A PDK2 anteriormente elusiva responsável pela fosforilação de Akt em Ser473 foi identificada como alvo mamífero de rapamicina (mTOR) em um complexo insensível à rapamicina com rictor e Sin1. Akt promove a sobrevivência celular por inibição de apoptose através da fosforilação e inativação de vários alvos, incluindo Bad, fatores de transcrição forkhead, c-Raf e caspase9. A PTEN fosfatase é um dos principais reguladores negativos da via de sinalização de PI3 quinase/Akt. LY294002 é um inibidor de PI3 quinase específico. Outra função essencial da Akt é a regulação da síntese de glicogênio através da fosforilação e inativação de GSK~3a e β. A Akt também pode desempenhar um papel na estimulação da insulina no transporte de glicose. Além de seu papel na sobrevivência e síntese de glicogênio, a Akt está envolvida na regulação do ciclo celular pela prevenção de fosforilação mediada por GSK-3p e degradação de ciclina D1 e pela regulação negativa dos inibidores de quinase dependentes de ciclina p27 Kip1 e p21 Waf1/Cip1. A Akt também desempenha um papel crítico no crescimento celular ao fosforilar diretamente mTOR em um complexo sensível à rapamicina contendo

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129/146 raptor. Mais importante, a Akt fosforila e inativa a tuberina (TSC2), um inibidor de mTOR dentro do complexo mTOR-raptor.

Fosfo-ÂMPK alfa

Metodologia [00453] O kit ELISA em Sanduíche de Fosfo-ΑΜΡΚα (Thr172) é um ensaio imunoabsorvente ligado a enzima em sanduíche de fase sólida (ELISA) que detecta níveis endógenos de ΑΜΡΚα quando fosforilado em Thr172. Um anticorpo de coelho ΑΜΡΚα foi revestido nas microcavidades. Após a incubação com Usados celulares, a ΑΜΡΚα (fosfo e não fosfo) foi capturado pelo anticorpo revestido. Após lavagem extensiva, um anticorpo de detecção de fosfo-ΑΜΡΚα (Thr172) de camundongo foi adicionado para detectar a fosforilação de Thr172 na proteína ΑΜΡΚα capturada. Anticorpo ligado a HRP de IgG anticamundongo foi, então, adicionado para reconhecer o anticorpo de detecção ligado. O substrato de HRP, TMB, foi adicionado para desenvolvimento de cor. A magnitude da absorbância para essa cor desenvolvida foi proporcional à quantidade de ΑΜΡΚα fosforilada em Thr172. Os resultados são ilustrados pela Figura 14.

[00454] A proteína quinase ativada por AMP (AMPK) é altamente preservada de levedura para plantas e animais e desempenha um papel fundamental na regulação da homeostase energética. AMPK é um complexo heterotrimérico composto por uma subunidade α catalítica e subunidades β e γ reguladoras, cada uma das quais é codificada por dois ou três genes distintos (a1, 2; β1, 2; y1, 2, 3). A quinase é ativada por uma relação AMP/ATP elevada devido ao estresse celular e ambiental, tal como choque térmico, hipoxia e isquemia. O supressor tumoral LKB1, em associação com as proteínas acessórias STRAD e MO25, fosforila ΑΜΡΚα em Thr172 no ciclo de ativação, e essa fosforilação é necessária para ativação de AMPK. A ΑΜΡΚα também é fosforilada em Thr258 e Ser485 (para a1; Ser491 para α2). A quinase a

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130/146 montante e a signifícância biológica desses eventos de fosforilação ainda não foram elucidados. A subunidade β1 é pós-translacionalmente modificada por miristoilação e fosforilação multissítio incluindo Ser24/25, Ser96, Ser101, Ser108 e Ser182. A fosforilação em Ser108 da subunidade β1 parece ser necessária para a ativação da enzima AMPK, enquanto a fosforilação em Ser24/25 e Ser182 afeta a localização da AMPK. Várias mutações em subunldades AMPKy foram identificadas, a maioria das quais estão localizadas nos sítios de ligação AMP/ATP putativos (domínios CBS ou Bateman). Mutações nesses sítios levam à redução da atividade de AMPK e causam acúmulo de glicogênio no coração ou músculo esquelético. A evidência de acúmulo indica que a AMPK não apenas regula o metabolismo de ácidos graxos e glicogênio, mas também modula a síntese de proteína e o crescimento celular através das vias EF2 e TSC2/mTOR, bem como o fluxo sanguíneo através de eNOS/nNOS.

Condusão [00455] O peptídeo com uma sequência da SEQUÊNCIA ID NO. 1 está trabalhando através da via de AMPK. Na ativação do músculo esquelético (fosforilação), a AMPK leva à ACC fosforilada que promove a oxidação de ácidos graxos. Essa é uma via muito diferente da via da insulina, como mostrado no perfil de expressão gênica em células do músculo esquelético descritas abaixo.

EXEMPLO 19

Estudo de Expressão Gênica

Metodologia [00456] A sobre e subexpressão gênica para controle negativo dos 50 principais genes para insulina e o peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 foram Investigadas.

[00457] Um volume de 2 ml de células HSkMC foi semeado em uma placa de 6 cm, pré-revestida com colágeno, em uma concentração de

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2x10^Λ5 células. As células foram deixadas aderir durante a noite a 37°C a 5% de CO₂ e, no dia seguinte, 0 meio de crescimento foi substituído por 2 ml de meio de diferenciação celular e voltou para a incubadora a 37°C a 5% de CO2. O meio de diferenciação celular foi alterado a cada 2 dias por um período de 6 dias, até as células HSkMC serem totalmente diferenciadas em miotubos. No dia 7, 0 meio de diferenciação celular foi substituído por 2 ml de meio basal e seco durante a noite a 37°C a 5% de CO2.

[00458] No dia do experimento, 0 meio de secagem foi removido e substituído por 2 ml de meio basal contendo 0,5 pg/ml da SEQUÊNCIA ID NO. 1. Células não tratadas foram executadas em paralelo. As células foram incubadas nesse tratamento por um período de 20 min a 37°C a 5% de CO2, ponto no qual 0 meio de tratamento foi removido e as células foram raspadas em 1 ml de PBS. A suspensão celular foi peletizada em uma microcentrífuga a 1500 rpm por 5 min e 0 sobrenadante foi removido. As células foram imediatamente congeladas em nitrogênio líquido e transferidas para um congelador a -80°C para armazenamento até serem despachadas para CROs.

[00459] Para determinar a expressão gênica, 0 experimento Agilent Single Color foi realizado por Elda Biotech usando um sistema de escâner de micromatrizes Agilent G2565CA. O RNA foi extraído das células e então hibridizado com Agilent Human Gene Expression Microarray. Os seguintes kits foram usados: Qiagen Rneasy, Agilent RNA 6000 Nano, Lowlnput QuickAmp labeling, RNA Spike In (uma cor), Hi RPM GE Hybridisation Kit Large, Gene Expression Wash Pack. O experimento usou uma micromatriz SurePrint G3 Human Gene Expression v3 8x60K. Cada amostra teve três repetições. As amostras passaram nas verificações de quantidade e qualidade de RNA. A análise de dados subsequente foi realizada usando 0 pacote bioconductor limma.

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132/146 [00460] Os dados de intensidade brutos foram corrigidos em segundo plano com o método normexp e um desvio de 50 e quantil normalizado, o que resultou em medidas de expressão em log 2. Usando ComBat, correção de efeito em lote foi aplicada para ajustar uma separação por número replicado revelado por análise do componente principal. Então, a análise Bayesiana empírica foi aplicada. A expressão diferencial foi calculada com base na comparação com amostras não tratadas e avaliada usando uma estatística t moderada. Para corrigir múltiplos testes, o valor p resultante foi ajustado usando o método de Benjamini e Hochberg. Nenhuma expressão diferencial foi detectada sob um limite de valor p ajustado de 0,05. Em vez disso, um limite de valor p bruto de 0,001 foi usado. Genes tendo um valor de alteração de dobra absoluto superior a 1,3 são apresentados nas listas a seguir.

[00461] Lista de genes significativamente sobre- e sub-regulados e suas alterações de dobra (expressão gênica de micromatriz).

[00462] Genes sobrerregulados para tratamento com insulina: ABCA9,ACIN1,ADAP2, AKIRIN2, ALG3,AMN,ANKS 3, ANP32 AIT1 ,ARGLU1 ,ARHGEF35,ARPC5L,ASAP1IT1 ,ATP5H,ATP8,AURKAPS1 ,BMS1 P6.BOD1 L1 ,BRD3,BROX,C12orf6 5,C14orf169,C20orf96,C21orf59,C4orf33,C5orf24,C5orf58_!C6orf47_!CA CNA1A,CASC15,CATSPER2P1,CBX5,CCDC102B,CCNLI,CCNT2AS1 ,CD86,CDK11 B,CENPC,CFAP36,CHD3,C1 AO1 ,CLASRP,CMTM8,CO PG21T1,CRHR1IT1,CWC22,DKFZP586B0319,DKFZp686M1136,DPP9AS1 ,DRAP1 ,DRD4,DYX1 C1 ,EIF4G3,EIF5,EPSTI1 ,EXOC1 ,FAM 127C,FAM155AIT1 ,FAM173A,FAM212A,FAM71 F1 .FASTKD1 ,FIP1 L1 ,FLJ11292,FLJ1 ₃₇₇₃ Ftsj3 gabPB1AS1 ,GADD45B,GATA2,GBP2,GOLGA2P6,GOLGA6L4,GPATH11 ,GP

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R135,GRIN2D,GSK3A,HEBP2,HMGB1,HMGB3P1,HNRNPA1L2,H0X BAS1 ,H0XC9,H0XD8,ID1 JER2JFI44JFT172JGF1 R,IGF2BP2,KANK3, KCTD3, KI AA1654, KiZ, KLF17, KRTAP19-2, KRTAP411 ,LDHAL6A,UNC00083,UNC00504,LRRC37A2,MALAT1 ,MAP3K10, MAP3K3,MBNL1 ,MIDN,MIR22HG,MIR612,MPV17L2,MRE11A,MTA2, MY01 C,MZF1 ,NAMPT,NBPF8,ND4L,NF1 P2,NIPBL,N0L8,N0P58,NPI PB5.NR2C1,0LA1 ,PAK11P1 ,PCDHGA2,PDCD6IP,PDGFRB,PFDN4,P GBD2,PGF,PGM5P2,PMAIP1 ,PNPLA8,POU2F1 ,PP12719,PPIG,PPP6 R1 ,PRKAG2,PRO2852,PRPF40A,PRR4,PSMA4,PTMA,RALBP1 ,RC3 H2.RCC1 ,REP15,RHOB,RN7SL1 ,R0M1 .RPLP1 ,RPS6KC1 ,SAMD11, SFSWAP,SH3KBP1 ,SLC25A34,SLFN5,SMARCC1 ,SMCR6,SMIM11 ,S NAI1,SNAR-A3,SNAR-B2,SNAR-D,SNAR-F,SNAR-G2,SNARH,SNHG9,SNORA10,SNORD97,SNORD99,50083,80X8, SRP19, SR SF11 ,SSC5D,STAR,TAB2,TAF3,TCEAL7,TCF7L1 ,TFPI2,THOC2,TINA GL1 ,TNFAIP8L1 ,T0P0RS,TRANK1 ,TRAPPC10,TXLNG,UBE2Q2 P1 ,UBN2,VASP,VHL,VPS37D,YBX3,ZBTB2,ZCCHC17,ZMYND ,ZNF503 -AS2,ZSWIM4,ZSWIM6 [00463] Genes sub-regulados para tratamento com insulina: ABHD2,ACTA2,ACVR1 ,ADAMTS9,ADCY6,ADD3,ADPRHL2,AGTRAP, ALAD,AMZ2P1 ,ANXA2P1 ,AP2B1 ,ARMCX6,ATP5A1 ,ATP5B,ATP5G1, ATP6VOE1,ATRAID,AXL,BFAR,BODI,BRF2,C1orf43,C5orf15,C9orf78, CA12,CAV1,CD47,CD82₎CD9,CDC123,CDC42BPA,CDC42EP4,CHST 14,CHST3,CHSY3,CLMP,CLPTM1 L,CLU,CNPPD1 ,C0LGALT1 ,COPG 1 ,COPZ2,CRISPLD2,CRTC3,CSRP1 ,CTSLP8,CYB5D2,CYB5R1 ,DAG 1 ,DANCR,DEK,DENND4C,DFNA5,DHRS1 ,DLST,DNAJB9,DNASE1 L1 ,DNASE2,DPAGT1,EBF2,EI24,EIF2B4,EIF3I,EIF3K,EIF3L,EIVIC3,END 0D1 ,ENO2,ENPP4,EPRS,ESYT1 ,ESYT2,EXT1 ,EZH1 ,FAF1 ,FAM57A, FAM96A,FAS,FHOD1 ,FKBP14,FLii,FLNB,FN3KRP,G6PD,GABARAP, GALM,GARS,GBA,GBAP1 ,GDE1 ,GJA1 ,GOLM1 ,GPRC5A,GPX3GRE

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M1 ,GSTM2,HDDC2,HEPH,HEXB,HLA-A,HLA-DMA,HLA DPA1 ,HLADPB1.HLADRB4,HOOK2,HTRA2,IDH1,IDS,IFIT3,IGF2R,IGFBP6,IL10RBJL11RA JLKJTGA3JTGAE,JKAMP,KIF3B,KLHDC2,LAMA2,LAPTM4B,LASP1, LUM,MAGED1 ,MAN2A1 ,MAN2B2,MANBA,MANSC1 ,MAP2K1 .MFSD5, MKNKI.MLEC.MMGTI.MPHOSPHS.MRPLIT.MRPLSy.MRPSISSA.M TFR1 L,MTHFD1 L,MUL1 ,MYD88,NBAS,NDRG1 ,NDUFA9,NIF3L1 ,NLR P1 ,NME6,NPC1 «NSMCE1 ,NUDT2,OAT,OLFML3,OXA1 LP4HA2,P4HT M,PAMR1 ,PARP6,PCYOX1 ,PDE6D,PDL1 Ml ,PDXP,PEA15,PEAR1 ,P EF1 ,PELO,PGAM1 ,PGM1 ,PGRMC1 ,PHB2,PIGH,PLEKHG4,PLP2,PISS,PPAP2B,PPIAL4B,PPL,PRKAB1 .PRMTS.PRNP.PRPFS.PRPSI ,PR RC1 ,PSAP,PSMB8,PSMD10,PTGS1 ,QSOX2,RAB11 FIP5,RAF1 ,RAR

G,RBM23,RER1 ,RHBDD2,RP9,RPL29P2,RPL5,RPRD1 B,RPUSD4,RT CB,SCAMP2,SCG2,SDC4,SDHB,SEC22C,SEC23A,SEC63,SENP3,S

EP15,SERINC1,SERINC3,SF3B2,SFXN3,SGCE,SIAE,SLBP,SLC12A4 ,SLC1 A1 ,SLC35B1 ,SLC35E2,SLC35E3,SLC39A1 ,SLC39A7,SMPD1 ,S NORA70F,SNX11 ,SNX19,SPPL2A,SPRED2,SRPR,STAU1 ,STEAP1 B, STIM1 ,STK38,STX18,SYPL1 ,SYT11JAF11 ,TAPBPL,TBC1 D22BJCN 2,TCTA,TES,TFG,TFRC,TGFB3,TM7SF2,TM9SF1 JMBIM1JMCO1 ,T MCO3,TMED10.TMEM138,TMEM179B,TMEM185A,TMEM216,TMEM 50A.TNS1 ,TNS3,TPI1 P2,TRAM2,TRiM16L_iTSPAN9_!TUB,TUBA1 A,UB Α02,υΒΕ2Ε3,υΝ050,υ801 ,USP24,VCL,VOPP1 ,VPS25,VPS33B,WA SS.WBP1 ^ΝΤ5Β,ΖΟΟΗΟ24,ΖΕΡ91 ,ZMAT3_!ZMYM6NB,ZNF384,ZNF 667-AS1 [00464] Genes sobrerregulados para tratamento com SEQ ID 1 ACAA2,ACSL1 ,ACVR1 ,ADAR,ADD3,ADIPOR2,ADPRM,AGTR1 ,AKR1

B10.AKR1 B15,ALAD,ALG14,AMZ2,AMZ2P1 ,ANKHD1 ,APOL6,ASCC1, ASH2L,ATF5,ATG3,ATP5A1 ,ATP5C1 ,ATP5J2,ATP6V0E1 ,ATP6V1 B2, ATXN7L3B,B2M,B4GALT5,BBS4,BIRC5,BLMH,BOD1 ,BRK1 ,BST1 ,BT F3,C11orf73_iC16orf58,C17orf62,C19orf52,C1orf43,C4orf3,C5orf15,C5

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135/146 orf58,C7orf25,C8orf33,CALM1,CCNB11P1,CCNG2,CD47,CDCA8,CF DP1 ,CHAMP1 ,CHCHD3,CHURC1 ,CISD3,CKAP5,CLMP,CLTA,COA1, COG3,COG8,COPS8,COX14,CPD,CSTF1,CSTF2T,CTCF,CYB5R3,C YCS,CYTB,DCTN6,DCTPP1 ,DDX21 ,DDX5,DDX60,DECR1 ,DERL1 ,DF NA5,DHX15,DHX32,DRG1 ,DSTYK,EFNB3,EMCN,EIVIGI,ENDOD1 ,EN PP2,ERICH1 ,ETFA,EZH1 ,F8A2,FAM96A,FH,FOS,FOSB,FUCA2,FUN DC2,GABARAPL2,GADD45B,GALNT15,GAS1,GATS,GBF1,GBP1,GD E1 ,GGA3,GJA1 ,GLB1 ,GLUL,GOLM1 _!GPR89B_!GRAMD3,GSTA4,GTF 2E2,H2AFZ₎HES!,HEXB,HIBADH,HISTIH4F,HIST2H2AA4_IHMGN3,HM GN4,HNRNPM,HOOK2,HSPB8,IDH1 ,IER3,IFI44L,IFIT1 JFT88JMMP2 L,IMPA2,INTS12,KAT7,KCTD10,KDELR3,KIAA0196,KIF2C,K!FAP3,K LF10,KLHL18,LAP3,LAPTM4B,LDHA,LDLR,LETMD1,LMAN2L,LMO4, LOXL4,LRP10,LSM1,LTBP2,LYPD6B,LYSMD2,MAD2L1BP,MANBA,M AT2A,MCL1 ,MEDAG,MFAP1 ,M!FAS1 ,MIOS,MKKS,MMGT1 «MRFAP1, MROH5,MRPL20_!MRPL33,MYD88,NDN,NDRG1 ,NDUFV2,NKAP,NOL C1 ,NT5C3B,NT5E,OAS1 ,OAT,OAZ2,ODF3L2,OLFML1 ,OLFML2B,OS BP,OSTC,OTUD1 ,OXCT1 ,PAIP2_!PARL_iPARP9,PATL1 ,PCED1 A,PDE 1 A,PEAR1 ,PELO,PFKL,PFKM,PGAM1 ,PGK1 ,PGM1 ,PIGH,PLEKHJ1, POGK,POLD2,POLR2B,POLR3F,PPA2,PPAP2B,PPAPDC2,PPL,PPP 2CB,PPP2R2A_lPQLC2L₎PRC1₎PRDM4,PSMA2,PSMA5_lPSMD10_lPS ME4,PTGS1 ,PTP4A1 ,PTTG2,RAB31 ,RAB32,RAB9BP1 ,RABEP1 ,RAC 1 ,RASL11 B.RCN1 ,RHOA,RIOKI,RNASEL,RNF121 ,RNF146,RNLS,RP A2,RPL15,RPL21 P44,RPP38,RTCB.SEC22C,SEC23IP,SENP2.SEP1 5,SERP2,SERTAD4,SETX,SFRP1 .SFT2D1 .SGCE.SIAE.SLBP.Si^S A12_iSLC25A25,SLC30A9,SLC35B1 .SLC44A1 .SLC9A3R1 ,SMAD7,SM IM19,SNAPC5,SNHG3,SNORD116W^NORDgeA^NXW.SRRD.SRSFZ.STARDy^TKie.STCMSTOML 2,SUCLA2,SUCLG1 ,SYNGR4,SYTI1 ,TASP1 ,TCP1 ,TFRC,TGFBR2,TI MM17A,TIMMDC1,TINF2JMCO1,TMEM173,TMEM203,TMEM230,TM EM50A,TMEM50B,TMEM60,TMX2,TNC,TNS3,TOMM22,TOR1A,TOR

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136/146

3A,TP5313,TPBG,TP11 ,TRIB1 ,TRIL,TUBB3,TUG1 ,TUSC3,UBE2C,UB E2E3,UBE2L3,UGCG,UNC119,UQCRFS1 ,USP18,USP24,USP34,VA MP7,VDAC3,VIMAS1 ,V0PP1 ,WARS,WDR36,WDR48,WDR61 ,WDYHV1 ,WLS,WRB,XP NPEP1 ,XRCC6BP1 ,YIPF6,ZFP91 ,ZMAT2,ZNF157,ZNF281 ,ZNF384,Z NF426,ZNF564,ZNF696,ZNF75D,ZSCAN32 [00465] Genes sub-regulados para tratamento com SEQ ID 1 ABLIM1 ,ACTR2,ADAM20,AHSA2,ALDH1 L2,AMN,APC,APOLD 1 ,ARGLU1 ,ARPC5,ASAP1IT1 ,ATXN2,ATXN3,AURKAPS1 ,BCL2L11 ,BCLAF1 ,BRD1 ,BTG3,C14or f169,C1 QTNF5,C20orf141 ,C20orf96,C5orf28,C6orf203,CACNA2D1 ,C CDC102B,CCDC125,CCDC6,CCNG1,CCNL1,CD46,CEACAM19,CEN PC,CHML,CIRBP,CNN2,COL1 A1 ,COL4A1 ,CRYBG3,CWC22,DDX3X, DENND4B,DHRS3,DIAPH2,DLG1,DNAJB4,DNAJC3,DOCK6,DPEP3, DSE,DST,DYNLT3,DZIP3,EDIL3,EGLN1 ,EIF4G3,ELF2,ELP2,EPC1 ,F AM111 A,FAM177A1 ,FBXO32,FERMT2,FGF7,FNIP1 ,FOSL2,FOXN2,F RYLGABPB1AS1 ,GABRE,GLS,GOLGA6L4,GOLGA8R,GOLIM4,GPATCH11 ,GPR1 35,GTF2H5,HCG11 ,HCG18,HIF1A,HNRNPA1 ,HOOK3,HOXC6,HSP90 AA1,HSP90AA2P,HSPA1B,HSPA4,HSPH1,HTTJGF2R,ITGB3,JIVIJD4, KCNMB2AS1,KCTD3,KDM2A,KIAA1143,KIZ,KRAS,KRT8P12,LCE1D,LINC015 06,LOX,LPGAT1,LPP,LRP12,LRRC3C,MACF1,MAMDC2,MAP1B,MA P2K3,MAP3K10,MATR3,MBNL1,MBTPS2,MDIVI2,MDIVI4,IVIED15,MET TL15,MGC24103,MUSTN1,MYH3,MYH8,MYLPF,MYO6,MZF1,NAB1, NADK,NADK2,NBEAL1 ,NCKAP5,ND6,NEK7,NKTR,NR2C1 ,NRN1 ,OF D1 ,PAPOLA,PAWR,PAXBP1 ,PBRM1 ,PCDHGA2,PDE1 C,PDZD8,PEA K1 ,PFDN2,PGBD2,PHF1 ,PJA2,PLOD3,POLR2J2,PPIVIE1 ,PPP1 R14A, PPP1 R16B,PPP1 R2,PPP1 R3B,PRO2852,PRPF40A,PRUNE2,PTPN1 1,PUM2,PXK,RAB12,RAB2A,RBM10,RCN2,REEP3,REST,RHOBTB3,

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137/146

RHOQ,RIOK3,RNF19B,RNF215,RNPC3,ROBO1 ,R0CK1 ,RPL26L1 ,S AMD14,SDPR,SEPT7P2,SERP1 ,SFSWAP,SGIP1 ,SH3KBP1 ,SKI,SLC 35A5,SLC46A3.SLC7A5,SMARCC1 ,SMARCC2,SMN1,SNAR-

H,SNORA16A,SNORD89,SOX6,SPHAR,SREK1,SRSF11,STT3B,STX

2, TAB2,TFPI,THBS1,THOC2,TINAGL1,TMA16,TMEM106C,TMEM26AS1 ,TNFAIP8,TOB1 ,TTC28,TXLNG,UBE2D1 ,UBE2Q2P1 ,UBL3,UCHL 5,UPF2,UPF3A,USP15,USP33,UTRN,UVSSA,WHAMMP1,WNT3,YBX

3, YWHAZ,ZBTB2.ZFC3H1 ,ZMYND11 ,ZNF22,ZNF37A,ZNF429,ZNF52 5,ZNF532,ZNF626,ZRANB2,ZSWIM8

EXEMPLO 20

Proteomica

Metodologia [00466] Os níveis de proteína foram obtidos usando LC/MS/MS. A análise estatística das contagens de proteína resultou em proteínas pouco e superabundantes. Apenas os valores de alteração de dobra de nível de proteína absolutos acima de 0,379 foram retidos. Para todas essas proteínas, as alterações de dobra transcritas associadas da análise de micromatrizes são apresentadas.

[00467] Espectrometria de massa foi realizada por MSBioworks. Os péletes celulares foram iisados em 100 μ! de tampão de RIPA modificado por sonicação. A quantificação foi realizada usando fiuorometria Qubit. 20 pg de cada amostra foram separados em 4-12% de um gel de gradiente bis-tris usando o tampão MOPS. O gel foi tingido com coomassie e cada faixa foi excisada em 20 segmentos igualmente dimensionados. As peças de gel foram processadas usando um robô (ProGest, DigiLab) com o seguinte protocolo:

- Lavar com 25 mM de bicarbonate de amônio seguido por acetonitril.

- Reduzir com 10 mM de ditiotreitol a 60°C seguido por alquilação com 50 mM de iodoacetamida à RT.

- Digerir com tripsina (Promega) a 37°C por 4h.

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- Resfriar bruscamente com ácido fórmico e analisar o sobrenadante diretamente sem processamento adicional.

[00468] Os digestos foram analisados por nano LC/MS/MS com um sistema Waters NanoAcquity HPLC com interface com um ThermoFisher Q Exactive. Os peptídeos foram carregados em uma coluna de captura e eluídos sobre uma coluna analítica de 75 pm a 350 nL/min; ambas as colunas foram embaladas com resina Luna C18 (Phenomenex). Um gradiente de 30min foi empregado (10h total por amostra). O espectrômetro de massa foi operado em modo dependente de dados, com MS e MS/MS realizado em Orbitrap com resolução de 70.000 FWHM e 17.500 FWHM, respectivamente. Os quinze íons mais abundantes foram selecionados para MS/MS. Os dados foram pesquisados usando uma cópia local de Mascot com os seguintes parâmetros:

Enzima: Tripsina; Banco de dados: Swissprot Human (direto e reverso com contam inantes comuns anexados); Modificação fixa: Carbamidometil (C); Modificações variáveis: Oxidação (M), Acetil (Proteína N-terminal), Pyro-Glu (Q N-terminal), Desamidação (NQ); Valores de massa: Monoisotópicos

Tolerância de massa do peptídeo: 10 ppm; Tolerância de Massa do Fragmento: 0,02 Da; Clivagem perdida máxima: 2 [00469] Arquivos Mascot DAT foram analisados no software Scaffold para validação, filtragem e para criar uma lista não redundante por amostra. Os dados foram filtrados em 1 % de taxa de descoberta de falso nível de peptídeo e proteína (FDR) e exigindo pelo menos dois peptídeos únicos por proteína. As listas de proteínas sobre- e subreguladas foram então estimadas.

Espectrometría de Massa [00470] Os digestos foram analisados por nano LC/MS/MS com um sistema Waters NanoAcquity HPLC com interface com um

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ThermoFisher Q Exactive. Os peptídeos foram carregados em uma coluna de captura e eluídos sobre uma coluna analítica de 75 pm a 350 nL/min; ambas as colunas foram embaladas com resina Luna C18 (Phenomenex). Um gradiente de 30 min foi empregado (10h total por amostra). O espectrômetro de massa foi operado em modo dependente de dados, com MS e MS/MS realizado em Orbitrap com resolução de 70.000 FWHM e 17.500 FWHM, respectivamente. Os quinze íons mais abundantes foram selecionados para MS/MS.

EXEMPLO 21

QPCR em genes específicos de interesse e sua alteração de dobra.

Procedimento Experimentai [00471] PCR quantitativa foi realizada usando um método com base em sonda TaqMan, em que a expressão do mRNA alvo foi quantificada em relação à expressão do gene normalizador (housekeeping) B2M. Uma mistura principal contendo iniciador/sonda e Mistura Principal de Expressão Gênica Taqman® (ABI Biosystems, CA, EUA) foi adicionada a 1 μΙ de modelo de cDNA. Um volume final de 10 μΙ foi pipetado em uma cavidade da placa Lightcycler de 96 cavidades (Sarstedt, Numbrecht, Alemanha) em duplicata, e PCR em tempo real foi realizada em um termociclador em tempo real Roche Lightcycler 96 (Roche Diagnostics, Basal, Suíça). O ciclo limite (Ct) para cada cavidade foi calculado usando o software do instrumento. A análise de dados foi feita com base no método AACt com dados brutos normalizados pelo gene normalizador B2M incluído na placa. Os resultados são expressos como alteração de dobra sobre o controle.

[00472] Resultados de QPCR (os métodos de tratamento permanecem os mesmos; a concentração da SEQUÊNCIA ID NO. 1 permanece 0,5 pg/ml).

[00473] Glut 4, LEPR, Adiponectina, Leptina estão relacionados ao metabolismo da glicose. Outros se referem à síntese e degradação

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140/146 muscular.

Nome do gene	Alteração de dobra
Adiponectina	1,07
Leptina	0,51
PPARGC1A	0,69
PRKAG3	0,35
COX4I1	0,85
NRF1	0,54
SIRT	0,41
UQCRB	2,56
FBXO32	1,00
GLUT4	1,95
HSPA2	0,67
LEPR	1,20
MYOG	0,70
TRIM63	0,70
ACVR2B	0,48
MSTN	0,17

EXEMPLO 22

Investigação o efeito de um peptídeo sintético (SEQUÊNCIA IP NO. 1) no controle da glicemia em um modelo de obesidade e diabetes de rato Procedimento Experimental

Descrição dos animais:

® Espécies - KK.Cg-Ay/J (camundongo KKAY)

® Fonte	- Jackson Laboratories
® Idade	-12 semanas de idade
® Sexo	- Masculino
* Aleatorização Alojamento e Alimentação:	- Com base na glicemia de jejum basal
® Aclimatação	- Não menos que cinco dias

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141/146

® Alojamento	- Os camundongos serão alojados em um ciclo claro/escuro de 12 horas; - Não mais do que 4 camundongos por gaiola dependendo do tamanho - Sistema de suporte de gaiola ventilada
® Dieta	- Ração padrão de roedores e água ad iibitum

Projeto:

® Via de administração - Injeção subcutânea

® Volume(s) de dose	-10 ml/kg
® Níveis de dose	Artigos de teste: 100 μΜ/kg, Metformina: 250 mg/kg
® Número por grupo	-10

Número total de animais - 30

Tabela 1: projeto de estudo

T ratamento	Tamanho do grupo	Dose	Dias de dosagem	Dose e via	Avaliações/resultados
KKAY veículo	10	n/a	14	Injeção subcutânea	Peso corporal: (UMA VEZ/semana) Ingestão de alimentos/água: Diária Glicose de jejum: (2/semana) OGTT: (Dia 12 ou 13) HbA1C: (UMA VEZ/semana) Sangue terminal: Soro Coleta de tecido: Fígado, músculo,

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					pâncreas
KKAY metformina	10	250 mg/kg	14	Injeção subcutânea	Peso corporal: (UMA VEZ/semana) Ingestão de alimentos/água: Diária Glicose de jejum: (2/semana) OGTT: (Dia 12 ou 13) HbA1C: (UMA VEZ/Semana) Sangue terminal: Soro Coleta de tecido: Fígado, músculo, pâncreas
KKAY SEQ ID 1	10	100 μ/kg	14	Injeção subcutânea	Peso corporal: (UMA VEZ/semana) Ingestão de alimentos/água: Diária Glicose de jejum: (2/semana) OGTT: (Dia 12 ou 13) HbA1C: (UMA VEZ/Semana) Sangue terminal: Soro Coleta de tecido: Fígado, músculo, pâncreas

Teste de Tolerância à Glicose Oral em Camundongos KKAY [00474] Durante o OGTT, os camundongos foram sangrados para

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143/146 glicose basal e insulina em -30 min (basal). Isto foi imediatamente seguido pela administração de artigos de teste. 30 min mais tarde, isto é, em 0 min, a todos os camundongos foi administrada uma solução de glicose (2 g/kg) através de administração por sonda esofágica. Após o teste de glicose, os níveis de glicose no sangue foram medidos de acordo com o cronograma abaixo.

Tabela 2: Paradigma do Tratamento OGTT

Tempo (minutos)	Tratamento	Medição
-30		Glicose Basal/lnsulina
0	Injeção de veículo/Metformina/compostos de teste
20		Glicose Basal/lnsulina
40		Glicose Basal/lnsulina
60		Glicose Basal/lnsulina
120		Glicose Basal/lnsulina

Ό0475] Os resultados estão ilustrados nas Figuras 18 a 20. A Figura 18 ilustra a glicose de jejum no sangue após 5 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 em camundongos KKAY. A Figura 19 ilustra a glicose de jejum no sangue após 7 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 em camundongos KKAY. A Figura 20 ilustra o peso corporal de camundongos KKAY após 13 dias de tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1.

Conclusão [00476] O tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 reduziu significativamente a glicose no sangue após 7 dias de tratamento. O tratamento com um peptídeo da SEQUÊNCIA ID NO. 1 não causou um aumento no peso corporal como muitos tratamentos antidiabetes fazem. A SEQUÊNCIA ID NO. 1 reduziu o peso corporal no

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144/146 grupo de tratamento em relação ao grupo não tratado.

EXEMPLO 23

Ensaio de antioxidação (ensaio de atividade de sequestro de radicais de DPPH) [00477] O teste de DPPH foi conduzido usando o método descrito em Lin et al. (Lin SY, Wang J, Zhao P, Pang Y, Ye HQ, Yuan Y, Liu JB and Jones G, Optimized antioxidant peptides fractions preparation and secondary structure analysis by MIR. Int J Biol Macromol 59: 151-157 (2013)).

[00478] Os radicais de DPPH foram dissolvidos em etanol a uma concentração final de 0,1 mM. O peptídeos e ácido ascórbico (controle positivo) foram dissolvidos em água desionizada para obter a concentração testada.

[00479] Em uma placa de 96 cavidades, as amostras foram preparadas como a seguir: 100 pL de solução de DPPH 0,1 mM, 100 pL de solução de peptídeos e 100 pL de etanol foram misturados por cavidade.

[00480] O ácido ascórbico foi preparado como a seguir: 100 pL de solução de DPPH 0,1 mM, 100 pL de solução de ácido ascórbico e 100 pL de etanol foram misturados por cavidade.

[00481] O branco foi preparado como a seguir: 100 pL de solução de DPPH 0,1 mM, 200 pL de etanol foram misturados por cavidade.

[00482] Três cavidades foram usadas por condições testadas.

[00483] A placa foi incubada no escuro a 25°C por 30 min. A absorbância a 517 nm foi, então, medida usando um leitor de placas.

[00484] A atividade de sequestro de radicais de DPPH (%) foi calculada como a seguir:

Atividade de sequestro de radicais de DPPH (%) = [1- (amostra de absorbância/branco de absorbância)] x 100 [00485] Os dados foram apresentados como média de porcentagem

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145/146 da atividade de sequestro de radicais de DPPH +/- desvio padrão.

EXEMPLO 24

Ensaio de Resposta Inflamatória [00486] O TNF-alfa é secretado por macrófagos em resposta à estimulação por endotoxinas, tais como os lipopolissacarídeos (LPS). Acredita-se que o TNF-alfa esteja envolvido na inflamação sistêmica e que a desregulação da produção de TNF-alfa esteja envolvida em muitas doenças. O ensaio de Biolegenda é um kit ELISA em sanduíche que é projetado para a quantificação precisa de TNF-alfa humano a partir do sobrenadante de cultura celular, soro ou plasma.

[00487] Os monócitos de THP-1 foram semeados em uma placa de 96 cavidades a 10.000 células por cavidade em RPMI contendo 10% de soro fetal de bezerro (FCS), 1% de Pen/strep, 1% de L-glutamina, 100 nM de PMA e foram permitidos diferenciar por 72 h antes da experimentação. Após a diferenciação, as células foram incubadas com 100 ng/ml, 10 ng/ml ou 1 ng/ml de peptídeo sintético por 24h, respectivamente. Após o tratamento, as células foram estimuladas com 10 ng/ml de LPS por 5h e a quantidade de TNF-alfa no sobrenadante foi determinada usando o kit ELISA de ensaio de Biolegenda.

[00488] Os resultados foram calculados como uma porcentagem do controle não tratado. Um aumento na leitura da densidade óptica indica maior quantidade de liberação de TNF-alfa no sobrenadante da cultura celular. Todas os experimentos foram preparados em duplicata em três placas (6 cavidades/condições). A significância foi calculada usando o teste t de Student (*p <0,05 em comparação com o controle, **p <0,01 em comparação com o controle, ***p <0,001 em comparação com o controle).

Equivalentes [00489] A descrição acima detalha as modalidades atualmente preferidas da presente invenção. Espera-se que várias modificações e

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146/146 variações na prática da mesma ocorram aos versados na técnica após a consideração dessas descrições. Essas modificações e variações devem ser englobadas nas reivindicações anexas a este documento.

Digitador, o quadro reivindicatório foi conferido por PTS e está salvo na PV.

Claims (35)

1. REIVINDICAÇÕES

   1. Composição compreendendo um peptídeo de até 50 aminoácidos, caracterizada pelo fato de que o peptídeo compreende uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1.
2. 2. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição cosmética tópica compreendendo uma quantidade cosmeticamente eficaz de um peptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1.
3. 3. Composição, de acordo com a reivindicação 1 ou 2, caracterizada pelo fato de que o referido peptídeo é um peptídeo bioativo.
4. 4. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que compreende uma pluralidade de peptídeos.
5. 5. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que a composição ainda compreende pelo menos um excipiente ou aditivo cosmeticamente aceitável.
6. 6. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada peio fato de que a composição ainda compreende pelo menos um ativo cosmeticamente aceitável.
7. 7. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações anteriores, caracterizada pelo fato de que o peptídeo tem uma ou mais de atividade antienvelhecimento, atividade de promoção do crescimento ceiular, atividade de promoção do transporte de glicose, atividade anabólica ou atividade de síntese de proteína.
8. 8. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado peio fato de ser como um cosmético.

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   2/5
9. 9. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser no retardo, na inibição ou na prevenção de envelhecimento da pele humana.
10. 10. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na melhoria do estado muscular em um mamífero.
11. 11. Uso, de acordo com a reivindicação 10, caracterizado pelo fato de que o estado muscular é promover a recuperação do músculo, normalmente após exercícios, mantendo ou restaurando a saúde muscular (por exemplo, massa de tecido magra) em um mamífero, e/ou melhorando o desempenho físico.
12. 12. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na promoção do crescimento de tecido.
13. 13. Uso, de acordo com a reivindicação 12, caracterizado pelo fato de que o crescimento de tecido é na promoção do crescimento de tecido epitelíal, promoção do crescimento de pele, promoção do crescimento de um órgão e/ou promoção do crescimento de um organismo.
14. 14. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser na promoção do crescimento muscular.
15. 15. Uso não terapêutico da composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, caracterizado pelo fato de ser no aumento da síntese de proteína.
16. 16. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 7, ou uso, de acordo com qualquer uma das reivindicações 8 a 15, caracterizada pelo fato de que a composição é em uma formulação selecionada do grupo que consiste em cremes,

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    3/5 múltiplas emulsões, composições anidras, dispersões aquosas, óleos, leites, bálsamos, espumas, loções, géis, géis em creme, soluções hidroalcoólicas, soluções hidroglicóligas, cosmético, produto de higiene pessoal, hidrogéis, linimentos, soros, sabões, pó para polvilhar, pasta, formulações semissóiidas, linimentos, soros, xampu, condicionador, pomadas, qualquer formulação de enxágue, talco, musses, pós, sprays, aerossóis, soluções, suspensões, emulsões, xaropes, elixires, filmes de polissacarídeo, emplastros, emplastros em gel, curativos, um sistema adesivo, emulsões água em óleo, emulsões óleo em água e emulsões de silicone.
17. 17. Dispositivo médico, caracterizado pelo fato de que compreende a composição, como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a 7 ou 16.
18. 18. Composição, de acordo com a reivindicação 1, caracterizada pelo fato de que a composição é uma composição farmacêutica compreendendo uma quantidade terapeuticamente eficaz de um peptídeo tendo 5 a 50 aminoácidos e compreendendo uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO. 1, em combinação com um veículo farmaceuticamente adequado.
19. 19. Composição, de acordo com a reivindicação 18, caracterizada pelo fato de que o peptídeo consiste essencialmente na SEQUÊNCIA ID NO: 1.
20. 20. Composição, de acordo com a reivindicação 18 ou 19, caracterizada pelo fato de ser formulada para administração oral ou parenteral a um paciente.
21. 21. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 20, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é um peptídeo modificado.
22. 22. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 21, caracterizada pelo fato de que o peptídeo é

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    4/5 modificado para aumentar sua meia-vida em plasma.
23. 23. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 22, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de diabetes ou pré-diabetes.
24. 24. Composição, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 23, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição distinguida por desperdício catabólico, incluindo sarcopenia ou caquexia.
25. 25. Composição farmacêutica, de acordo com qualquer uma das reivindicações 18 a 24, caracterizada pelo fato de ser para uso em um método de tratamento ou prevenção de uma doença ou condição mediada por estresse oxidativo.
26. 26. Uso, como definido na reivindicação 25, caracterizado pelo fato de que a doença ou condição mediada por estresse oxidativo é selecionada de aterosclerose e câncer.
27. 27. Peptídeo, caracterizado pelo fato de que consiste em até 50 aminoácidos e compreende uma sequência de aminoácidos da SEQUÊNCIA ID NO: 1.
28. 28. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 27, caracterizado pelo fato de que é modificado.
29. 29. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que é modificado com um grupo de proteção.
30. 30. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 29, caracterizado pelo fato de que é modificado com um grupo de proteção N-terminal ou C-terminal.
31. 31. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que é modificado por substituição de pelo menos um L-aminoácido com um D~isômero.
32. 32. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28,

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    5/5 caracterizado peto fato de que é modificado com um grupo de modificação selecionado de bipolietileno glicol (PEG), monometóxipolíetHeno glicol, dextrano, poli-(N-vinil pirrolidona) polietileno glicol, homopolímeros de propileno glicol, um copolímero de óxido de polipropileno/óxido de etileno, polipropileno glicol, polióis polioxietilados (por exemplo, glicerol) e álcool poiiviníItoo, ácidos colomíntoos ou outros polímeros à base de carboidrato, polímeros de aminoácidos e derivados de biotina.
33. 33. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado pelo fato de que é modificado por substituição de peto menos um aminoácido com um análogo de aminoácido.
34. 34. Peptídeo, de acordo com a reivindicação 28, caracterizado peto fato de que é modificado para aumentar a resistência do peptídeo modificado à degradação proteolítica para proteases gastrointestinais de mamíferos.
35. 35. Peptídeo ou peptídeo modificado, de acordo com qualquer uma das reivindicações 28 a 34, caracterizado pelo fato de ser para uso como um medicamento.