CN107050050A - 一种肾小球和肾小管复合损伤的猕猴慢性肾病模型的建立方法 - Google Patents
一种肾小球和肾小管复合损伤的猕猴慢性肾病模型的建立方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了阿霉素和/或顺铂联合本发明涉及阿霉素与顺铂联合使用在制备用于筛选治疗慢性肾病的动物模型中的用途，其中阿霉素的施用剂量为1～2mg/Kg/次，顺铂的施用剂量为2mg/kg/天；所述动物为灵长类动物。本发明还公开了一种制备慢性肾病的动物模型的方法。本发明方法可以有效建立伴有小球和小管间质复合损伤的猕猴慢性肾病动物模型，而且制备方法安全，可以用于相关药物的筛选，应用前景优良。
Description
技术领域
本发明涉及慢性肾病的动物模型的建立，具体地，是伴有小球和小管间质复合损伤的猕猴慢性肾病动物模型的建立。
背景技术
各种病理因素导致的慢性肾病(CKD)是人类心血管疾病、早衰及终末期肾病的主要风险因素之一。成年人慢性肾病发病率为8％-12％。西方国家，慢性肾病患病率在65岁以上老年人中达到25％；中国11.5％左右，城市(13％)高于农村(10％)。在CKD患者中，仅8.7％被诊断，4.9％患者得到治疗。CKD具有发病率高、伴发心血管病患病率高、病死率高；对CKD的知晓率低、防治率低、伴发心血管病知晓率低“三高三低”特点。随我国人群饮食结构和生活习惯的改变，其他的继发性慢性肾病正不断增多，如糖尿病肾病、高血压肾病等使慢性肾病的防治工作面临严峻挑战。
目前针对慢性肾病的应用基础研究实验对象主要是啮齿类动物，研究结果的应用有很大局限性，非人灵长类动物作为目前动物界最高等种群，在解剖结构、生理代谢及免疫系统等与人类有高度相似性，大概有98.5％的基因与人类具有同源性，是级别最高的非人慢性肾病模型使用物种，但利用非人灵长类动物建立模拟人类慢性肾病发生发展过程的慢性肾病模型不多，尤其兼顾肾小球和肾小管损伤模型很少，目前文献仅报道猴免疫缺陷病毒SHIV诱导，因SHIV存在人源性感染的风险，安全性差，因此有必要探索新的、安全的方法建立此类模拟人类慢性肾病模型，为后期研究打下良好的模型基础。
发明内容
本发明的技术方案是提供了一种伴有小球和小管间质复合损伤的慢性肾病动物模型的构建方法。
本发明提供了阿霉素和/或顺铂在制备用于筛选治疗慢性肾病的动物模型中的用途，其中阿霉素的施用剂量为1～2mg/Kg/次，顺铂的施用剂量为2mg/kg/天；所述动物为灵长类动物。
其中，使用阿霉素和顺铂时，阿霉素和顺铂的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，开始加用顺铂，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg，加顺铂同时给予阿霉素，剂量为2mg/kg。
其中，使用阿霉素或顺铂时，阿霉素的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg；顺铂的给药方式为：给药2次，第1次给药后60天再给一次，给药剂量为5mg/kg。
其中，所述阿霉素为静脉注射施药；所述的顺铂为腹腔注射施药。
其中，所述的动物模型是伴有小球和小管间质复合损伤的猕猴动物慢性肾病动物模型。
本发明还提供了前述慢性肾病的动物模型的制备方法，它是将阿霉素和/或顺铂施用于灵长类动物，其中阿霉素的施用剂量为1～2mg/Kg/次，顺铂的施用剂量为2mg/kg/天。
其中，使用阿霉素和顺铂时，阿霉素和顺铂的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，开始加用顺铂，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg，加顺铂同时给予阿霉素，剂量为2mg/kg。
其中，使用阿霉素或顺铂时，阿霉素的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg；顺铂的给药方式为：给药2次，第1次给药后60天再给一次，给药剂量为5mg/kg。
其中，所述阿霉素为静脉注射施药；所述的顺铂为腹腔注射施药。
其中，所述灵长类动物为猕猴。
本发明还提供了一种筛选治疗慢性肾病的药物的方法，包括如下步骤：
a、按照前述的方法建立的慢性肾病模型；
b、将候选物施用于a步骤所述的慢性肾病模型；
c、用慢性肾病动物模型评价潜在的治疗慢性肾病的药物。
本发明方法可以有效建立伴有小球和小管间质复合损伤的猕猴慢性肾病动物模型，而且制备方法安全，可以用于相关药物的筛选，应用前景优良。
由于灵长类动物本身的特殊性，采用药物的方式建立慢性肾病动物模型非常困难，本发明采用特定的药物剂量和给药次数，成功制备得到了猕猴慢性肾病动物模型，效果显著。
根据本发明的上述内容，按照本发明相关领域的普通技术知识和惯用手段，在不脱离本发明上述基本技术思想前提下，还可以做出其它多种形式的修改、替换或变更。
附图说明
图1建模第120天时肾小球HE、Masson和PASM染色。蓝染胶原纤维主要表达于肾小囊壁层周边，肾小球系膜区也呈不同程度蓝染。除正常组外，余三组蓝色较深，范围较广，阿霉素组和联合组更加明显。PASM染色见黑色银染颗粒主要沉积于肾小球内系膜区，显示系膜轻-中度局灶节段性硬化不伴系膜基质增生、系膜局部增厚。联合组较阿霉素组和顺铂组更典型，局部足细胞肿胀、空泡样变性。阿霉素组、顺铂组肾小球内皮细胞、系膜细胞无明显增生、血管腔无明显受压、未见到明显炎性细胞浸润，联合组局部肾小球血管腔扩张，×400。
图2建模第120天时肾小管HE、Masson和PASM染色。阿霉素组肾小管部分管腔缩小、肾小管上皮细胞增高、管周胶原纤维化；顺铂组大部分肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞水肿变性及空泡样变性明显、管周胶原纤维化。联合组肾小管管腔缩小，呈中-重度萎缩、肾小管上皮细胞增高、管周胶原纤维化。阿霉素组、顺铂组及联合组管周无明显银染颗粒沉积，间质内无明显炎性细胞浸润，×400。
具体实施方式
实施例1本发明动物模型的制备
1材料和方法
1.1主要材料和试剂
雌性猕猴12只，购自四川宜宾横竖生物科技有限公司。初始体重4.5±0.5kg，猕猴单笼喂养，专用饲料喂养，每日2次，每次饲料后加一个苹果，清洁饮水。
PASM试剂盒来(货号36-47，北京环宇金鹰科技)、Masson试剂盒(货号D026，南京建成)、阿霉素冻干粉(产品编码：1599494734，山东普德药业)、顺铂(产品编号：A14200156601，齐鲁制药)，余为常规化学分析纯试剂。
1.2建模和分组
雌性猕猴12只，体重(4.5±0.5kg)，分4组，每组3只。分别为正常组、阿霉素组、顺铂组和阿霉素+顺铂联合组。联合组给药方式为阿霉素静脉给药，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg，停药1周，开始加用顺铂，每间隔一周1次给药，连续4次，腹腔注射，剂量为2mg/kg，加顺铂同时给予阿霉素，剂量为2mg/kg；阿霉素组同联合组阿霉素给药方法；顺铂组腹腔注射5mg/kg，第60天时再重复一次。在给药第0、30、60、90、120天检测血清肌酐、尿素氮、肾小球滤过率、总蛋白、白蛋白、肝功血钙、磷指标。
1.3猕猴肾组织HE、Masson和PASM染色
给药第120天，肾脏穿刺活检，常规石蜡包埋切片，片厚5μm，进行肾组织HE、Masson和PASM染色。
1.3.1 HE染色：常规二甲苯脱蜡、梯度酒精水化后水洗2次，每次3分钟。苏木素染色5分钟，1％盐酸乙醇分化、1/400氨水反蓝后水洗，伊红2分钟，水洗后梯度酒精脱水、二甲苯透明、中性树胶封片后镜下观察肾皮质肾小球皮质部位肾小管病理变化。
1.3.2 Masson染色：石蜡切片脱蜡至水，依次自来水和蒸馏水洗。苏木精染液染核5-10min。充分水洗,如过染可盐酸酒精分化、蒸馏水洗。用Masson丽春红酸性复红液5-10min。以2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。1％磷钼酸水溶液分化3-5min。不经水洗,直接用苯胺蓝或光绿液染5min。以0.2％冰醋酸水溶液浸洗片刻。95％酒精、无水酒精、二甲苯透明、中性树胶封固。
1.3.3 PASM染色：切片脱蜡至水、蒸馏水洗，高碘酸溶液处理10-15分钟，蒸馏水速洗2遍，浸入水浴至58-60度的六胺银工作液内20-30分钟，镜下控制银染色的强度，蒸馏水速洗后进入氯化金溶液处理1分钟，5％海波处理1分钟，水洗，苏木素复染细胞核，分化返兰、脱水、透明、封片，镜下观察肾皮质肾小球。
1.4统计分析
血清肾功数据用均数±标准差表示，组内差异采用单因素方差分析(Banferronipost hoc test)，组间差异采用配对t检验。P<0.05，有显著统计学差异。
2结果
2.1猕猴一般情况及体重变化
实验过程中，各组猕猴表现有明显不同，联合组猕猴较阿霉素组和顺铂组精神差、反应慢、不爱活动、食欲差、身体消瘦明显、毛色暗淡无光泽。各组猕猴体重变化，联合组体重随给药时间逐渐下降，阿霉素组和顺铂组体重随时间稍增加(表1)。
表1猕猴体重变化(均数±标准差，n＝3)
2.2猕猴肾功变化
血清生化检测结果显示给药第30天时，各组肌酐、尿素氮较给药前增高，顺铂组增加更显著。第60天时，阿霉素组和顺铂组肌酐、尿素氮下降，联合组仍上升，到90天时各组均升高，120天时下降，但联合组肌酐和尿素氮水平较阿霉素组和顺铂组高。肾小球滤过率各组从给药第30天时开始就明显下降，到第120天时，阿霉素组和顺铂组较给药前下降近25％，联合组较给药前下降近40％。血清白蛋白给药后三个模型组均呈下降趋势，到给药第120天时阿霉素组和顺铂组恢复近正常水平，联合组呈进行性下降。肝功能AST、ALT指标随给药时间呈进行性增加。在给药后第120天，顺铂组AST接近给药前水平，阿霉素组和联合组仍较给药前明显增加，三个模型组ALT均较给药前明显增加，联合组更甚。血清钙、磷结果显示第30天时，三个模型组血钙和血磷均稍上升；60天时，阿霉素组和顺铂组血钙轻度降低、血磷升高，120天时血钙近给药前水平，血磷仍较给药前高。联合组血钙和血磷随时间增高，到120天联合组血钙和血磷水平均较给药前增高(表2)。
表2建模不同时间各组猕猴肾功变化(均数±标准差，n＝3)
注：a,dP<0.05，与同时间点另三组比较；b,c,eP<0.05，与同组给药前比较。
2.3猕猴肾组织病理变化
建模第120天时肾小球病理变化显示蓝染胶原纤维主要表达于肾小囊壁层周边，肾小球系膜区也呈不同程度蓝染。除正常组外，余三组蓝色较深，范围较广，阿霉素组和联合组更加明显。PASM染色见黑色银染颗粒主要沉积于肾小球内系膜区，显示系膜轻-中度局灶节段性硬化不伴系膜基质增生、系膜局部增厚。联合组较阿霉素组和顺铂组更典型，局部足细胞肿胀、空泡样变性明显。阿霉素组、顺铂组肾小球内皮细胞、系膜细胞无明显增生、血管腔无明显受压、未见到明显炎性细胞浸润，联合组局部肾小球血管腔扩张(图1)。
建模第120天时阿霉素组肾小管部分管腔缩小、肾小管上皮细胞增高、管周胶原纤维化；顺铂组大部分肾小管管腔扩张，肾小管上皮细胞水肿变性及空泡样变性明显、管周胶原纤维化。联合组肾小管管腔缩小，呈中-重度萎缩、肾小管上皮细胞增高、管周胶原纤维化。阿霉素组、顺铂组及联合组管周无明显银染颗粒沉积，间质内无明显炎性细胞浸润(图2)。
综合上述检测指标可以看出，本发明单独给予阿霉素组、顺铂，或者联合给予阿霉素组和顺铂，可以使得肾小球滤过率下降，并有尿白蛋白等肾损伤标志物出现，肾小管出现了病变，和人类慢性肾病的病理和肾功变化过程相似，说明成功制备得到了慢性肾病模型，同时兼顾了肾小球和肾小管的损伤。其中，特别是阿霉素和顺铂联合诱导慢性肾病模型的各个指标变化较大。
该实验证明，本发明建立了猕猴的慢性肾病模型，可用于筛选治疗慢性肾病的药物及治疗方法。
Claims (10)
1.阿霉素和/或顺铂在制备用于筛选治疗慢性肾病的动物模型中的用途，其中阿霉素的施用剂量为1～2mg/Kg/次，顺铂的施用剂量为2mg/kg/天；所述动物为灵长类动物。
2.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：使用阿霉素和顺铂时，阿霉素和顺铂的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，开始加用顺铂，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg，加顺铂同时给予阿霉素，剂量为2mg/kg。
3.根据权利要求1所述的用途，其特征在于：使用阿霉素或顺铂时，阿霉素的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg；顺铂的给药方式为：给药2次，第1次给药后60天再给一次，给药剂量为5mg/kg。
4.根据权利要求1-3任意一项所述的用途，其特征在于：所述阿霉素为静脉注射施药；所述的顺铂为腹腔注射施药。
5.根据权利要求1-4任意一项所述的用途，其特征在于：所述的动物模型是伴有小球和小管间质复合损伤的猕猴动物慢性肾病动物模型。
6.一种制备慢性肾病的动物模型的方法，其特征在于：它是将阿霉素和/或顺铂施用于灵长类动物，其中阿霉素的施用剂量为1～2mg/Kg/次，顺铂的施用剂量为2mg/kg/天。
7.根据权利要求5所述的模型的方法，其特征在于：使用阿霉素和顺铂时，阿霉素和顺铂的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，开始加用顺铂，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg，加顺铂同时给予阿霉素，剂量为2mg/kg；
使用阿霉素或顺铂时，阿霉素的给药方式为：先给予阿霉素，每周1次，第1-4周剂量分别为4mg/kg、2mg/kg、1mg/kg和2mg/kg；停药1周后，每间隔一周1次给药，连续4次，剂量为2mg/kg；顺铂的给药方式为：给药2次，第1次给药后60天再给一次，给药剂量为5mg/kg。
8.根据权利要求6或7所所述的方法，其特征在于：所述阿霉素为静脉注射施药；所述的顺铂为腹腔注射施药。
9.根据权利要求6-8任意一项所述的方法，其特征在于：所述灵长类动物为猕猴。
10.一种筛选治疗慢性肾病的药物的方法，包括如下步骤：
a、按照权利要求6-9任意一项所述的方法建立的慢性肾病模型；
b、将候选物施用于a步骤所述的慢性肾病模型；
c、用慢性肾病动物模型评价潜在的治疗慢性肾病的药物。
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