CN105434447A

CN105434447A - 一种慢性肾脏病血管钙化实验模型的建立方法

Info

Publication number: CN105434447A
Application number: CN201410432207.6A
Authority: CN
Inventors: 张雪梅; 彭文; 陈启菁; 王浩
Original assignee: Fudan University
Current assignee: Fudan University
Priority date: 2014-08-28
Filing date: 2014-08-28
Publication date: 2016-03-30

Abstract

本发明属肾脏病学领域，涉及一种慢性肾脏病血管钙化实验模型及其制备方法。本发明利用C57BL/6小鼠造模，采用腺嘌呤联合维生素D，配合高磷低蛋白饮食的干预方式，建立慢性肾脏病血管钙化实验模型。本发明的制备方法成模时间短，稳定性好；建立的慢性肾脏病血管钙化实验模型可进一步用于筛选治疗慢性肾脏病血管钙化的药物及其机制研究。

Description

一种慢性肾脏病血管钙化实验模型的建立方法

技术领域

本发明属肾脏病学领域，涉及一种慢性肾脏病血管钙化实验模型的建立方法。

背景技术

目前医学界公认，CKD-MBD(chronickidneydisease-mineralandbonedisorder，肾性骨骼病变)是指由慢性肾脏病引起的矿物质和骨代谢系统性紊乱，其中，血管钙化是CKD的常见并发症，各期CKD患者均存在程度不等的钙磷代谢紊乱，由此所引起的血管钙化是CKD患者晚期心血管事件死亡的独立危险因素。

通常，现有技术常采用5/6th切除大鼠肾模型和腺嘌呤大鼠肾毒性模型进行肾衰竭引起血管钙化的研究。在上述两个模型中，受到急性肾损伤后的实验动物回出现严重的高磷酸盐血症和甲状旁腺机能亢进，随后发展成CKD。所述5/6th切除大鼠肾模模型较经典，所发生的肾小球损伤与人的局灶节段性肾小球硬化相似，一般8周到12周后手术组出现血肌酐、尿素氮明显增高，低血钙，高血磷，呈现典型的慢性肾衰竭症状，并出现血管钙化、骨密度下降等心血管及肾性骨病等慢性肾衰竭并发症表现；但该模型存在以下缺点：(1)需通过一步法或两步法外科手术建立模型，增加了麻醉意外和手术感染的几率；(2)建模周期较长，通常需要18周以上；相比之下，所述腺嘌呤大鼠肾毒性模型因其简便易行，成活率高近年来引起较多关注，其比5/6th切除大鼠肾模型有更快速和严重的肾病进展以及甲状旁腺机能亢进和动脉钙化，通常给予含0.75％腺嘌呤的饮食4周后出现CKD症状，表现为继发性甲状旁腺功能亢进症，甲状旁腺增生，血中甲状旁腺激素急剧升高，钙磷代谢严重紊乱，骨的再吸收作用增强，主动脉、冠状动脉以及其他软组织的钙化形成；所述主动脉钙化主要出现在中膜，与临床上典型的慢性透析病人动脉钙化极为相似，但该模型亦存在两大缺点：(1)由于大鼠自由进食，摄取腺嘌呤的量有较大差异，模型个体差异较大；(2)是该模型会引起大鼠严重的体重下降，甚者在建模后体重几乎下降了50％。上述缺陷明显不利于药物研究和筛选，基于此，Terai等改良了腺嘌呤大鼠肾毒性模型，给予大鼠灌胃600mg/kg/d腺嘌呤，10天后即造成急性肾损伤，且未见明显体重下降；但所建模型的最大缺点是血管钙化发生率较低，在第8周时只有12.5％左右，尽管其表现有肾毒性和骨改变。

综上所述，目前的慢性肾脏病血管钙化动物模型均采用大鼠造模，且成模率普遍不高；且由于大鼠实验要求药物用量大，实验空间大，劳动量大，业内对采用该类动物模型进行筛选、评价抗血管钙化的药物不乐观。

同时，基于实验小鼠仅限于基因敲除模型，如：载脂蛋白E缺陷小鼠、骨桥蛋白(OPN)缺陷小鼠、基质Gla蛋白(MGP)缺陷小鼠、骨保护素(osteoprotegerin,OPG)缺陷小鼠等；基因敲除的方法虽然可排除饮食和药物诱导血管钙化时所伴随的副作用和复合因素，但其制备过程复杂，需时长，且成本较高，无法得到广泛应用。

当前，国内外尚未见有关腺嘌呤或5/6Nx切除诱导小鼠血管钙化模型的报道，其可能与小鼠进行肾切除手术难度较大或给药后死亡率较高有关。

发明内容

本发明的目的是提供一种慢性肾脏病血管钙化实验模型的建立方法。

本发明所采用的技术方案是：

采用腺嘌呤联合维生素D，配合高磷低蛋白饮食，建立慢性肾脏病血管钙化实验模型。本发明的实施例中，采用腺嘌呤联合维生素D，配合高磷低蛋白饮食，建立慢性肾脏病血管钙化实验C57BL/6小鼠模型。

本发明的慢性肾脏病血管钙化实验模型通过下述方法建立，其包括步骤：

(1)采用腺嘌呤(剂量100mg/kg)对实验C57BL/6小鼠，每隔2天灌胃1次，持续1周；

(2)第2周至第6周，每周给药同样剂量的腺嘌呤1次；

(3)第2周至第6周，每隔2天给药活性维生素D₃Calcitriol1μg/kg；本发明的实施例中采用腹腔注射给药方式；

(4)第2周至第6周，模型鼠全部采用高磷低蛋白饮食(含磷量为1.2％)，建立慢性肾脏病血管钙化动物模型。

对制得的慢性肾脏病血管钙化实验模型进行性能鉴定：其包括步骤：

(1)建立模型6周后，常规处理实验动物，取鉴定样品(血或肾脏、血管组织)；

(2)测定血液生化指标；

(3)肾脏组织进行HE染色，血管组织进行vonkossa染色；

(4)数据分析；

鉴定结果显示：

(1)所述实验模型血清中的尿素氮(BUN)，血肌酐(Cre)，尿酸(UA)，血磷(P)，血(Ca)均显著增加；

(2)部分实验模型发生明显血管钙化；或发生血管壁明显增厚，中层纤维变形的血管病变；

结果表明，本发明采用腺嘌呤联合1,25(OH)₂D₃和高磷饮食可致实验小鼠肾毒性，并引起血管钙化制得慢性肾脏病血管钙化实验模型，本方法成模时间短，稳定性好；所述慢性肾脏病血管钙化模型可进一步用于筛选治疗慢性肾脏病血管钙化的药物及其机制研究。

附图说明

图1为建立模型的操作步骤。

图2显示了建模后小鼠血清生化指标的变化情况，其中：

A为血清尿素氮变化；B为血肌酐变化；C为尿酸变化；D为血磷变化；E为血钙变化。

图3显示了建模后小鼠肾脏病理学的变化，其中：

A为对照组(未造模)小鼠的肾脏形态学情况；B为模型小鼠的肾脏病形态学情况。

图4显示了建模后小鼠血管病理学的变化，其中：

A为对照组(未造模)小鼠的血管形态学情况；B为模型组发生钙化小鼠的血管形态学情况；C为模型组未发生钙化小鼠的血管形态学情况。

具体实施方式

实施例1建立慢性肾脏病血管钙化实验模型

(1)采用剂量100mg/kg腺嘌呤，每隔2天灌胃1次实验C57BL/6小鼠，持续1周；

(2)第2周至第6周，每周给药同样剂量的腺嘌呤1次；

(4)第2周至第6周，模型鼠全部采用含磷量为1.2％的高磷低蛋白饮食，建立慢性肾脏病血管钙化实验模型。

组织取材和血液指标测定：

各动物称体重，取血分离血清，分离胸主动脉，取双肾脏称平均质量；所有组织分成两部分，一部分置于4％的多聚甲醛中，做常规石蜡包埋、切片，供病理和免疫组化检查，另一部分肾置于-80℃冰箱中备用；血清用自动生化分析仪测定血钙、血磷、尿素氮(BUN)、肌酐(Cre)、尿酸(UA)含量；

测定结果显示：与对照组相比，模型血清BUN，Cre，UA,P，Ca均显著增加，表明所建的实验模型致肾衰效果明显；

制备石蜡切片：

(1)取材的组织样品4％多聚甲醛中固定48小时以上；

(2)乙醇梯度脱水：70％乙醇24小时，80％乙醇12小时，95％乙醇12小时，100％乙醇1小时，100％乙醇1小时，为石蜡渗透至组织内部、包埋组织做必要的准备；

(3)二甲苯透明：二甲苯：乙醇(1:1)10分钟，二甲苯Ⅰ20分钟，二甲苯Ⅱ20分钟；

(4)浸蜡：石蜡Ⅰ40分钟，石蜡Ⅱ90分钟；

(5)石蜡包埋：将融化的石蜡倒入包埋框，而后用加温的镊子将浸蜡的组织块放入，控制温度在56℃；

(6)切片：每个标本取10长切片，每张切片厚3μm。用经0.1％多聚赖氨酸处理的玻片贴片，烤片过夜后，存于4℃冰箱待用。

HE染色：

(1)石蜡切片置二甲苯中脱蜡5-10min；

(2)移入二甲苯和纯酒精(1∶1)混合液中5min左右；

(3)移入100％、95％、85％、70％酒精，各级为2～5min。最后经蒸馏水，水洗5min后转入染液；

(4)Harris苏木素染5-10min；

(5)水洗5min；

(6)0.5％盐酸酒精(70％酒精配制)分色片刻，镜检控制，直至细胞核及核内染色质清晰为止，约数30s；

(7)水洗15min，蓝化；

(8)75％乙醇，洗1min；

(9)0.5％水溶性伊红Y乙醇液染色1min；

(10)依次经70％、85％、95％、100％酒精脱水，各级为2～3分钟；

(11)二甲苯透明(二次)，共约10分钟；

(12)擦去切片周围多余二甲苯，切勿干涸，迅速滴加适量中性树胶，再加盖玻片封固；

肾脏病理学检测结果显示：与对照组相比，所述模型组肾小球萎缩，系膜细胞增多，间质区增宽，表明实验小鼠发生了肾衰竭。

Vonkossa染色：

(1)石蜡切片脱蜡至水；

(2)在日光下或紫外线灯下用2％硝酸银浸染20-60min；

(3)蒸馏水洗5min；

(4)5％硫代硫酸钠水溶液处理2min；

(5)自来水洗5min；

(6)0.1％核固红染液复染1-2min；

(7)蒸馏水洗5-10秒钟；

(8)常规脱水透明，中性树胶封固；

血管病理学检测结果如图4所示：与对照组相比，所述模型组实验小鼠血管壁均明显增厚，部分小鼠可见到明显钙化的发生(图中黑色部分)，未发生钙化的小鼠血管其中层可见清晰的的弹力纤维并发生变性；

检测结果表明，本发明的制备方法可有效导致血管向钙化病变发展，成功建立慢性肾脏病血管钙化实验模型。

Claims

1.一种慢性肾脏病血管钙化实验模型的建立方法，其特征在于，选用实验动物，按下述步骤：

(1)腺嘌呤每隔2天灌胃1次，持续1周；

(2)第2周至第6周，每周给同样剂量的腺嘌呤1次；

(3)第2周至第6周，每隔2天给活性维生素D₃Calcitriol；

(4)第2周至第6周，采用高磷低蛋白饮食，建立慢性肾脏病血管钙化实验模型。

2.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，实验动物为C57BL/6小鼠。

3.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中，腺嘌呤的剂量为100mg/kg。

4.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(3)中，活性维生素D₃Calcitriol的剂量为1μg/kg。

5.按权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤(4)中，高磷低蛋白饮食的含磷量为1.2％。

6.按权利要求1～5任一所述的方法制备得到的慢性肾脏病血管钙化实验模型。

7.按权利要求6所述慢性肾脏病血管钙化动物模型，其特征在于，该模型通过下述步骤进行鉴定：

(1)建立模型6周后，常规处理实验动物，取鉴定样品；

(2)测定血液生化指标；

(3)肾脏组织进行HE染色，血管组织进行vonkossa染色；

(4)数据分析。