CN113812377B - 一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及生物医学和生物医药技术领域，具体是一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法。包括烧伤合并慢性肾病实验模型，所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过腺嘌呤灌注以诱导慢性肾病，慢性肾病诱导成功后，配合烧伤加速慢性肾病的发展，建立稳定的烧伤合并慢性肾病实验模型，对制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定。本发明公开了一种烧伤合并慢性肾病的动物研究模型及其应用。先用腺嘌呤诱导慢性肾病，然后对小鼠背部进行烧伤处理。烧伤后，小鼠肾功能显著降低，肾损伤显著加重。这种模型能够用于研究烧伤对肾功能的影响，尤其是长期的影响。本发明对于烧伤后肾脏损伤的医学研究具有巨大的科学意义和社会效益，也具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明涉及生物医学和生物医药技术领域，具体是一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法。
背景技术
实验动物是指经人工培育，对其饲养环境和卫生条件进行控制，遗传背景明确清晰，用于科学研究、教育、生产、检定以及其它科学实验的动物。其中小鼠是目前使用最为广泛的实验动物，基因组与人类高度同源，生理生化和调控机理与人类基本一致，同时有饲养成本低和繁殖周期短的优点。实验动物模型在新药研发中可以降低风险、提高效率。
严重烧伤通常伴随多器官衰竭，其中最常见的是肾脏，38％的烧伤患者出现急性肾损伤(AKI)。烧伤患者出现AKI与死亡率正相关，也延长了住院时间。AKI曾经被视为一种自限性和可逆的短期疾病，现在被认为是慢性肾病(CKD)的先兆和长期发病的原因。临床统计显示，烧伤AKI患者出院后对肾脏替代疗法的需求高于正常群体，并且增加终末期肾病和长期全因死亡率的风险。所以，长期来看，烧伤可能导致患者肾脏功能的减退。因此，研究烧伤和CKD的关系对提升烧伤患者预后生活质量有重要意义。
要想研究烧伤对肾功能的影响，先要建立研究模型。目前，烧伤对内脏损伤的影响多集中在烧伤早期，缺乏长期的预后数据。这可能归结于小鼠具有较强的恢复能力，在伤后能快速再生并恢复功能。因此，要想观察烧伤对肾功能的长期影响，可能需要先降低小鼠伤后愈合能力。年龄和肾功能不全会降低组织愈合能力。基于此原理，通过在成年小鼠上诱导慢性肾病，降低肾脏功能恢复的能力，可能更容易观察到烧伤对肾功能的影响。
喂食腺嘌呤是一种简单有效诱导啮齿动物慢性肾病的方法。目前认为，腺嘌呤诱导的CKD其机制可能与在肾小管内形成难溶性代谢产物导致肾损伤有关。喂食方法主要包括食物添加或直接灌胃。例如，在大鼠饮食中添加0.75％的腺嘌呤，四周即可观察到明显的肾功能和结构变化。腺嘌呤增加血清尿素氮(BUN)和血清肌酐浓度和尿中尿酸的排泄，产生蛋白尿，并诱发肾脏萎缩和纤维化，这与人类CKD相似。腺嘌呤还会导致肾小球足细胞损伤，结蛋白和促纤维化转化生长因子β(TGF-β)表达增加，胶原沉积。凋亡增加导致肾小管间质和肾小球萎缩，肾组织促凋亡的caspase-3蛋白表达增加。氧化应激的生物标志物血红素氧合酶-1(HO-1)表达增加。炎症生物标志物肿瘤坏死因子-α(TNF-α)和白细胞介素-6(IL6)的蛋白表达增加，炎症细胞浸润(单核细胞、巨噬细胞、肌成纤维细胞)也增加。内皮型一氧化氮合酶(eNOS)表达降低，诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达增加。同时，该模型还显示心血管系统的功能和结构损伤，出现更接近于人类CKD的缓慢进展(17)。因此，本研究将采用腺嘌呤诱导CKD模型，来降低肾脏的恢复能力。
本发明专利的目的是建立一种基于小鼠的研究烧伤与肾功能的模型。为此，我们建立了腺嘌呤诱导的CKD小鼠模型和酒精烧伤模型，记录了烧伤后小鼠的肾功能、肾形态和组织病理变化。
发明内容
本发明提供一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法。
本发明所采用的技术方案为：一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法，其特征在于：包括烧伤合并慢性肾病实验模型，所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过腺嘌呤灌注以诱导慢性肾病，慢性肾病诱导成功后，配合烧伤加速慢性肾病的发展，建立稳定的烧伤合并慢性肾病实验模型，对制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定；所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立，其步骤包括：
S1：采用腺嘌呤(剂量200mg/kg)对实验C57BL6小鼠，每天灌胃1次，连续5天；
S2：腺嘌呤灌胃1个月后鉴定小鼠尿液；
S3：选取慢性肾病造模成功的小鼠，麻醉后平放，背部脱毛；
所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定，其步骤包括：
S1：烧伤两个月后，常规处理实验动物，取鉴定样品，包括尿液、血液、肾脏；
S2：鉴定血液生化指标；
S3：鉴定肾脏外形特征；
S4：鉴定肾脏组织特征，包括H&E染色；
S5：数据分析。
所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S2中，若小鼠尿蛋白肌酐比值没有显著高于正常小鼠，则判定为小鼠造模失败，不进行烧伤实验。若鉴定小鼠尿蛋白肌酐比值显著高于正常值20％以上，则判定为慢性肾病造模成功，进行烧伤实验。
所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S3中的背部脱毛具体步骤为：
S1：先在背部平铺一张含有2*3.5cm孔洞的湿纸巾；
S2：背部喷洒酒精后，点火灼烧10秒钟；
S3：用湿纸巾铺盖在灼烧部位灭火。
所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定结果显示烧伤合并慢性肾病实验模型中血浆尿素氮(BUN)和血浆肌酐(SCR)均显著升高，部分实验模型发生明显的肾损伤。
本发明的有益效果：
本发明明中烧伤加速了由腺嘌呤诱导的慢性肾病的进展。本方法稳定性好，操纵简便。所述烧伤合并慢性肾病模型可用于筛选治疗烧伤后出现肾损伤和肾功能不全的药物及其机制研究。
附图说明
图1为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的建立模型的分组和操作步骤。
图2为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的实验方案的技术执行步骤。
图3为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的显示了小鼠烧伤前后和每周逐渐恢复的情况，其中：A为烧伤前后的背部皮肤；B为烧伤后第7天和第14天的图片。
图4为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的显示了建模后小鼠血清生化指标的变化情况，其中：A为血浆尿素氮；B为血浆肌酐。
图5为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的显示了肾脏重量和形态变化，其中：A为肾脏重量变化；B为肾脏形态变化的代表性图片。
图6为本发明一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法的显示了肾脏组织病理学变化，其中：A为组织石蜡切片H&E染色的代表性图片；B为肾脏组织病理学综合评分。
具体实施方式
下面对本发明作进一步说明。
一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法，其特征在于：包括烧伤合并慢性肾病实验模型，所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过腺嘌呤灌注以诱导慢性肾病，慢性肾病诱导成功后，配合烧伤加速慢性肾病的发展，建立稳定的烧伤合并慢性肾病实验模型，对制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定；所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立，其步骤包括：
S1：采用腺嘌呤(剂量200mg/kg)对实验C57BL6小鼠，每天灌胃1次，连续5天；
S2：腺嘌呤灌胃1个月后鉴定小鼠尿液；
S3：选取慢性肾病造模成功的小鼠，麻醉后平放，背部脱毛；
所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定，其步骤包括：
S1：烧伤两个月后，常规处理实验动物，取鉴定样品，包括尿液、血液、肾脏；
S2：鉴定血液生化指标；
S3：鉴定肾脏外形特征；
S4：鉴定肾脏组织特征，包括H&E染色；
S5：数据分析。
所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S2中，若小鼠尿蛋白肌酐比值没有显著高于正常小鼠，则判定为小鼠造模失败，不进行烧伤实验。若鉴定小鼠尿蛋白肌酐比值显著高于正常值20％以上，则判定为慢性肾病造模成功，进行烧伤实验。
所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S3中的背部脱毛具体步骤为：
S1：先在背部平铺一张含有2*3.5cm孔洞的湿纸巾；
S2：背部喷洒酒精后，点火灼烧10秒钟；
S3：用湿纸巾铺盖在灼烧部位灭火。
所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定结果显示烧伤合并慢性肾病实验模型中血浆尿素氮(BUN)和血浆肌酐(SCR)均显著升高，部分实验模型发生明显的肾损伤，如肾萎缩，肾小球萎缩，肾小管和肾间质损伤。
实施例
建立烧伤合并慢性肾病实验模型。
(1)采用剂量200mg/kg剂量的腺嘌呤，每天给C57BL小鼠灌胃，连续5天；
(2)初始灌胃1个月后，小鼠背部进行2*3.5cm的75％酒精喷洒烧伤实验，烧伤10秒；
(3)烧伤后即时给小鼠进行腹腔注射补液，烧伤后24小时也给小鼠进行腹腔注射补液，补液剂量为每只小鼠0.5mL 5％葡萄糖溶液和生理盐水。
组织取材和指标测定：
各动物称体重，取血分离血浆，用干净的磷酸盐缓冲盐溶液(PBS)灌洗全身血管和器官，取双侧肾脏称取质量，同时拍照记录形态；所有肾脏组织分成两部分，一部分保存在零下80℃冰箱，一部分泡在4％的多聚甲醛溶液中，做常规石蜡包埋、切片、染色；血浆尿素氮(BUN)和血浆肌酐分别用试剂盒检测。
测定结果显示：与空白对照组相比，腺嘌呤诱导的慢性肾病小鼠有更高的血浆尿素氮含量、更低的肾脏质量，肾脏形态上更无光泽、肾组织质地变硬、表面呈均匀弥漫的细颗粒状，以及更高的病理评分，说明腺嘌呤诱导的慢性肾病成功。与CKD组相比，烧伤后的小鼠有更高的血浆尿素氮和血浆肌酐含量、更更无光泽的形态和更高的病理评分，说明烧伤进一步加剧了慢性肾病的进展，造模成功。腺嘌呤显著降低了肾脏/体重的比值，烧伤并没有进一步引起肾脏重量的变化。
制备石蜡切片：
(1)取材：新鲜组织固定于4％多聚甲醛室温24h以上。将组织从固定液取出在通风橱内用手术刀将目的部位组织修平整，将修切好的组织和对应的标签放于脱水盒内。
(2)脱水：将脱水盒放进吊篮里于脱水机内依次梯度酒精进行脱水。75％酒精4小时，85％酒精2小时，90％酒精2小时，95％酒精1小时，无水乙醇I 30分钟，无水乙醇II 30分钟，二甲苯I 5分钟，二甲苯II 5分钟，蜡I1小时，蜡II 1小时。
(3)包埋：将浸好蜡的组织于包埋机内进行包埋。先将融化的蜡放入包埋框，待蜡凝固之前将组织从脱水盒内取出按照包埋面的要求放入包埋框并贴上对应的标签。于零下20°冻台冷却，蜡凝固后将蜡块从包埋框中取出并修整蜡块。
(4)切片：将修整好的蜡块置于石蜡切片机上切片，片厚5μm。切片漂浮于摊片机40℃温水上将组织展平，用载玻片将组织捞起，并放进60℃烘箱内烤片。待水烤干蜡烤化后取出常温保存备用。
H&E染色：
(1)石蜡切片常规二甲苯，乙醇脱蜡至水。
(2)苏木素染10分钟。
(3)流水冲洗，去余色。
(4)0.7％盐酸乙醇分化数秒钟。
(5)流水冲洗，切片变蓝约15分钟。
(6)95％乙醇30秒钟。
(7)酒精性伊红染30秒。
(8)成片常规脱水步骤：95％乙醇I脱水30秒。95％乙醇II脱水30秒。100％乙醇I脱水30秒。100％乙醇II脱水30秒钟。常规二甲苯I脱水30秒。常规二甲苯II脱水30秒。
(9)中性树胶封片。
肾脏组织病理学检测结果：肾脏组织病理评分是肾损伤的一种衡量标准。相比于Blank组，腺嘌呤显著增加了肾小球和总分上的病理学评分，烧伤进一步提升了评分。在肾小管和肾间质的病理学评分上，烧伤并没有显著增加CKD小鼠肾小管和肾间质的评分，这可能是由于组间样本量不足。综上所述，腺嘌呤成功诱导CKD，烧伤进一步促进了肾脏的病理变化。
本发明明中烧伤加速了由腺嘌呤诱导的慢性肾病的进展。本方法稳定性好，操纵简便。所述烧伤合并慢性肾病模型可用于筛选治疗烧伤后出现肾损伤和肾功能不全的药物及其机制研究。
以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明实施例技术方案的精神和范围。
Claims (3)
1.一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法，其特征在于：包括烧伤合并慢性肾病实验模型，所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过腺嘌呤灌注以诱导慢性肾病，慢性肾病诱导成功后，配合烧伤加速慢性肾病的发展，建立稳定的烧伤合并慢性肾病实验模型，对制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定；所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立，其步骤包括：
S1：采用腺嘌呤剂量200mg/kg对实验C57BL6小鼠，每天灌胃1次，连续5天；
S2：腺嘌呤灌胃1个月后鉴定小鼠尿液；
S3：选取慢性肾病造模成功的小鼠，麻醉后平放，背部脱毛；
所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S3中的背部脱毛具体步骤为：
S1：先在背部平铺一张含有2*3.5cm孔洞的湿纸巾；
S2：背部喷洒酒精后，点火灼烧10秒钟；
S3：用湿纸巾铺盖在灼烧部位灭火；
所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定，其步骤包括：
S1：烧伤两个月后，常规处理实验动物，取鉴定样品，包括尿液、血液、肾脏；
S2：鉴定血液生化指标；
S3：鉴定肾脏外形特征；
S4：鉴定肾脏组织特征，包括H&E染色；
S5：数据分析。
2.根据权利要求1所述的一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法，其特征在于：所述烧伤合并慢性肾病实验模型通过下述方法建立步骤S2中，若小鼠尿蛋白肌酐比值没有显著高于正常小鼠，则判定为小鼠造模失败，不进行烧伤实验，若鉴定小鼠尿蛋白肌酐比值显著高于正常值20％以上，则判定为慢性肾病造模成功，进行烧伤实验。
3.根据权利要求1所述的一种烧伤合并慢性肾病实验模型的建立方法，其特征在于：所述制得的烧伤合并慢性肾病小鼠模型进行性能鉴定结果显示烧伤合并慢性肾病实验模型中血浆尿素氮BUN和血浆肌酐SCR均显著升高，部分实验模型发生明显的肾损伤。
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