MXPA05012739A - Uso de inhibidor de quinasa de tirosina para tratar diabetes. - Google Patents

Abstract

La invencion se refiere al uso de un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, o c-kit, por ejemplo (4-(4-metilpiperazin- 1-ilmetil)-N -[4-metil-3 -(4-piridin-3- il)pirimidin -2-ilamino) -fenil]-benzamida, Bis (1H-2-indolil)-1 -metanonas, AG1295, CT52923, RP-1776; GFB-111; pirrolo-[3, 4-c] -beta-carbolina -dionas, SU 102, AG1296, RPR101511A, CDP 860, Zvegf3, CP673451, PD 170262, KI 6783, KN 1022, AG 13736, CHTR 258, MLN 518, SU 11248, Leflunomida, o una sal farmaceuticamente aceptable de los mismos, para la fabricacion de un medicamento para el tratamiento de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I, diabetes tipo II.

Description

USO DE INHIBIDOR DE QUINASA DE TIROSINA PARA TRATAR DIABETES La invención se refiere al uso de 4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-iIamino)-fenil]-benzamida, referida posteriormente en la presente como el "Compuesto I", o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II, al uso del Compuesto I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en el tratamiento de diabetes, por ejemplo diabetes tipo l o diabetes tipo II, a un método para el tratamiento de animales de sangre caliente, incluyendo mamíferos, en especial seres humanos, que sufran de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II, mediante la administración a dicho animal que necesite este tratamiento, de una dosis efectiva contra la enfermedad, del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

Leyenda de las Figuras: Figura 1. La producción de NO inducida por citoquina no es afectada por 10 µ M del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, en células bTC-6 y en islotes de rata aislados. Los resultados son promedios +. SEM para tres observaciones independientes. Figura 2. El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege parcialmente a las células de islotes humanos contra el óxido nítrico. Los resultados son promedios +_ SE de tres donadores separados. Figura 3. índices de apoptosis en células bTC-6 tratadas con ARNsi mezclado o ARNsi específico de c-Abl. El tratamiento de citoquina ( I L - 1 ß + IFN-? + TNF-a) se inicia 24 horas antes del análisis de las células. La apoptosis se cuantifica mediante citometría de flujo. Los resultados son promedios +_ SEM para 3-4 observaciones. Más de un millón de americanos tienen diabetes tipo 1 , también denominada como diabetes meilitus dependiente de insulina, abreviado como IDDM (por sus siglas en inglés), o diabetes juvenil. En la diabetes tipo 1, el páncreas de una persona produce poca o nada de insulina, una hormona necesaria para sostener la vida. Aunque no se conocen enteramente las causas, la diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune multi-factorial que resulta de la destrucción específica y progresiva de las células-beta productoras de insulina en el páncreas. Es una de las enfermedades crónicas más costosas de la niñez y una que nunca se supera. Aunque la insulina permite que una persona permanezca viva, no cura la diabetes ni pre iene sus efectos eventuales y devastadores: insuficiencia renal, ceguera, daño de nervios, amputaciones, ataque cardíaco y embolia. Con el fin de permanecer vivos, aquéllos con diabetes tipo 1 deben aplicarse múltiples inyecciones de insulina diariamente, o infundirse continuamente insulina a través de una bomba, y probar su azúcar en sangre picando sus dedos para extraerse sangre seis o más veces al día. Mientras tratan de equilibrar las inyecciones de insulina con su cantidad de ingestión de alimento, las personas con diabetes tipo 1 deben prepararse constantemente para reacciones h i p o g I i cé m i ca s potenciales, es decir, bajo azúcar en sangre, e hiperglicémicas, es decir, alto azúcar en sangre, las cuales pueden ser amenazantes de la vida. A pesar de la rigurosa atención para mantener una dieta saludable, régimen de ejercicio, y de inyectarse siempre la cantidad apropiada de insulina, muchos otros factores pueden afectar adversamente el control de azúcar en sangre de una persona, incluyendo: tensión, cambios hormonales, períodos de crecimiento, actividad física, medicaciones, enfermedad/infección, y fatiga. Incluso con la insulina, la diabetes tipo 1 da como resultado una reducción drástica en la calidad de vida, y reduce el lapso de vida promedio por 15 años. Cada año, aproximadamente 30,000 americanos son diagnosticados con diabetes tipo 1, más de 13,000 de los cuales son niños. Esto es, 35 niños cada día. La diabetes tipo 2, también denominada como diabetes mellitus no dependiente de insulina, abreviado como NIDDM (por sus siglas en inglés), o diabetes de adultos, normalmente está asociada con la obesidad, la resistencia a la insulina, y una falta relativa de insulina. Aunque esta forma de diabetes en la mayoría de los casos no requiere de insulina, hay sorprendentes similitudes entre ella y la diabetes tipo 1. Por ejemplo, actualmente es convenido que hay una falta absoluta de células-beta productoras de insulina en la diabetes tipo 2, y que esta deficiencia de células-beta probablemente se debe a un mayor índice de muerte de células-beta. Por consiguiente, el tratamiento farmacológico que conduzca a la protección contra la muerte de las células-beta, puede ser útil como un tratamiento tanto para diabetes tipo 1 como tipo 2. De una manera sorprendente, se encontró que un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo la SAL I, es particularmente útil para el tratamiento de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II. De una forma inesperada, se encontró que un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo la SAL I, se puede utilizar para curar o prevenir la diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o tipo II. El Compuesto I es la 4-(4-metíl-piperazin-1-ilmetil)- N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-ilamino)-fenilj- benzamida, que tiene la siguiente fórmula: La base libre del Compuesto I, sus sales aceptables, y su preparación, se dan a conocer en la Patente Europea otorgada Número 0564409. La base libre del Compuesto I corresponde a la fracción activa. La sal de adición de ácido mono-metan-sulfónico del Compuesto I, referida posteriormente en la presente como la "Sal I", y una forma de cristal preferida de la misma, por ejemplo, la forma de cristal beta, se describen en la Solicitud de Patente del TCP Número WO99/03854, publicada el 28 de enero de 1999. La invención se refiere al uso de un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, como un fármaco contra la diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. De una manera más preferible, la invención se refiere al uso del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo la Sal I, como un fármaco contra la diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II. Los inhibidores de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG, utilizados de conformidad con la presente invención, se seleccionan a partir del grupo que comprende los siguientes compuestos: 4-(4-metil-piperazin- -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-benzamida, referida posteriormente en la presente como el Compuesto I, un inhibidor de las isoformas del receptor de PDGF, Bcr-Abl, y c-Kit, que sobresale por su alta potencia y disponibilidad oral; B is ( 1 H -2 - i n d o I i I )- 1 - m e ta n o n a s , otra clase de inhibidores de quinasa de tirosina que se han caracterizado como inhibidores de PDGF-4 TK, como se describe en Mahboobi S. y colaboradores, J. Med. Chem. 2002, 45:1002-1018, e incorporado a la presente como referencia; el bloqueador de quinasa receptora de PDGF, AG1295, que tiene el Número CAS 71897-07-9; AG1295/96 como es descrito por Kovalenko M. y colaboradores, Cáncer Res. 1994, 54:6106-6114, y Ludewig D . y colaboradores, Cell Tissue Res. 2000, 299:97-103, e incorporado a la presente como referencia; CT52923 ( 4- (6 , 7-d i m e tox i -4-q u i n azo I i n i I )- N -(3,4-metilendioxi-bencil)-1-piperazin-tiocarboxamida); R P -1776; GFB-111 ; pi r ro I o - [3 , 4- c] -be ta- ca r b o I i n a-d i o n as , SU 102 (desarrollado por SUGEN); AG1296 que tiene el Número CAS 146535-11-7; RPR101511A desarrollado por Aventis Pharma; CDP 860 y Zvegf3 desarrollados por ZymoGenetics; CP 673451 y PD 170262 de Pfizer; Kl 6783, que tiene el Número CAS 190726-45-5, un inhibidor de PDGF-R desarrollado por Kirin Brewery, Japón; KN 1022 desarrollado por Kyowa Hakko en Japón, y Millenium Pharmaceuticals en Estados Unidos; AG 13736 desarrollado por Pfizer; CHIR 258 desarrollado por Chiron Corporation; MLN 518 de Millenium Pharmaceuticals y SU 11248 de S U G E N - Pf ize r , Leflunomida; o sales farmacéuticamente aceptables de los mismos. CT52923 ha sido descrito por Matsuno K. y colaboradores, "Synthesis and structure activity re I ati o n s h i s of PDGF receptor phosphorylation inhibitor-1" en el 18th Symposium on Medicinal Chemistry; 25-27 de Noviembre de 1998; Kyoto, Japón, la Sociedad Farmacéutica de Japón, División de Química Medicinal, Tokio, Japón: Extracto 2 - P -05. RP-1776, un péptido cíclico, se aisló a partir del caldo de cultivo de Streptomyces sp. KY11784. Es descrito, por ejemplo, por Toki S., Agatsuma T. y colaboradores, J. Antibiot. (Tokio) Mayo de 2001; 54(5):405-14. GFB-111 se describe, por ejemplo, en Blaskovich M.A. y colaboradores, Nat. Biotechnol. Octubre de 2000; 18(10): 1065-70, y en Delarue F. y colaboradores, 91st Annual meeting of the American Association for Cáncer Research, 41 :458, 2000.

Las p¡rrolo-[3,4-c]-beta-carbolina-dionas son descritas, por ejemplo, por Teller S., Eur. J. ed. Chem., Abril de 2000; 35 ( 4 ) : 413-27. CDP 860 es un fragmento de anticuerpo pegilado derivado a partir del anticuerpo antireceptor de factor de crecimiento derivado de plaquetas-beta humano. CP 673451 se dirige al receptor de PDGF. PD 170262 ó la 2- [4-(2-d ieti l-a m ino-etoxi )-f e n i I-amino]-8-metil-6-(3-tienil)-pirido-[2,3-d]-pir¡m¡din-7(8H)-ona, es un potente inhibidor de la quinasa de tirosina con selectividad para la quinasa de tirosina del factor de crecimiento derivado de plaquetas. La síntesis y la actividad inhibidora de la quinasa de tirosina de una serie de 2-amino-8H-pirido-[2,3-d]-pirimidinas, se describen, por ejemplo, en Klutchko S. y colaboradores, 213th American Chemical Society National eeting: Extracto: MEDI 201 (cartel), 1997, E.U.A. Kl 6783 o la 4-(3 , 4-d i m e t o x i-f e n o xi )-6 , 7 -d i m e toxi -quinolina, se describe, por ejemplo, en Kubo K. y colaboradores, Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 7:2935-2940, 1997, y Yagi M. y colaboradores, Exp. Cell Research 234:285-92, 1997. KN 1022 o la 6 , 7-d i m etoxi -4- [4- (4- n i t rof e n i I )-a m i n o-carbonil-piperazin-1-il]-quinazolina, la cual inhibe la fosforilación de PDGFR, se describe, por ejemplo, en 217th American Chemical Society National Meeting, Extracto: MEDI 061, Parte 1, 1999, Japón. AG 013736 o la N -m e t i I -2-{3 - [2- ( 2 - p i r¡ d i I )-v¡ n i I]- 1 H -indazoI-6-ilsulfanil}-benzamida, se da a conocer, por ejemplo, en Heller y colaboradores, Pharmacological activities of AG 013736, un inhibidor de molécula pequeña de las quinasas de tirosina de VEGF/PDGFR, 93rd Annual meeting of the American Association for Cáncer Research 43:1082, 2002, E.U.A. CHIR 258 es un inhibidor de quinasa de factor de crecimiento de amino-benzimidazol-quinolina oralmente activo, el cual demostró un espectro de actividad inhibidora contra las quinasas de tirosina receptoras, por ejemplo de la familia PDGFR. CHIR 258 se da a conocer, por ejemplo, en Steigerwalt R. y colaboradores y Lee S. H. y colaboradores, en 94th Annual Meeting of the American Association for Cáncer Research 753 (más cartel), Extracto 3783, y 934 (más cartel), Extracto R4702, respectivamente, 2003, E.U.A. SU11248 o la ( 2-d i et i I -a m i n o -eti I )-a m i n a del ácido 5-[3-fluoro-2-oxo-1 ,2-dihidroindol-(3Z)-iliden-metil]-2,4-dimetil-1H-pirrol-3-carboxílico, es un inhibidor de quinasa de dirección múltiple con selectividad para, por ejemplo, PDGFR, SU11248, se da a conocer, por ejemplo, en Xin L. y colaboradores, 93rd Annual Meeting of the American Association for Cáncer Research 43:1081 (más cartel), 2002, E.U.A. LN 518 es un derivado de piperazinilo de la quinazolina de la fórmula: 4-[4-(N-para-iso-propoxi-fenil-carbamoil)-1-piperazinil]-6-metoxi-7-(piperidino-propiloxi)-quinazolina, que inhibe, por ejemplo, la fosforilación de PDGF R en ensayos de enlace, se describe, por ejemplo, en Stone R. M. y colaboradores, Blood 102:65-66, 2003, Kelly L. M. y colaboradores, Cáncer Cell 1:421-23, 2002. La Leflunomida (SU 101) o la 4-lsoxazol-carboxamida, 5-m et i l-N -[4-(tr ¡f I u o ro-m eti I )-f e ni lo] , es un inhibidor de la quinasa de tirosina. SU11654 inhibe la actividad de quinasa de tirosina de la c-kit. La estructura de los agentes activos identificados por números de código, nombres genéricos o comerciales, se puede tomar de la edición actual del compendio estándar "The Merck Index", o de las bases de datos, por ejemplo Patents International (por ejemplo, IMS World Publications). El contenido correspondiente de los mismos se incorpora a la presente como referencia. La presente invención pertenece además al uso de 4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-¡lamino)-fenil]-benzamida, Bis-(1H-2-indolil)-1-metanonas, AG1295, CT52923, RP-1776; GFB-111; pirrolo-[3,4-c]-beta-carbolina-dionas, SU 102, AG1296, RPR101511A, CDP 860, Zvegf3, CP 673451 , PD 170262, Kl 6783, KN 1022, AG 13736, CHIR 258, MLN 518, SU 11248, Leflunomida, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, para la fabricación de un medicamento para el tratamiento de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II, de preferencia se utiliza el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo. La presente invención pertenece además al uso de un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit- ó ARG, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, para la fabricación de un medicamento para curar diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo ll, de preferencia el inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG se selecciona a partir del grupo que comprende 4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-ilam¡no)-fenil]-benzamida, B i s - ( H-2-indolil)-1-metanonas, AG1295, CT52923, RP-1776; GFB-11 ; p i r ro I o -[3 , 4- c]- b e ta -carbolina-dionas, SU 102, AG1296, RPR101511A, CDP 860, Zvegf3, CP 673451, PD 170262, Kl 6783, KN 1022, AG 13736, CHIR 258, MLN 518, SU 11248, Leflunomida, o una sal farmacéuticamente aceptable de los mismos, de preferencia (4-(4-metil-piperazin-1-ilmetiI)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-p¡rimidin-2-ilamino)-fenil]-benzamida. En la presente descripción, el término "tratamiento" incluye tanto el tratamiento profiláctico o preventivo, como el tratamiento curativo o supresor de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de los pacientes en riesgo de diabetes, así como en los pacientes enfermos. Este término incluye además el tratamiento para la demora del progreso de la enfermedad. Mediante "suprimir y/o revertir la diabetes", el solicitante pretende significar que la condición de diabetes ya no está presente en el paciente, o que la enfermedad es menos severa de lo que era antes de, o sin, el tratamiento. El término "curar", como se utiliza en la presente, significa que el tratamiento conduce a la remisión de la diabetes o de los episodios continuos de diabetes. El término "profiláctico" o "prevenir", significa la prevención del establecimiento o de la recurrencia de diabetes . El término "demora de progreso", como se utiliza en la presente, significa que la administración del compuesto activo a los pacientes que estén en una pre-etapa o en una fase temprana de diabetes, impide que evolucione adicionalmente la enfermedad, o hace más lenta la evolución de la enfermedad, en comparación con la evolución de la enfermedad sin la administración del compuesto activo. Las composiciones farmacéuticas de acuerdo con la presente invención, se pueden preparar de una manera conocida por sí misma, y son aquéllas adecuadas para administración enteral, tal como oral o rectal, o parenteral, a animales de sangre caliente, incluyendo el hombre, las cuales comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de cuando menos un ingrediente farmacológicamente activo, solo o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente aceptables, en especial adecuados para aplicación enteral o parenteral. La vía de administración preferida de las formas de dosificación de la presente invención es oralmente. Por consiguiente, la invención también se refiere a un método de tratamiento de un animal de sangre caliente que tenga diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II, el cual comprende administrar a este animal que necesite dicho tratamiento, el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva. La invención se refiere a un método para administrar a un sujeto humano que sufra de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II, de preferencia diabetes tipo I, una sal de adición de ácido del Compuesto I, y de preferencia la Sal I, la sal de monometan-sulfonato de 4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-ilamino)-fen¡l]-benzamida. La persona experta en la técnica pertinente está absolutamente capacitada para seleccionar los modelos de prueba relevantes para probar los efectos benéficos mencionados en la presente sobre la diabetes, por ejemplo diabetes tipo o tipo II. La actividad farmacológica de este compuesto, por ejemplo, se puede demostrar por medio de los Ejemplos descritos más adelante, mediante pruebas in vitro y pruebas in vivo, o en estudios clínicos adecuados. Los estudios clínicos adecuados son, por ejemplo, estudios de escala de dosis no aleatorios de etiqueta abierta en pacientes que tengan diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o tipo II. La eficacia del tratamiento se determina en estos estudios, por ejemplo, mediante una evaluación de la enfermedad cada 4 semanas, con el control realizado con placebo. La dosificación efectiva del Compuesto I puede variar dependiendo del compuesto o composición farmacéutica particular empleada, del modo de administración, del tipo de diabetes, por ejemplo tipo 1 o tipo II, que se esté tratando, o de su severidad. El régimen de dosificación se selecciona de acuerdo con una variedad de factores adicionales, incluyendo la función renal y hepática del paciente. Un médico, clínico, o veterinario de una experiencia ordinaria puede determinar fácilmente y prescribir la cantidad efectiva de los compuestos requeridos para prevenir, contrarrestar, o detener el progreso de la condición. Dependiendo de la edad, de la condición individual, del modo de administración, y del cuadro clínico en cuestión, se administran dosis efectivas, por ejemplo dosis diarias del Compuesto I o de una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, correspondientes a de 100 a 1 ,000 miligramos de la base libre como fracción activa, en especial 800 miligramos, a animales de sangre caliente de un peso corporal de aproximadamente 70 kilogramos. De preferencia, el animal de sangre caliente es un ser humano. Para los pacientes con una respuesta inadecuada a las dosis diarias, se puede considerar con seguridad la escala de la dosis, y los pacientes se pueden tratar siempre que se beneficien del tratamiento y en ausencia de toxicidades limitantes. La invención se refiere también a un método para administrar a un sujeto humano que sufra de diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o tipo II, el Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, el cual comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo al sujeto humano una vez al día, durante un período que exceda a 3 meses. La invención se refiere en especial al método en donde se administra a un adulto una dosis diaria de 400 a 800 miligramos, de preferencia 800 miligramos, del Compuesto I. La invención proporciona además un paquete de medicamento que comprende un inhibidor de quinasa de tirosina c-Abl, PDGF-R, c-kit, ó ARG, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, por ejemplo el Compuesto I, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo, por ejemplo la Sal I, junto con instrucciones impresas 5 para su administración a pacientes que tengan diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II.

Ejemplo 1: E l Compuesto I , por ejemplo la Sal 1 , protege contra la muerte de células-b y la diabetes? 10 En el siguiente ejemplo, células ß-?06 se refieren a las células beta-TC6. La diabetes mellitus dependiente de insulina (IDDM, por sus siglas en inglés) (Tipo 1) es una enfermedad autoinmune m u Iti-f a cto ria I que resulta de la destrucción 15 específica y progresiva de las células-ß productoras de insulina. Se piensa que la disfunción y el daño de las células-ß se presenta por un contacto directo con las células de infiltración de islotes (macrófagos, cél u las-( K)T CD4+ ó CD8 + ), y/o por la exposición a los mediadores citotóxicos 2o producidos por estas células, tales como las citoquinas pro- inflamatorias (IL-1, TNF-a, IFN-?), radicales libres, ligando Fas, TRAIL, y perforina. La a utoi n m u n idad dirigida contra las células-beta podría iniciarse por factores del medio ambiente, tales como las toxinas de células-beta, „<. componentes nutricionales, tensión, sobrecarga metabólica, virus, etc. Es probable que la célula-beta, al convertir la señal de muerte externa en eventos apoptóticos internos, participe activamente en su propia destrucción en la diabetes tipo 1. Las citoquinas pro-inflamatorias, en particular la combinación de IL-1 e IFN-?, inducen la apoptosis y necrosis de las células-beta. Por consiguiente, es concebible que estas citoquinas no solamente modulen la actividad de las células inmunes de infiltración de islotes, sino que también ejerzan efectos nocivos sobre las células-beta en la patogénesis de la diabetes tipo 1. Parece ser que el estímulo de las células-beta con IL-1 conduce a múltiples eventos de señalización, incluyendo la activación de las quinasas de proteína (P C, p38, JNK, ERK, MSK1), lipasas (PLC, PLD, esfingomielinasa), ciclo-oxigenasa, y factores de transcripción (NF-??, ATF-2, c-jun, Elk-1 , CREB, cEBP-ß, IRF-1 , STAT-1). Estos eventos son seguidos por la inducción de la sintasa de óxido nítrico inducible (¡NOS) y de las proteínas relacionadas con tensión, tales como hsp70, oxigenasa heme, Mn-SOD, ICE, y otras. Desafortunadamente, no están claras las alteraciones en la expresión genética que son esenciales para la muerte de células-beta en la diabetes tipo 1. De una manera predominante, la apoptosis se presenta en una línea de células-beta en respuesta a luz ultravioleta o a la inhibición de la reparación del ADN. Esto es precedido por la inducción de proteína supresora de tumor p53, la generación de especies de oxígeno reactivas, la inhibición de PARP, el paro del ciclo celular S y G2, y por una reducción en el potencial de membrana mitocondrial. Las citoquinas, las cuales promueven principalmente la necrosis, y solamente hasta un menor grado la apoptosis, activan esencialmente los mismos pasos de señalización que la inhibición de la reparación del ADN o la luz ultravioleta. A partir de estos experimentos in vitro, está claro que el modo de muerte de células-beta puede variar dependiendo de la señal de muerte, pero también que se pueden utilizar sendas de señalización similares para lograr diferentes formas de muerte de células-beta. C-Abl es una quinasa de proteína tirosina ubicuitamente expresada, con un peso molecular aproximado de 145 kDa. Bajo condiciones fisiológicas, se ha demostrado que c-Abl participa en el control de las funciones citoesqueléticas, tales como la migración y la estructura celular, y el progreso del ciclo celular. Sin embargo, cuando se exponen las células a diferentes formas de tensión, c-Abl llega a activarse altamente, lo cual conduce al paro del ciclo celular y a la apoptosis. En resumen, extensos estudios en células que no son beta han demostrado que c-Abl promueve la apoptosis en respuesta a diferentes tipos de tensión. No se ha elucidado el papel supuesto de c-Abl en las células productoras de insulina. Por consiguiente, no está claro si esta proteína tiene algún papel en la muerte de las células-beta y la decisión entre apoptosis y necrosis. Significado para la diabetes tipo 1. Aunque la patogénesis de la diabetes tipo 1 parece ser muy compleja, es posible que las sendas ¡ n t ra ce I u I a re s que conducen a la muerte de células-beta converjan en algún punto particular. Hipotéticamente, esto nos podría dar, empleando solamente un planteamiento, la posibilidad de bloquear una multitud de señales de muerte, logrando de esta manera la sobrevivencia de las cé I u I a s - b e ta . La quinasa de tirosina c-Abl podría ser una mediadora significativa de la muerte de las células-beta. C-Abl se expresa en las células bTC-6 y en los islotes de rata aislados, y la inhibición de la actividad de c-Abl, ya sea utilizando el agente farmacológico del Compuesto I, o bien mediante la eliminación genética de la expresión de c-Abl con la técnica de ARNi, da como resultado una protección contra la muerte de células-beta inducida por citoquinas pro-inflamatorias o por donadores de óxido nítrico. C-Abl no actúa promoviendo la producción de óxido nítrico, debido a que la inhibición de c-Abl no contrarresta la producción de óxido nítrico inducida por la citoquina. En vista de estos datos, c-Abl actúa como un sensor de tensión y de las señales de muerte externas, y esta activación de c-Abl podría conducir a la fosforilación y activación de las quinasas JNK y MAP p38, a la inactivación de NF-?? y PI3K, a la liberación mitocondrial de los factores pro-apoptóticos, y finalmente a la muerte de las células-beta. El Compuesto I es capaz de bloquear diferentes señales de muerte, logrando de esta manera la sobrevivencia de las células-beta y la protección contra la diabetes. Resultados: Con el fin de establecer si el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, interfiere con, o si c-Abl participa en, la cascada de señalización que conduce a la muerte de células-beta, se exponen los islotes de rata aislados al donador de óxido nítrico de liberación lenta DETA/NO (0.5 mM), o a la combinación de l L- 1 ß (25 Unidades/mililitro) + IFN-y (1 ,000 Unidades/mililitro) + TNF-a (1,000 Unidades/mililitro) durante 24 horas. En ambos casos, los islotes se cultivan con o sin 10 µ? del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, a través de todo el período de incubación. En seguida del período de incubación, los islotes se tiñen vitalmente con yoduro de propidio + bis-bencimida, y se fotografían en un microscopio de fluorescencia. Las células apoptóticas (con núcleos condensados o fragmentados) y necróticas (núcleos no fragmentados rojos o rosados) se cuentan y se expresan como un porcentaje del número total de células. La Sal l, por ejemplo el Compuesto I, por sí mismo, no afecta la viabilidad de las células de los islotes.

DETA/NO induce necrosis en el 10 por ciento de las células de islotes, y la combinación de citoquinas induce aproximadamente el 40 por ciento de necrosis. Es interesante que la muerte celular inducida por el donador de NO es claramente contrarrestada por el Compuesto I, por ejemplo la Sal I (Tabla 1). También, la necrosis de células de islotes inducida por citoquina es parcialmente reducida por el inhibidor de c-Abl. Las frecuencias de células apoptóticas están debajo del 10 por ciento en todos los grupos (no se muestran los resultados).

Tabla 1. El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra la muerte de células de islotes inducida por NO y citoquina. Los resultados son promedios +. SEM de tres observaciones separadas. Se determinan los niveles de nitrito a partir de células incubadas con la combinación de citoquinas dada anteriormente, durante 24 horas, con o sin 1 ó 10 µ? del Compuesto I, por ejemplo la Sal I. La producción de óxido nítrico inducida por citoquina no es inhibida por el Compuesto I, por ejemplo la Sal I (Figura 1). Por el contrario, la producción de óxido nítrico en la presencia de la Sal I es más alta, posiblemente debido a la viabilidad más alta de las células expuestas a la Sal I; 35 por ciento más nitrito liberado a partir de las células expuestas a citoquina más el Compuesto I, comparándose con las citoquinas solas. Se prueba si el Compuesto I protege contra el fármaco diabetogénico estreptozotocina in vitro. Con 0.4 mM de estreptozotocina, la protección es altamente significativa, mientras que con 0.75 mM de estreptozotocina, el Compuesto I protege sólo débilmente (Tabla 2). Con 0.6 mM de estreptozotocina, el efecto protector del Compuesto I es intermedio.

Tabla 2. El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra la muerte de células de islotes inducida por estreptozotocina. Se agrega el Compuesto I (10 µ?) 24 horas antes de la estreptozotocina. Se cosechan los islotes y se fotografían seis horas después de la adición de la estreptozotocina. Las células necroticas (núcleos no fragmentados rojos o rosados) se cuentan y se expresan como un porcentaje del número total de células. Los resultados son el porcentaje de células necroticas expresado como promedios +_ SEM a partir de tres observaciones separadas. ***_ **_ y * denotan p < 0.001 , 0.01 , y 0.05, empleando la prueba-t emparejada de Student.

Con el fin de investigar si el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, regula la muerte celular también en células de islotes humanos, se incuban los islotes humanos durante 24 horas con o sin el Compuesto I, por ejemplo la Sal I (10 µ?), DETA/NO (2 mM), y Brefeldina A (10 µ?). Como se observó con los islotes de rata, también los islotes humanos son parcialmente protegidos contra los niveles tóxicos de NO (Figura 2). Por consiguiente, la Sal 1 contrarresta parcialmente la muerte de células de islotes inducida por Brefeldina B (tensión de ER). Con el fin de investigar si c-Abl regula y/o si el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, también protege contra la diabetes inducida por estreptozotocina in vivo, se emplea el siguiente procedimiento: Los ratones NMRI machos, con un peso de aproximadamente 25 gramos, se compran en Taconic &B, Sollentuna, Suecia. Los animales tienen acceso libre a agua del grifo y alimento granulado a través de todo el estudio. El material del lecho se cambia semanalmente. Se determinan el peso y la glucosa en sangre utilizando el Pen Sensor (MediSense, Waltham, MA, E.U.A.) antes del experimento. Los animales se entuban con 200 microlitros del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, disuelto en NaCI al 0.9 por ciento, en 200 miligramos/kilogramo de peso corporal, en tres días consecutivos (día -1, 0, 1). En el día 0, los ratones se inyectan con 120 ó 160 miligramos/kilogramo de peso corporal de la estreptozotocina ( S i g m a - A I d ri ch Co., St. Louis, MO, E.U.A.) en la vena de la cola. La estreptozotocina se disuelve en NaCI al 0.9 por ciento justo antes de la inyección. Se determinan el peso y la glucosa en sangre en los días 0, 1 , 2, 3, 5, 7, 9, en muestras de sangre recolectadas de la cola. En el día 9, los animales se sacrifican mediante dislocación cervical. Toda la experimentación con animales es aprobada por el Animal Ethics Commitee (Comité de Ética con Animales) local (Tierp, Suecia). El tratamiento con el Compuesto I protege completamente contra la inyección de 120 miligramos/ kilogramo de estreptozotocina (Tabla 4). En adición, el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege parcialmente contra la dosis más alta de estreptozotocina (160 miligramos/ kilogramo) (Tabla 3).

Día Suero Compuesto I STZ STZ + Compuesto 1 -2 8.6 + 0.6 7.5+_0.7 8.2 + 0.9 7.9 + 0.4 0 7.4 + 0.3 7.5 + 0.6 8.5 + 0.5 6.8+0.4* 1 7.6 + 0.3 8.5 + 0.8 10.3+0.7 8.0 + 0.3** 2 8.5 + 0.3 9.0 + 0.5 20.2+1.6 11.7 + 0.7*** 3 8.5 + 0.4 9.1+0.4 20.7+0.5 13.5 + 1.3*** 5 7.6 + 0.2 8.5 + 0.6 21+1.3 14.4+1.4** 7 7.7 + 0.3 8.5 + 0.5 25.6+0.9 18.1+2.1** 9 8.7 + 0.2 9.0 + 0.4 27.2 + 0.4 20.0±_2.4** Tabla 3. Efecto del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, sobre la diabetes en ratones, inducida por 160 miligramos/ kilogramo de estreptozotocina. Los ratones NMRI se alimentan con 200 miligramos/kilogramo del Compuesto I mediante intubación una vez al día en los días -1, 0, y 1. En el día 0, los ratones se inyectan con 160 miligramos/ kilogramo de estreptozotocina intravenosamente, y se determina la glucosa en sangre en los días dados en la Figura. y *** denotan p < o.05, 0.01 , y 0.001 contra STZ, empleando la prueba-t de Student. El número de observaciones es de 5 (Suero y Compuesto l) y 10 (STZ y STZ + Compuesto I).

Día STZ STZ + Compuesto I 0 8.9 + 0.4 7.8 + 0.3 1 9.9 + 0.2 7.4 + 0.3*** 2 9.5 + 0.5 7.4 + 0.4* 3 10.0 + 0.8 8.2 + 0.9 5 12.7 + 1.5 9.0 + 0.9* 7 12.6 + 1.2 8.8 + 0.6* Tabla 4. Efecto del Compuesto I sobre diabetes en ratones inducida por 120 miligramos/kilogramo de estreptozotocina. Los ratones NMRI se alimentan con 200 miligramos/kilogramo del Compuesto I mediante intubación una vez al día en los días -1 , 0, y 1. En el día 0, los ratones se inyectan con 160 miligramos/kilogramo de estreptozotocina intravenosamente, y se determina la glucosa en sangre en los días dados en la Figura. * y *** denotan p < 0.05 y 0.001 , respectivamente, cuando se comparan contra el grupo de STZ correspondiente (prueba-t de Student). El número de observaciones es de 10.

Diseño y métodos de investigación: 1. Para identificar señales de muerte y factores de tensión adicionales que promuevan la muerte de las células-beta humanas a través de sendas inhibidas por el Compuesto I . Las células de islotes humanos se tratan con 10 µ? de la Sal l, por ejemplo el Compuesto I, y se determina la muerte de células de islotes en respuesta a los siguientes agentes citotóxicos: peróxido de hidrógeno (150 µ?; tensión oxidativa), estaurosporina (200 nM, inhibición de PKC), FCCP (5 µ M ; desacoplamiento y transición de permeabilidad de membrana m i to co n d ri a I ) , Brefeldina A (10 µ?, tensión de ER), tapsigargina (200 n M , tensión de ER y aumento de Ca2 + ), y doxorrubicina (2 µ?, daño del ADN). La muerte celular se visualiza por el teñido vital con yoduro de propidio y bis-bencimida, seguido por el microscopio de fluorescencia. Se utilizan islotes en grupos duplicados de 10. Este procedimiento permite hacer la cuantificación tanto de la apoptosis como de la necrosis en los islotes intactos. La técnica de teñido vital se combina con el ensayo XTT (una versión simplificada del ensayo MTT), lo cual nos proporciona un ensayo de rastreo simple y rápido de la viabilidad de los islotes. 2. Para estudiar si el Compuesto I afecta al desarrollo de diabetes en modelos animales de diabetes tipo 1_. Como se describió anteriormente, el Compuesto I, por ejemplo la Sal 1, protege contra una inyección de una sola dosis de estreptozotocina . Con el fin de extender esta observación, se evalúa el papel de la c-Abl en el desarrollo de diabetes en el modelo de ratón negro/c57KSJ tratado con multi-estreptozotocina. Los tratamientos diarios con el Compuesto I (200 miligramos/kilogramo del Compuesto I en 200 microlitros de NaCI al 0.9 por ciento) se inician un día antes del primer tratamiento con estreptozotocina (inyecciones diarias de dosis baja de 40 miligramos/ kilogramo durante 5 días), y se continúan durante diez días o dos semanas, cuando se presenta una diabetes manifiesta. El tratamiento se evalúa mediante mediciones diarias de los valores de glucosa en sangre. Después de diez días o dos semanas, los ratones se sacrifican, y se remueven los páncreas y se fijan para el análisis inmunohistoquímico y morfométrico. Se califican la inflamación de los islotes y la masa de células-beta. Se estudia la importancia de c-Abl en la recurrencia de la enfermedad en el ratón diabético no obeso, abreviado como ratón NOD. Se emplea un protocolo similar al dado anteriormente. Sin embargo, en este caso, el tratamiento con el Compuesto 1 se da a ratones NOD hembras diabéticas. Un día después de la primera administración del Compuesto I mediante intubación, se trasplantan 300 islotes aislados de ratones NOD jóvenes, debajo de la cápsula del riñon. Después de siete días, se determinan los valores de glucosa, y se sacrifican los ratones. En este punto del tiempo, la mayoría de las células-beta trasplantadas han sido destruidas por las células inmunes activadas, y es detectable cualquier efecto supuesto del Compuesto I sobre la sobrevivencia de las células-beta. Los trasplantes se recuperan y se fijan para el análisis. En tercer lugar, se estudia el efecto del Compuesto 1 sobre el curso natural de la diabetes en ratones NOD. Los ratones NOD hembras, a la edad de 4 a 5 semanas, cuando no hay o hay muy poca insulitis, reciben mini-bombas osmóticas de Alzet subcutáneamente, que liberan 0.25 microlitros por hora durante cuatro semanas, del Compuesto I concentrado, o bien del vehículo solo. Después de las cuatro semanas, los ratones se sacrifican, y se remueven los páncreas y se fijan para el análisis i n m u n o h i s to q u ím i co y m o rf o m ét ri co . Se califica el grado de insulitis y de masa de células-beta. En vista de la posibilidad de que la inhibición farmacológica de c-Abl sea problemática, se intenta un planteamiento genético. Para este propósito, se aislan islotes de ratones c57/KSJ negros y NOD, y se dispersan las células de islotes mediante tratamiento con tripsina. Las células de islotes se transducen con el vector adenoviral recombinante a 5 OI, que dirige la transcripción de una molécula de ARNsi específica de c-Abl. Como el control, se utiliza un vector adenoviral que codifica una secuencia de ARNsi mezclado. Luego se permite que las células se vuelvan a acumular durante 5 días in vitro antes del implante debajo de la cápsula del riñon de los ratones singénicos. Los ratones se tratan y se analizan como se menciona anteriormente. Puede ser que el vector adenoviral sea inadecuado para propósitos in vivo, considerando su toxicidad inherente y su inmunogenicidad. Se construye un vector AAV que exprese la misma construcción anti-ARNsi de c-Abl. Aproximadamente el 30 por ciento de las células-beta de islotes se transducen mediante el AAV, cuando se dispersan in vitro (no se muestran los resultados). Ésta es considerablemente más baja que la eficiencia de transducción obtenida con los vectores a d e n o v i ra le s , pero es suficientemente alta para permitir la evaluación de c-Abl en la destrucción de células-beta in vivo.

Métodos e instalaciones Islotes humanos. Se cultivan islotes humanos en flotación libre, en condiciones de cultivo convencionales (glucosa 5.6 mM en RPMI 1640 + suero fetal de becerro al 10 por ciento). Citometría de flujo y clasificación de células. La eficiencia se evalúa fácilmente con un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson) con una capacidad de clasificación de células, y utilizando la forma desestabilizada de la proteína fluorescente verde como un reportero, y se clasifican simultáneamente las células t ra n sf e ctad as para una experimentación adicional o para el trasplante. Por consiguiente, ya no es necesario apoyarse en la generación de clones seleccionados de células de insulinoma que expresen establemente el transgén (problemas con la variación clonal). Se pueden utilizar células transitoriamente transfectadas separadas de las células no transfectadas. En adición, el citómetro de flujo también evalúa la viabilidad celular (teñido con yoduro de propidio) y la apoptosis (anticuerpo anti-caspasa activada-3). En adición, también se utiliza el citómetro de flujo para la clasificación de células-beta de roedor, el análisis del ciclo celular, el potencial de membrana m i t o co n d r i a I , la producción de radicales libres de oxígeno, y los estudios de inmunofluorescencia (insulina, glucagon , Bcl-2).

Ejemplo 2: Cápsulas con metan s u lf o n at o de 4- [ ( 4- m et i I - 1-piperazin-1-ilmetil)-N-r4-metil{3-fF4-(3-piridinil)-2-pirimidinin-aminoT-fenin-benzamida, forma de cristal beta Se preparan cápsulas conteniendo 119.5 miligramos de la Sal l, que corresponden a 100 miligramos del Compuesto I (base libre) como fracción activa, en la siguiente composición: Composición: Sal í 119.5 mg Avicel 200 mg PVPPXL 15 mg Aerosil 2 mg Estearato de magnesio 1.5 mg 338.0 mg Las cápsulas se preparan mezclando los componentes y llenando la mezcla en cápsulas de gelatina dura, tamaño 1.

Ejemplo 3: Estudios sobre los mecanismos subyacentes a la protección inducida por el Compuesto I contra la muerte de células-beta y la diabetes ¡n vivo Antecedentes: Se sabe que el Compuesto l inhibe la c-Abl, una quinasa de proteína tirosina ubicuitamente expresada con un peso molecular aproximado de 145 kDa. Bajo condiciones fisiológicas, se ha demostrado que la c-Abl participa en el control de las funciones citoesqueléticas, tales como la migración y la estructura celular, y el progreso del ciclo celular. Sin embargo, cuando se expone a las células a diferentes formas de tensión, la c-Abl llega a ser altamente activada, lo cual conduce a paro del ciclo celular y apoptosis. Resultados recientemente obtenidos: La c-Abl se expresa en las células bTC-6 y en los islotes de rata aislados, y la inhibición de la actividad de c-Abl, utilizando el agente farmacológico del Compuesto I, dio como resultado protección contra la muerte de células-beta inducida por la estreptozotocina, las citoquinas pro-inflamatorias, o por los donadores de óxido nítrico. El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, es un inhibidor selectivo utilizado clínicamente para el tratamiento de leucemia mielógena crónica. En adición a la c -Abl, se sabe que el Compuesto I inhibe los oncogenes de ABL, c-KIT, el receptor de PDGFbeta, y el homólogo de c-Abl, ARG. Por consiguiente, es necesario demostrar que los efectos de la Sal I son mediados específicamente por medio de la inhibición de c-Abl. Por consiguiente, las células bTC-6 se trataron con ARNsi mezclado, o bien ARNsi específico para c-Abl. El ARNsi se introduce en las células utilizando el reactivo de Lipofectamina. Luego las células son seguidas durante 1 ó 3 días, después de lo cual, se aisla el ARN total. El ADNc se sintetiza a partir del ARN, y se utiliza para la amplificación con reacción en cadena de la polimerasa utilizando cebadores específicos para c-Abl (35 ciclos) y b-actina, es decir, beta-actina (20 ciclos). Los productos de la reacción en cadena de la polimerasa se separan sobre un gel de agarosa, y se visualizan mediante teñido con bromuro de etidio. No se puede observar ninguna banda de c-Abl en las células 24 horas después del tratamiento con ARNsi (no mostrado). Sin embargo, a las 72 horas, aparece una banda de c-Abl. Estos resultados sugieren que el ARNsi dirigido contra c-Abl media la eliminación genética del mensajero por medio del mecanismo del ARNi, y que el efecto es solamente transitorio en las células bTC-6 que proliferan rápidamente (no se muestran los datos). Habiendo establecido que se pueden reducir los niveles de ARNm de c-Abl con la técnica de ARNi, en seguida investigamos si las células bTC-6 deficientes en ARNm de c-Abl respondían a la combinación de I L - 1 ß , IFN-?, y TFN- , con un incremento en la muerte celular. Contrariamente a la situación observada en las células de islotes primarias, las células bTC-6 mueren en respuesta a las citoquinas de preferencia mediante apoptosis. Más aún, la muerte de las células bTC-6 inducida por citoquina es potencialmente contrarrestada por el ARNsi específico de c-Abl dos y tres días después del tratamiento (Figura 3). Esto indica que un cambio presumiblemente lento de la proteína c-Abl da como resultado una demora en el efecto del tratamiento con ARNsi. Pero más importante, los datos sugieren que la protección inducida por la Sal I contra un donador de NO y la combinación de citoquinas, es mediada por la inhibición de la c-Abl. Conexión entre c-Abl y diferente quinasas MAP: Se buscó una conexión entre c-Abl y las diferentes quinasas MAP: p38, JNK, y ERK, que podrían actuar como efectores corriente abajo de c-Abl. Para este propósito, los islotes de rata se incuban previamente durante 24 horas con 10 µ? del Compuesto I, y luego se exponen a DETA/NO (2 mM) y la combinación de I L- 1 ß , IFN-?, y TNF-a durante 20 minutos. Entonces se analizan los islotes para determinar la fosforilación de p38, JNK2, y ERK1/2, utilizando anticuerpos fosfoespecíficos e inmunomanchado. El tratamiento con el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, contrarresta parcialmente (del 25 al 45 por ciento) la activación de p38, JNK, y ER , inducida por DETA/NO, y aumentó la activación de MAPK inducida por citoquina (Tablas 5 y 6).

Tabla 5. Efectos del Compuesto 1, por ejemplo la Sal I, sobre la activación de p38, JNK, y ERK, inducida por DETA/NO y citoquina. Los islotes de rata aislados se incuban previamente durante 24 horas con 10 µ? del Compuesto I, y luego se exponen durante 20 minutos a DETA/NO o a las citoquinas I L- 1 ß (50 Unidades/mililitro) e IFN-? (1,000 Unidades/mililitro). La fosforilación de ER , JNK, y p38 se determina mediante inmunomanchado, y se expresa por cantidad total de ERK, JNK, y p38. Los resultados se expresan como un porcentaje del control, y son promedios para 4 observaciones separadas. ** y * denotan p < 0.01 y p < 0.05, respectivamente, cuando se comparan contra el grupo correspondiente sin el Compuesto I, empleando ANOVA de 2 vías y la prueba-t de Student.

Tabla 6. Los resultados de la Tabla 5 se vuelven a calcular, de tal manera que se expresan los efectos del Compuesto I en porcentaje del grupo correspondiente sin adición alguna del Compuesto I.

Estos resultados apoyan que la producción de óxido nítrico inducida por citoquina activa las JNK y p38 cuando menos parcialmente por medio de la senda de c-Abl, y que esto conduce a la muerte de las células-beta. Por otra parte, la elevación temprana en la actividad de p38 y JNK que ocurre en respuesta a las citoquinas, parece ser suprimida por c-Abl. Sin embargo, en esta situación, es probable que este primer pico en la actividad de p38 y JNK inducida por 5 citoquina represente una respuesta fisiológica que conduzca a una expresión genética alterada y a una mayor proliferación, y no a la apoptosis por sí misma. Por ejemplo, se ha sugerido que la activación de citoquina p38 y JNK participa en la expresión subsecuente del gen ¡NOS. En este Q contexto, la supresión de p38 y JNK mediada por c-Abl observada actualmente, explica muy bien la mayor producción de óxido nítrico observada en los islotes tratados con citoquinas y el Compuesto I. En vista de estos datos, la c-Abl actúa como un 5 sensor de tensión y de las señales de muerte externas, y esa activación de c-Abl podría conducir a la fosforilación y activación de las quinasas MAP JNK y p38, y finalmente a la muerte de las células-beta. o Experimentos adicionales: 1. Para estudiar la expresión de c-Abl en células-beta. Se puede evaluar la expresión del ARNm de c- Abl mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. Se comparan los niveles de ARNm de c-Abl de los islotes con aquéllos de otros tejidos. Las sondas fluorescentes específicas para c-Abl se adquieren en T1B MOLBIOL Syntheselabor (Berlín, Alemania), y las señales fluorescentes se cuantifican contra una curva estándar de ADNc de c-Abl, utilizando el Instrumento Lightcycler. El número de moléculas de ARNm de c-Abl se estandariza a las moléculas de ARNm de actina-b. Se compara el contenido de ARNm de c-Abl de los islotes humanos, con aquél de hígado, músculo, riñon, bazo, cerebro, y pulmón. En paralelo, se cuantifica la expresión de la quinasa de tirosina ARG similar a c-Abl, que podría actuar de una forma similar a la c-Abl. En este contexto, se determina si los niveles de ARNm de c-Abl son afectados por las citoquinas, la tensión oxidativa, y la tensión de ER. Los islotes humanos se exponen a I L - 1 ß (25 Unidades/mililitro) + IFN-? (1 ,000 Unidades/mililitro) + TNF-(1,000 Unidades/mililitro), peróxido de hidrógeno 100 mM, o brefeldina A (10 µ?) durante tres horas, y luego se analizan para determinar la expresión del ARNm de c-Abl mediante reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. 2. Para estudiar si la c-Abl se fosforita en respuesta a la tensión de cé I u I as- bet a . Se generan líneas celulares bTC-6 estables que sobre-expresan c-Abl de tipo silvestre, mediante lipofección de las células con un plásmido de pCDNA3/c-Abl (obtenido en el Instituto Ludwig, Universidad de Uppsala), seguido por selección de resistencia a la geneticina. Luego, las células bTC-6 que sobre-expresan c-Abl se exponen a IL-1, brefeldina A, y DETA/NO durante 20, 60, y 360 minutos, para establecer si la c-Abl se fosforila en respuesta a las citoquinas, la tensión de ER, y el óxido nítrico. Entonces se homogeneizan las células en la presencia de inhibidores de fosfatasa, y se inmuno-precipita la c-Abl utilizando el anticuerpo K-12 anti-c-Abl (Santa Cruz). Después del PAGE y de la transferencia a filtros de nilón, se analizan las bandas de c-Abl para determinar la fosforilación de tirosina en el aminoácido 245, y la fosforilación de tirosina total con dos anticuerpos de c-Abl fotoespecíf icos (Tyr245 y Thr735) disponibles en Cell Signaling Technology, y el anticuerpo de fosfotirosina 4G10. Se incrementa la actividad de c-Abl cuando se hiper-fosforilan los residuos de aminoácidos Tyr245 y Thr735. 3. Para estudiar si la localización subcelular de c-Abl es afectada por la tensión de células-beta. Se cultivan células bTC-6 que expresan c-Abl sobre portaobjetos y luego se exponen a citoquinas, brefeldina A, y donador de óxido nítrico, durante seis horas. En seguida de la fijación, el bloqueo, y la permeabilización, las células se analizan mediante el microscopio confocal utilizando verde Mitotracker (Molecular Probes), el cual tiñe de verde la mitocondria, y el anticuerpo de c-Abl, K-12 (Santa Cruz), el cual, con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina, tiñe de rojo la c-Abl. Si se re-localiza la c-Abl desde el retículo endoplásmico hasta la mitocondria, se cambia el patrón de teñido desde rojo y verde separados, hasta solamente amarillo. 4. Para identificar los objetivos corriente abajo de c-Abl. Para este propósito, se generan células CbTC-6 que s o b re -exp resa n transitoriamente la tipo silvestre o una forma constitutivamente activa de c-Abl. Las células bTC-6 se lipofectan (Lipofectamina + Li p of e cta m i n a plus) con el vector pcDNA3/c-Abl, y un vector de expresión de GFP. Esto da como resultado el 20 por ciento de células positivas para GFP, las cuales se van a enriquecer hasta más del 75 por ciento mediante FACS. Las células clasificadas se aplican a una placa y se cultivan durante 24 horas, y luego se analizan para determinar la fosforilación de los objetivos candidatos de ERK, JNK, p38, ???, p53, y AKT (efector corriente abajo de PI3K). 20 y 120 minutos antes del análisis, las células se estimulan con doxorrubicina (activación nuclear de c-Abl) o DETA/NO (activación citoplásmica de c-Abl) con o sin la Sal I, por ejemplo el Compuesto I. La fosforilación (ser/thr) de las proteínas objetivas supuestas se analiza mediante inmunomanchado utilizando anticuerpos f osf o- e s p e c íf i co s co m e re i a I m e n te disponibles (Cell Signal Technology). Esto revela si los efectores candidatos son fosforilados y activados en respuesta a la activación de c-Abl. Se analizan los niveles de Bcl-2, Bcl-XL, y Aph2, utilizando la técnica tradicional de Western blot. En algunos casos, algunas veces es necesaria la inmunoprecipitación de las proteínas candidatas para aumentar la sensibilidad del análisis de inmunomanchado. Para la fosforilación específica de tiros i na, se inmunoprecipitan los efectores candidatos, y se analizan mediante inmunomanchado, utilizando el anticuerpo PY20 anti-fosfotirosina. 5. Para estudiar la interacción entre c-Abl y Shb: Se inician experimentos con el objetivo de entender la supuesta interacción entre la c-Abl y la proteína adaptadora Shb. Shb es una proteína que contiene dominio SH2 con motivos ricos en prolina en su término N, un dominio central de PTB (enlace de fosfotirosina), varios sitios de fosforilación de tirosina potenciales, y un dominio SH2 extermina!, y se sabe que sirve a un papel en la generación de complejos de señalización en respuesta a la activación de la quinasa de tirosina. Es interesante que se incrementa la propensión apoptótica de las células-beta que sobre-expresan Shb. En realidad, el ratón transgénico que expresaba SHB bajo el control del promotor de insulina de rata, exhibió índices elevados de apoptosis cuando se cultivaron los islotes en ausencia de suero o en la presencia de citoquinas citotóxicas. En vista de un reporte reciente que muestra que el miembro Shd de la familia SHb se enlaza a, e interactúa con, la c-Abl, es posible que la c-Abl actúe por medio de interacciones con Shb en las células-beta. Con el fin de investigar esto, las células transitoriamente transf ectadas para sobre-expresar c-Abl, Shb, ó un muíante de Shb, se tratan con pervanadato, y luego se inmunoprecipitan con un anticuerpo anti-Shb. Entonces se lleva a cabo el inmuno-manchado sobre los inmunoprecipitados, para analizar los niveles de c-Abl y Shb, y la fosforilación de tirosina de la c-Abl co-precipitada con Shb. Los descubrimientos preliminares indican que la c-Abl se co-precipita con Shb, y viceversa, y que la s o b re -exp res i ó n de c-Abl da como resultado una mayor fosforilación de Shb (no se muestran los datos). Estos descubrimientos apoyan la noción de que Shb es un sustrato para la quinasa c-Abl. Con el fin de entender adicionalmente la interacción entre c-Abl y Shb, se llevan a cabo experimentos de extracción de proteína de fusión. Se permite que las proteínas de fusión GST, GST-ShbSH2, y GST-ShbPTB/dominio rico en prolina, interactúen con los homogenatos de células-COS conteniendo altos niveles de c -Abl. Las reacciones se llevan a cabo con o sin estímulo con pervanadato, es decir, para ver la importancia de la fosforilación de tirosina de c-Abl, y con la adición de fosfotirosina , es decir, para ver la importancia de la interacción del dominio-SH2 con el residuo de fosfotirosina.

Los productos de extracción se analizan para determinar c-Abl y fosfo-c-Abl mediante inmunomanchado. Estos experimentos indican los dominios de Shb que son necesarios para el enlace con c-Abl no fosforilada o fosforilada. Se llevan a cabo los experimentos correspondientes utilizando la proteína de fusión de c-Abl (c-Abl-SH2 y c-Abl-SI-13), con el objeto de evaluar los dominios que son críticos para el enlace con Shb. Con el fin de establecer si la interacción de Shb-c-Abl media la mejor propensión de las células de islotes que sobre-expresan Shb a sufrir apoptosis en respuesta a diferentes estímulos nocivos, se aislan islotes de ratones transgénicos-Shb, y se exponen a las citoquinas, a DETA/NO, y a la estreptozotocina, con o sin el tratamiento previo con el Compuesto I. Se cuantifican la apoptosis y la necrosis, y los datos obtenidos de los ratones transgénicos se comparan con aquéllos de los ratones de control obtenidos en paralelo. Si se normalizan los niveles mejorados de apoptosis y necrosis de los islotes-Shb mediante el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, es posible que la interacción de Shb-c-Abl sea una senda reguladora de apoptosis esencial. Instalaciones: AR N i . Se inician los estudios con el objetivo de desactivar la expresión genética en células-beta, empleando la técnica de ARNi. El ARN de interferencia pequeño (ARNsi) se adquiere en Dharmacon Research a un costo de 300 a 600 dólares norteamericanos por par de oligonucleótidos de ARN. Utilizando el ARNsi marcado con FITC, se observa que el ARNsi se introduce de una manera eficiente en las células productoras de insulina utilizando Upofectamina o Lipofectamina 2000 (no se muestran los resultados). Desafortunadamente, el efecto del ARNsi liposomalmente suministrado es solamente transitorio. Para la producción de vectores adeno-asociados recombinantes (AAV), se utiliza el AAV Helper-Free System (Stratagene). Este estuche incluye plásmidos para la producción de vectores-AAV que expresan beta-gal, utilizados para los estudios preliminares de eficiencia de transfección. El trabajo con vectores virales ha ganado aprobación de la Agencia Gubernamental Sueca Arbetarskyddstyrelsen . Reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real . El instrumento Lightcycler (Roche) es un ciclador de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real. El aparato permite hacer una cuantif icación rápida y precisa de las moléculas de ARNm, y por consiguiente, es adecuado para los estudios de la expresión genética. Se proporcionan técnicas de microscopio confocal y de microscopio de electrones.

Claims (7)

REIVINDICACIONES

1. El uso de 4-(4-metil-piperaz¡n-1 -Mmetil)-N-[4-metil-3-(4-p¡r¡din-3-il)-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la fabricación de un medicamento para curar o prevenir la diabetes.

2. El uso de 4-(4-metil-piperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-pir¡din-3-¡l)- irimidin-2-iIamino)-fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la fabricación de un medicamento para curar la diabetes.

3. El uso de 4-(4-met¡l-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metiI-3-(4-piridin-3-il)-pirimidin-2-ilamino)-fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, para la fabricación de un medicamento para prevenir la diabetes.

4. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la diabetes es diabetes tipo I.

5. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en donde la diabetes es diabetes tipo II.

6. El uso de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5, en donde la 4-(4-metil-piperazin-1 -ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridin-3-il)-pir¡midin-2-¡lamino)-fenil]-benzamida está en la forma de la sal de mono-metan- sulfonato.

7. Un paquete de medicamento, el cual comprende 4-(4-metil-piperazin-1-ilmetil)-N-[4-metii-3-(4-piridin-3-iI)-pirimidin-2-ilamino)-fen¡l]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, junto con instrucciones impresas para su administración a los pacientes que tengan diabetes, por ejemplo diabetes tipo I o diabetes tipo II.