JP4776537B2 - 糖尿病処置のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用 - Google Patents

糖尿病処置のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用 Download PDF

Info

Publication number
JP4776537B2
JP4776537B2 JP2006529925A JP2006529925A JP4776537B2 JP 4776537 B2 JP4776537 B2 JP 4776537B2 JP 2006529925 A JP2006529925 A JP 2006529925A JP 2006529925 A JP2006529925 A JP 2006529925A JP 4776537 B2 JP4776537 B2 JP 4776537B2
Authority
JP
Japan
Prior art keywords
diabetes
abl
compound
cells
type
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
JP2006529925A
Other languages
English (en)
Other versions
JP2006528225A5 (ja
JP2006528225A (ja
Inventor
ロベルト・ペール・ヘーガークヴィスト
ニルス・リチャード・ウェルシュ
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Individual
Original Assignee
Individual
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Priority claimed from GB0312086A external-priority patent/GB0312086D0/en
Priority claimed from GB0402682A external-priority patent/GB0402682D0/en
Application filed by Individual filed Critical Individual
Publication of JP2006528225A publication Critical patent/JP2006528225A/ja
Publication of JP2006528225A5 publication Critical patent/JP2006528225A5/ja
Application granted granted Critical
Publication of JP4776537B2 publication Critical patent/JP4776537B2/ja
Anticipated expiration legal-status Critical
Expired - Fee Related legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/40—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil
    • A61K31/403—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom, e.g. sulpiride, succinimide, tolmetin, buflomedil condensed with carbocyclic rings, e.g. carbazole
    • A61K31/404—Indoles, e.g. pindolol
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/41—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having five-membered rings with two or more ring hetero atoms, at least one of which being nitrogen, e.g. tetrazole
    • A61K31/42—Oxazoles
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/4353—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems
    • A61K31/437—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom ortho- or peri-condensed with heterocyclic ring systems the heterocyclic ring system containing a five-membered ring having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. indolizine, beta-carboline
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/435—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with one nitrogen as the only ring hetero atom
    • A61K31/47—Quinolines; Isoquinolines
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/498—Pyrazines or piperazines ortho- and peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinoxaline, phenazine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/506—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim not condensed and containing further heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/517—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with carbocyclic ring systems, e.g. quinazoline, perimidine
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K31/00—Medicinal preparations containing organic active ingredients
    • A61K31/33—Heterocyclic compounds
    • A61K31/395—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins
    • A61K31/495—Heterocyclic compounds having nitrogen as a ring hetero atom, e.g. guanethidine or rifamycins having six-membered rings with two or more nitrogen atoms as the only ring heteroatoms, e.g. piperazine or tetrazines
    • A61K31/505—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim
    • A61K31/519—Pyrimidines; Hydrogenated pyrimidines, e.g. trimethoprim ortho- or peri-condensed with heterocyclic rings
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
    • A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
    • A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Diabetes (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Obesity (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Endocrinology (AREA)
  • Emergency Medicine (AREA)
  • Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
  • Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
  • Acyclic And Carbocyclic Compounds In Medicinal Compositions (AREA)
  • Nitrogen Condensed Heterocyclic Rings (AREA)
  • Plural Heterocyclic Compounds (AREA)

Description

発明の詳細な説明
本発明は、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病を処置するための医薬組成物の製造を目的とした4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミド、以下“化合物Ｉ”と称する、またはその薬学的に許容される塩の使用、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病の処置における化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩の使用、処置を必要とするI型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病に罹患した哺乳動物を含む温血動物、特にヒトに、当該疾患に有効量の化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩を投与することによる処置方法、に関する。
図の説明:
図１. bTC-6細胞および単離ラット膵島におけるサイトカイン惹起NO産生は10μMの化合物Ｉ、例えば塩Ｉにより影響されない。結果は独立した3観察の平均値±標準誤差である。
図２. 化合物Ｉ、例えば塩Ｉは部分的に一酸化窒素に対してヒト膵島細胞を保護する。結果は、別々の3ドナーからの平均値±標準誤差である。
図３. スクランブルsiRNAまたはc-Abl-特異的siRNAで処理されたbTC-6細胞におけるアポトーシスの割合。サイトカイン処置(IL-1β＋IFN-γ＋TNF-α)は細胞を解析する24時間前に開始する。アポトーシスはフローサイトメトリーにより定量される。結果は3-4観察の平均値±標準誤差である。
百万人以上のアメリカ人が、インスリン依存性糖尿病、略してIDDMまたは若年性糖尿病とも呼ばれる、I型糖尿病である。I型糖尿病では、患者の膵臓は生命維持に必要なホルモンであるインスリンをほとんど産生しないか、全く産生しない。原因は完全には知られていないが、I型糖尿病は多因子性自己免疫疾患で、膵臓のインスリンを産生するベータ細胞の特異的で進行性の破壊に因る。それは、最も費用がかかる、小児の慢性疾患の一つであり、決して克服できない疾患である。インスリンはヒトを生存させるが、病気を治癒させず、結果として生ずる破壊的な影響：腎不全、失明、神経損傷、切断、心臓発作および卒中を予防もしない。生き続けるため、I型糖尿病の人は、日々何回もインスリンの注射をしなければならず、またはポンプを介してインスリンを持続注入しなければならなく、さらに1日に6回以上、採血のために指を刺すことで血糖を測定しなければならない。インスリン注射と食餌量とのバランスをとることに努める一方、I型糖尿病の人は、可能性としてある、生命を脅かす、低血糖、すなわち低い血糖、および高血糖、すなわち高い血糖の反応に対し絶えず準備しなければならない。健康によい食餌、運動計画、および常に適切量のインスリンを注射することを維持するために厳重に注意しているにもかかわらず、ストレス、ホルモン変化、成長期、身体活動、薬物治療、病気／感染症、および疲労を含む他の多くの因子が、人間の血糖コントロールに悪影響を与え得る。インスリンを使用してもなお、I型糖尿病は通常生活の質を著しく低下させ、15年平均寿命を短縮する。毎年、3万人のアメリカ人がI型糖尿病と診断され、そのうち、1万3千人以上が小児である。それは、毎日、１日で35人の小児ということである。
II型糖尿病は、またインスリン非依存性糖尿病、略してNIDDM、または成人型糖尿病と呼ばれ、通常肥満、インスリン抵抗性およびインスリンの相対的欠乏に関係する。この型の糖尿病はほとんどの場合非インスリン要求性であるが、これとI型糖尿病には著しい類似性がある。例えば、II型糖尿病においてもインスリン産生ベータ細胞が絶対的に欠乏していること、およびこのベータ細胞の欠乏はおそらくベータ細胞死の速度増加に因ることが、今日認められている。したがって、ベータ細胞死を保護する薬理学的処置はI型糖尿病およびII型糖尿病の両方の処置として有用であり得る。
驚くべきことに、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤またはそれらの薬学的に許容される塩、例えば、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩である塩Ｉは、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病の処置に特に有用であることが見出された。予想外に、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤またはそれらの薬学的に許容される塩、例えば、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩である塩Ｉが、I型またはII型糖尿病等の糖尿病を治療または予防するために用いることができることが見出された。
化合物Ｉは、下記式
Figure 0004776537
 を有する、4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミドである。
化合物Ｉ遊離塩基、その許容される塩およびその製造法は欧州で付与された特許0564409に開示されている。化合物Ｉ遊離塩基が活性部分に相当する。化合物Ｉのモノメタンスルホン酸付加塩、以下“塩Ｉ”と称する、およびその好ましい結晶形、例えばベータ結晶形、は1999年1月28日に公開されたＰＣＴ特許出願WO99/03854に開示されている。
本発明はI型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病に対する薬剤としての、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤またはそれらの薬学的に許容される塩の使用に関する。最も好ましくは、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病に対する薬剤としての化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩である塩Ｉの使用に関する。
本発明よって使用されるc-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤は、以下の化合物：4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミド、以下化合物Ｉと称する、高活性および経口利用可能により傑出する、PDGF受容体イソ型、Bcr-Abl、およびc-Kit阻害剤; ビス(1H-2-インドリル)-1-メタノン類、Mahboobi Sら、 J. Med. Chem. 2002, 45:1002-1018で記載されるPDGF-R TK阻害剤として特徴づけられる他のクラスのチロシンキナーゼ阻害剤（引用により本明細書に組み込まれる）; CAS番号71897-07-9であるPDGF受容体キナーゼブロッカーAG1295; Kovalenko Mら、Cancer Res. 1994 54:6106-6114およびLudewig Dら、Cell Tissue Res. 2000, 299:97-103に記載されるAG1295/96（引用により本明細書に組み込まれる）; CT52923 (4-(6,7-ジメトキシ-4-キナゾリニル)-N-(3,4-メチレンジオキシベンジル)-1-ピペラジンチオカルボキサミド); RP-1776; GFB-111; ピロロ[3,4-c]-ベータ-カルボリン-ジオン類、SU 102 (SUGENにより開発された); CAS番号146535-11-7であるAG1296; Aventis Pharmaにより開発されたRPR101511A; ZymoGeneticsにより開発されたCDP 860およびZvegf3; Pfizer由来のCP 673451およびPD 170262; CAS番号190726-45-5であるKI 6783、キリンビール（日本）により開発されたPDGF-R阻害剤; 協和発酵（日本）およびMillenium Pharmaceuticals（米国）により開発されたKN 1022; Pfizerにより開発されたAG 13736; Chiron Corporationにより開発されたCHIR 258; Millenium Pharmaceuticals由来MLN 518およびSUGEN-Pfizer由来SU 11248、Leflunomide; またはそれらの薬学的に許容される塩、からなる群から選択される。
CT52923は、Matsuno Kら、“PDGF受容体リン酸化阻害剤-1の合成と構造活性相関” 第18回医薬品化学シンポジウム; 1998年11月25-27日; 京都、日本、日本薬学会、医薬品化学部門、東京、日本:要旨集 2-P-05に記載されている。
RP-1776は環状ペプチドであり、ストレプトマイセス属の培養液から単離された。KY11784は例えば、Toki S、Agatsuma Tら、J. Antibiot. (Tokyo) 2001 May;54(5):405-14に記載されている。
GFB-111は、例えば、Blaskovich MAら、Nat. Biotechnol. 2000 Oct;18(10):1065-70およびDelarue F.ら、91st Annual meeting of the American Association for Cancer research, 41:458, 2000に記載されている。
ピロロ[3,4-c]-ベータ-カルボリン-ジオン類は、例えば、Teller S, Eur. J. Med. Chem. 2000 Apr;35(4):413-27に記載されている。CDP 860はヒト抗血小板由来成長因子ベータ受容体抗体由来のペグ化抗体フラグメントである。
CP 673451はPDGF受容体を標的とする。
PD 170262または2-[4-(2-ジエチルアミノエトキシ)フェニルアミノ]-8-メチル-6-(3-チエニル)ピリド[2,3-d]ピリミジン-7(8H)-オンは血小板由来成長因子チロシンキナーゼに特異的な強力なチロシンキナーゼ阻害剤である。一連の2-アミノ-8H-ピリド[2,3-d]ピリミジン類の合成およびチロシンキナーゼ阻害活性は、例えば、Klutchko Sら、213th American Chemical Society National meeting:要旨集 MEDI 201(ポスター), 1997, USAに記載されている。
KI 6783または4-(3,4-ジメトキシフェノキシ)-6,7-ジメトキシキノリンは、例えば、Kubo Kら、Bioorganic and Medicinal Chemistry Letters 7:2935-2940, 1997およびYagi Mら、Exp. Cell Research 234:285-92, 1997に記載されている。
PDGFRリン酸化を阻害する、KN1022または6,7-ジメトキシ-4-[4-(4-ニトロフェニル)アミノカルボニルピペラジン-1イル]-キナゾリンは、例えば、217th American Chemical Society National meeting 要旨集 MEDI 061, Part1, 1999, 日本に記載されている。
AG 013736またはN-メチル-2-[3-[2-(2-ピリジル)ビニル]-1H-インダゾール-6−イルスルファニル]-ベンズアミドは、例えば、Hellerら、AG 013736の薬理学的活性、低分子VEGF/PDGFR チロシンキナーゼ阻害剤、93rd Annual meeting f the American association for Cancer research 43:1082, 2002, USAに記載されている。
CHIR 258は経口で活性のある、アミノ-ベンゾイミダゾール キノリン成長因子キナーゼ阻害剤であり、例えば、PDGFRファミリー由来の、受容体チロシンキナーゼに対して、幅広い阻害活性を示す。CHIR 258は、例えば、Steigerwalt Rら、およびLee SHらにより、94th Annual Meeting of the American Association for Cancer Research 753(およびポスター)要旨集3783および934 (およびポスター)要旨集R4702、それぞれ2003、USAで開示されている。
SU11248または5-[3-フルオロ-2-オキソ-1,2-ジヒドロインドール-(3Z)−イリデンメチル]-2,4-ジメチル-1H-ピロール-3-カルボン酸(2-ジエチルアミノエチル)アミンは、例えば、PDGFRに特異性のある、複数標的キナーゼ阻害剤である。SU11248は、例えば、Xin L.ら、93rd Annual Meeting of the American Association for Cancer Research 43:1081 (およびポスター), 2002, USAで開示されている。
MLN 518は式4-[4-(N-パラ-イソ-プロポキシフェニルカルバモイル)-1-ピペラジニル]-6-メトキシ-7-(ピペリジノプロピルオキシ)-キナゾリンである、キナゾリンのピペラジニル誘導体であり、例えば、結合試験でPDGFRリン酸化を阻害し、例えば、Stone RMら、Blood 102:65-66, 2003、Kelly LMら、Cancer Cell 1: 421-23, 2002に開示されている。
Leflunomide (SU 101)または4-イソオキサゾールカルボキサミド、5-メチル-N-[4-(トリフルオロメチル)フェニル]はチロシンキナーゼ阻害剤である。
SU11654はc-kitのチロシンキナーゼ活性を阻害する。
コード番号、一般または商品名で特定される活性物質の構造は、標準概論“The Merck Index”の現行版から、または、例えば、Patents International (例えば IMS World Publications)等のデータベースから、解釈され得る。対応するそれらの内容は、参照により本明細書に組み込まれる。さらに、本明細書は、4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミド、ビス(1H-2-インドリル)-1-メタノン類、AG1295、CT52923、RP-1776; GFB-111; ピロロ[3,4-c]-ベータ-カルボリン-ジオン類、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、Leflunomideまたはそれらの薬学的に許容される塩の、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病を処置するための薬剤の製造を目的とする使用に関し、好ましくは、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩が用いられる。
本発明はさらに、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病を治療するための薬剤の製造を目的とした、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの薬学的に許容される塩の使用に関し、好ましくは、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤は、4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミド、ビス(1H-2-インドリル)-1-メタノン類、AG1295、CT52923、RP-1776; GFB-111; ピロロ[3,4-c]-ベータ-カルボリン-ジオン類、SU 102、AG1296、RPR101511A、CDP 860、Zvegf3、CP 673451、PD 170262、KI 6783、KN 1022、AG 13736、CHIR 258、MLN 518、SU 11248、Leflunomideまたはそれらの薬学的に許容される塩、からなる群から選択され、好ましくは、4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミドである。
本明細書の記載で、“処置”なる語は、予防的または防止的処置および治療または病気抑制処置の両方を含み、糖尿病の危険性を有する患者および病気の患者の処置を含む。この語は、さらに、病気の進行を遅らせるための処置を含む。
“糖尿病を抑制および／または回復させる”という語によって、出願人は、糖尿病の状態がもはや患者には存在しないか、または病気が治療前、もしくは治療なしのときに比較して、重症でないことを意味する。
本明細書で用いられる“治療”なる語は、糖尿病または進行している糖尿病の症状を回復させる処置を意味する。
“予防的”または“防止的”なる語は、糖尿病の発症、または再発を防ぐことを意味する。
本明細書で用いられる“進行を遅延させる”とは、活性化合物を糖尿病の前段階または初期段階の患者に投与することにより、活性化合物を投与しない場合の病気の進展に比較して、さらなる病気の進展を防止し、または病気の進展を遅くすることを意味する。
本発明による医薬組成物は、本質的に既知の方法で調製することができ、そして、ヒトを含む温血動物に対する、経口または直腸投与等の経腸的投与、および非経腸的投与に適したものであり、単独でまたは一以上の薬学的に許容される、特に経腸的または非経腸的使用に適した担体と組み合わせて、治療有効量の少なくとも一薬理学的有効成分を含む。本発明の投与形の投与の好ましい投与経路は経口である。
したがって、本発明はまた、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病である温血動物を処置する方法であって、そのような処置が必要な当該動物に化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩を治療有効量投与することを含む方法に関する。
本発明はI型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病、好ましくはI型糖尿病に罹患したヒト対象に、化合物Ｉの酸付加塩および好ましくは塩Ｉである4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミドのモノメタンスルホン酸塩を投与する方法に関する。
関連技術の当業者は、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病に対する本明細書で言及されている有益な効果を証明するために、適切な試験モデルを十分に選択することができる。そのような化合物の薬理活性は、例えば、以下に記載される実施例の手段によって、インビトロ試験によっておよびインビボ試験または適切な臨床試験によって示され得る。適切な臨床試験は、例えば、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病の患者を対象とした非盲検、非無作為化、用量増加試験である。処置の有効性は、これらの試験において、例えば、プラセボで行うコントロールと共に、４週間毎、その病気を評価することによって決定される。
化合物Ｉの有効用量は、採用される特定の化合物または医薬組成物、投与形態、処置される糖尿病の型、例えばI型またはII型、またはその重症度によって変わり得る。投与計画は、患者の腎臓および肝臓の機能を含むさらなる多様な因子に従って選択される。通常の技能を有する医師、臨床医または獣医師は病気を予防し、対抗しまたは進行をくい止めるために必要な有効量の化合物を、容易に決め、および処方することができる。
年齢、個々の状態、投与形態、および問題の臨床像によって、有効用量、例えば、活性部分としての遊離塩基の100から1000mg、とりわけ800mgに対応する、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩の一日投与量が、体重約70kgの温血動物に投与される。好ましくは、温血動物はヒトである。一日投与量に対する反応が不十分な患者に対しては、用量増加が安全に考慮され、患者は処置により利益を受け、制限する毒性が出現しないかぎり、処置され得る。
本発明は、また、I型糖尿病またはII型糖尿病等の糖尿病に罹患したヒト対象に、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩を投与する方法に関し、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩の薬剤有効量をヒト対象に、一日一回、三ヶ月以上の期間で投与することを含む方法に関する。本発明は、とりわけ、化合物Ｉの400から800mg、好ましくは800mgの一日の用量を成人に投与する、方法に関する。
本発明はさらに、c-Abl-、PDGF-R-、c-kit-、またはARG-チロシンキナーゼ阻害剤、またはそれらの薬学的に許容される塩、例えば、化合物Ｉまたはその薬学的に許容される塩、例えば塩Ｉを、I型糖尿病、II型糖尿病等の糖尿病患者に投与するための印刷された使用説明書と一緒に含む、薬剤パッケージを提供する。
実施例１:化合物Ｉ、例えば塩Ｉはベータ細胞死および糖尿病に対し保護するか？
以下の実施例において、β-TC6細胞はベータ-TC6細胞として記載する。
インスリン依存性（I型）糖尿病（IDDM）は多因子自己免疫疾患であり、インスリン産生β細胞の特異的で進行的な破壊を原因とする。β細胞の機能障害および損傷は膵島浸潤細胞（マクロファージ、CD4+またはCD8+(NK)T-細胞）との直接的な接触、および／またはこれらの細胞により産生される、例えば、炎症性サイトカイン（IL-1、TNF-α、IFN-γ）、フリーラジカル、Fasリガンド、TRAILおよびパーフォリン等の細胞障害性メディエーターへの暴露、から生ずると考えられている。ベータ細胞に向けられる自己免疫は、ベータ細胞毒素、栄養成分、ストレス、代謝過剰負担、ウィルス等の環境要因によって開始され得る。I型糖尿病においては、ベータ細胞は、外部の細胞死シグナルを内部のアポトーシスイベントに変換することによって、自らの破壊に積極的に関与しているように思われる。炎症性サイトカイン、とりわけIL-1およびIFN-γの組み合わせが、ベータ細胞のアポトーシスおよびネクローシスを惹起する。したがって、これらのサイトカインが、I型糖尿病の発症において膵島浸潤免疫細胞の活性を調節するだけでなく、ベータ細胞に直接有害な作用を及ぼすことは想像できる。IL-1によるベータ細胞の刺激は、プロテインキナーゼ（PKC、p38、JNK、ERK、MSK1）、リパーゼ（PLC、PLD、スフィンゴミエリナーゼ）、シクロオキシゲナーゼおよび転写因子（NF-κB、ATF-2、c-jun、Elk-1、CREB、cEBP-β、IRF-1、STAT-1）の活性化を含む、複数のシグナル伝達イベントを誘導すると思われる。これらのイベントの後に、誘導型一酸化窒素合成酵素(iNOS)、および、hsp70、ヘムオキシゲナーゼ、Mn-SOD、ICE、その他のストレス関連タンパク質が誘導される。残念ながら、I型糖尿病において、どの遺伝子発現の変化がベータ細胞死に必須であるかは不明である。ベータ細胞株では、アポトーシスは主にUV光線やDNA修復の阻害に応じて起こる。これに先駆けて、p53癌抑制タンパクの誘導、活性酸素種の生成、PARP阻害、S期およびG2期での細胞周期の停止、およびミトコンドリアの膜電位の低下が起こる。サイトカインは、主にネクローシスを、および僅かにアポトーシスを促進し、DNA修復阻害またはUV光線と本質的に同様なシグナル伝達段階を活性化する。これらのインビトロ実験により、ベータ細胞死の形態が、細胞死シグナルに依存して変わり得るだけでなく、同様のシグナル伝達経路がベータ細胞の違う細胞死の形態を成し遂げるのに利用され得ることも明らかである。
C-Ablは普遍的に発現するタンパク質チロシンキナーゼで、およその分子量は145KDaである。生理的条件下では、c-Ablは、移動および細胞構造等の細胞骨格機能、および細胞周期の進行を制御することに関与していることが示されてきた。しかしながら、細胞が違った形式のストレスに曝されると、c-Ablは高度に活性化され、細胞周期を停止させ、アポトーシスへ誘導する。要するに、多くの非ベータ細胞における研究によって、c-Ablが多様なストレスに応じてアポトーシスを誘導することが示されてきた。インスリン産生細胞におけるc-Ablの推定される役割はまだ明らかとなってない。したがって、このタンパクがベータ細胞死、およびアポトーシスとネクローシス間の決定に何らかの役割を果たしているか否か不明である。
I型糖尿病の重要性。I型糖尿病の発症原因は大変複雑であると考えられるが、ベータ細胞を細胞死に導く細胞内経路はいくつかの特定のポイントに収束することができる。仮定では、このことより、我々がたった一つのアプローチを採用するだけで、多数の細胞死シグナルを阻止することを可能にし、それゆえ、ベータ細胞を生存させられる。
チロシンキナーゼであるc-Ablはベータ細胞死において重要なメディエーターであり得る。c-AblはbTC-6細胞および単離ラット膵島に発現し、そして、薬理学的試薬である化合物Ｉを用いるか、またはRNAi技術を用いてc-Ablの発現をノックアウトすることによって、c-Ablの活性を阻害することで、炎症性サイトカインまたは一酸化窒素供与体により惹起されるベータ細胞死を防ぐ。c-Ablは一酸化窒素の産生を促進することによって作用しない。なぜなら、c-Ablの阻害がサイトカイン誘導一酸化窒素の産生を妨げないからである。
これらのデータを考慮すれば、c-Ablはストレスおよび外部細胞死シグナルのセンサーとして働き、そして、c-Ablの活性化は、JNKおよびp38 MAPキナーゼのリン酸化および活性化、NF-κBおよびPI3Kの不活性化、ミトコンドリアでのプロアポトーシス因子の放出、および最終的にはベータ細胞死を誘導する。化合物Ｉは異なる細胞死シグナルを止めることができ、それによりベータ細胞の生存および糖尿病に対する保護を成し得る。
結果: 化合物Ｉ、例えば塩Ｉがベータ細胞死を誘導するシグナルカスケードを妨げるか否か、またはc-Ablがベータ細胞死を導くシグナルカスケードに関与しているか否かを証明するため、単離ラット膵島を徐放性一酸化窒素供与体DETA/NO (0.5mM)、またはIL-1β(25U/ml)+IFN-γ(1000U/ml)+TNF-α(1000U/ml)の組み合わせに24時間暴露させる。どちらの場合も、膵島をインキュベーション期間を通して、10μMの化合物Ｉ、例えば塩Ｉの存在下または非存在下で培養する。インキュベーション期間の後、膵島をプロピジウムイオダイド＋ビスベンジミドで生体染色し、蛍光顕微鏡で撮影する。アポトーシス（白色の凝集、または断片化核）およびネクローシス（赤色またはピンク色の非断片化核）を数え、全細胞数のパーセントで表す。塩Ｉ、例えば、化合物Ｉそれ自体は膵島細胞の生存に影響を与えない。DETA/NOは膵島細胞の10％にネクローシスを誘導し、サイトカインの組み合わせは約40％にネクローシスを誘導する。興味深いことに、一酸化窒素供与体によって誘導される細胞死は、化合物Ｉ、例えば塩Ｉによって明らかに妨げられる（表１）。また、サイトカイン惹起膵島細胞のネクローシスは部分的にc-Abl阻害剤によって低減される。アポトーシス細胞の割合は、全てのグループで10％以下である（結果は示さない）。
Figure 0004776537
 表１. 化合物Ｉ、例えば塩Ｉ、は一酸化窒素およびサイトカイン惹起膵島細胞死に対して保護する。結果は別々の3観察からの平均値±標準誤差である。
1もしくは10μMの化合物Ｉ、例えば塩Ｉの存在下、または非存在下での、上記のサイトカインの組み合わせで24時間インキュベーションされた細胞からの亜硝酸塩のレベルを測定する。サイトカイン誘導一酸化窒素の産生は、化合物Ｉ、例えば塩Ｉによっては阻害されない（図１）。反対に、塩Ｉ存在下の一酸化窒素の産生は、おそらく塩Ｉ暴露細胞がより生存しているため、高く、サイトカイン単独に比較して、サイトカインに加えて化合物Ｉを暴露した細胞からの亜硝酸塩の放出は35％増加している。
化合物Ｉがインビトロで糖尿病惹起薬剤ストレプトゾトシンに対して保護効果を有するか否かを試験する。0.4mMストレプトゾトシンで、保護は強く、有意で、一方、0.75mMストレプトゾトシンで化合物Ｉは弱くしか保護しない（表２）。0.6mMストレプトゾトシンで、化合物Ｉの保護効果は中間である。
Figure 0004776537
 表２. 化合物Ｉ、例えば、塩Ｉはストレプトゾトシン惹起膵島細胞死に対して保護する。化合物Ｉ（10μM）をストレプトゾトシンの24時間前に添加する。膵島を回収し、ストレプトゾトシン添加6時間後に撮影する。ネクローシス（赤色またはピンク色の非断片化核）を数え、全細胞数のパーセントで表す。結果はネクローシス細胞のパーセントであり、別々の3観察からの平均値±標準誤差で表される。
***、**および*は、対応のあるスチューデントのt検定を用いて、p<0.001、0.01および0.05を示す。
化合物Ｉ、例えば塩Ｉがヒト膵島細胞でもまた細胞死を制御するか否かを検討するために、ヒト膵島を、化合物Ｉ、例えば、塩Ｉ（10μM）、DETA/NO（2mM）およびブレフェルディンA（10μM）存在下または非存在で下、24時間インキュベーションした。ラット膵島で観察されたように、ヒト膵島も部分的に一酸化窒素の毒性レベルに対して保護される（図２）。したがって、塩ＩはブレフェルディンＢ惹起膵島細胞死を部分的に妨げる（ＥＲストレス）。
インビボにおいて、ストレプトゾトシン惹起糖尿病をc-Ablが制御するか否か、および／または化合物Ｉ、例えば塩Ｉがそれに対して保護するか否かを検討するために、以下の手順を使用する：雄性NMRIマウス、体重約25gをTaconic M& B（Sollentuna、スウェーデン）より購入する。動物は試験の間を通して、水道水および食物ペレットを自由に摂取できる。床敷きは毎週交換する。実験前に、体重と血糖をPen Sensor（MediSense, Waltham, MA, 米国）を用いて測定する。動物に3連続日間（-1、0、1日目）、0.9%NaClに溶解させた200μlの化合物Ｉ、例えば塩Ｉを体重当たり200mg/kgで経口投与する。0日目にマウスにストレプトゾトシンを体重当たり120または160mg/kgを尾静脈より投与する。ストレプトゾトシンは投与直前に0.9％NaClに溶解する。体重と血糖は尾より採取された血液サンプルを用いて0、1、2、3、5、7、9日目に測定する。9日目に動物を頸椎脱臼により屠殺する。全て動物実験は現地の動物倫理委員会（Tierp、スウェーデン）により認可されている。
化合物Ｉの処置はストレプトゾトシン120mg/kgの注入に対して完全に保護する（表４）。さらに、化合物Ｉ、例えば塩Ｉは、より高濃度のストレプトゾトシン（160mg/kg）に対して部分的に保護する（表３）。
Figure 0004776537
 表３．ストレプトゾトシン160mg/kgにより惹起されるマウス糖尿病に対する化合物Ｉ、例えば塩Ｉの効果。-1、0および1日目に、化合物Ｉ、200mg/kgをNMRIマウスに1日1回強制経口投与する。0日目に、ストレプトゾトシン160mg/kgをマウス静脈内へ注入し、図に記載のある日に血糖を測定する。*、**および***はスチューデントのt検定を用い、STZに対してp<0.05、0.01および0.001を示す。観察数は5（生理食塩水および化合物Ｉ）および10（STZおよびSTZ +化合物Ｉ）である。
Figure 0004776537
 表４．ストレプトゾトシン120mg/kgにより惹起されるマウス糖尿病に対する化合物Ｉの効果。-1、0および1日目に、化合物Ｉ、200mg/kgをNMRIマウスに1日1回強制経口投与する。0日目に、ストレプトゾトシン120mg/kgをマウス静脈内へ注入し、図に記載のある日に血糖を測定する。*、**および***はそれぞれ、対応するSTZ群に対する比較でp<0.05、0.01および0.001を示す（スチューデントのt検定）。観察数は10である。
研究設計および方法:
1. 化合物Ｉが阻害する経路によりヒトベータ細胞死を促進する、さらなる細胞死シグナルおよびストレス因子の同定。ヒト膵島細胞を塩Ｉ、例えば化合物Ｉ 10μMで処理し、以下の細胞毒性薬剤に応答する膵島細胞死を測定する：過酸化水素（150μM；酸化ストレス）、スタウロスポリン（200nM、PKC阻害）、FCCP（5μM；脱共役およびミトコンドリア膜透過性転移）、ブレフェルディンA（10μM、ERストレス）、タプシガルギン（200nM、ERストレスおよびCa2+の増加）およびドキソルビシン（2μM、DNA損傷）。細胞死はプロピジウムイオダイドおよびビスベンジミドによって生体染色し、蛍光顕微鏡により可視化する。膵島は10個のグループをデュプリケートで用いる。この方法は、無処置の膵島でのアポトーシスおよびネクローシスの両方の定量化を可能にする。生体染色技術はXTT試験（簡便化したMTT試験）と組み合わせ、これにより我々は膵島の生存を簡単で速くスクリーニング試験できる。
2. 化合物ＩがI型糖尿病動物モデルで糖尿病の進行に影響を及ぼすか否かの検討。上述したように、化合物Ｉ、例えば塩Ｉはストレプトゾトシン単回投与に対して保護効果を示す。この観察結果を拡大するために、ストレプトゾトシンで複数回処置したc57KSJ/blackマウスモデルでの糖尿病の進行におけるc-Ablの役割について評価する。毎日の化合物Ｉ処置（0.9％NaCl 200μl中の化合物Ｉ 200mg/kg）を最初のストレプトゾトシン処置（低用量 40mg/kg注入、5日間毎日）の一日前より始め、糖尿病が顕在化する、10日間または2週間継続する。処置は毎日血糖値を測定することによって評価する。10日または2週間後、マウスを屠殺して、膵臓を摘出し、免疫組織学的および形態学的解析のために固定する。膵島の炎症およびベータ細胞塊を採点する。
非肥満性糖尿病マウス、略してNODマウスでの病気再発におけるc-Ablの重要性について検討する。上述したのと同様のプロトコルを用いる。しかしながら、この場合、化合物Ｉ処置を糖尿病の雌性NODマウスで行う。最初の化合物Ｉの強制経口投与の1日後、若年NODマウスから単離された膵島300を腎臓被膜の下に移植する。７日後、糖値を測定し、マウスを屠殺する。この時点で、ほとんどの移植ベータ細胞は活性化された免疫細胞で破壊されており、ベータ細胞の生存に対する化合物Ｉの推定される効果が検出可能である。移植片を回収し、解析のために固定する。
第三に、NODマウスの糖尿病の自然の進行における化合物Ｉの効果を検討する。全く、またはほとんど膵島炎の認められない雌性NODマウス4-5週齢に、濃縮された化合物Ｉまたは溶媒のみを4週間、1時間当たり0.25μl放出するAlzet浸透圧ポンプを皮下に埋め込む。4週間後、マウスを屠殺し、膵臓を摘出し、免疫組織学的または形態学的解析のために固定する。膵島炎の程度およびベータ細胞塊を採点する。
c-Ablの薬理学的阻害が問題となる可能性を考慮して、遺伝学的手法を試みる。この目的で、膵島をc57/KSJ blackおよびNODマウスから摘出し、トリプシン処置で膵島細胞を分散させる。膵島細胞に、c-Abl特異的なsiRNA分子を転写するように指定された5MOIの組換アデノウィルスベクターを形質導入する。コントロールとしてスクランブルsiRNA配列をコードするアデノウィルスベクターを用いる。そして、細胞をインビトロで5日間再凝集し、その後同型マウスの腎臓被膜下に移植する。マウスを上述のように処置し、解析する。
アデノウィルスベクターは、それら本来の毒性および免疫原性を考慮すれば、インビボ目的には適切でないかもしれない。同じ抗c-Abl siRNA構築物を発現するAAVベクターを構築する。インビトロで分散させた場合、約30％の膵島ベータ細胞がAAVにより形質導入される（結果は示さず）。これは、アデノウィルスで得られる形質導入効率よりも非常に低いが、インビボでベータ細胞の破壊におけるc-Ablの評価を可能にするためには十分高い。
方法と設備
ヒト膵島。ヒト膵島は標準的な培養条件（RPMI1640中5.6 mM グルコース+ 10% FCS）で自由浮遊培養する。
フローサイトメトリーおよび細胞ソーティング。効率は細胞分類能力を有するフローサイトメーター（FACSCalibur、Becton-Dickinson）で、不安定型の緑色蛍光タンパク質をレポーターとして用いて容易に評価され、同時にさらなる実験または移植のために遺伝子導入された細胞を分類する。したがって、トランス遺伝子を安定発現するインスリノーマ細胞の選択されたクローンの作成に、もはや頼る必要はない（クローンの多様性に関する問題）。非遺伝子導入細胞から分離された一過性に遺伝子が導入された細胞を使用する。さらに、フローサイトメーターはまた、細胞生存能（プロピジウムイオダイド染色）およびアポトーシス（抗活性型カスパーゼ3抗体）を評価する。さらに、フローサイトメーターはまた、齧歯類ベータ細胞、細胞周期解析、ミトコンドリア膜ポテンシャル、酸素フリーラジカルの生成、および免疫蛍光試験（インスリン、グルカゴン、Bcl-2）のために用いられる。
実施例２: 4-[(4-メチル-1-ピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-[[4-(3-ピリジニル)-2-ピリミジニル]アミノ]フェニル]ベンズアミド メタンスルホン酸、ベータ結晶型のカプセル
化合物Ｉ（遊離塩基）100mgに対応する塩Ｉ 119.5mgを活性成分として含むカプセルが以下の組成で調製される：
Figure 0004776537
 カプセルは組成物を混合し、混合物を硬質ゼラチンカプセル、サイズ1に詰めることにより調製される。
実施例３:インビボでのベータ細胞死および糖尿病に対する化合物Ｉ惹起保護についての機序検討
背景: 化合物Ｉは、普遍的に発現する、分子量約145KDaのタンパク質チロシンキナーゼc-Ablの阻害剤として知られる。生理的条件下では、c-Ablは、移動および細胞構造等の細胞骨格機能、および細胞周期の進行を制御することに関与していることが示されてきた。しかしながら、細胞が違った形式のストレスに曝されると、c-Ablは高度に活性化され、細胞周期を停止させ、アポトーシスへ誘導する。
最近得られた結果: c-AblはbTC-6細胞およびラット単離膵島に発現し、薬理学的試薬である化合物Ｉを用いてc-Abl活性を阻害すると、ストレプトゾトシン、炎症性サイトカイン、または、一酸化窒素供与体で惹起されるベータ細胞死を抑制する。化合物Ｉ、例えば塩Ｉは臨床でCML治療に用いられる選択的阻害剤である。化合物Ｉはc-Ablに加えて、ABL癌遺伝子、c-KIT、PDGFベータ受容体およびc-Ablの相同体ARGを阻害することが知られている。したがって、塩Ｉの効果が特にc-Ablの阻害を介していることが示される必要がある。したがって、bTC-6細胞を、スクランブルsiRNAまたはc-Abl特異的siRNAで処置する。siRNAをリポフェクトアミン試薬を用いて細胞内に導入する。その後、細胞を1または3日間追跡し、その後全RNAを単離する。cDNAがそのRNAより作成され、c-Ablに特異的なプライマーを用いた（35サイクル）、およびb-アクチンすなわちベータアクチン特異的なプライマーを用いた（20サイクル）PCR増幅のために用いられる。PCR産物をアガロースゲルによって分離し、エチジウムブロマイド染色で可視化する。siRNA処置24時間後では細胞に、c-Ablのバンドは認められない（データは示さず）。しかしながら、72時間後ではc-Ablのバンドが出現する。これらの結果から、c-Ablに対するsiRNAはRNAiのメカニズムでメッセンジャーをノックアウトすること、および、その効果は増殖の速いbTC-6細胞では一過性にすぎないことが示唆された（データは示さず）。RNAi技術を用いてc-AblのmRNAレベルを減少させることを確立したので、次に我々はc-Abl mRNAを欠損したbTC-6細胞がIL-1β、IFN-γおよびTNF-αの組み合わせに反応して細胞死が増加するか否かを検討した。初代培養膵島細胞で見られた状況に反し、bTC-6細胞はサイトカインに反応して主にアポトーシスによって死に至る。さらに、サイトカイン惹起bTC-6細胞の細胞死は処置後2および3日でc-Abl特異的siRNAにより強く抑制される（図３）。これは、おそらくc-Ablタンパク質の遅いターンオーバーによりsiRNA処置の効果が遅れることを示す。しかし、さらに重要なことには、そのデータから、塩Ｉで惹起される一酸化窒素供与体およびサイトカインの組み合わせに対する保護がc-Ablの阻害を介していることが示唆される。
c-Ablと種々のMAPキナーゼとの関係: c-Ablと、c-Ablの下流のエフェクターとして働いているかもしれない、種々のMAPキナーゼ、p38、JNKおよびERKとの関係を調べた。この目的のため、ラット膵島を24時間、化合物Ｉ 10μMと予めインキュベーションし、その後、20分間、DETA/NO（2ｍM）およびIL-1β、IFN-γおよびTNF-αの組み合わせに暴露する。その後、膵島をリン酸特異的抗体およびイムノブロッティングを用いて、p38、JNK2およびERK1/2のリン酸化について解析する。化合物Ｉ、例えば塩Ｉによる処置は、部分的（25-45％）DETA/NO惹起p38、JNKおよびERKの活性化を抑制し、そしてサイトカイン惹起MAPK活性化を増加させた（表５および６）。
Figure 0004776537
 表５. DETA/NO-およびサイトカイン-惹起p38、JNKおよびERKの活性化における化合物Ｉ、例えば塩Ｉの効果。単離ラット膵島を24時間、化合物Ｉ 10μMで予めインキュベートし、その後、20分間、DETA/NOまたはサイトカインIL-1β（50U/ml)およびIFN-γ（1000U/ml)に暴露する。ERK、JNKおよびp38のリン酸化をイムノブロッティングで測定し、ERK、JNKおよびp38の全量当たりで表す。結果はコントロールのパーセントで表し、別々の4観察の平均値である。**および*はそれぞれ、2-way ANOVAおよびスチューデントのt検定を用い、化合物Ｉで処置しない対応する群に比較し、p<0.01およびp<0.05を示す。
Figure 0004776537
 表６. 化合物Ｉの効果を、化合物Ｉを全く添加しない対応する群のパーセントで表すために、表５の結果を再計算する。
これらの結果は、サイトカイン惹起一酸化窒素産生がJNKおよびp38を少なくとも部分的にc-Abl経路を介して活性化すること、およびこれがベータ細胞死を導くことを支持している。一方、サイトカインに反応して起こるp38およびJNK活性の早期の上昇は、c-Ablにより抑制されるようである。しかしながら、この状況で、サイトカイン惹起p38およびJNK活性の最初のピークは、遺伝子発現の変化および増殖の増大を導く生理的反応を表し、アポトーシス自体を表さないようである。例えば、サイトカインによるp38およびJNKの活性化は続いて起こるiNOS遺伝子の発現に関与することが示唆されている。そのような状況で、今回認められたc-Ablが調節するp38およびJNKの抑制は、サイトカインと化合物Ｉで処置された膵島で観察された一酸化窒素の産生増加を上手く説明している。
これらのデータの観点から、c-Ablはストレスと外部細胞死シグナルのセンサーとして働き、そして、c-Abl活性化がJNKおよびp38MAPキナーゼをリン酸化ならびに活性化し、最終的にはベータ細胞を死に導くのであろう。
追加実験:
1. ベータ細胞でのc-Ablの発現検討。c-Abl mRNA発現をリアルタイムPCRにより評価することができる。膵島c-Abl mRNAのレベルを他の組織と比較する。c-Ablに特異的な蛍光プローブはTIB MOLBIOL Syntheselabor (ベルリン、ドイツ)より購入し、蛍光シグナルはLightcycler機器を用いて、c-Abl標準曲線に対して定量する。c-Abl mRNA分子の数を、b-アクチンmRNA分子により標準化する。ヒト膵島c-Abl mRNAの量は、肝臓、筋肉、腎臓、脾臓、脳および肺と比較される。並行して、c-Ablと同様の様式で作用し得る、c-Ablと類似するチロシンキナーゼであるARGの発現を定量化する。これに関して、c-AblのmRNAレベルがサイトカイン、酸化ストレスおよびERストレスにより影響されるか否か検討される。ヒト膵島を3時間、IL-1β（25U/ml）＋IFN-γ（1000U/ml）＋TNF-α（1000U/ml）、100mM過酸化水素またはブレフェルディンA（10□M)に曝し、その後、リアルタイムPCRによってc-Abl ｍRNAの発現を解析する。
2. ベータ細胞ストレスに反応してc-Ablがリン酸化されるか否かの検討。野生型c-Abl過剰発現するbTC-6安定株をpCDNA3/c-Ablプラスミド（Ludwig Institute、ウプサラ大学より入手）で細胞をリポフェクションすることにより作成し、その後、ジェネティシンに対する耐性により選別する。そして、c-Ablがサイトカイン、ERストレスおよび一酸化窒素に反応してリン酸化されるか否かを調べるために、20、60、360分間、c-Abl過剰発現bTC-6細胞をIL-1、ブレフェルディンAおよびDETA/NOに暴露する。その後、細胞をフォスファターゼ阻害剤の存在下でホモジナイズし、c-AblをK-12抗c-Abl抗体（Santa Cruz）を用いて免疫沈降する。PAGEおよびナイロンフィルターに転写した後、c-Ablバンドを、Cell Signaling Technologyから入手可能な2種のリン酸化特異的c-Abl抗体（Tyr245 and Thr735）およびリン酸化チロシン抗体4G10を用いて、アミノ酸245のチロシンのリン酸化および全チロシンのリン酸化について解析する。アミノ酸残基Tyr245およびThr735が過剰リン酸化されたとき、c-Abl活性は増加する。
3. c-Ablの細胞内局在がベータ細胞ストレスにより影響されるか否かの検討。c-Ablを過剰発現するbTC-6細胞をカバースリップ上で培養し、その後、サイトカイン、ブレフェルディンAおよび一酸化窒素供与体に6時間暴露する。固定、ブロッキングおよび透過化の後、細胞を、ミトコンドリアを緑色に染色するMitotracker green（Molecular Probes）、およびローダミン結合二次抗体と併用するとc-Ablを赤色に染色するK-12 c-Abl 抗体（Santa Cruz）を使用して、共焦点顕微鏡で解析する。c-AblがERからミトコンドリアに移動すれば、染色パターンは赤と緑色が分かれている状態から黄色のみに変化する。
4. c-Ablの下流標的の同定。この目的で、一過性に野生型、または構成的に活性化型のc-Ablを過剰発現するCbTC-6細胞を作成する。bTC-6をpcDNA3/c-Abl-ベクターおよびGFP-発現ベクターでリポフェクションする（リポフェクトアミン＋リポフェクトアミンプラス）。この結果、20％がGFP陽性細胞となり、これはFACSを用いて75％以上に濃縮する。分類された細胞を播種し、24時間培養し、そして候補ターゲットERK、JNK、p38、IκB、p53およびAKT（PI3Kの下流エフェクター）のリン酸化を解析する。解析の20および120分前に、細胞をドキソルビシン（c-Ablの核での活性化）またはDETA/NO（c-Ablの細胞質での活性化）で、塩Ｉ、例えば化合物Ｉ存在下、非存在下で刺激する。市販のリン酸化特異的抗体（Cell Signal Technology）を用いたイムノブロッティングにより、推定される標的タンパク質のリン酸化（ser/thr）が解析される。これにより、候補エフェクターがリン酸化されるか否か、およびc-Abl活性化に応じて活性化されるか否かを明らかにする。Bcl-2、Bcl-XLおよびAph2のレベルは伝統的なウェスタンブロットを用いて解析する。いくつかの場合では、イムノブロット解析の感度を上げるため、ときには、候補タンパク質の免疫沈降が必要である。チロシン特異的リン酸化のために、候補エフェクターを免疫沈降し、PY20抗リン酸化チロシン抗体を用いたイムノブロッティングにより解析する。
5. c-AblおよびShbの相互作用の検討：
実験を、c-Ablとそのアダプタータンパク質Shbとの推定される相互作用を理解することを目的に開始する。ShbはN末にプロリン−リッチモチーフ、中央部に、PTB（リン酸化チロシン結合）−ドメイン、いくつかのチロシンリン酸化が可能な部位、およびC末にSH2ドメインを有するSH2−ドメイン含有タンパク質であり、チロシンキナーゼ活性化に応じて、シグナリング複合体を形成する役割を果たすことが知られている。興味深いことには、Shb過剰発現ベータ細胞は、アポトーシスする傾向がより強くなる。実際に、SHBをラットインスリンプロモーターの制御下で発現しているトランスジェニックマウスは、膵島を無血清で培養したとき、または細胞障害性サイトカイン存在下で培養したとき、アポトーシスの割合が上昇していることが示される。Shbファミリーの一員であるShdが、c-Ablと結合および相互作用することを示す最近の論文を考慮すれば、c-Ablがベータ細胞内でShbとの相互作用を介して作用する可能性がある。これを調べるために、c-Abl、ShbまたはShb変異体を過剰発現させるために一過性に導入された細胞をペルバナデート（pervanadate）で処理し、そして抗Shb抗体を用いて免疫沈降させる。その後、c-AblとShbのレベルを解析するために、免疫沈降物でイムノブロッティングを行い、チロシンリン酸化c-ABlがShbと共に沈降する。予備的な結果では、c-AblはShbと共沈降し、および逆もあり、そして、c-Ablの過剰発現によりShbリン酸化が増加することが示されている（データは示さず）。これらの結果はShbがc-Ablキナーゼの基質であるという概念を支持する。
c-AblとShbの相互作用をさらに理解するために、融合タンパク質引き込み（fusion protein pull-down）実験を実施する。GST、GST-ShbSH2およびGST-ShbPTB/プロリンリッチドメイン融合タンパク質をc-Ablを高いレベルで含むCOS細胞ホモジネートと相互作用させる。反応をペルバナデート刺激存在下または非存在下で行い、すなわち、c-Ablチロシンリン酸化、およびリン酸化チロシンの付加の重要性を理解するために、すなわちリン酸化チロシン残基とSH2ドメインとの相互作用の重要性を理解するために、行う。引き込み産物をイムノブロットによって、c-Ablおよびリン酸化c-Ablで解析する。これらの実験は非リン酸化またはリン酸化c-Ablに結合するために必要なShbドメインがどれであるかを示している。どのドメインがShbへの結合に重要であるかを評価するために、c-Abl融合タンパク質（c-Abl-SH2およびc-Abl-SH3）を用いて、対応する実験を行う。
Shb-c-Abl相互作用が、Shb過剰発現膵島細胞が様々な毒性刺激に応じてアポトーシスする増強された傾向を介在するか否かを明らかにするために、膵島をShbトランスジェニックマウスより単離し、サイトカイン、DETA/NOおよびストレプトゾトシンを化合物Ｉの前処理あり、なしで暴露させた。アポトーシスおよびネクローシスを定量化し、そしてトランスジェニックマウスにより得られたデータを並行して得られたコントロールマウスのデータと比較する。Shb膵島におけるアポトーシスおよびネクローシスの増加が化合物Ｉ、例えば塩Ｉによって、正常化されれば、Shb-c-Abl相互作用は必要不可欠なアポトーシス制御経路であり得る。
設備: RNAi。RNAi技術を用いてベータ細胞における遺伝子発現を抑制する目的で、実験を始める。低分子干渉RNA（siRNA）をDharmacon ResearchよりRNAオリゴヌクレオチドのペアあたり300-600米国ドルの費用で購入する。FITC標識siRNAを用いて、リポフェクトアミンまたはリポフェクトアミン2000によって、siRNAを効率良くインスリン産生細胞に導入する（結果は示さず）。残念ながら、リポソームによって運ばれたsiRNAの効果は一過性に過ぎない。組換アデノ随伴ウィルスベクター（AAV)の作成のためにAAV Helper-Free System （Stratagene）を使用する。このキットには、予備的に遺伝子導入効率を検討するのに用いられるbeta-gal発現AAVベクター作成のためのプラスミドが含まれる。ウィルスベクターを用いる仕事はスウェーデン政府機関Arbetarskyddstyrelsenから承認されている。
リアルタイムPCR。Lightcycler機器(Roche)がリアルタイムPCRサイクラーである。この機器は、素早く、かつ正確なmRNA分子の定量が可能であり、したがって、遺伝子発現の検討に適している。
共焦点顕微鏡および電子顕微鏡技術は提供される。
bTC-6細胞および単離ラット膵島におけるサイトカイン惹起NO産生は10μMの化合物Ｉ、例えば塩Ｉにより影響されない。結果は独立した3観察の平均値±標準誤差である。 化合物Ｉ、例えば塩Ｉは部分的に一酸化窒素に対してヒト膵島細胞を保護する。結果は、別々の3ドナーからの平均値±標準誤差である。 スクランブルsiRNAまたはc-Abl-特異的siRNAで処理されたbTC-6細胞におけるアポトーシスの割合。サイトカイン処置(IL-1β＋IFN-γ＋TNF-α)は細胞を解析する24時間前に開始する。アポトーシスはフローサイトメトリーにより定量される。結果は3-4観察の平均値±標準誤差である。

Claims (7)

  1. 4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミドまたはその薬学的に許容される塩を有効成分とする、糖尿病の治療または予防に使用するための医薬。
  2. 糖尿病の治療に使用する、請求項１に記載の医薬。
  3. 糖尿病の予防に使用する、請求項１に記載の医薬。
  4. 糖尿病がI型糖尿病である請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬。
  5. 糖尿病がII型糖尿病である請求項１から３のいずれか１項に記載の医薬。
  6. 4-(4-メチルピペラジン-1−イルメチル)-N-[4-メチル-3-(4-ピリジン-3−イル)ピリミジン-2−イルアミノ)フェニル]-ベンズアミドがモノメタンスルホン酸塩の形態である、請求項１から５のいずれか１項に記載の医薬。
  7. 請求項１から６のいずれか１項に記載の医薬を、糖尿病の患者に投与するための使用説明書と共に含む、糖尿病の治療または予防に使用するための薬剤パッケージ。
JP2006529925A 2003-05-27 2004-05-26 糖尿病処置のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用 Expired - Fee Related JP4776537B2 (ja)

Applications Claiming Priority (5)

Application Number Priority Date Filing Date Title
GB0312086.2 2003-05-27
GB0312086A GB0312086D0 (en) 2003-05-27 2003-05-27 Organic compounds
GB0402682.9 2004-02-06
GB0402682A GB0402682D0 (en) 2004-02-06 2004-02-06 Organic compounds
PCT/EP2004/005679 WO2004105763A2 (en) 2003-05-27 2004-05-26 Use of tyrosine kinase inhibitor to treat diabetes

Publications (3)

Publication Number Publication Date
JP2006528225A JP2006528225A (ja) 2006-12-14
JP2006528225A5 JP2006528225A5 (ja) 2007-06-21
JP4776537B2 true JP4776537B2 (ja) 2011-09-21

Family

ID=33492240

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
JP2006529925A Expired - Fee Related JP4776537B2 (ja) 2003-05-27 2004-05-26 糖尿病処置のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用

Country Status (21)

Country Link
US (1) US7875616B2 (ja)
EP (1) EP1631291B1 (ja)
JP (1) JP4776537B2 (ja)
KR (1) KR101102229B1 (ja)
AT (1) ATE439133T1 (ja)
BR (1) BRPI0410704A (ja)
CA (1) CA2526594C (ja)
DE (1) DE602004022540D1 (ja)
DK (1) DK1631291T3 (ja)
ES (1) ES2331800T3 (ja)
HK (1) HK1087638A1 (ja)
IL (1) IL171927A (ja)
IS (1) IS2712B (ja)
MA (1) MA27812A1 (ja)
MX (1) MXPA05012739A (ja)
NO (1) NO331715B1 (ja)
NZ (1) NZ543709A (ja)
PL (1) PL1631291T3 (ja)
PT (1) PT1631291E (ja)
RU (1) RU2365373C2 (ja)
WO (1) WO2004105763A2 (ja)

Families Citing this family (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP1653934B1 (en) * 2003-08-15 2008-05-14 AB Science Use of c-kit inhibitors for treating type ii diabetes
US20060094682A1 (en) * 2004-10-29 2006-05-04 Odyssey Thera, Inc. Kinase inhibitors for the treatment of diabetes and obesity
WO2008001885A1 (fr) * 2006-06-30 2008-01-03 Kyowa Hakko Kirin Co., Ltd. INHIBITEUR DE KINASE Abl
AU2012308993A1 (en) * 2011-09-15 2014-03-27 Novartis Ag Use of 4-amino-5-fluoro-3-[6-(4-methylpiperazin-1-yl)-1H-benzimidazol-2-yl]-1H-quinolin-2-one in the treatment of cancer in moderate hepatic impaired patients

Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0687834A (ja) * 1992-04-03 1994-03-29 Ciba Geigy Ag ピリミジン誘導体及びその製法
JP2001510192A (ja) * 1997-07-18 2001-07-31 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｎ−フェニル−２−ピリミジンアミン誘導体の結晶変形、その製造法およびその使用
WO2001064200A2 (en) * 2000-03-03 2001-09-07 Novartis Ag Use of pdgf receptor tyrosine kinase inhibitors for the treatment of diabetic nephropathy

Family Cites Families (12)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
DE59605711D1 (de) * 1995-10-11 2000-09-14 Arteva Tech Sarl Schwerentflammbare Sicherheitsgurte enthaltend phosphor-modifizierte Polyesterfasern
GB9716557D0 (en) 1997-08-06 1997-10-08 Glaxo Group Ltd Benzylidene-1,3-dihydro-indol-2-one derivatives having anti-cancer activity
PT1033364E (pt) * 1999-03-01 2005-07-29 Pfizer Prod Inc Ciano com acidos oxamicos e derivados como ligandos de receptores de tiroide
PL366088A1 (en) * 2000-02-15 2005-01-24 Teva Pharmaceutical Industries Ltd. A method for synthesizing leflunomide
MY128450A (en) * 2000-05-24 2007-02-28 Upjohn Co 1-(pyrrolidin-1-ylmethyl)-3-(pyrrol-2-ylmethylidene)-2-indolinone derivatives
US6677368B2 (en) 2000-12-20 2004-01-13 Sugen, Inc. 4-aryl substituted indolinones
WO2003020698A2 (en) 2001-09-06 2003-03-13 Prochon Biotech Ltd. Protein tyrosine kinase inhibitors
AUPS243002A0 (en) 2002-05-20 2002-06-13 Baker Medical Research Institute Therapeutic target and uses thereof
DE10235227A1 (de) * 2002-08-01 2004-02-19 Johann Berger Verfahren zur Herstellung eines gewebten Gurtbandes
US7195876B2 (en) * 2002-08-09 2007-03-27 Theravance, Inc. Oncokinase fusion polypeptides associated with hyperproliferative and related disorders, nucleic acids encoding the same and methods for detecting and identifying the same
AU2003295604A1 (en) * 2002-11-13 2004-06-03 Genpath Pharmaceuticals, Incorporated Gpc15: methods and compositions for treating cancer
DE10255360A1 (de) * 2002-11-27 2004-06-17 Johann Berger Verfahren zur Herstellung eines gewebten Gurtbandes

Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JPH0687834A (ja) * 1992-04-03 1994-03-29 Ciba Geigy Ag ピリミジン誘導体及びその製法
JP2001510192A (ja) * 1997-07-18 2001-07-31 ノバルティス アクチエンゲゼルシャフト Ｎ−フェニル−２−ピリミジンアミン誘導体の結晶変形、その製造法およびその使用
WO2001064200A2 (en) * 2000-03-03 2001-09-07 Novartis Ag Use of pdgf receptor tyrosine kinase inhibitors for the treatment of diabetic nephropathy

Also Published As

Publication number Publication date
IS2712B (is) 2011-01-15
IS8139A (is) 2005-11-22
CA2526594C (en) 2011-11-08
MA27812A1 (fr) 2006-03-01
US7875616B2 (en) 2011-01-25
PT1631291E (pt) 2009-10-28
RU2365373C2 (ru) 2009-08-27
NO331715B1 (no) 2012-03-05
EP1631291A2 (en) 2006-03-08
NO20056188L (no) 2005-12-23
PL1631291T3 (pl) 2010-04-30
HK1087638A1 (en) 2006-10-20
KR20060021865A (ko) 2006-03-08
ES2331800T3 (es) 2010-01-15
JP2006528225A (ja) 2006-12-14
DE602004022540D1 (de) 2009-09-24
EP1631291B1 (en) 2009-08-12
KR101102229B1 (ko) 2012-01-05
BRPI0410704A (pt) 2006-06-13
RU2005140516A (ru) 2007-07-10
IL171927A (en) 2011-10-31
AU2004243491A1 (en) 2004-12-09
CA2526594A1 (en) 2004-12-09
WO2004105763A2 (en) 2004-12-09
WO2004105763A3 (en) 2005-06-02
US20070072932A1 (en) 2007-03-29
MXPA05012739A (es) 2006-05-17
NZ543709A (en) 2009-04-30
IL171927A0 (en) 2006-04-10
ATE439133T1 (de) 2009-08-15
DK1631291T3 (da) 2009-11-02

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Wu et al. Activity of the type II JAK2 inhibitor CHZ868 in B cell acute lymphoblastic leukemia
US8614192B2 (en) Method for treating ocular cancer
JP2013241438A (ja) Ｋｉｔの変異体の阻害剤
Su et al. Oxidative stress induces neuronal apoptosis through suppressing transcription factor EB phosphorylation at Ser467
Wang et al. Trifluoperazine induces apoptosis through the upregulation of Bax/Bcl‑2 and downregulated phosphorylation of AKT in mesangial cells and improves renal function in lupus nephritis mice
Wang et al. YC-1 [3-(5′-Hydroxymethyl-2′-furyl)-1-benzyl Indazole] exhibits a novel antiproliferative effect and arrests the cell cycle in G0-G1 in human hepatocellular carcinoma cells
CN115429805A (zh) 一种抗flt3-itd耐药突变型急性髓系白血病药物
Solar et al. Erythropoietin treatment of human ovarian cancer cells results in enhanced signaling and a paclitaxel‐resistant phenotype
JP4776537B2 (ja) 糖尿病処置のためのチロシンキナーゼ阻害剤の使用
US20110263609A1 (en) Methods of Identifying and Treating Individuals Exhibiting NUP214-ABL1 Positive T-Cell Malignancies with Protein Tyrosine Kinase Inhibitors and Combinations Thereof
US7799788B2 (en) Method of treating chronic myelogenous leukemia cells
AU2004243491B2 (en) Use of tyrosine kinase inhibitor to treat diabetes
WO2021202320A9 (en) Methods for treating inflammatory and fibrotic diseases and disorders
CN100372537C (zh) 酪氨酸激酶抑制剂在治疗糖尿病中的用途
CN108619488B (zh) 一种治疗肿瘤的联合用药方法
Han et al. The combination of tetracyclines effectively ameliorates liver fibrosis via inhibition of EphB1/2
JP7477152B2 (ja) Ｈｔｌｖ－１関連疾患の発症予防、進展抑制または治療のための剤
CN114207437B (zh) 筛选抗癌剂的方法和用于治疗胰腺癌的激酶抑制剂的组合药物
JP2003514017A (ja) 膵臓癌の治療のためのｎｓａｉｄの使用
CN111434353A (zh) Ras抑制剂筛选及疗效标志物
US20050220779A1 (en) Integrin linked kinase modulation of macrophage activation
Brown Caspase-3 promotes cell proliferation and inhibits dna-damage induced necrosis in colorectal cancer
Ouyang The Involvement of Receptor Interacting Protein Kinase 1 (RIPK1) in the Pathogenesis of Acute Pancreatitis

Legal Events

Date Code Title Description
A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20060125

A529 Written submission of copy of amendment under article 34 pct

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A529

Effective date: 20060125

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20070426

A621 Written request for application examination

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621

Effective date: 20070426

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20100601

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20100901

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20100908

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20101001

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20101008

A601 Written request for extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601

Effective date: 20101029

A602 Written permission of extension of time

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602

Effective date: 20101108

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20101201

A131 Notification of reasons for refusal

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131

Effective date: 20110419

A521 Request for written amendment filed

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523

Effective date: 20110427

TRDD Decision of grant or rejection written
A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

Effective date: 20110531

A01 Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01

A61 First payment of annual fees (during grant procedure)

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61

Effective date: 20110628

R150 Certificate of patent or registration of utility model

Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150

FPAY Renewal fee payment (event date is renewal date of database)

Free format text: PAYMENT UNTIL: 20140708

Year of fee payment: 3

LAPS Cancellation because of no payment of annual fees