NO331715B1

NO331715B1 - Anvendelse av 4-(4-metylpiperazin-1-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasoytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for terapi eller prevensjon av diabetes

Info

Publication number: NO331715B1
Application number: NO20056188A
Authority: NO
Inventors: Robert Per Hagerkvist; Nils Richard Welsh
Original assignee: Robert Per Hagerkvist; Nils Richard Welsh
Priority date: 2003-05-27
Filing date: 2005-12-23
Publication date: 2012-03-05
Also published as: CA2526594C; ES2331800T3; MA27812A1; IL171927A; US7875616B2; HK1087638A1; US20070072932A1; PT1631291E; RU2365373C2; KR101102229B1; KR20060021865A; DE602004022540D1; NZ543709A; PL1631291T3; WO2004105763A2; AU2004243491A1; NO20056188L; RU2005140516A; JP2006528225A; EP1631291B1

Abstract

Det beskrives anvendelse av c-Abl-, PDGF-R- eller c-kit tyrosinkinaseinhibitorer, for eksempel 4-(4- metylpiperazin-1-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for behandling av diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes.

Description

Foreliggende oppfinnelse angår anvendelse av 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid, heretter omtalt som "Forbindelse I", eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for terapi eller prevensjon av diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes. Videre vedrører oppfinnelsen en medikamentpakke som omfatter forbindelse I, eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for administrering til pasienter med diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes.

Figurforklaring:

Figur 1: Cytokinindusert NO produksjon påvirkes ikke av 10 uM Forbindelse I, for eksempel salt I, i bTC-6 celler og isolerte rotteøyer. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for tre uavhengige observasjoner. Figur 2: Figur 1, for eksempel salt I, beskytter partielt humane øyceller mot nitrogenoksid. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra tre separate donorer. Figur 3: Apoptosehastigheten i bTC-6 celler behandlet med scramblet siRNA eller c-Abl-spesiifkke siRNA. Cytokinbehandling (IL-1 p + IFN-y + TNF-a) initieres 24 timer før analysen av cellene. Apoptose kvantifiseres ved strømningscytometri. Resultatene er gjennomsnitt ± SEM for 3 - 4 observasjoner.

Mer enn en million amerikanere har type 1 diabetes, også kalt insulinavhengig diabetes mellitus, forkortet IDDM, eller juvenil diabetes. I type 1 diabetes produserer en persons pankreas lite eller ikke insulin, et hormon som er nødvendig for å opprettholde liv. Selv om årsakene ikke er helt kjent, er type 1 diabetes en multifaktoriell autoimmun sykdom som skyldes den spesifikke og progressive destruering av insulinproduserende beta-celler i pankreas. Den er en av de mest omkostningsbelagte, kroniske sykdommer i barndommen, en sykdom man ikke vokser ut av. Mens insulin tillater at en person kan holde seg i live, kan insulin ikke helbrede diabetes og forhindrer heller ikke de endelige og ødeleggende effekter: nyresvikt, blindhet, nerveskade, amputeringer, hjerteanfall og slag. For å holde seg i live må de med type 1 diabetes ta flere insulininjeksjoner daglig eller kontinuerlig infusere insulin gjennom en pumpe, og teste blodsukkeret ved å stikke fingrene for blodprøver 6 eller flere ganger daglig. I et forsøk på å balansere insulininjeksjonen med mengden av næringsinntak, må personer med type 1 diabetes konstant være forberedt på potensielle hypoglykemiske, dvs. lavt blodsukker, og hyperglykemiske, dvs. høyt blodsukker, reaksjoner, som kan være livstruende. På tross av omhyggelig forsiktighet for å opprettholde en sunn diett, utøve fastlagte regimer og alltid injisere riktige mengder insulin, kan mange andre faktorer ugunstig påvirke en persons blodsukkerkontroll inkludert: stress, hormonelle forandringer, vekstperiode, fysisk aktivitet, medisinering, sykdommer/infeksjoner og tretthet. Selv med insulin resulterer type 1 diabetes vanligvis i en drastisk reduksjon av livskvalitet og forkorter den gjennomsnittlige levetid med 15 år. Hvert år diagnostiseres rundt 30.000 amerikanere med type 1 diabetes, over 13.000 av disse er barn. Det er 35 barn hver eneste dag.

Type 2 diabetes, også kalt ikke-insulinavhengig diabetes mellitus, forkortet til NIDDM, eller voksen diabetes, er vanligvis assosiert med fedme, insulinresistens og en relativ mangel på insulin. Selv om denne form for diabetes i de fleste tilfeller ikke krever insulin, er det en slående likhet mellom denne og type 1 diabetes. For eksempel er man i dag enige om at det er en absolutt mangel på insulinproduserende beta-celler, også i type 2 diabetes, og at denne beta-celle defektivitet sannsynligvis skyldes en øket hastighet av beta-celledød. Således kan farmakologisk behandling som fører til beskyttelse mot beta-celledød være brukbar ved behandling av både type 1- og type 2 diabetes.

Overraskende er det funnet at Forbindelse I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for eksempel SALT 1, er spesielt brukbar for behandling av diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes. Uventet ble det funnet at Forbindelse I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for eksempel SALT I, kan benyttes for å helbrede eller forhindre diabetes, for eksempel type I eller type II diabetes.

Forbindelse I er 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)primidin-2-ylamino)fenyl]benzamid med den følgende formel:

Forbindelse I fri base, akseptable salter derav og forbindelsens fremstilling er beskrevet i EP 0564409. Forbindelse I fri base tilsvarer den aktive del.

Monometansulfonsyre addisjonssaltet av Forbindelse I, heretter angitt som "Salt I", og en foretrukket krystallform derav, for eksempel beta-krystallform, er beskrevet i WO99/03854, publisert 28. januar 1999.

Ifølge oppfinnelsen inkluderer uttrykket "behandling" både profylaktisk eller preventiv behandling så vel som kurativ eller sykdomsundertrykkende behandling inkludert behandling av pasienter som risikerer å få diabetes, så vel som syke pasienter. Uttrykket inkluderer videre behandling for å forsinke sykdommens progresjon.

Med "undertrykke og/eller reversere diabetes" menes her at diabetes-tilstanden ikke lenger er tilstede i pasienten eller at sykdommen er mindre alvorlig enn den var før eller uten behandling.

Uttrykket "helbrede" som benyttet her, betyr at behandlingen fører til remisjon av diabetes eller av pågående diabetesepisoder.

Uttrykket profylaktisk" eller "forhindre" betyr prevensjon av starten eller gjenopptreden av diabetes.

Uttrykket "forsinke progresjon" som benyttet her, betyr at administreringen av den aktive forbindelse til pasienter som er i et pre-trinn eller i en tidlig fase av diabetes forhindrer at sykdommen utvikler seg videre eller reduserer utviklingen av sykdommen sammenlignet med utviklingen av sykdommen uten administrering av den aktive forbindelse.

De farmasøytiske preparater ifølge oppfinnelsen kan fremstilles på i og for seg kjent måte og er de som er egnet for enteral som oral eller rektal, eller parenteral administrering til varmblodige dyr inkludert mennesker, omfattende en terapeutisk effektiv mengde av minst en farmakologisk aktiv bestanddel, alene eller i kombinasjon med en eller flere farmasøytisk akseptable bærere, spesielt beregnet for enteral eller parenteral applikasjon. Den foretrukne administreringsvei for doseringsformene ifølge oppfinnelsen er oral.

Fagmannen på det angjeldende området er fullt ut i stand til å velge relevante testmodeller for å vise de fordelaktige effekter som er nevnt her på diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes. Den farmakologiske aktivitet for en slik forbindelse kan for eksempel påvises ved hjelp av eksemplene som er beskrevet nedenfor, ved in vitro tester og in vivo tester eller i egnede, kliniske studier. Egnede kliniske studier er for eksempel åpen merket, ikke-randomisert, doseeskaleringsstudier i pasienter som har diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes. Effektiviteten av behandlingen bestemmes i disse studier for eksempel ved å evaluere sykdommen hver 4. uke, der kontrollen oppnås ved placebo.

Den effektive dosen av Forbindelse I kan variere avhengig av den spesielle forbindelse eller de farmasøytiske preparater som benyttes, administreringsvei, type diabetes, for eksempel type I- eller type II, som behandles, videre sykdommens alvor. Doseregimet velges i henhold til en varietet av ytterligere faktorer inkludert renal- og hepatisk funksjon hos pasienten. En lege, veterinær eller annet personale med vanlig kunnskap på området, kan lett bestemme og foreskrive den effektive mengde av forbindelser som kreves for å forhindre, motvirke eller stanse progresjonen av tilstanden.

Avhengig av alder, individuell tilstand, administreringsmodus og det kliniske bildet, administreres effektive doser, for eksempel daglige doser av Forbindelse I eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav tilsvarende 100 til 1000 mg av den frie base som aktiv del, særlig 800 mg, til varmblodige dyr med rundt 70 kg kroppsvekt. Fortrinnsvis er det varmblodige dyr et menneske. For pasienter med en utilstrekkelig respons på de daglige doser, kan doseescalering på sikker måte tas i betraktning og pasienter kan behandles så lenge de trekke fordel av behandlingen og i fravær av begrensende toksisiteter.

En utførelsesform ifølge oppfinnelsen vedrører anvendelse av 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for terapi eller prevensjon av diabetes, hvor medikamentet administreres en gang daglig i en periode som overstiger 3 måneder. Oppfinnelsen angår også slike anvendelser der en daglig dose på 400 til 800 mg og fortrinnsvis 800 mg av Forbindelse I administreres til en voksen person.

En utførelsesform ifølge oppfinnelsen vedrører medikamentpakke som omfatter 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for administrering til pasienter med diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes, hvor medikamentet administreres en gang daglig i en periode som overstiger 3 måneder. Oppfinnelsen angår også slike anvendelser der en daglig dose på 400 til 800 mg og fortrinnsvis 800 mg av Forbindelse I administreres til en voksen person.

Eksempel 1; Beskyttende Forbindelse I, for eksempel Salt I, mot beta- ceUedød og

diabetes?

Insulinavhengig (Type I) diabetes mellitus (IDDM) er en multifaktoriell autoimmunsykdom som skyldes den spesifikke og progressive destruering av insulinproduserende p-celler. Dysfunksjon og skade på p-celler er antatt å skyldes en direkte kontakt med øyinfiltrerende celler (makrofager, CD4<+->eller CD8<+>(NK)T-celler) og/eller eksponering til cytotoksiske mediatorer som produseres av disse celler, som proinflammatoriske cytokiner (IL-1, TNF-a, IFN-y), fri radikaler, Fas ligand, TRAIL og perforin. Autoimmunitet rettet mot beta-celler kan initieres av miljøfaktorer som beta-celletoksiner, næringskomponenter, stress, metabolsk overbelastning, virus, osv.. Det er sannsynlig at beta-cellen ved konvertering av eksterne dødssignal til indre apoptotiske evenementer, aktivt deltar i sin egen destruksjon ved type I diabetes. Proinflammatoriske cytokiner og særlig kombinasjonen av IL-1 og IFN-y, induserer beta-celleapoptose og nekrose. Således er det å anta at disse cytokiner ikke bare modulerer aktiviteten av øy-infiltrerende immunceller, men også utøver en direkte noksiøs effekt på beta-cellen i patogenesen av type I diabetes. Det synes som om stimulering av beta-celler med IL-1 fører til multiple signalevenementer som inkluderer aktivering av proteinkinaser (PKC, p38, JNK, ERK, MSK1), lipaser (PLC, PLD, sphingomyelinase)cyklooksygenase og tanskripsjonsfaktorer (NF-kB, ATF-2, c-jun, Elk-1, CREB, cEBP-p, IRF-1, STAT-1). Disse evenementer følges av induksjon av induserbar nitrogenoksidsyntase (iNOS) og stressrelaterte proteiner som hsp70, heme oksygenase, Mn-SOD, ICE og andre. Uheldigvis er det ikke klart hvilke endringer i genekspresjonen som er vesentlige for beta-celledød ved type I diabetes. Predominant apoptose inntrer i en beta-cellelinje som respons på UV-lys og inhibering av DNA reparasjon. Dette foregås av p53 tumorsuppressor proteininduksjon, generering av reaktive oksygenspecier, PARP-inhibering, S- og G2cellesyklusstans og reduksjon av det mitokondriale membranpotensialet. Cytokiner som fremmer hovedsakelig nekrose og kun i mindre grad apoptose, aktiverte i det vesentlige de samme signaltrinn som inhibering av DNA-reparasjon i UV-lys. Fra disse in vitro forsøk er det klart at beta-cellemodusen for død kan variere avhengig av dødssignalet, men også at tilsvarende signalvei kan benyttes for å oppnå forskjellige former for beta-celledød. C-Abl er en ubikvitøst uttrykt proteintyrosinkinase med en molekylvekt rundt 145 kDa. Under fysiologiske betingelser er c-Abl påvist å delta i kontrollen av cytoskjelettale funksjoner, som migrering og cellestruktur, og cellesyklusprogresjon. Når imidlertid cellene eksponeres til forskjellige former for stress, blir c-Abl sterkt aktivert, noe som fører til cellesyklusstans og apoptose.

Som en oppsummering har utstrakte studier i ikke-beta-celler vist at c-Abl fremmer apoptose som respons på forskjellige typer stress. Den putative rolle for c-Abl i insulinproduserende celler, er ikke belyst. Således er det uklart hvorvidt dette protein spiller noen rolle i beta-celledød og avgjørelsen mellom apoptose og nekrose.

Signifikans for type I diabetes.

Selv om patogenesen av type I diabetes synes å være meget kompleks, er det mulig at den intracellulære vei som fører til beta-celledød konvergerer ved et visst spesielt punkt. Hyppotetisk kunne de, ved bruk av kun en vei, gi muligheten for å blokkere et antall dødssignaler og derved oppnå beta-celle overlevelse.

Tyrosinkinase c-Abl kan være en signifikant mediator av beta-celledød. C-Abl uttrykkes i bTC-6 celler og i isolerte rotte-øyer og inhibering av c-Abl aktiviteten, enten ved bruk av det farmakologiske middel FORBINDELSE I eller ved å slå ut c-Abl ekspresjonen med RN Ai teknikken, resulterte i beskyttelse mot beta-celledød indusert av proinflammatoriske cytokiner eller ved nitrogenoksid-donorer. C-Abl virker ikke ved å fremme nitrogenoksid-produksjonen fordi inhibering av c-Abl ikke motvirker cytokin-indusert nitrogenoksidproduksjon.

I lys av disse data virker c-Abl som en sensor på stress og eksterne dødssignaler og at c-Abl aktivering kan føre til fosforylering og aktivering av JNK- og p38 MAP kinaser, inaktivering av NF-kB og PI3K, mitokondria! frigivning av pro-apoptotiske faktorer og til slutt beta-celledød. Forbindelse I er i stand til å blokkere forskjellige dødssignaler og derved oppnå beta-celle overlevelse og beskyttelse mot diabetes.

Resultater;

For å påvise hvorvidt Forbindelse I, for eksempel Salt I, interfererer med eller hvorvidt c-Abl deltar i signalkaskaden som fører til beta-celledød, eksponeres isolerte rotte-øyer til den langsomt frigivende nitrogenoksiddonor DET A/NO (0,5 mM) eller til kombinasjonen av IL-lp (25 U/ml) + IFN-y (1000 U/ml) + TNF-oc (1000 U/ml) i 24 timer. I begge tilfeller dyrkes øyer med eller uten 10 uM Forbindelse I, for eksempel Salt I, gjennom inkuberingsperioden. Etter inkuberingsperioden vitalfarges øyer med propidiumjodid + bisbenzimid og fotograferes i et fluorescensmikroskop. Apoptotiske (hvite, kondenserte eller fragmenterte) kjerner og nekrotiske (røde eller rosa ikke-fragmenterte) kjerner telles og uttrykkes som prosentandel av det totale celletall. Salt I, for eksempel Forbindelse I, påvirker per se øyceller levedyktigheten. DETA/NO induserer nekrose i 10% av øycellene og kombinasjonen av cytokiner rundt 40% nekrose. Interessant er at celledød som induseres av NO-donoren klart motvirkes av Forbindelse I, for eksempel Salt I, (Tabell I). Også cytokin-indusert øycelle-nekrose reduseres delvis av c-Abl initiatoren. Frekvensene for apoptotiske celler ligger under 10% i alle grupper (resultater ikke vist).

Tabell 1: Forbindelse I, f.eks. Salt I, beskytter mot NO- og cytokin-induserte

øycelledød

Resultatene er gjennomsnitt ± SEM fra tre separate observasjoner.

Nivåer av nitritt fra celler som er inkubert med kombinasjonen av cytokiner gitt ovenfor i 24 timer, med eller uten 1 eller 10 uM av Forbindelse I, for eksempel Salt I,

bestemmes. Cytokin-indusert nitrogenoksidproduksjon inhiberes ikke av Forbindelse I, for eksempel Salt I (Figur 1). Tvert imot er nitrogenoksidproduksjonen i nærvær av Salt I høyere, muligens på grunn av den høyere levedyktighet for de Salt I-eksponerte celler.

35% mer nitritt frigis fra cytokin pluss Forbindelse I eksponerte celler sammenlignet med cytokin alene.

Det testes om hvorvidt Forbindelse I beskytter mot det diabetogeniske medikamentet streptozotocin in vitro. Ved 0,4 mM streptozotocin er beskyttelsen høyst signifikant mens ved 0,75 mM streptozotocin, beskytter Forbindelse I kun svakt (Tabell 2). Ved 0,6 mM streptozotocin er den beskyttende effekt av forbindelse I middels.

Tabell 2: Forbindelse I, f.eks. Salt I, beskytter mot streptozotocin-indusert

øycelledød

Forbindelse 1(10 uM) tilsettes 24 timer før streptozotocin. Øyer høstes og fotograferes 6 timer etter tilsetning av setozotocin. Nekrotiske (røde eller rosa ikke-fragmenterte) kjerner telles og uttrykkes som prosentandel av totalt celletall. Resultatene er prosentandel nekrotiske celler uttrykt som gjennomsnitt ± SEM fra tre separate observasjoner.<***>,<**>og<*>angir p<0,001, 0,01 og 0,05 ved bruk av Students parede t-test.

For å undersøke hvorvidt Forbindelse I, for eksempel Salt I, regulerer celledød også i human øyceller, inkuberes humanøyer i 24 timer med eller uten Forbindelse I, for eksempel Salt I, (10 uM), DETA/NO (2 mM) og Brefeldin A (10 uM). Som observert for rotteøyene ble også humanøyer partielt beskyttet mot toksiske nivåer av NO (Figur 2). Således motvirker Salt I partielt Brefeldin B-indusert øycelledød (ER stress).

For å undersøke hvorvidt cAbl regulerer og/eller hvorvidt forbindelse I, for eksempel Salt I, også beskytter mot streptozotocin-indusert diabetes in vivo, ble den følgende prosedyre benyttet: NMRI hannmus med en vekt rundt 25 g erverves fra Taconic M&B, Sollentuna, Sverige. Dyrene har fri tilgang til ledningsvann og pelletisert føde under hele studien. Leiematerialet endres hver uke. Vekt og blodglukosenivået bestemmes ved bruk av en Pen Sensor (MediSense, Waltham, MA, USA) før forsøket. Dyrene tvangsfores med 200 mikroliter Forbindelse I, for eksempel Salt I, oppløst i 0,9% NaCl 200 mg/kg kroppsvekt tre etter hverandre følgende dager (dag - 1, 0,1). På dag 0 injiseres musene med 120 eller 160 mg/kg kroppsvekt streptozotozin (Sigma-Aldric Co., St. Louis, MO, USA.) i halevenen. Streptozotocin oppløses i 0,9% NaCl akkurat før injeksjon. Vekt og blodglukose bestemmes på følgende dager 0,1,2, 3, 5, 7, 9 i blodprøver samlet fra halen. På dag 9 avlives dyrene ved cervical dislokasjon. Alle dyreforsøkene ble godkjent av den lokale dyreetikk-komité (Tierp, Sverige).

Forbindelse I behandlingen beskytter fullstendig mot 120 mg/kg streptozotocin-injeksjon (Tabell 4). I tillegg beskytter forbindelse I, for eksempel Salt I, partielt mot den høyere streptozotocin-dose (160 mg/kg) (Tabell 3).

Tabell 3. Effekt av Forbindelse I, for eksempel Salt I, på diabetes i mus indusert av 160 mg/kg streptozotocin NMPJ mus gis 200 mg/kg Forbindelse I ved tvangsforing 1 gang daglig på dag -1, 0 og 1. På dag 0 injiseres musene med 160 mg/kg streptozotocin intravenøst og blodglukosenivået bestemmes på dagene som gitt i figuren.

<*>,<**>og angir p<0,05, 0,01 og 0,001 vs STZ ved bruk av Studenfs t-test. Antallet observasjoner er 5 (Saltoppløsning og Forbindelse I) og 10 (STZ + Forbindelse I).

Forskningsdesign og metoder:

1. For å identifisere ytterligere dødssignaler og stressfaktorer som understøtter død av humane beta- celler via Forbindelse I inhiberte veier. Human øyceller behandles med 10 uM salt I, for eksempel forbindelse I og øycelldød bestemmes som respons på de følgende cytotoksiske midler: Hydrogenperoksid (150 uM; oksidativt stress), staurosporin (200 mM, PKC-inhibering), FCCP (5 uM; avkobling og mitokondrial membranpermeabilitetstransisjon), Brefeldin A (10 uM, ER stress), trapsigarin (200 nM, ER stress og øket Ca<2+>) og doksorubicin (2 uM, DNA-skade). Celledød visualiseres ved vitalfarging med propidiumjodid og bisbenzimid fulgt av fluorescens mikroskopi. Øyer i duplikatgrupper på 10 benyttes. Denne prosedyre tillater kvantitering av både apoptose og nekrose i intakte dyr. Den vitale fargingsteknikk kombineres med XTT- analysen (en forenklet versjon av MTT-analysen) som gir en enkel og hurtig screening-analyse av øy-levedyktighet. 2. For å studere hvorvidt Forbindelse I påvirker utviklingen av diabetes i type I diabetes dvremodelle. Som beskrevet ovenfor, beskytter Forbindelse I, for eksempel Salt I, mot en enkeltdose streptozotocin-injeksjon. For å utvikle denne observasjon bedømmes rollen til c-Abl i utviklingen av diabetes i de multippel-streptozotocin-behandlede c57KSJ/sorte musemodeller. Den daglige Forbindelse I behandling (200 mg/kg Forbindelse I i 200 ul 0,9% NaCl) startes en dag før den første streptozotocin-behandling (dålig lavdose 40 mg/kg injeksjoner i 5 dager) og fortsetter i 10 dager eller 2 uker når de manifesteres diabetes. Behandlingen evalueres ved daglig måling av blodglukoseverdier. Etter 10 dager eller 2 uker avlives musene og pankreas fjernes og fikseres for immunohistokjemisk og morfometrisk analyse. Øy inflammasjon og beta-cellemasse bedømmes.

Viktigheten av c-Abl ved gjenopptreden av sykdommen i de ikke-obese, diabetiske mus, forkortet til NOD-mus, studeres. En tilsvarende protokoll benyttes som angitt ovenfor. I dette tilfellet blir imidlertid Forbindelse I behandlingen gitt til diabetiske NOD-hunnmus. På dagen etter den første Forbindelse I-administrering ved tvangsforing, transplanteres 300 øyer som er isolert fra unge NOD-mus under nyrekapselen. Etter 7 dager bestemmes glukoseverdier og musene avlives. På dette tidspunkt er de fleste transplanterte beta-celler destruert av de aktive immunceller og enhver putativ effekt av Forbindelse I for beta-celle-overlevelsen er detekterbar. Transplantatene gjenvinnes og fikseres for analyse.

For det tredje studeres effekten av Forbindelse I på det naturlige forløp av diabetes i NOD-mus. NOD-hunnmus med en alder på 4 - 5 uker, når det er intet eller meget lite insulitt, mottar Alzet mini-osmotiske pumper subkutant som frigir 0,25 fil pr. time i 4 uker av konsentrert Forbindelse I eller kun vehikkel. Etter 4 uker avlives musene og pankreas gjenvinnes og fikseres for immunohistokjemisk og morfometrisk analyse. Graden av insulitt og beta-cellemasse bedømmes.

I lys av den mulighet at farmakologisk inhibering av c-Abl kan være problematisk, forsøkes det en genetisk vei. For dette formål isoleres øyer fra c57/KSJ sorte og NOD-mus og disperse øyceller ved trypsinbehandling. Øycellene transduceres med rekombinant adenoviralvektor i en mengde av 5 MOI som retter transkripsjonen av et c-Abl spesifikt siRNA-molekyl. Som en kontroll benyttes det en adenoviral vektor som koder en scramblet siRNA sekvens. Cellene tillates så å reaggregere i 5 dager in vitro før implantering under nyrekapslene av syngeniske mus. Musene behandles og analyseres som beskrevet ovenfor.

Det kan være at en adenoviral vektor er uegnet for in vivo formålene tatt i betraktning deres inherente toksisitet og immuogenisitet. En AAV vektor konstrueres som uttrykker det samme anti-c-Abl siRNA konstrukt. Rundt 30% av øy-beta-cellene transduseres ved AAV når de dispergeres in vitro (resultater er ikke vist). Dette er betydelig lavere enn den transduksjonseffektivitet som oppnås med adenovirale vektorer, men er tilstrekkelig høyt til å tillate evaluering av c-Abl i beta-celledestruksjonen in vivo.

Metoder og fasiliteter

Humanøyer. Humanøyer dyrkes frittflytende ved standard dyrkingsbetingelser (5,6 mM glukose i RPMI1640 + 10% FCS).

Strømningscvtometri og cellesortering. Effektiviteten bedømmes lett ved hjelp av et strømningscytometer (FACSCalibur Becton-Dickinson) med cellesorteringsevne og ved bruk av den destabiliserte form av det grønne, fluorescente protein som rapportør og sorterer samtidig de transfekterte celler for ytterligere forsøk eller transplantasjon. Således er det ikke lenger nødvendig å stole på generering av valgte kloner av insulinomaceller som stabilt uttrykker transgene (problemer med klonal variasjon). Transient transfekterte celler som er separert fra de ikke-transfekterte celler kan benyttes. I tillegg bedømmer strømningscytometer også cellelevedyktigheten (propidium jodidfarging) og apoptose (anti-aktivert caspase-3 antistoff). I tillegg benyttes strømningscytometre også for å sortere gnager beta-celler, cellesyklusanalyse, mitokandrial membranpotensiale, produksjon av oksygenfrie radikaler og immunofluorescensstudier (insulin, glukagon, Bcl-2).

Eksempel 2: Kapsler med 4- r( 4- metvl- l- piperazin- l- vlmetvl)- N- r4- metyl- 3- rr4-( 3-Pvridinvl)- 2- pvrimidinvllamino1fenyllbenzamidmetansulfonat, beta- krystallform

Kapsler inneholdende 119,5 mg Salt I tilsvarende 100 mg Forbindelse I (fri base) som aktiv del fremstilles i følgende sammensetning:

Kapslene fremstilles ved å blande komponentene og å fylle blandingen i harde gelatinkapsler, størrelse 1.

Eksempel 3: Studier på mekanismen som ligger under Forbindelse I- indusert beskyttelse mot beta- celledød og diabetes in vivo

Bakgrunn: Forbindelse I er kjent for å inhibere c-Abl, en ubikitøst uttrykt protein tyrosinkinase med den omtrentlige molekylvekt 145 kDa. Under fysiologiske betingelser er c-Abl påvist å delta i kontrollen av cytoskeletale funksjoner, som migrering og cellestruktur, og cellesyklusprogresjon. Når imidlertid cellene eksponeres til forskjellige former for stress, blir c-Abl meget aktivert, noe som fører til cellesyklusstans og apoptose.

Nylig oppnådde resultater: C-Abl uttrykkes i bTC-6 celler og i isolerte rotteøyer og inhibering av c-Abl aktiviteten, ved bruk av det farmakologiske middel for Forbindelse I, resulterte i beskyttelse mot beta-celledød indusert av streptozotocin,

proinflammatoriske cytokiner og av nitrogenoksiddonorer. Forbindelse I, for eksempel Salt I, er en selektiv inhibitor benyttet klinisk for behandling av CML. I tillegg til c-Abl er Forbindelse I kjent for å inhibere ABL onkogener, c-KIT, PDGFbeta-reseptorer og c-Abl homologen ARG. Således er det nødvendig å vite at Salt I-effektene medieres spesifikt ved inhibering av c-Abl. bTC-6 celler ble derfor behandlet med enten scramblet siRNA eller siRNA som er spesifikk for cAbl. siRNA innføres i cellene ved bruk av lipofectamin-reagensen. Cellene følges så i 1 eller 3 dager hvoretter total RNA isoleres. cDNA syntetiseres fra RNA og benyttes for PCR-forsterkning ved bruk av primere som er spesifikke for c-Abl (35 sykler) og b-aktin, for eksempel beta-aktin (20 sykler). PCR-produktene separeres på en agarosegel og visualiseres ved etidiumbromid-farging. Ingen c-Abl b- og c kan observeres i celler 24 timer etter siRNA-behandling (ikke vist). Ved 72 timer opptrer det imidlertid et c-Abl bånd. Disse resultatene antyder at SiRNA rettet mot c-Abl medierer knock-out av meddeleren via RNAi-mekanismen og at effekten kun er transient i de hurtigprolifererende b TC-6 celler (data ikke vist). Etter å ha etablert at c-Abl mRNA-nivåene kan reduseres ved RNAi-teknikken, undersøkte man deretter hvorvidt bTC-6 celler som var defektive på c-Abl mRNA responderte på kombinasjonen av IL-1 (5, IFN-y og TFN-a med øket celledød. I motseting til situasjonen som ble observert i primære øyceller, døde bTC-6 celler som respons på cytokiner, preferensielt ved apoptose. I tillegg blir cytokinindusert bTC-6 celledød potent mot virkningen av c-Abl spesifikk siRNA to og tre dager etter behandling (Figur 3). Dette indikerer at en antatt langsom turnover av c-Abl-protein resulterer i en forsinkelse i effekten av siRNA-behandlingen. Viktigere er det imidlertid at disse data antyder at SALT I-indusert beskyttelse mot en NO-donor og kombinasjonen av cytokin medieres ved inhibering av c-Abl.

Forbindelsen mellom c-Abl og forskjellige MAP kinaser: Det ble undersøkt om det fantes en forbindelse mellom c-Abl og de forskjellige MAP-kinaser p38, JNK og ERK som kan virke som nedstrømseffektorer av c-Abl. For dette formål ble rotteøyer pre-inkubert i 24 timer med 10 uM Forbindelse I og så eksponert til DETA/NO (2 mM) og kombinasjonen av IL-1 (}, IFN-y og TFN-a i 20 minutter. Øyene analyseres deretter på fosforylering av p38, JNK2 og ERK 1/2 ved bruk av fosfospesifikke antistoffer og immunoblotting. Forbindelse I, for eksempel Salt I behandling, motvirket partielt (25 - 45%) den DETA/NO-induserte aktivering av p38, JNK og ERK, og økte den cytokininduserte MAPK-aktivering (Tabellene 5 og 6).

Tabell 5: Effekter av Forbindelse I, for eksempel Salt I, på DETA/NO- og cytokin-indusert p38-, JNK- og ERK-aktivering. Isolerte rotter inkuberes i 24 timer med 10 uM forbindelse I og eksponering i 20 min. til DET A/NO eller cytokinene IL-1(5 (50 U/ml) og IFN-y (1000 U/ml). ERK, JNK og p38 fosforylering bestemmes ved immunoblotting og uttrykkes pr. totale mengder ERK, JNK og p38. Resultatene er uttrykt som prosent av kontroll og er gjennomsnittet for 4 separate observasjoner.

<**>angir p<0,01 henholdsvis p<0,05, sammenlignet vs korresponderende gruppe med Forbindelse I ved bruk av 2-veis ANOVA- og Student's t-test.

Tabell 6. Resultatene fra Tabell 5 er rekalkulert slik at effektene av Forbindelse I uttrykkes i prosent av den tilsvarende gruppe uten noen Forbindelse I tilsetning.

Disse resultater understøtter at cytokinindusert nitrogenoksid-produksjon aktiverer JNK og p38 i det minste partielt via c-Abl veien og at dette fører til beta-celledød. På den annen side synes den tidlige stigning i p38- og JNK-aktivitet som inntrer som respons på cytokiner, å bli undertrykket av c-Abl. I denne situasjon er det imidlertid sannsynlig at den første topp i cytokinindusert p38- og JNK-aktivitet representerer en fysiologisk respons som fører til endret genekspresjon og øket proliferering, og ikke til apoptose per se. For eksempel er det antydet at ved cytokinaktivering deltar p38 og JNK i den etterfølgende ekspresjon av iNOS-genet. I en slik kontekst, forklarer den nå observerte c-Abl-medierte suppresjon av p38 og JNK fint den økede nitrogenoksidproduksjon som observeres i øyer behandlet med cytokiner og Forbindelse I.

I lys av disse data virker c-Abl som en sensor på stress og eksterne dødssignaler og at c-Abl aktivering kan føre til fosforylering og aktivering av JNK- og p38 MAP-kinaser og til slutt beta-celledød.

Ytterligere forsøk:

1. For å studere ekspresjonen av c-Abl i beta-celler.

c-Abl mRNA ekspresjon kan bedømmes ved sanntids-PCR. Nivåer av øy-c-Abl mRNA sammenlignes med de i andre vev. Fluorescentprober som er spesifikke for c-Abl erverves blant TIB MOLBIOL Syntheselabor (Berlin, Tyskland) og fluorescente signaler kvantifiseres mot en c-Abl cDNA standardkurve ved bruk av et Lightcycler instrument. Antallet c-Abl mRNA molekyler standardiseres til b-aktin mRNA molekyler. c-Abl mRNA innholdet i humanøyer sammenlignes med det til lever, muskel, nyre, milt, hjerne og lunge. Parallelt kvantifiseres ekspresjonen av c-Abl lik tyrosinkinase ARG, som kan virke på en måte tilsvarende c-Abl. I denne kontekst bestemmes det hvorvidt nivåene av c-Abl mRNA påvirkes av cytokiner, oksidativt stress og ER stress. Humane øyer eksponeres til IL-1(5 (25 (U/ml) + IFN-y (1000 U/ml) + TNF-a (1000 U/ml), 100 mM hydrogenperoksid eller brefeldin A (10 uM) i 3 timer og analyseres deretter for c-Abl mRNA ekspresjon ved sanntids-PCR. 2. For å studere hvorvidt c-Abl fosforyleres som respons på beta-cellestress. Stabile bTC-6 cellelinjer som overuttrykker villtype c-Abl genereres ved lipofektering av cellene med pCDNA3/c-Abl plasmid (oppnådd fra Ludwig Institute, Universitetet i Uppsala) fulgt av seleksjon for resistens mot geneticin. De c-Abl-overuttrykkende bTC-6 celler eksponeres så til IL-1, brefeldin A og DET A/NO i 20, 60 henholdsvis 360 minutter for å etablere hvorvidt c-Abl fosforyleres som respons på cytokiner, ER stress og nitrogenoksid. Cellene homogeniseres deretter i nærvær av fosfataseinhibitorer og c-Abl immunopresipiteres ved bruk av K-12 anti-C-Abl antistoff (Santa Cruz). Etter PAGE og overføring til nylonfilter, analyseres c-Abl bånd på tyrosin-fosforylering ved aminosyre 245 og total tyrosinfosforylering med to fosfospesifikke c-Abl antistoffer (Tyr245 og Thr735) tilgjengelig fra Cell Signaling Technology, og fosfotyrosinantistoff 4G10. c-Abl-aktiviteten øker når aminosyrerestene Tyr245 og Thr735 er hyper-fosforylert. 3. For å studere hvorvidt den subcellulære lokalisering av c-Abl påvirkes av beta-cellestress.

bTC-6 celler som overuttrykker c-Abl dyrkes på dekkglass og eksponeres til cytokiner, brefeldin A og nitrogenoksiddonor i 6 timer. Etter fiksering, blokkering og permeabilisering analyseres cellene ved konfokal mikroskopi ved bruk av Mitotracker green (Molecular Probes) som farger mitokondria grønne, og K-12-c-Abl antistoff (Santa Cruz) som, med et rhodamin-konjugert, sekundært antistoff, farger c-Abl rødt. Hvis c-Abl blir relokalisert fra ER til mitokondria forandres fargingsmønstre fra de adskilte røde og grønne til kun gul.

4. For å identifisere nedstrømsmål for c-Abl.

For dette formål genereres CbTC-6 celler som transient overuttrykker villtype eller en konstitutivt aktiv form av c-Abl. bTC-6 celler lipofekteres (Lipofectamin + Lipofectamin pluss) med pcDNA3/c-Abl-vektoren og en GFP-ekspresjonsvektor. Dette resulterer i 20% GFP-positive celler som så anrikes til mer enn 75% ved FACS. Sorterte celler bringes på plate og dyrkes i 24 timer og analyseres deretter for fosforylering av kandidatmålene ERK, JNK, p38, IkB, p53 og AKT (nedstrøms effektor av PI3K). 20 og 120 minutter før analyse stimuleres cellene med doksorubicin (nukleær aktivering av c-Abl) eller DETA/NO (cytoplasmisk aktivering av c-ABl) med eller uten Salt I, for eksempel Forbindelse I.

Fosforylering (ser/thr) av de putative målproteiner analyseres ved immunoblotting ved bruk av kommersielt tilgjengelige, fosfo-spesifikke antistoffer (Cell Signal Technology). Dette avdekker hvorvidt kandidateffektorer fosforyleres og aktiveres som respons på c-Abl-aktivering. Nivåer av Bcl-2, Bcl-XLog Aph2 analyseres ved bruk av tradisjonelle Western blot teknikker. I noen tilfeller er immunopresipitering av kandidatproteinene nødvendig for å øke sensitiviteten for immunoblot-analysen. For tyrosin-spesifikk fosforylering blir kandidateffektorer immunopresipitert og analysert ved immunblotting ved bruk av PY20 anti-fosfotyrosin antistoff.

5. For å studere interaksjonen mellom c-ABl og Shb:

Forsøk initieres med henblikk på å forstå den putative interaksjon mellom c-Abl og adaptorproteinet Shb. Shb er et SH2-domeneholdig protein med prolinrike deler ved sin N-terminus, et sentralt PTB (fosfotyrosinbindende)-domene, flere potensielle tyrosin fosforyleringsseter og et C-terminalt SH2-domene, og er kjent for å spille en rolle ved generering av signalkomplekser som respons på tyirosinkinaseaktivering. Interessant er det at den apoptotiske propensitet hos Shb-over-uttrykkende beta-celler økes. Således viste transgeniske mus som uttrykker SHB under kontroll av rotteinsulinpromoteren forhøyede grader av apoptose når øyer ble dyrket i fravær av serum eller i nærvær av cytotoksiske cytokiner. I lys av en nylig rapport som viser at Shb-familiemedlemmet Shd binder til og interagerer med c-Abl, er det mulig at c-Abl virker via interaksjoner med Shb i beta-celler. For å undersøke dette behandles celler som transient er transfektert til å overuttrykke c-Abl, Shb eller en Shb-mutant, behandlet med pervanadate og så immunopresipitert med et anti-Shb-antistoff. Immunoblotting gjennomføres deretter på immunopresipitatene for å analysere nivåene av c-Abl og Shb, og tyrosinfosforylering av c-Abl ko-presipitert Shb. Preliminære funn antyder at c-Abl ko-presipiterer med Shb og vice versa og c-Abl overekspresjon resulterer i øket Shb-fosforylering (data ikke vist). Disse funn understøtter den antagelse at Shb er et substrat for c-Abl kinase.

For ytterligere å forstå interaksjonen mellom c-Abl og Shb, gjennomføres det fusjonsprotein pull-down forsøk. GST, GST-ShbSH2 og GST-ShbPTB/prolinrikt domene-fusjonsproteiner tillates å interagere med COS-cellehomogenater inneholdende høye nivåer av c-Abl. Reaksjonene gjennomføres med eller uten pervanadatstimulering, dvs. for å se betydningen av c-Abl tyrosinfosforylering, og fosfotyrosintilsetning, dvs. for å se betydningen av SH2-domeneinteraksjonen med fosfotyrosinresten. Pull-down produktene analyseres på c-Abl og fosfo-c-Abl ved immunoblotting. Disse forsøk antyder hvilke domener av Shb som er nødvendig for å binde til ikke-fosforylert eller fosforylert c-Abl. De tilsvarende forsøk ved bruk av c-Abl-fusjonsprotein (c-Abl-SH2 og c-Abl-SH3) gjennomføres for å evaluere hvilke domener som er kritisk for bindingen til Shb.

For å etablere hvorvidt Shb-c-Abl interaksjonen medierer den forsterkede propensitet hos Shb-overuttrykkende øy celler til å undergå en poptose som respons på forskjellige noksiøse stimuli isoleres øyer fra Shb-transgeniske mus og eksponeres til cytokiner, DETA/NO og stsreptozotocin med eller uten forbehandling med Forbindelse I. Apoptose og nekrose kvantifiseres og data oppnådd fra de transgeniske mus sammenlignes med de fra kontrollmus, oppnådd i parallell. Hvis økede nivåer apoptose og nekrose av Shb-øyene normaliseres med forbindelse I, for eksempel Salt I, er det mulig at Shb-c-Abl interaksjonen kan være en vesentlig, apoptoseregulerende vei.

Fasiliteter: RNAi. Studier initieres med henblikk på å skru av genekspresjonen i beta-celler ved bruk av RNAi teknikken. Små, interfererende RNA (siRNA) erverves fra Dharmacon Research til en pris på 300 - 600 US dollar pr. par RNA oligonukleotider. Ved bruk av FITC-merket SiRNA observeres det at siRNA effektivt innføres i insulinproduserende celler ved bruk av Lipofectamin eller Lipofectamin 2000 (resultater ikke vist). Uheldigvis er effekten av liposomalt avledet siRNA kun transient. For fremstilling av rekombinante, adenoassosierte (AAV) vektorer, benyttes det AAV hjelperfrie system (Stratagene). Denne kit inkluderer plasmider for produksjon av beta-gal uttrykkende AAV-vektorer som benyttes for preliminær transfeksjonseffektivitetstudier. Arbeid med virale vektorer har oppnådd godkjennelse fra "Arbetarskyddstyrelsen" under den svenske regjering.

Sanntids PCR. Lightcycler instrument (Roche) er en sanntids PCR sykliserer. Denne apparatur tillater hurtig og nøyaktig kvantifisering av mRNA molekyler og er derfor egnet for studier på genekspresjon.

Det er tilveiebrakt konfokal mikroskopi- og elektronmikroskopi-teknikker.

Claims

1. Anvendelse av 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav for fremstilling av et medikament for terapi eller prevensjon av diabetes.

2. Anvendelse ifølge krav 1, hvor medikamentet er for terapi av diabetes.

3. Anvendelse ifølge krav 1, hvor medikamentet er for prevensjon av diabetes.

4. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 der nevnte diabetes er type I diabetes.

5. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 1 til 3 der nevnte diabetes er type II diabetes.

6. Anvendelse ifølge et hvilket som helst av kravene 4 eller 5 der 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyrimidin-2-ylamino)fenyl]-benzamidet er i form av et monometansulfonatsalt.

7. Medikamentpakke,karakterisert vedat den omfatter 4-(4-metylpiperazin-l-ylmetyl)-N-[4-metyl-3-(4-pyridin-3-yl)pyirmidin-2-ylamino)fenyl]-benzamid eller et farmasøytisk akseptabelt salt derav, for administrering til pasienter med diabetes, for eksempel type I diabetes eller type II diabetes.