ES2331800T3

ES2331800T3 - Utilizacion de inhibidores de tirosina-quinasa para el tratamiento de la diabetes.

Info

Publication number: ES2331800T3
Application number: ES04739375T
Authority: ES
Inventors: Robert P. Hagerkvist; Nils Richard Welsh
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2003-05-27
Filing date: 2004-05-26
Publication date: 2010-01-15
Anticipated expiration: 2024-05-26
Also published as: IL171927A; AU2004243491A1; US7875616B2; JP4776537B2; PT1631291E; RU2365373C2; HK1087638A1; MA27812A1; DK1631291T3; DE602004022540D1; NO20056188L; IS2712B; IS8139A; RU2005140516A; KR20060021865A; EP1631291B1; IL171927A0; NZ543709A; CA2526594A1; US20070072932A1

Abstract

Utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para la cura o prevención de la diabetes.

Description

Utilización de inhibidores de tirosina-quinasa para el tratamiento de la diabetes.

La presente invención hace referencia a la utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida, en adelante "Compuesto 1", o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de composiciones farmacéuticas para el tratamiento de la diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, al Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la utilización en el tratamiento de la diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.

Leyenda de las figuras

Figura 1. La producción de NO inducida con citoquina no se ve afectada por 10 \muM del Compuesto I, por ejemplo la sal I, en células bTC-6 e islotes de rata aislados. Los resultados son media \pm SEM para tres observaciones independientes.

Figura 2. El Compuesto I, por ejemplo la sal I, protege parcialmente células islotes humanas contra óxido nítrico. Los resultados son media \pm SEM para tres donantes separados.

Figura 3. Las tasas de apoptosis en células bTC-6 tratadas con siARN de secuencia aleatoria o siARN específico para la c-Abl. El tratamiento con citoquina (IL-1\beta + IFN-\gamma + TNF-\alpha) se inicia 24 horas antes del análisis de células. La apoptosis se cuantifica mediante la citometría de flujo. Los resultados son media \pm SEM para 3-4 observaciones.

Más de un millón de estadounidenses tienen diabetes tipo 1, también llamada diabetes mellitus insulino-dependiente, abreviada como DMID, o diabetes juvenil. En la diabetes tipo 1, el páncreas de una persona produce poca o nada de insulina, una hormona necesaria para la vida. Aunque las causas no se conocen del todo, la diabetes tipo 1 es una enfermedad autoinmune multifactorial que se produce tras la destrucción específica y progresiva de las células beta en el páncreas que producen insulina. Es una de las enfermedades de la niñez crónicas más costosas y una de las que nunca se deja atrás. Mientras que la insulina le permite a una persona permanecer vivo, no cura la diabetes ni evita sus efectos eventuales y devastadores: insuficiencia renal, ceguera, daños al sistema nervioso, amputaciones, ataque cardíaco y accidente cerebrovascular. Para mantenerse con vida, los que padecen diabetes tipo 1 deben recibir múltiples inyecciones de insulina diariamente o recibir insulina de forma continua a través de una bomba, y medir su nivel de azúcar pinchándose los dedos para obtener sangre seis o más veces por día. Al tratar de equilibrar las inyecciones de insulina con la cantidad de alimentos que ingieren, las personas con diabetes tipo 1 debe prepararse constantemente para potenciales reacciones ante hipoglucemia, es decir, bajo nivel de azúcar en sangre, e hiperglucemia, es decir, alto nivel de azúcar en sangre, las cuales pueden ser letales. A pesar de la atención rigurosa a mantener una dieta y un régimen de ejercicio saludables e inyectarse siempre la cantidad apropiada de insulina, muchos otros factores pueden afectar negativamente el control de azúcar en sangre de una persona, incluyendo: estrés, cambios hormonales, períodos de crecimiento, actividad física, medicamentos, enfermedades/infecciones y fatiga. Incluso con insulina, la diabetes tipo 1 usualmente produce una reducción drástica de la calidad de vida y reduce la vida promedio en 15 años. Cada año aproximadamente 30000 estadounidenses reciben un diagnóstico de diabetes tipo 1, de los cuales más de 13000 son niños. Es decir, 35 niños diarios.

La diabetes tipo 2, también llamada diabetes mellitus no insulino-dependiente, abreviada como DMNID, o diabetes del adulto, usualmente se asocia con la obesidad, la resistencia a la insulina y una relativa falta de insulina. Aunque esta forma de diabetes no requiere insulina en la mayoría de los casos, hay similitudes destacables entre ella y la diabetes tipo 1. Por ejemplo, actualmente hay consenso en cuanto a que hay una falta total de células beta que producen insulina también en la diabetes tipo 2, y que esta deficiencia de células beta probablemente se deba a una mayor tasa de muerte de células beta. Por lo tanto, el tratamiento farmacológico que lleva a la protección contra la muerte de células beta puede resultar útil como tratamiento tanto de la diabetes tipo 1 como de la diabetes tipo 2.

La WO01/64200 muestra la utilización de tirosina quinasa del receptor de PDGF, especialmente el Compuesto I en relación al tratamiento de la nefropatía diabética y la glomerulonefritis proliferativa. La nefropatía diabética es la causa más común de la insuficiencia renal en su estadio final. Los datos en WO01/64200 se limitan al efecto del Compuesto I en la proliferación celular mesangial y en la proteinuria.

Sorprendentemente, se encontró que el Compuesto I inhibidor de tirosina quinasa c-Abl o una sal farmacéuticamente aprobada del mismo, por ejemplo la SAL I, es particularmente útil para el tratamiento de la diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. Inesperadamente, se encontró que el Compuesto I inhibidor de tirosina quinasa c-Abl o una sal farmacéuticamente aprobada del mismo, por ejemplo la SAL I, puede utilizarse para curar o prevenir la diabetes, por ejemplo, diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2.

El Compuesto I es 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida que tiene la siguiente fórmula

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La base libre del Compuesto I, sus sales aceptables y su preparación se reivindican en la patente europea otorgada 0564409. La base libre del Compuesto I corresponde a la parte de la molécula activa. La sal del Compuesto I de adición de ácido monometanosulfónico, en adelante llamada "Sal I", y una forma cristalina preferente de la misma, por ejemplo la forma cristalina beta, se describen en la solicitud de patente WO99/03854 en virtud del PCT publicada el 28 de enero de 1999.

Más preferentemente, la invención se refiere a la utilización del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable de la misma, por ejemplo, para la elaboración de un fármaco contra la diabetes, por ejemplo, la diabetes tipo 1 o tipo 2.

El inhibidor tirosina quinasa c-Abl utilizado según la presente invención es 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida, en adelante Compuesto I, o sales farmacéuticamente aceptables del mismo.

La presente invención se refiere a la utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida, o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, preferentemente 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida para la elaboración de un medicamento para curar la diabetes, por ejemplo, la diabetes tipo 1 o tipo 2.

En la presente descripción, el término "tratamiento" incluye tanto el tratamiento profiláctico o preventivo como el tratamiento curativo o supresor de la enfermedad, incluyendo el tratamiento de pacientes en riesgo de diabetes como el de pacientes enfermos. Este término también incluye el tratamiento para retardar la progresión de la enfermedad.

Al utilizar el término "suprimir y/o revertir la diabetes" el solicitante quiere decir que la enfermedad de diabetes deja de estar presente en el paciente o que la enfermedad es menos seria que antes del tratamiento o sin éste.

El término "cura" como se lo utiliza en la presente significa que el tratamiento lleva a la remisión de la diabetes o de episodios continuos de diabetes.

Los términos "profiláctico" o "prevenir" significan la prevención de la aparición o recurrencia de diabetes.

El término "retardar la progresión" como se lo utiliza en la presente significa que la administración del compuesto activo a pacientes en un pre-estado o en una fase temprana de diabetes evita que la enfermedad evolucione más o reduce la evolución de la enfermedad en comparación con la evolución de la enfermedad sin la administración del compuesto activo.

Las composiciones farmacéuticas según la presente invención pueden prepararse en una manera conocida per se y son aquellas adecuadas para la administración enteral, tal como oral o rectal, y parenteral a animales de sangre caliente, incluyendo humanos, que comprenden una cantidad terapéuticamente efectiva de al menos un ingrediente farmacológicamente activo, solo o en combinación con uno o más vehículos farmacéuticamente activos, especialmente adecuados para la aplicación enteral o parenteral. La vía de administración preferente de la vía de dosificación de la presente invención es oral.

Por lo tanto, la presente invención también se refiere al compuesto I para su utilización en el tratamiento de animales de sangre caliente que padecen diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, que comprende la administración del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable de éste a dicho animal que necesita tal tratamiento en una cantidad que sea terapéuticamente efectiva contra la enfermedad.

Un experto en el arte pertinente puede seleccionar perfectamente los modelos de prueba relevantes para sondear los efectos beneficiosos aquí mencionados para casos de diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. La actividad farmacológica del compuesto I puede, por ejemplo, demostrarse mediante los ejemplos antes descritos, a través de análisis in vitro y análisis in vivo o en estudios clínicos adecuados. Son estudios clínicos adecuados, por ejemplo, estudios abiertos no aleatorios de incrementos en la dosis en pacientes que padecen diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2. La eficacia del tratamiento se determina en estos estudios, por ejemplo mediante la evaluación de la enfermedad cada 4 semanas, con el control alcanzado en placebo.

La dosificación efectiva del Compuesto I puede variar según el compuesto particular o la composición farmacéutica utilizada, el modo de administración, el tipo de diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, que se está tratando o su gravedad. El régimen de dosificación se selecciona según una variedad de otros factores, incluyendo la función renal y hepática del paciente. Un médico, médico clínico o veterinario puede determinar y prescribir la cantidad efectiva de compuestos requeridos para prevenir, contrarrestar y detener la progresión de la enfermedad.

Según la edad, condición individual, modo de administración y la imagen clínica en cuestión, dosis efectivas, por ejemplo dosis diarias del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable de éste que corresponde a de 100 a 1000 mg de la base libre como la parte de la molécula activa, especialmente 800 mg, se administran a animales de sangre caliente de aproximadamente 70 kg de peso corporal. Preferentemente, el animal de sangre caliente es un humano. Para pacientes con una respuesta adecuada a dosis diarias, el incremento en la dosis puede considerarse con seguridad y los pacientes pueden tratarse durante todo el tiempo que se beneficien del tratamiento y en ausencia de toxicidades limitativas.

La invención también se refiere al compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable de éste para su utilización en un método para administrarlo a un ser humano para tratar la diabetes, por ejemplo diabetes tipo 1 o diabetes tipo 2, que comprende administrar una cantidad farmacéuticamente efectiva del Compuesto I o una sal farmacéuticamente aceptable de éste al ser humano una vez por día por un período que no exceda los tres meses. La invención se refiere específicamente a dicha utilización donde preferentemente se administra una dosis diaria de 400 a 800 mg, preferentemente 800 mg del Compuesto I a un adulto.

Ejemplo 1 ¿El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra la muerte de células beta y la diabetes?

En el siguiente ejemplo, las células \beta-TC6 se refieren a células beta TC6.

La diabetes mellitus insulino-dependiente (DMID) (Tipo 1) es una enfermedad autoinmune multifactorial que resulta de la destrucción específica y progresiva de células \beta productoras de insulina. Se cree que la disfunción y daño de células \beta se produce a partir del contacto directo con células infiltrantes en islotes (macrófagos, CD4^{+} o CD8^{+} células T (NK)) y/o exposición a mediadores citotóxicos producidos por estas células, tales como citoquinas pro-inflamatorias (IL-1, TNF-a, IFN\gamma), radicales libres, ligando Fas, TRAIL y perforina. La autoinmunidad dirigida contra las células beta puede desatarse por factores medioambientales tales como toxinas en células beta, componentes nutricionales, estrés, sobrecarga metabólica, virus, etc. Es probable que la célula beta, al convertir la señal de muerte externa a eventos apoptóticos internos, participe activamente en su propia destrucción en diabetes tipo 1. Las citoquinas pro-inflamatorias, en especial la combinación de IL-1 y IFN-\gamma, inducen la apoptosis y necrosis de células beta. Por lo tanto, es posible que estas citoquinas no sólo modulen la actividad de las células inmunes que infiltran islotes sino que también produzcan efectos nocivos directos sobre la célula beta en la patogénesis de la diabetes tipo 1. Parece que la estimulación de las células beta con IL-1 lleva a múltiples eventos de señalización incluyendo activación de proteínas quinasas (NF-\kappaB, AFT-2, c-jun, Elk-1, CREB, cEBP-\beta, IRF-1, STAT-1). Tras estos eventos se produce la inducción de óxido nítrico sintasa inducible (iNOS) y proteínas relacionadas con el estrés tales como hsp70, heme oxigenasa, Mn-SOD, ICE y otras. Desafortunadamente, no está claro qué alteraciones en la expresión genética son esenciales para la muerte de las células beta en la diabetes tipo 1. Predominantemente, la apoptosis ocurre en una línea de células beta en respuesta a luz UV o inhibición de la reparación de ADN. Esto se ve precedido por inducción de la proteína supresora de tumores p53, generación de especies reactivas de oxígeno, inhibición de PARP, arresto del ciclo celular en S y G_{2} y un descenso del potencial de membrana mitocondrial. Las citoquinas, que promueven principalmente la necrosis, y sólo hasta un grado menor la apoptosis, activaron esencialmente los mismos pasos de señalización que la inhibición de reparación de ADN o luz UV. A partir de estos experimentos in vitro, queda claro que el modo de muerte de las células beta puede variar según la señal de muerte, pero también que pueden utilizarse vías de señalización similares para alcanzar diferentes formas de muerte de células beta.

C-Abl es una proteína tirosina quinasa de expresión ubicua con un peso molecular aproximado de 145 kDa. Bajo condiciones fisiológicas, c-Abl ha mostrado participar en el control de funciones citoesqueléticas, tales como migración y estructura celular, y progresión del ciclo celular. Sin embargo, cuando las células están expuestas a diferentes formas de estrés, la c-Abl se activa en gran medida, lo que lleva al arresto del ciclo celular y apoptosis.

En resumen, estudios exhaustivos en células no beta han demostrado que la c-Abl promueve la apoptosis en respuesta a varios tipos de estrés. El supuesto rol de la c-Abl en las células productoras de insulina no se ha podido dilucidar. Por lo tanto, no está claro si esta proteína desempeña algún rol en la muerta de células beta y la decisión entre la apoptosis y la necrosis.

Relevancia para la diabetes tipo 1. Aunque la patogénesis de la diabetes tipo 1 parece ser muy compleja, es posible que las rutas intracelulares que conducen a la muerte de células beta converjan en un punto específico. Hipotéticamente, esto podría ofrecernos, utilizando un único enfoque, la posibilidad de bloquear una multitud de señales de muerte celular, y así lograr que las células beta sobrevivan.

La tirosina quinasa c-Abl podría ser un mediador importante en la muerte de células beta. La C-Abl se expresa en células bTC-6 y en islotes de ratas aislados, y la inhibición de la actividad de la c-Abl, ya sea utilizando el agente farmacológico Compuesto I o silenciando la expresión de c-Abl con la técnica de ARNi, produjo la protección contra la muerte de células beta inducida por citoquinas pro-inflamatorias o por donantes de óxido nítrico. La C-Abl no actúa promoviendo la producción de óxido nítrico, ya que la inhibición de c-Abl no contrarrestó la producción de óxido nítrico inducida por citoquinas.

En vista de estos datos, la c-Abl actúa como un sensor de estrés y señales de muerte celular externas y esa activación de c-Abl puede llevar a la fosforilación y activación de las quinasas JNK y p38 MAP, inactivación de NF-\kappaB y PI3K, liberación mitocondrial de factores pro-apoptóticos y finalmente muerte de células beta. El Compuesto I es capaz de silenciar diferentes señales de muerte celular, por lo tanto logra la supervivencia de células beta y la protección contra la diabetes.

Resultados: Para establecer si el Compuesto I, por ejemplo la Sal 1, interfiere con o si la c-Abl participa en la cascada de señalización que conduce a la muerte de células beta, se exponen islotes aislados de rata al donante de óxido nítrico de liberación lenta DETA/NO (0,5 mM) o a la combinación de IL-1\beta (25 U/ml) + IFN-\gamma (1000 U/ml) + TNF-\alpha (1000 U/ml) durante 24 horas. En ambos casos, los islotes se cultivan con o sin 10 \muM del Compuesto I, por ejemplo Sal I, durante todo el período de incubación. Después del período de incubación, los islotes se someten a tinción vital con yoduro de propidio + bisbenzimida y se fotografían en un microscopio de fluorescencia. Las células apoptóticas (con núcleo blanco condensado o fragmentado) y necróticas (con núcleo rojo o rosado no fragmentado) se cuentan y expresan como porcentaje del número total de células. La Sal I, por ejemplo el Compuesto I, por sí solo no afecta la viabilidad celular del islote. DETA/NO induce a la necrosis en el 10% de las células islotes y la combinación de citoquinas, produce aproximadamente 40% necrosis. Es interesante destacar que la muerte celular inducida por el donante de NO se ve claramente contrarrestada por el Compuesto I, por ejemplo la Sal I (Tabla 1). La necrosis celular de islotes inducida por citoquinas decrece parcialmente debido al inhibidor c-Abl. Las frecuencias de células apoptóticas es inferior al 10% en todos los grupos (no se muestran los resultados).

TABLA 1 El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra la muerte celular de islotes inducida por NO y citoquina

Los resultados con media \pm SEM de tres observaciones separadas.

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Se determinan los niveles de nitrito de células incubadas con la combinación de citoquinas antes indicadas durante 24 horas, con o sin 1 ó 10 \muM del Compuesto I, por ejemplo, Sal I. La producción de óxido nítrico inducida por citoquina no se inhibe por el Compuesto I, por ejemplo la Sal I (Figura 1). Por el contrario, la producción de óxido nítrico en presencia de la Sal I es mayor, posiblemente debido a la mayor viabilidad de las células expuestas a la Sal I, 35%
más de nitrato liberado de células expuestas al cytoldne más el Compuesto I en comparación con las citoquinas solas.

Se prueba si el Compuesto I protege contra el fármaco diabetogénico estreptozotocina in vitro. En 0,4 mM de estreptozotocina, la protección es muy significativa, mientras que en 0,75 mM de estreptozotocina, el Compuesto I protege sólo un poco (Tabla 2). En 0,6 mM de estreptozotocina, el efecto protector del Compuesto I es intermedio.

TABLA 2 El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra la muerte celular de islotes inducida por estreptozotocina

El Compuesto I (10 \muM) se agrega 24 horas antes de la estreptozotocina. Los islotes se cultivan y fotografían seis horas después de la adición de estreptozotocina. Las células necróticas (núcleos rojos o rosados no fragmentados) se cuentan y expresan como porcentaje del número total de células. Los resultados son porcentajes de células necróticas expresados como media \pm SEM de tres observaciones separadas. ***, ** y * y denotan p<0,001, 0,01 y 0,05 utilizando la prueba pareada t-Student.

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Para investigar si el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, regula la muerte celular también en células islotes humanas, se incuban células islotes humanas durante 24 horas con o sin el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, (10 \muM), DETA/NO (2 mM) y Brefeldina A (10 \muM). Como se observó con los islotes de ratas, los islotes humanos también están parcialmente protegidos contra niveles tóxicos de NO (Figura 2). Por lo tanto, la Sal I contrarresta parcialmente la muerte celular de islotes inducida por Brefeldina B (estrés ER).

Para investigar si la c-Abl regula y/o si el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, también protege contra la diabetes inducida por estreptozotocina in vivo, se utilizó el siguiente procedimiento: Se adquirieron ratones machos NMRI, con un peso de aproximadamente 25 g de Taconic M & B, Sollentuna, Suecia. Los animales tienen acceso libre a agua de la llave y alimento en forma de gránulos durante todo el estudio. Las camas se cambiaron semanalmente. El peso y glucosa en sangre se determinaron utilizando el Pen Sensor (MediSense, Waltham, Massachusetts, EE.UU.) antes del experimento. A los animales se les suministró por sonda 200 microlitros del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, disueltos en 0,9% de NaCl 200 mg/kg de peso corporal durante tres días consecutivos (día -1, 0, 1). El día 0 se inyectó a los ratones 120 ó 160 mg/kg de peso corporal de estreptozotocina (Sigma-Aldrich Co, St. Louis, Missouri, EE. UU.) en la vena de la cola. La estreptozotocina se disolvió en 0,9% NaCl justo antes de la inyección. Se determinó el peso y la glucosa en sangre el día 0, 1, 2, 3, 5, 7, 9 en muestras de sangre tomadas de la cola. El día 9 los animales se sacrificaron mediante dislocación cervical. Toda la experimentación animal está aprobada por el Comité de Ética Animal local (Tierp, Suecia).

El tratamiento con el Compuesto I protege completamente contra la inyección de 120 mg/kg de estreptozotocina (Tabla 4). Además, el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege parcialmente contra la dosis más alta de estreptozotocina (160 mg/kg) (Tabla 3).

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TABLA 3 Efecto del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, en la diabetes en ratones inducida por 160 mg/kg de estreptozotocina

Los ratones NMRI son alimentados con 200 mg/kg del Compuesto I por sonda una vez al día los días -1, 0 y 1. El día 0 se inyecta 160 mg/kg de estreptozotocina en los ratones por vía endovenosa y se determina la glucosa en sangre los días que se indican en la figura. *, ** y *** denotan p<0,05, 0,01 y 0,001 vs STZ utilizando la prueba t-Student. La cantidad de observaciones fue de 5 (Salina y Compuesto I) y 10 (STZ y STZ + Compuesto I).

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TABLA 4 Efecto del Compuesto I en la diabetes en ratones inducida por 120 mg/kg de estreptozotocina

Los ratones NMRI son alimentados con 200 mg/kg del Compuesto I por sonda una vez al día los días -1, 0 y 1. El día 0 se inyecta 120 mg/kg de estreptozotocina en los ratones por vía endovenosa y se determina la glucosa en sangre los días que se indican en la figura. *, ** y *** denotan p<0,05 y 0,001, respectivamente, al compararlos con el grupo STZ correspondiente (prueba t-Student). La cantidad de observaciones es de 10.

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Diseño y métodos de investigación

1.: Identificar señales de muerte celular adicionales y factores de estrés que promueven la muerte de células beta humanas a través de vías inhibidas por el Compuesto I. Se tratan células islotes humanas con 10 \muM de Sal I, por ejemplo el Compuesto I, y se determina la muerte de células islotes en respuesta a los siguientes agentes citotóxicos: peróxido de hidrógeno (150 \muM; estrés oxidativo), estaurosporina (200 nM, inhibición de la PKC), FCCP (5 \muM; desligamiento y transición de permeabilidad de la membrana mitocondrial), Brefeldina A (10 \muM, estrés ER), tapsigargina (200 nM, estrés ER y Ca^{2+} aumentado y dexorubicina (2 \muM, daño al ADN). La muerte celular se visualiza mediante la tinción vital con yoduro de propidio y bisbenzimida seguido de microscopía de fluorescencia. Se utilizan islotes en grupos duplicados de 10. Este procedimiento permite la cuantificación tanto de la apoptosis como de la necrosis en islotes intactos. La técnica de tinción vital se combina con el ensayo XTT (una versión simplificada del ensayo MTT), que nos ofrece un ensayo de detección simple y rápido de la viabilidad de los islotes.

2.: Estudiar si el Compuesto I afecta el desarrollo de la diabetes tipo 1 en modelos de animales. Como se describió antes, el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, protege contra una inyección de una sola dosis de estreptozotocina. Para extender esta observación, se evalúa el rol de la c-Abl en el desarrollo de diabetes en el modelo de ratón negro/c57KSJ tratado con multi-estreptozotocina. Los tratamientos diarios con el Compuesto I (200 mg/kg del Compuesto I en 200 \mul al 0,9% de NaCl) comenzaron el día anterior al primer tratamiento con estreptozotocina (inyecciones de dosis bajas diarias de 40 mg/kg durante 5 días) y continuaron durante 10 días o dos semanas si hay diabetes manifiesta. El tratamiento se evalúa mediante mediciones diarias de los valores de glucosa en sangre.

\quad: Después de diez días o dos semanas, los ratones se sacrifican y se extirpan los páncreas y se preparan para análisis inmunohistoquímicos y morfométricos. Se califica la inflamación de islotes y la masa de células beta.

\quad: Se estudia la importancia de la c-Abl en la recurrencia de la enfermedad en ratones diabéticos no obesos, abreviado como ratones NOD. Se utiliza un protocolo similar al antes indicado. Sin embargo, en este caso el tratamiento con el Compuesto I se aplica a ratas hembras diabéticas NOD. Un día después de la primera administración del Compuesto I por sonda, se transplantaron 300 islotes aislados de los ratones NOD jóvenes bajo la cápsula renal. Después de siete días, se determinan los valores de glucosa y los ratones se sacrifican. En este punto, la mayoría de las células beta transplantadas han sido destruidas por las células inmunes activadas y puede detectarse cualquier supuesto efecto del Compuesto I en la supervivencia de las células beta. Los transplantes se recuperan y fijan para el análisis.

\quad: En tercer lugar, se estudia el efecto del Compuesto I en el curso natural de la diabetes en ratones NOD. Las ratas NOD de 4-5 semanas de vida, si no hay insulitas o hay muy poca, reciben bombas mini-osmóticas Alzet por vía subcutánea que liberan 0,25 \mul por hora durante cuatro semanas del Compuesto I concentrado o solo el vehículo. Tras cuatro semanas, los ratones se sacrifican y el páncreas se extirpa y se fija para el análisis inmunohistoquímico y morfométrico. Se califica el grado de insulitas y la masa de células beta.

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En vista de la posibilidad de que la inhibición farmacológica de la c-Abl pueda ser problemática, se intenta un enfoque genético. Con este fine, se aíslan islotes de ratones negros c57/KSJ y NOD y se dispersan células islotes mediante tratamiento con tripsina. Las células islotes se transducen con vector adenoviral recombinante en una MOI de 5 que dirige la transcripción de una molécula de siARN c-Abl específica. Como control se utiliza un vector adenoviral que codifique una secuencia de siARN aleatoria. Después las células se agregan nuevamente in vitro antes de la implan-
tación bajo la cápsula renal de los ratones singénicos. Los ratones se tratan y analizan como se indica más arriba.

Puede ocurrir que el vector adenoviral no sea adecuado para fines in vivo teniendo en cuenta su toxicidad inherente e inmunogenicidad. Se construye un vector AAV que expresa el mismo constructo siARN anti c-Abl. Se transduce aproximadamente el 30% de las células beta islotes mediante AVV cuando se dispersan in vitro (no se muestran los resultados). Esto es considerablemente menor que la eficiencia de transducción obtenida con vectores adenovirales, pero es lo suficientemente alta para evaluar la c-Abl en la destrucción de células beta in vivo.

Métodos y recursos

Islotes humanos. Se cultivan islotes humanos libres flotando en condiciones de cultivo estándar (5,6 mM de glucosa en RPMI1640 + 10% FCS).

Citometría de flujo y clasificación celular. La eficiencia se evalúa fácilmente con un citómetro de flujo (FACSCalibur, Becton-Dickinson) con capacidad de clasificación celular y utilizando la forma desestabilizada de la proteína verde fluorescente como reportera, y al mismo tiempo clasifica las células transfectadas para más experimentación o transplante. Por lo tanto, ya no es necesario confiar en la generación de clones seleccionados de células con insulinoma que expresan el transgen de manera estable (problemas con variación clonal). Pueden utilizarse células transfectadas de manera transitoria separadas de las células no transfectadas. Además, el citómetro de flujo también evalúa la viabilidad celular (tinción con yoduro de propidio) y apoptosis celular (anticuerpo anti-caspasa 3 inactivado). Además, el citómetro de flujo también se utiliza para clasificar las células beta de roedores, análisis del ciclo celular, potencial de membrana mitocondrial, producción de radicales libres de oxígeno y estudios de inmunofluorescencia (insulina, glucagón, Bcl-2).

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Ejemplo 2 Cápsulas con 4-(4-metil-1-piperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-[[4-(3-piridinil)-2-pirimidinil]amino]fenil]-benzamida metanosulfonato, forma cristalina beta

Se preparan cápsulas que contiene 119,5 mg de Sal I correspondiente a 100 mg del Compuesto I (base libre) como parte activa en la siguiente composición:

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Las cápsulas se preparan mezclando los componentes y rellenando la mezcla en cápsulas de gelatina duras, tamaño 1.

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Ejemplo 3 Estudios sobre los mecanismos que subyacen la protección inducida por el Compuesto I contra la muerte de células beta y diabetes in vivo

Antecedentes: Se sabe que el Compuesto I inhibe la c-Abl, una proteína tirosina quinasa de expresión ubicua con un peso molecular aproximado de 145 kDa. Bajo condiciones fisiológicas, la c-Abl ha mostrado participar en el control de las funciones citoesqueléticas, tales como la migración y estructura celular, y la progresión del ciclo celular. Sin embargo, cuando las células se exponen a diferentes formas de estrés, la c-Abl se vuelve altamente activada, lo que conduce al arresto del ciclo celular y apoptosis.

Resultados obtenidos recientemente: La c-Abl se expresa en células bTC-6 y en islotes aislados de ratas, y la inhibición de la actividad de la c-Abl, utilizando el agente farmacológico Compuesto I, produjo la protección contra la muerte de células beta inducida por estreptozotocina, citoquinas pro-inflamatorias o donantes de óxido nítrico. El Compuesto I, por ejemplo la Sal I, es un inhibidor selectivo utilizado clínicamente para el tratamiento de CML. Además de la c-Abl, se sabe que el Compuesto I inhibe oncogenes ABL, c-KIT, el receptor PDGFbeta y la ARG homóloga de c-Abl. Por lo tanto, es necesario mostrar que la Sal I lleva a cabo una remediación específicamente a través de la inhibición de la c-Abl. Las células b TC-6 por ende se trataron con siARN de secuencia aleatoria o siARN específico para la c-Abl. El siARN se introdujo en las células utilizando el reactivo Lipofectamina. Las células se sometieron a un seguimiento durante 1 ó 3 días, tras lo cual se aisló el ARN total. Se sintetizó cADN del ARN y se utilizó para amplificación con PCR utilizando iniciadores específicos para c-Abl (35 ciclos) y b-actina, es decir, beta-actina (20 ciclos). Los productos PCR se separan en un gel de agarosa y se visualizan mediante tinción con bromuro de etidio. No puede observarse c-Abl b en células 24 horas después del tratamiento del siARN (no se muestra). Sin embargo, a las 72 horas, aparece una banda de c-Abl. Estos resultados sugieren que el siARN dirigido contra la c-Abl media en la eliminación del mensajero a través del mecanismo de ARNi y que el efecto es sólo transitorio en células bTC-6 que proliferan rápidamente (no se muestran los datos). Habiendo establecido que los niveles de mARN c-Abl pueden disminuir con la técnica de ARNi, investigamos a continuación si las células bTC-6 deficientes en mARN c-Abl respondían a la combinación de IL-1\beta, IFN-\gamma y TNF-\alpha con mayor muerte celular. A diferencia de la situación que se observa en células islotes primarias, las células bTC-6 mueren como respuesta a las citoquinas preferentemente por apoptosis. Además, la muerte de células bTC-6 inducida por citoquinas es fuertemente contrarrestada por siARN específico a la c-Abl dos y tres días después del tratamiento (Figura 3). Esto indica que un recambio presumiblemente lento de la proteína c-Abl produce una demora en el efecto del tratamiento de siARN. Pero aún más importante es que los datos sugieren que la protección inducida por la Sal I contra un donante de NO y la combinación de citoquinas se ve mediada por la inhibición de c-Abl.

Conexión entre c-Abl y diferentes quinasas MAP: Se busca una conexión entre c-Abl y las diferentes quinasas MAP p38, JNK y ERK que puedan actuar como efectores de caída de vapor de la c-Abl. Con este fin, se pre-incuban islotes de ratas durante 24 horas con 10 \muM del Compuesto I y después se exponen a DETA/NO (2 mM) y la combinación de IL-1\beta, IFN-\gamma y TNF-\alpha durante 20 minutos. Los islotes de analizan para fosforilación de p38, JNK2 y ERK1/2 utilizando anticuerpos fosfoespecíficos y inmunotransferencia. El tratamiento con el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, contrarresta parcialmente (25-45%) la activación inducida por DETA/NO de p38, JNK y ERK, y aumenta la activación de MAPK inducida por citoquinas (Tablas 5 y 6).

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TABLA 5 Efectos del Compuesto I, por ejemplo la Sal I, en la activación de p38, JNK y ERK inducida por DETA/NO y citoquinas

Se pre-incuban islotes de ratas aislados durante 24 horas con 10 \muM del Compuesto I y después se exponen durante 20 minutos a DETA/NO o a las citoquinas IL-1\beta (50 U/ml) y IFN-\gamma (1000 U/ml). La fosforilación de p38, JNK y ERK se determina mediante inmunotransferencia y se expresa por cantidades totales de ERK, JNK y p38. Los resultados se expresan como porcentaje de control y son medias para 4 observaciones separadas. ** y * denotan que p<0,01 y p<0,05, respectivamente, al compararlas con el grupo correspondiente sin el Compuesto I utilizando ANOVA de 2 vías y la prueba t Student.

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TABLA 6

Los resultados de la Tabla 5 se calculan nuevamente para expresar los efectos del Compuesto I en porcentajes del grupo correspondiente sin adición del Compuesto.

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Estos resultados confirman que la producción de óxido nítrico inducida por citoquinas activa la JNK y p38 al menos parcialmente a través de la ruta de la c-Abl y que esto lleva a la muerte de células beta. Por otro lado, el aumento temprano de actividad de p38 y JNK que ocurre en respuesta a las citoquinas parece estar suprimido por la c-Abl. En esta situación, es probable que este primer pico en la actividad de p38 y JNK inducido por citoquinas represente una respuesta fisiológica que conduce a la expresión alterada de genes y mayor proliferación, y no a la apoptosis per se. Por ejemplo, se ha sugerido que la activación de p38 y JNK por citoquinas participa en la subsecuente expresión del gen iNOS. Este contexto, la supresión de p38 y JNK mediada por c-Abl que se observa aquí explica bien el aumento en la producción de óxido nítrico observado en islotes tratados con citoquinas y Compuesto I.

En vista de estos datos, la c-Abl actúa como un sensor de estrés y señales externas de muerte y la activación de c-Abl puede llevar a fosforilación y activación de JNK y p38 MAP quinasas y finalmente la muerte de células beta.

Experimentos adicionales:

1. Para estudiar la expresión de c-Abl en células beta. La expresión de c-Abl en mARN puede evaluarse a través de PCR en tiempo real. Los niveles de la c-Abl en mARN de los islotes se comparan con los de otros tejidos. Las sondas fluorescentes específicas para la c-Abl se adquiere de TIB MOLBIOL Syntheselabor (Berlín, Alemania) y las señales fluorescentes se cuantifican contra una curva estándar de c-Abl cADN utilizando el instrumento Lightcycler. La cantidad de moléculas c-Abl mARN se estandariza en moléculas de b-actina mARN. El contenido de c-Abl mARN de islotes humanos se compara con el del hígado, músculos, riñón, bazo, cerebro y pulmón. Paralelamente, se cuantifica la expresión de ARG tirosina quinasa similar a la c-Abl, que puede actuar en forma similar a la c-Abl. En este contexto, se determina si los niveles de c-Abl mARN se ven afectados por citoquinas, estrés oxidativo y estrés ER. Los islotes humanos se exponen a IL-1\beta (25 U/ml) + IFN-\gamma (1000 U/ml) + TNF-\alpha (1000 U/ml), 100 mM de peróxido de hidrógeno o brefeldina A (10 \BoxM) durante tres horas y después se analizó la expresión de c-Abl mARN mediante PRC en tiempo real.

2. Para estudiar si la c-Abl se fosforila en respuesta al estrés de células beta. Las líneas de células bTC-6 estables que sobreexpresan c-Abl de tipo fuerte se generan mediante lipofección de las células con un plásmido pCDNA3/c-Abl (obtenido del Ludwig Institute, Uppsala University), seguida de una selección para resistencia a la geneticina. Las células bTC-6 con sobreexpresión de c-Abl se exponen a IL-1, brefeldina A y DETA/NO durante 20, 60, 360 minutos para establecer si la c-Abl se fosforila en respuesta a las citoquinas, estrés ER y óxido nítrico. Las células después se homogenizan en presencia de inhibidores de fosfatasa y c-Abl se inmunoprecipita utilizando el anticuerpo K-12 c-Abl (Santa Cruz). Después de PAGE y transferencia de filtros de nylon, las bandas de c-Abl se analizan para la fosforilación de tirosina en el aminoácido 245 y fosforilación de tirosina total con dos anticuerpos c-Abl fosfoespecíficos (Tyr245 y Thr735) disponible en Cell Signalling Technology y el anticuerpo fosfotirosina 4G10. La actividad de c-Abl aumenta cuando los residuos aminoácidos Tyr245 y Thr735 son hiper-fosforilados.

3. Para estudiar si la localización subcelular de la c-Abl se ve afectada por estrés de células beta. Las células bTC-6 con sobreexpresión de c-Abl se cultivan en cubreobjetos y después se exponen a citoquinas, brefeldina A y un donante de óxido nítrico durante 6 horas. Tras la fijación, bloqueo y permeabilización, las células se analizan mediante microscopía confocal utilizando Mitotracker verde (sondas de moléculas), que tiñe la mitocondria de verde y el anticuerpo K-12 c-Abl (Santa Cruz), en el cual, con un anticuerpo secundario conjugado con rodamina, se tiñe la c-Abl de rojo. Si la c-Abl se re-localiza de ER a mitocondria, el patrón de tinción se cambia de rojo y verde separado a sólo amarillo.

4. Para identificar blancos cascada de c-Abl. Con este fin, se generan células CbTC-6 que sobre expresan transitoriamente el tipo fuerte o una forma activa constitutivamente de c-Abl. Las células bTC-6 se lipofectan (Lipofectamina + Lipofectamina plus) con el vector pcADN3/c-Abl y un vector con expresión de GFP. Esto da como resultado un 20% de células GFP-positivas, que se enriquecen hasta más de un 75% con FACS. Las células variadas se colocan en placas y cultivan durante 24 horas y después se analizan para fosforilación de los blancos candidatos ERK, JNK, p38, l\kappaB, p53 y AKT (efector cascada de P13K). Veinte y 120 minutos antes del análisis, las células se estimulan con doxorubicina (activación nuclear de c-Abl) o DETA/NO (activación citoplásmica de c-Abl) con o sin la Sal I, por ejemplo el Compuesto I.

Se analiza la fosforilación (ser/thr) de las supuestas proteínas blanco mediante inmunotransparencia utilizando anticuerpos fosfoespecíficos disponibles comercialmente (Cell Signal Technology). Esto revela si los efectores candidatos se fosforilan y activan en respuesta a la activación de c-Abl. Se analizan los niveles de Bcl-2, Bcl-X_{L} y Aph2 utilizando la técnica tradicional de Western blot. En algunos casos, la inmunoprecipitación de las proteínas candidatas a veces es necesaria para aumentar la sensitividad del análisis mediante inmunotransparencia. Para la fosforilación específica de tirosina, los efectores candidatos se inmunoprecipitan y analizan mediante inmunotransparencia utilizando el anticuerpo PY20 anti-fosfotirosina.

5. Para estudiar la interacción entre c-Abl y Shb:

Se inician experimentos para comprender la supuesta interacción entre la c-Abl y la proteína adaptador Shb. Shb es una proteína que contiene un dominio SH2 con motivos ricos en prolino en su extremo N terminal, un domino central PTB (con enlace con fosfotirosina), varios sitios potenciales de fosforilazión de tirosina y un dominio de C-terminal SH2, y se sabe que cumple un rol en la generación de complejos de señalización en respuesta a la activación de la tirosina quinasa. De manera interesante, aumenta la propensión apoptótica de las células beta con sobreexpresión de Shb. De hecho, los ratones transgénicos que expresan SHB bajo control del promotor de insulina en ratas mostró tasas elevadas de apoptosis cuando los islotes se cultivaron en ausencia de suero o en presencia de citoquinas citotóxicas. En vista de un informe reciente que indica que la Shd miembros de la familia Shb se une a/e interactúa con la c-Abl, es posible que la c-Abl actúe a través de interacciones con Shb en células beta. Para investigar esto, las células temporalmente transfectadas para sobreexpresar c-Abl, Shb o un mutante de Shb se tratan con peróxido de vanadato y después se inmunoprecipitan con un anticuerpo anti Shb. Después se lleva a cabo la inmunotransparencia en los inmunoprecipitados para analizar los niveles de c-Abl y Shb, y la fosforilación de tirosina de Shb coprecipitada con c-Abl. Hallazgos preliminares indican que la c-Abl coprecipita con Shb, y viceversa, y que la sobreexpresión de c-Abl produce un aumento de fosforilación de Shb (no se muestran los datos). Estos hallazgos apoyan la noción de que Shb es un substrato para la quinasa c-Abl.

Para comprender mejor la interacción entre c-Abl y Shb, se realizan experimentos de pull down de proteínas de fusión. Se permite que GST, GST-ShbSH2 y GST-ShbPTB/proteínas fusión que contienen un dominio rico en prolina interactúen con homogenatos de células COS que contienen altos niveles de c-Abl. Las reacciones se generan con o sin simulación de peróxido de vanadato, es decir, para ver la importancia de la fosforilación de tirosina c-Abl, y adición de fosfotirosina, es decir, para ver la importancia de la interacción del domino SH2 con residuos de fosfotirosina. Los productos de pull-down se analizan para c-Abl y fosfo-c-Abl mediante inmunotransparencia. Estos experimentos indican qué dominios de Shb son necesarios para el enlace de c-Abl fosforilado o no fosforilado. Se realizan los experimentos correspondientes utilizando la proteína de fusión c-Abl (c-Abl-SH2 y c-Abl-SH3) para evaluar qué dominios son fundamentales para el enlace de Shb.

Para establecer si la interacción de Shb-c-Abl media la propensión de las células islotes con sobreexpresión de Shb a sufrir apoptosis en respuesta a diferentes estímulos nocivos, se aíslan los islotes de los ratones Shb-transgénicos y se los expone a citoquinas, DETA/NO y estreptozotocina con o sin pre-tratamiento con el Compuesto I. La apoptosis y necrosis se cuantifican y los datos obtenidos de los ratones transgénicos se comparan con los de los ratones de control obtenidos en paralelo. Si los niveles mejorados de apoptosis y necrosis de los islotes Shb se ven normalizados por el Compuesto I, por ejemplo la Sal I, es posible que la interacción Shb-c-Abl sea una ruta esencial de regulación de apoptosis.

Instalaciones: ARNi. Se inician estudios para silenciar la expresión genética en células beta utilizando la técnica de ARNi. Se adquiere ARN de pequeña interferencia (siARN) de Dharmacon Research a un costo de 300-600 dólares estadounidenses por par de oligonucléotidos de ARN. Utilizando siARN marcado FITC, se observa que el siARN se introduce de manera eficiente en las células que producen insulina utilizando Lipofectamina o Lipofectamina 2000 (no se muestran los resultados). Desafortunadamente, el efecto del siARN introducido liposomalmente sólo es transitorio. Para producir vectores recombinantes adeno-asociados (AAV), se utiliza AAV Helper-Free Sytem (Stratagene). Este kit incluye plásmidos para la producción de vectores AAV que expresan beta gal utilizados para estudios preliminares de eficiencia de transfección. El trabajo con vectores virales ha recibido la aprobación de la agencia gubernamental sueca Arbetarskyddstyrelsen.

PCR en tiempo real. El instrumento lightcycler (Roche) es un ciclador para PCR en tiempo real. El aparato permite una cuantificación rápida y precisa de moléculas de mARN, y por lo tanto es adecuado para estudios de expresión genética.

Se proporcionan técnicas de microscopía confocal y microscopía electrónica.

Claims

1. Utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para la cura o prevención de la diabetes.

2. Utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para curar la diabetes.

3. Utilización de 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo para la elaboración de un medicamento para prevenir la diabetes.

4. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la diabetes es diabetes tipo 1.

5. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3 donde la diabetes es diabetes tipo 2.

6. Utilización según cualquiera de las reivindicaciones 4 a 5 donde la 4-(4-metilpiperacina-1-ilmetil)-N-[4-metil-3-(4-piridina-3-il)pirimidina-2-ilamino)fenil]-benzamida se encuentra en la forma de una sal de monometanosulfanato.