CN1031651A - 双链rna缺乏状态的诊断和治疗 - Google Patents

Abstract

本发明介绍了一种诊断患者dsRNA缺乏状态 以及通过加入足量外源dsRNA取代dsRNA而校 正所述缺乏状态的方法。

Description

本发明涉及dsRNA缺乏状态的诊断，以及加入适当分子构型的外源dsRNA以恢复其正常水平的方法。

已发现天然dsRNA在宿主防疫中未发挥各种作用时。一些诊断和治疗病毒疾病，一般的病原菌慢性感染和癌症形成的新方法，例如，艾滋病（逆病毒感染/癌症）的发展是与生物过程中逐步严重的机能障碍相关的，本发明人发现，这些生物过程是由dsRNA催化的，它不仅包括干扰素的合成，而且还包括有生物活性的2-5A的产生，RNA酶L活性以及各种细胞介导的免疫功能。本发明人发现，特定细胞中特定生物活性dsRNA的减少，或依赖于dsRNA的酶的减少，影响到疾病的发展。

涉及生物活性dsRNA的代谢途径中的缺乏状态是处在导致死亡的宿主防御系统中各种细胞损伤的中心。早先，本发明人从被HIV感染的ARC和艾滋病病人的淋巴细胞中测得一种RNA酶L的抑制剂，它只是细胞内dsRNA水平不正常的结果之一。用适当构型的合成dsRNA进行治疗可消除这种抑制剂，它解释为本发明人所观察到的部分临床反应，与象病毒浓度的减少以及目前医学上仍是难以滞愈的各种病毒血症病人体由免疫功能的恢复有关。相应地，本发明人现已完成了一综合发明，它可在对各种疾病划分过程中对各种dsRNA缺乏状态进行解释、定量测定和校正。本发明人也发现，某些dsRNA，如失配dsRNA，实际上可以取代天然存在的dsRNA，其功能在于帮忙维持正常细胞生长所必需的功能。如果不用合适的外源dsRNA对这种dsRNA调节的缺乏进行校正，就可能产生各种异常细胞病变，从而导致病毒和其它细胞内病原体慢性感染，减少免疫细胞的功能，使疾病最终呈慢性状态，也可能是自身的死亡。

临床手段：

病毒感染可能常常与免疫系统的部分紊乱相伴随，而这种紊乱是由各种试剂以及直接攻击免疫功能的病毒引起的。例如，艾滋病（获得性免疫缺陷综合症）是紧跟着人免疫缺陷病毒（HIV）感染T淋巴细胞，引起免疫系统逐步衰退而产生的（Coffin等，《Science》，232卷，697页，1986）。

确切地讲，应该注意HIV病毒存在不同的名称;LAV是从法国巴黎巴斯德研究所分离出的HIV病毒的名称，HTLV-Ⅲ是从美国马里兰州Bethesda国立卫生研究所分离出来的HIV病毒的名称。通常，HIV是用作病毒的普通术语。在本文中，HIV通常泛指或命名为HIV或HTLV-Ⅲ或LAV，而不打算区分它们。而且，说明书和权利要求书中的术语HIV包括与艾滋病的产生相关的所有其它病毒，不管是已被分离的，还是未被分离的。

HIV感染是一种渐进性的疾病，尽管从一种状态到另一种状态的转化率是可变的。被HIV感染的无症状个体可建立起一种具有淋巴结病特征的状态（LAS或前ARC）。病人逐步发展成与艾滋病相关的综合症，显示出T₄细胞缺损，继而表现出淋巴细胞经受抗原刺激的繁殖和产生IFN-γ能力的减弱，这些病人丧失了各种细胞介导的免疫功能，如迟发型皮肤超敏反应，实际上完全变为无反应。证明了宿主防御机制的破坏，包括带状疱疹感染，口念珠菌病（真菌性口炎）以及象持续性发热、盗汗性腹泻和失重等症状。最终，这些病人受到机会致病菌的严重感染（如卡氏肺囊虫），而被称为成熟的艾滋病患者，在12个月内有近似50%的死亡率。选择HIV病毒感染作为例子仅仅是因为其dsRNA缺乏的水平非常明显。许多其它疾病，包括无痛的病毒感染，同样与类似的缺乏有关。因此，本发明具有极其广泛的应用范围。

还有很重要的一点，即上面所指出的典型进程并没有说明HIV感染的患者或许多其它具有慢性疾病[如非洲淋巴细胞瘤病毒（EB）感染，肝炎病毒感染，巨细胞病毒、疱疹病毒感染等]的患者在临床症状方面的明显差异。各种患者中免疫系统组分的极大差异的速率衰退以及生物活性dsRNA的缺乏在这一过程中是一原因或影响因素。HIV感染可在各种不同类型的细胞（如血细胞，胶质细胞）中出现。某些患者出现神经性机能障碍，作为他们的第一症状。因此，各种患者可能具有极其不同的治疗要求，尽管所有患者都可能需要从T₄细胞中排除HIV。

在各种不同病毒感染（包括ARC患者）中出现的两个普通病理特征需要指出一下：免疫缺陷和进行中的病毒感染的聚集（Fauci，“Proc.Nat’l.Acad.Sci.USA》83卷，9278页，1986）。仅攻击免疫缺陷而不能控制病毒复制的治疗手法似乎起反作用，尤其当这种治疗活化了T₄细胞时更是如此。例如，具有Tac受体的T辅助细胞与淋巴因子IL-2相应答。在艾滋病患者中，IL-2引起HIV敏感细胞膨胀，疾病明显恶化。

直接攻击病毒感染（如HIV感染）所取得的明显成功尤其被命名为叠氮胸苷（AZT）的病毒逆转录酶抑制剂所证实，它能够减少，某些患者HIV的“负荷”，从而延长寿命。这种治疗法也不是不能产生所需的结果。在少数患者中，AZT也引起T细胞介导的免疫性的暂时恢复，它是通过T₄细胞的短暂升高以及迟发型超敏反应的出现而测得（Fischl等，《New Eng.J.Med》，1987年7月）。但是，当逆转录酶抑制剂达到产生明显的抗病毒效果的剂量时是有毒的，因此带来耐药力极差。抗病毒剂可能需要病人终生服用。

IFN作为一般抗病毒化合物或抗艾滋病药品都是无效的，这可能是因为它不是一种对于本发明人所揭示的dsRNA相关缺陷的解毒药。的确，ARC/艾滋病患者在IFN代谢途径中有各种“缺陷”，如产生有缺陷的、酸不稳性IFN，以及T细胞无力产生适量的IFNγ，这些都在医学文献中有完整叙述。本发明人早以得出结论，在ARC和艾滋病患者的各种与IFN相关的缺陷完全或部分与淋巴细胞中RNA酶L（一种末端途径介体）活性有关，这些在本发明人1987年3月3日递交的系列号为021，372的共同未决申请中已有叙述，在此引用以作参考。尽管ARC/艾辞病和其它慢性病毒血症患者的血淋巴细胞中依赖dsRNA的2-5A合成酶升高，但本发明人发现，在同一血细胞中真空2-5A水平下降，RNA酶L也下降（见下）。本发明人已将RNA酶L的低活性与能够和光亲和标记的2-5A类似物结合的Mr    80，000蛋白质的低数量相联。本发明与已被关闭且相关物缺乏的dsRNA途径和/或RNA酶L抑制剂相一致。

接种抗HIV和其它病毒的疫苗或使用被动抗HIV抗体也可以考虑分别用于病毒的预防和治疗，但都有明显的限制。例如，HIV（尤其系统感病毒）可以很容易地隐蔽感染细胞。在上面提到的专利申请中，本发明人也指出了dsRNA的一种作用，即增强抗一般病毒尤其是逆转病毒的抗体的形成。

本发明人在此叙述了一种新现象，它支持了这样一种观点，即双链RNA（dsRNA）组成了能够有效地抵抗由各种亚急性/慢性病毒感染（如HIV等）所带来的病毒和免疫缺陷的第一组分子。对这种缺陷的校正可达到类似激光那样的精确性，且对机体的其它功能没有不利影响，而对于现行用于治疗慢性病毒感染的方法来说这种不利影响是一个普通的缺点。本发明人认为，具有未解决的且无痛的病毒感染的患者常常在其重要的细胞内依赖dsRNA途径上存在特定缺陷，通过加入外源dsRNA可以恢复或至少部分改善这种缺陷（这在图1的流程中作了图表式的解释），且在治疗前或治疗期间监测这些途径，提供了一种调整个别患者或特定疾病所需的取代疗法中的dsRNA程度的有效新方法。

与宿主防御相关的关键酶需要dsRNA来表达生物活性。如果细胞内天然dsRNA水平太低可以通过加入外源dsRNA活化这些酶。dsRNA的多种行为部分来自于它诱导整个IFN-α、β、γ-合成的能力，它是通过一组细胞内介体来进行的，包括依赖dsRNA的蛋白质激酶、依赖dsRNA的2-5A合成酶和依赖2-5A的RNA酶L。如Lengyel所述，这些依赖dsRNA的酶是由于IFN而发挥许多生物学活性（《Ann.Rev.Biochem》，51卷，251页，1982）。例如，一种阻断2-5A合成酶表达的反义RNA的产生，可引起动物细胞对于不同病毒感染的深度敏感性（Bendetti等，《Prac.Natl.Acad.Sci    USA》84卷，658页，1987年）。dsRNA活化的蛋白质激酶使elF2磷酸化从而抑制蛋白质合成;它也具有降解病毒蛋白质的蛋白质水解活性。》84卷，658页，1987年）。ds活化的2-5A合成酶合成2-5A，后者活化RNA酶L，本发明人认为在抑制各种动物病毒如细胞生长控制中都发挥关键作用的一种途径（避免了肿瘤的形成）。2′-5′多聚腺苷酸是不正常的，在这种情况下，大部分dsRNA的正常3′，5′磷酸二酯键连接特性被获得了新的生物学特性的新型磷酸二酯键所代替。

dsRNA的抗病毒活性：

dsRNA是一种已知的抗病毒状态诱导物（Marcus等，《Nature》66卷，815页，1977）。与此类似，poly（A）：poly（U）不诱导IFN而产生抗病毒状态。但是，在本发明之前，并不知道存在天然dsRNA调节剂，从而也不知道实际dsRNA缺乏状态在人体中是普遍，尤其是与病原菌发作相关（病毒、真菌、原生动物、细菌侵入等）。

dsRNA的抗增殖活性：

本发明人早已发现，当在软琼脂上对100多个新鲜人肿瘤进行研究时，有42%的在仅一个细胞集落暴露于dsRNA后肿瘤细胞集落形成减少50%或更多（J.IFN.Res.6卷，373页，1986）。这些细胞缺乏dsRNA。本发明人也叙述了各种人肿瘤细胞系中的独立IFN和dsRNA敏感性，且发现在无胸腺小鼠中繁殖的人肿瘤对dsRNA敏感;dsRNA治疗对某些肿瘤（如肾的）有疗效，且动物活到预期的正常寿命（见公布的欧洲专利申请0，113，162）。在此，本发明人报道了一种临床反应和依赖dsRNA的酶活化之间的强烈相互作用，

dsRNA增强免疫活性：

本发明人早已报道（J.Immunol.，124卷，1852页，1980），dsRNA增强抗人白血病细胞的天然杀伤细胞（NK）的溶胞活性。dsRNA对NK强化的结构需要类似于它对于2-5A合成酶活化和IFN诱导的需要。

dsRNA介导的基因控制

Sullo等证实（《Cell》43卷，793页，1985），dsRNA在支撑成纤维细胞中诱导活性基因，包括被定名为fos和myc的致癌基因。这里所说的“活性基因”是指在调节细胞内关键行为如繁殖、生长等时需要其发挥作用的那些基因。被dsRNA诱导的IFN-β基因可利用一种调节蛋白，它在细胞暴露于dsRNA时被除去（Zinn等，《细胞》45卷，611页，1986）。本发明人也测得，对于生物活性来说，外源供给的dsRNA类似天然的、无病毒细胞内dsRNA，象与poly（U）复合的异源核RNA或mRNA。例如，本发明人最近发现，在海拉细胞核有一种可诱导IFN的dsRNA，它可在体外活化2-5A合成酶。远在动物进化周期后面向细胞免疫的出现明显地为IFN/dsRNA分子朝着完成细胞分化（尤其是由IFN促进的分化）方向进行建立了一个阶段。本发明人也获得了一个更全面的理解，即dsRNA能够完成由其它调节蛋白促进的分化，它为所定义的dsRNA缺乏状态建立了一个阶段。

图1是一流程图，显示了导致宿主发病和宿主恢复的双重途径;

图2是一曲线图，画出了如所示的IFN疗法开始前和开始后的天数对合成酶活性的关系;

图2B是一曲线图，比较了治疗120天后的白细胞数和失配dsRNA量。

图3是一聚丙烯酰胺凝胶电泳板的照片，显示出沿每条泳道的各种区和带。

图4是曲线图，比较了每立方毫升血液中T₄淋巴细胞的绝对数（以从基线变化的百分数表示）与治疗月数的关系。

本发明人在此叙述了一种新现象，它支持这样一种观点，即双链RNA（dsRNA）组成了有效抵抗各种亚急性/慢性感染（象HIV等）的病毒和免疫损伤的第一组分子。对这种缺陷的校正可达到类似激光一样的精确性，且对机体的其它功能没有不利影响，而这种不利影响恰恰是现行的治疗慢性病毒感染的方法的共同缺点。本发明人认为，具有未解决的无痛病毒感染的患者在依赖于dsRNA的细胞内关键途径上存在特定缺陷，它可通过外源加入使dsRNA恢复或至少部分达到改善（在图1的流程中已清楚解释），且认为，在治疗前或治疗期间监测这些途径，提供了一种调整个体患者或特定疾病所需的替换疗法中的dsRNA程度的有效新方法。

本发明提供了一种检测患者样品中dsRNA缺乏状态、定量分析这种缺乏（如果有的话）的诊断方法，也提供了一种恢复任何dsRNA缺乏的治疗方法，它以服用外源dsRNA（偶而与淋巴因子结合）为标志。通常，dsRNA缺乏状态在免疫系统的组成细胞中被证实，而不管这种组成细胞是否处在繁殖或分化过程。例如，通过免疫系统的组成细胞无力维持足量水平的生物活性RNA酶L，就可证实dsRNA的缺乏。治疗前、治疗期间和治疗后监测细胞内依赖于dsRNA的途径，使得临床医师能够根据个体需要调整dsRNA替换疗法的程度。估计dsRNA缺乏的其它方法在下面有详细说明。“介体”在此指能够影响dsRNA的存在而引起的特定生物化学功能的细胞内任何部分（如具体的多聚核苷酸，蛋白质，dsRNA一单独的或是结合的）。这些生化作用将从单个细胞或整个（机体）水平上增强宿主防御机制。

对本发明的治疗方法敏感的疾病一般是，与健康个别相比其细胞内dsRNA水平低于正常限度的缺乏，引起组织病变的dsRNA缺乏和/或与细胞内病原菌的存在偶联或共存的异常低水平dsRNA存在下的缺乏。更具体的疾病或组织病变和全身症状包括：如：逆病毒感染（包括HIV，疱疹科病毒，副粘病毒，鼻病毒）等病毒感染，肝炎和慢性疲劳综合症。还包括癌细胞的失控繁殖和免疫系统病变，而不管细胞是否处在繁殖或分化过程。

“失配dsRNA”是指互补链之间的氢键（碱基堆集）相对完整即在每29个连续碱基中平均只有一个以下的碱基被破坏的dsRNA。“失配”是指由于链的内陷（或外陷）产生容易被核糖核酸酶水解的部位，而导致RNA双螺旋的正常构型被破坏。也应相应地理解术语“失配dsRNA”。

dsRNA可能是含有一定比例的尿嘧啶碱基或鸟嘌呤碱基的多聚胞苷酸和多聚肌苷酸的复合物，如其比例从五分之一到三十分之一（poly I.poly（C_4-29X＞U或G）。

dsRNA可能具有通式r In·r（C₁₂U）n。下面讨论了其它合适的dsRNA的例子。

在一最佳失配dsRNA r In·r（C₁₂，U）n中，由6至12个碱基（即半个至1个完整RNA双螺旋）的未破坏链组成的区域既作为引起淋巴因子释放的生物触发器，也作为组成天然抗病毒途径的酶的专性细胞内辅助因子。由尿嘧啶残基组成的失配区定期插进多嘧啶链，以加速dsRNA水解，从而防止毒性产生。

最适用于本发明的失配dsRNA是从选自poly（Cn，G）的共聚核苷酸得来的，其中n是从4到29的整数。它也是多聚肌苷酸和多聚胞苷酸复合物的失配类似物，通过沿多聚胞苷酸（r（Cn）链加进未配对碱基（尿嘧啶或鸟嘌呤）对r In·r Cn进行修饰而形成。或者，通过对多聚肌苷酸（r In）的核糖基骨架进行修饰（如加入2′-O-甲基核糖基）从poly（I）·poly（C）dsRNA获得dsRNA。这些r In·r Cn的失配类似物，尤其是通式为r In·r（C_11-14，U）n和r In·r（C₂₉，G）n的类似物，在Carter和Ts′O的美国专利4，130，641和4，024，222中已有所述，在此引用以作参考。其中所述的dsRNA一般适用于本发明。在某些情况下，互补核苷酸双螺旋也可用于取代疗法。

用于本发明的失配dsRNA的例子有：

poly（I）·poly（C₄，U）

poly（I）·poly（C₇，U）

poly（I）·poly（C₁₃，U）

poly（I）·poly（C₂₂，U）

poly（I）·poly（C₂₀，G）

poly（I）·poly（C₂₉，G）

poly（I）·poly（Cp）₂₃G＞P

dsRNA-淋巴因子协同作用：

由于dsRNA通过IFN部分介导的特定淋巴因子系统在其生物中发挥显著作用，因此本发明人认为，它必须（a）在缺乏IFN缺乏细胞中诱导IFN，（b）活化相关的依赖dsRNA酶介体，细胞内dsRNA在外源施用IFN不起反应的细胞中是不可诱导的。

如果dsRNA仅通过IFN起作用，且如果dsRNA在细胞内是过量的，那么单独的IFN过量将发挥IFN和dsRNA结合时同样高的生物活性。但是，这是一种比较少见的情况，因为本发明人发现了许多dsRNA-IFN协同作用的例子，而很少发现无协同作用的例子。例如，dsRNA在抑制来自人膀胱癌、肺癌和纤维肉瘤的细胞的生长时与人IFNα、β或γ协同作用。本发明人将这些结果扩大到15个其它人肿瘤细胞系，只有一个细胞系不能显示抗繁殖协同作用。本发明人也发现，在移入无胸腺小鼠的某些人肿瘤中同样出现抗肿瘤协同作用。在临床上本发明人也同样观察到，作为对肾肿瘤和CML的抗癌方案，IFN和dsRNA的结合使用要比任何一种单独使用时优越。

dsRNA缺乏状态

作为一种原型途径，2-5A合成酶/RNA酶L途径包括一种或多种dsRNA，2-5A，连接酶和抑制剂。这在dsRNA和RNase    L之间存在一直接生化联系，其中依赖2-5A合成酶的产物2-5A是RNA酶L活性所必需的辅助因子。下面的例子列举了在dsRNA介导的途径中可能存在的几种缺陷，它可通过外源加入dsRNA而得以恢复。

图1的流程中显示了dsRNA的充足导致宿主复原和dsRNA缺乏导致宿主发病的关系。生物活性dsRNA是细胞内产生的，或是由某些事件引入的，它导致抗病毒状态，以及免疫细胞分化和宿主复原。

体外测定2-5A合成酶价值不大，因为这种检测没有反应出体内2-5A合成酶活性。因此，本发明人建立了一种新方法，从健康个体的外周血单核细胞（PBMC）中和失配dsRNA治疗前及治疗后从病原菌感染的患者中提取和测定2-5A的数量。2-5A的浓度可通过2-5A对于亲和纯的RNA酶L降解poly（U）[³²P]p Cp的活化能力而测定。

表    1

细胞内2-5A浓度和病毒感染患者

的PBMC提取液中2-5A合成酶

和RNA酶L体外活性

PBMC来源    失配RNase    L2-5A合成酶    细胞内    RNA酶L

周数 活性^a2-5A^b潜伏的^c，d活化的^d

栏    1    2    3    4    5

＃1    AIDS    0    49    ＜0.2    260    -    -

+    4    105    ND    -

KS    9    4    ＜0.2    -

15    10    1.8    ++

19    21    0.8    -

24    26    ＞10.0    ++++

28    20    ＞10.0    ++++

＃2    AIDS    -1    205    ＜0.2    240    -    -

+    0    180    ND    -    -

KS    4    117    1.4    +

+    8    19    2.4    +++

PCP    21    ND    6.8    ++

26    9    5.4    ++++

PBMC来源    失配RNase    L    2-5A合成酶    细胞内    RNA酶L

周数 活性^a2-5A^b潜伏的^c，d活化的^d

＃3    ARC    -6    11    ＜0.2    270    -    -

2    13    ND    -

4    19    ＜0.2    -

17    3    1.8    ++++

＃4    ARC    0    130    ＜0.2    270    -    -

2    185    ND    -

4    18    0.4    +

8    ND    ＜0.2    -

22    ND    ＞10.0    ++++

＃5    LAS    0    30    0.6    280    -    -

4    36    ＜0.2    -

9    12    1.0    ++

17    21    3.0    ++++

5    0.3-1.1    1350    ++++

健康志愿者

a    整合到2-5A的ATP纳摩尔数/在poly（I）∶poly（C）-琼脂糖检测中测得的蛋白质毫克数。标准偏差9%;ND-未测。

b    纳摩尔数/在核心纤维素检测（两份）中测得的蛋白质克数;标准偏差20%。

c    dpm/在放射结合检测（两份）（第3栏）中测得的50微克蛋白质;标准偏差20%。

d    在两次独立的rRNA断裂检测（栏4和5）中测得。形成的特定酶解产物（SCP）可通过凝胶照片的光密度追踪而定量测得，且以形成的SCP除以18S和28S    rRNA，再乘以100表示;-，0;+，10-13;++，31-63;64-85;++++，86-100。

方法

从10个健康个体和5个具有LAS、ARC和AIDS（由疾病控制中心定义）的男性患者体中获得肝素化的外周血。这项研究所涉及的5个患者的临床、病毒和免疫特性在本发明人的文章（《Lancet》，1987年6月6日）中已有鉴定，分别对应其中的10，8，1，7和2号患者。PBMC在Ficoll-Hupaque上分离。L929和HL929（一种缺乏RNase    L的L929的亚克隆）细胞维持在单层培养物上。L929和HL929的胞浆提取物在甘油缓冲液中制备，PBMC提取液在NP40溶解缓冲液中制备。提取液的蛋白质浓度范围从10-15微克/微升。KS：卡波济肉瘤;PCP：卡氏肺囊虫肺炎。

利用poly（I）∶poly（C）-琼脂糖在PBMC提取液中测定2-5A合成酶（栏1）的活性（每次50微克蛋白）。2-5A从PBMC提取液（100微克蛋白质）的乙醇可溶部分（70%乙醇，体积比）中分离。然后在20微升的水中冷冻和再溶解于乙醇提取的2-5A。在使用L929提取液（作为RNA酶L来源）的核心纤维素检测中，从利用真实2-5A获得的校对曲线可测得存在于PBMC提取液（栏2）中的细胞内2-5A的浓度。在这一检测中2-5A对RNA酶L的活化是基于poly（U）[³²P]p Cp向酸可溶性片段转化。在对照实验中（缺少2-5A），所加poly（U）[³²P]p Cp（1.3uci/nmole）的总17700dpm中的6500dpm保留在玻璃纤维过滤板上。当真实2-5A≤1×10^-10M时，poly（U）[³²P]p Cp降解0%;当2-5A＞1×10^-7M时，poly（U）[³²P]p Cp降解100%。潜伏RNA酶L水平通过两种途径测得：（ⅰ）同PBMC提取液中加入20，000dpm P₃A₄[³²P]p Cp后进行放射结合检测（每次检测50微克蛋白质（（栏3）。（ⅱ）在2-5A存在下进行核糖体RNA断裂检测（栏4）。将从L929细胞制备的提取液（每次检测150微克蛋白质）于30℃保温60分钟，其中存在5微升PBMC提取液的乙醇可溶部分和1×10M^-8P₃A₃（最终体积为20微升）。提取总RNA，变性处理，在1.8%琼脂糖凝胶上进行电泳分析。在紫外光下可见溴乙锭染色的RNA带。在所加2-5A缺乏情况下通过核糖体断裂检测可测定出活化RNA酶L水平（栏5）。

对于健康人来说，PBMC提取液中功能性2-5A的浓度为0.3-1.1纳摩尔/蛋白质克数;对于病毒感染的患者来说，在失配dsRNA治疗前，其浓度从低至不可测定到每克蛋白质0.6纳摩尔。但当失配dsRNA治疗后，积累的2-5A达到每克蛋白10.0纳摩尔以上。已报到，2-5A活化的部分纯化的RNA酶L主要打断poly（U），而不是poly（C）。分离的人2-5A，象真实的2-5A，能够活化来自健康人的L929细胞或PBMC的亲和纯RNA酶L，以特异性地降解poly（U），见表4。应当注意，当使用TCA从PBMC中提取2-5A时，除提取出poly（U）降解（RNA酶L）活性外，还提取出poly（C）降解活性。通过蛋白酶水解或乙醇进一步提取，可消除这种TCA可提取的poly（C）降解活性。在来自各种人PBMC的TCA可溶百分中发现了这种poly（U）可降解活性，但至今未在永久细胞系（如Hela    L929，HL929）中发现。在PBMC的乙醇可溶部分未测得poly（C）降解活性。

表3

dsRNA对由呼吸道合胞病毒感

染的CCL25细胞形成的感染中心的作用

失配dsRNA 感染中心^b减少的百分数

的浓度^a平板计数 平均计数

0μg/ml 49，44，15^＊，33 42.0

0.5μg/ml 38，36，26，16^＊33.3 21.7

1.0μg/ml    54，44，42，53    48.5    15.5

2.5μg/ml    37，32，24，30    30.8    26.7

5.0μg/ml    27，14，17，18    19.0    54.8

10.0μg/ml    1，1，7，5    3.5    91.7

25.0μg/ml    0，2，0，0    0.5    98.8

＊未用于计算平均计数的数据。

失配dsRNA的最高浓度[r I·r（C₁₂，U）n，25μg/ml]对CCL25细胞没有毒性。

（a）在24孔平板的四排孔中含有融合的CCL25细胞，在RSV感染细胞的平板培养之前1小时，将1.5ml含有上述浓度dsRNA的维持培养基再加到四排孔中。将无dsRNA的维持培养基再加到模拟处理的细胞中。

（b）在总体积为1ml，其中含有5×10⁵PFU的RSV（MOI＝12）情况下感染悬液中4×10⁴CCL25细胞。在37℃下2小时的温育过程中，随着细胞的周期性重新悬浮出现病毒吸附。最后，用维持培养基以1/100稀释悬浮液。取数份0.5ml的感染细胞悬液，直接加入到各试验孔中和各感染中心对照孔中。将0.5ml维持培养基加到细胞对照孔中。全部培养物于37℃，5%CO₂-95%空气下温育72小时，与甲醇混合并用吉姆萨氏染剂染色。在显微镜下计数空斑（感染中心）。

moi是指感染复数;即，可用于感染每个靶细胞的病毒粒子的大约数目。PFU是指空斑形成单位;即，通过计数病变细胞（死细胞）测得的病毒单位数目。

虽然已有关于2-5A存在于从未处理动物中分离出的组织中以及2-5A在用dsRNA处理过的小鼠组织中积累的报道，但是本发明人的报道是2-5A在人的组织中积累的首次报道。充分证实了真实2-5A可与RNA酶L结合并激活之使rRNA降解为具有高度特性的特异酶切产物（SCP）。因此，本发明人鉴定了从PBMC提取液中分离出的2-5A在rRAN酶切测定中的活性。经乙醇提取的2-5A通过RNA酶L产生的特异酶切图谱与在真实2-5A存在下所得到的图谱相同。这些结果表明给受病毒感染的病人静脉内注射失配dsRNA使得血细胞中的2-5A从低于检测的浓度开始显著增加。

RNA酶L的活性

在受HIV感染的个体中缺乏RNA酶L活性被进一步证实并扩展（表1，3，4，5栏）。基于2-5A活化RNA酶L对rRNA的酶切特异性的灵敏技术（Wreschner    et    al，Nucleic    Acids    Res.，Vol.9，pp.1571-1581，1981）可测定从少到1ml外周血中分离出的PBMC提取液中的活化RNA酶L。L929细胞系（HL929）的RNA酶L缺乏亚克隆提取液被用作核糖体的来源。用放射结合测定法测得受HIV感染病人的PBMC提取液中隐性RNA酶L的水平比健康个体中的隐性RNA酶L的水平低5-7倍（表1，第3栏;240-280dpm对1350dpm）。WU等人已报道了类似的观察结果（AIDS    Research，vol.2，pp.127-131，1986）。对于用失配dsRNA治疗的病人中隐性RAN酶L水平的测定，放射结合测定的应用受到限制，因为存在于这些病人的PBMC样品中的2-5A积累（表1，第2栏）能竞相与RNA酶L结合。因此，2-5A活化RNA酶L水平的测定是必不可少的。

首先，在没有外源2-5A加入情况下通过测定rRNA由PBMC提取液的特异性酶切，来测定活化RNA酶L水平（表1，第5栏）。利用这一测定方法，证实了在治疗之前受HIV感染病人的PBMC提取液中的RNA酶L未被激活（如图3的聚丙烯酰胺凝胶电泳所示）。由于得知了在这些PBMC样品中胞内2-5A水平低（表3，第2栏），所以这一结果不是出乎预料的。然而，所有受试健康个体的PBMC提取液都显示出活化RNA酶L的存在，在rRNA酶切测定中产生特异酶切产物，尽管在某些健康个体中的2-5A低至0.3纳摩尔/蛋白克（表3，第5栏）。值得注意的是在治疗之前受HIV感染的病人样品中RNA酶L活性的缺乏不能归于所报道的2-5A竞争性抑制剂的积累（Caylet    et    al    European    J.Bioch.，vol.143，pp.165-177，1984）。通过真实2-5A的加入能使RNA酶L活性得到恢复（表1，第4栏）。

其次，通过两个独立的测定方法测定了隐性RNA酶L的水平。在rRNA特异性酶切测定中测定了隐性RNA酶L活性，但其中加进了2-5A（表3，第4栏）。在失配dsRNA治疗前所取的样品中，在5位待检测病人的任一位中都不能测出隐性RNA酶L活性。

采用P₃A₄[³²P]pCp光亲合标记技术进一步测定在受HIV感染病人的PBMC中RNA酶L是否缺失或改变。以前的光亲合标记研究已经鉴定出具有象RNA酶L一样对P₃A₄[³²P]pCp结合亲合力和特异的poly（U）内切核糖核酸水解活性的Mr 80，000的蛋白质。用P₃A₄[³²P]pCp测定了存在于PBMC提取液中的RNA酶L的亲合性标记。得自正常个体之PBMC提取液的RNA酶L（50μg蛋白）与ARC病人（在失配dsRNA治疗之前的病人）进行比较或在有或没有真实P₃A₄（1×10^-8M）存在的情况下，加入P₃A₄[³²P]pCp（30，000dpm，3000 Ci/mmole）之后光标记L929细胞提取液（50μg蛋白）。在2-5A核心纤维素上纯化得自正常个体之PBMC提取液的RNA酶L（100μg蛋白）并在加入P₃A₄[³²P]pCp（30，000dpm;3000Ci/mM）之后进行光标记。在0℃下温育90分钟后，将样品转移到冰冷的瓷滴试板上并用254nm UVG-11 Mineralight灯（Ultraviolet Products），以2cm的距离（1.0J/m²）光解3分钟。确定蛋白标志物和Mr 80，000RNA酶L的位置。

本发明的光标记研究表明P₃A₄[³²P]pCp与健康人PBMC提取液中蛋白质共价相连（聚丙烯酰胺凝胶数据未示出）。然而，在受病毒慢性感染病人的PBMC提取液中蛋白质未被标记。在相同的试验条件下，在L929细胞提取液中，M80，000的蛋白质被特异性地光标记。将P₃A₄（1×10^-8M）加入到含有P₃A₄[³²P]pCp的温育混合物中防止了光标记，从而进一步证实了光标记是对RNA酶L高度特异的。对用核心纤维素法从健康人的PBMC提取液中提纯的蛋白质的光标记研究揭示了与Mr 80，000蛋白质的共价连接，在真实2-4A存在时能够降解poly（U），但不能降解poly（A），poly（C）和poly（G）（见表4）。这些结果放在看可进一步证实从健康个体的PBMC中提纯并用P₃A₄[³²P]pCp光标记蛋白质。

用失配dsRNA治疗4-17周之后，先检测5位慢性感染病人的PBMC提取液中的活化RNA酶L;到失配dsRNA治疗17-28周时，这5位病人的活化RNA酶L活性与在健康个体中所观察到的RNA酶L水平相同（表1，第5栏）。活化RNA酶L水平与从相同样品中分离出的功能性2-5A的浓度密切相关（表1，见第2栏与第5栏的比较）。最令人感兴趣的是，在28周内1号病人维持一个升高的胞内2-5A水平并使RNA酶L完全活化，在失配dsRNA治疗后3周停止（表1，第2和5栏）。

这里所述的试验表明5位受HIV感染的病人在血液单核细胞中具有共同的分子表型：低水平的2-5A和缺乏可测的RNA酶L活性。健康个体的血液单核细胞水平显示出不同的表型，其中2-5A平均水平较高，并易于检测RNA酶L活性。后一表型与功能2-5A合成酶/RNA酶L途径的预期结果更为一致。在正常个体中，2-5A的稳态库是可测的;大部分该胞内2-5A变得与RNA酶L紧密相关，从而可激活RNA酶L。在本文所述的试验步骤中，清楚地证实了在受病毒慢性感染的病人血液单核细胞中，2-5A的胞内水平低于测定标准，用现有技术测定没有活化RNA酶L。

总之，这里的重大发现在于用失配dsRNA治疗克服了在2-5A合成酶/RNA酶L途径中的缺点。由于通过将2-5A加入到PBMC提取液中不能恢复RNA酶L的体外活性，所以不能简单地通过没有2-5A时RNA酶L蛋白质的正常水平来解释本结果。RNA酶L蛋白质很可能缺乏或受到抑制，因缺乏被2-5A光亲合性标记类似物的结合性进一步证实了推断。在这里所述的受治疗病人中，在10～20天内PBMC中的HIVRNA水平降低并且受HIV感染的PBMC的感染中心（共培养）数目更加缓慢地下降。在此所测得的胞内2-5A和RNA酶L活性的增加与在这些病人中感染中心的丧失更加一致。该结果清楚地表明在用失配dsRNA治疗数周后，2-5A合成酶/RNA酶L途径在受HIV感染的病人中比在健康人中更有效。因此该结果与某些慢性病毒感染表示dsRNA缺乏状态（通过供给外源生物活性dsRNA可使这一状态逆转）的假设完全一致。

通过下列说明性实施例可进一步描述本发明，其中所有的份数和百分比除非另外指明均为重量比。

实施例1

协同IFN和dsRNA处理

dsRNA缺乏状态是其中经IFN处理的肿瘤细胞显示一点点或不显示IFN诱导的生长停滞的状态。这是一种dsRNA缺乏的功能性或操作试验，如果需要的话，可用各种下述的生化测定法进一步确证。在许多情况下，“dsRNA缺乏”的临床诊断将随着本发明更广泛的实施变得完善。已知IFN^γ肿瘤细胞在IFN受体中非常缺乏并可含有高水平或低水平的介体，但在每种情况下都发现它们对供给的外源dsRNA反应。这些例子具有临床相关性，因为它们表明dsRNA将扩大特别是IFN以及其它淋巴激活素，例如，IL-2，各种集落刺激因子和TNF的治疗范围。慢性骨髓性白血病（CML）是一个恰当的例子。大约60%的CML病人只对IFN反应，而40%的病人不反应。后者不能诱导血液单核细胞（MNC）中的2-5A合成酶，如Rosenblum等人在“癌症研究”第46卷，第4848页（1986）中所述。图2-A表示IFN抗性病例，在该例中在单独用IFN处理一段短时间（7天）后用失配dsRNA加上IFN处理，然后用失配RNA与IFN联合处理。该病人在只接受IFN时不能诱导2-5A合成酶活性，但径IFN和失配dsRNA联合处理该介体的活性的确大幅度增加。在化疗之前由阻断所引起的血细胞数目瞬时增加以后，2-5A合成酶的诱导作用伴随着持续数月之久的完全血液学缓解。RNA酶L活性也得到了测定并发现其比正常情况高10～100倍（图3A，泳道1），体外产生的RNA酶解产物表明除了正常RNA酶L的通常rRNA酶解产物以外的进一步降解。在用IFN/dsRNA结合治疗30天以后RNA酶L活性恢复到正常水平和酶切轮廓（图3A，泳道2），在这里注意到定期观察到这种反应。

实施例2

T₄细胞的病毒感染

另一种dsRNA缺乏状态是动物病毒本身（或其复制中间产物）为介体活化提供抑制dsRNA或部分生物活性dsRNA的状态，尽管IFN和它的介体可被病毒感染所诱导。在宿主中许多与慢性症状学相关的病毒都将属于这一范畴。T₄细胞受HIV感染也可构成如图1所示的情况。在组织培养中失配dsRNA可有效地阻断T₄细胞中HIV的复制（见本发明人已公开欧洲专利申请0，213，921号），尽管在这些相同细胞中HIV的复制仅受到α，β或γIFN（单独或生理混合物）适当抑制。由于HIV RNA本身显示相当大的二级结构，不能阻断其自身表达，因此不同的dsRNA可能引起不同的生物反应。在HIV mRNA5′末端广泛dsRNA结构的一个区域使被怀疑为HIV处理（tat）蛋白的Mr15000多肽结合（Muesing et.al.，Cell，vol.48，p.691，1987），我认为失配dsRNA可与HIV RNA竞争tat蛋白。支持有效HIV感染的性质，以及其它慢性病毒血症，在ARC和AIDS中可能是第二种dsRNA缺乏状态。

实施例3

HIV感染细胞

第三种dsRNA缺乏状态是在患有慢性病毒感染（如在ARC和AIDS中的HIV）的个体之血液淋巴细胞中观察到的。Preble等人（J.Infect.Dis.，vol.152，1985）报道了这些细胞具有高水平的dsRNA依赖2-5A合成酶，本发明人进一步证实了这一发现。这一结果在所研究的一系列连续的ARC和AIDS患者中具有典型性，就dsRNA在宿主痊愈中的中心作用和用合适来源的外源dsRNA替换dsRNA缺乏状况的必要性而言，这一结果有助于形成本发明的基础。

本发明人报道了RNA酶L在ARC和AIDS患者中经常缺失（1987年6月6日，The    Lancet）;但本发明人报道了RNA酶L在某些病例中经失配dsRNA治疗数周后能够恢复到更加正常的活性。如图3B，泳道4所示，ARC淋巴细胞提取液在某些条件下能够抑制正常RNA酶L的活性。由于三氯乙酸（TCA）和乙醇可溶性提取液缺乏抑制活性，所以在ARC患者的MNC中所观察到的可转移抑制剂可能是Williams等人所述的在疱疹感染细胞中的抑制剂（Virology，vol.151，p.233，1986）。同样，在到目前为止所研究的健康个体之MNC提取液（泳道5）中也始终未看到抑制剂。

由于失配dsRNA直接作用于这些细胞，所以它们也必定是dsRNA缺乏的。因此，本发明人已证明不同的dsRNA具有不同的生物活性（HIV    dsRNA是抑制性的，而失配dsRNA则不然）。看来得自ARC和AIDS患者的淋巴细胞在仅仅执行某些必需dsRNA依赖性功能的意义上说是dsRNA缺乏的。除非加入外源dsRNA，至少一种功能，即维持生物活性RNA酶L的足够水平，不能被执行。

实施例4

慢性疲劳综合症

需要适宜替换治疗的dsRNA缺乏的一个实例是慢性疲劳症（CFS），是涉及到大约1千万到1千2百万美国人，难于诊断，普遍存在的病症，其特征为极度疲劳，淋巴腺增大和体质症状（如体重减轻，无食欲等）。这种状况最初出现于年轻，有活力的人。尽管某些CFS患者显示出神经精神病学变化（如抑郁，记忆丧失和类似的紊乱），慢性疲劳症有时还是难于与整个神经病学病症，特别是抑郁症区分开。各种实验室研究表明许多不同的病毒可在患有慢性疲劳症的个体中复制，而且这些个体实际上成为“病毒下水道”。病毒（如EB病毒，细胞肥大病毒，逆转录病毒，疱疹病毒等）常常存在于这些个体中。

在正常个体和患有慢性疲劳症的病人中，2′-5′A分子的体内浓度，即胞内dsRNA水平的生化相关的精确测量，评价方法如下：用2′-5′A核心纤维素测定法[亲合层析（用poly U-｛³²P｝-p Cp）]分析病人样品乙醇可溶性部分（Ficoll-Hypaque纯化的外周血淋巴细胞中2′-5′A的含量。在该测定中，利用2′-5′A活化RNA酶L水解poly（U）的能力测定功能性2′-5′A的浓度。

通过测试15位无近期病毒感染史（如不发烧，无体质症状，未出疹等）的正常人确定参照值。用真空2′-5′A分子得到校正曲线，借此测定其淋巴细胞2′-5′A水平的浓度。正常个体参照值以2′-5′A的毫微摩尔数表示，每克PBMC细胞为0.3到1.1毫微摩尔。

利用这种测定方法，测试了10位显示通常的慢性疲劳症症状的病人，所得结果如下：

表2

每克淋巴细胞蛋白质中含

病人编号    2′-5′A的毫微摩尔数

1    ＜0.08

2    ＜0.05

3    ＜0.05

4    ＜0.05

5    未测

6    未测

7    ＜0.01

8    ＜0.01

9    ＜0.01

10    ＜0.08

患有慢性疲劳症的病人每克淋巴细胞蛋白质中的2′-5′A一般低于0.1毫微摩尔并总是低于大约0.2毫微摩尔。对于这种患有慢性疲劳症的患者可通过按照需要供给外源dsRNA来治疗，直到2′-5′A寡核苷酸的胞内水平达到表明胞内dsRNA水平恢复到正常状态和/或病人的临床复合症状减轻。通过不断测定病人的胞内2′-5′A寡核苷酸水平并按需要供给外源dsRNA以维持2′-5′A水平在正常范围内（通常每克淋巴细胞蛋白质中0.2毫微摩尔以上的2′-5′A）来维持病人对慢性疲劳症和机会病毒的抗性。

在低抗病毒性疾病（如慢性疲劳症）时，天然dsRNA在宿主防御方面起一定作用。生物活性dsRNA，或依赖于dsRNA的酶，特别是RNA酶L的病毒相关抑制剂的特异性减少与外周血淋巴细胞中异常低水平的2′-5′A有关，其中特异性细胞有助于疾病的发展。dsRNA，特别是失配dsRNA，可抑制疾病的发展。

患有慢性疲劳症患者的治疗方法是静脉内滴注200～600mg（依疾病的严重程度和受病毒感染的程度等而定）的r I·r（C_11-14，U），每周两次，随着临床的改进1′-5′A的水平增高。dsRNA的给药量和给药频率将根据所测得的与病人的临床改进相关的2′-5′A水平而定。dsRNA的给药量在给药后立即于远离滴注点处测定应为每毫升病人系统血液循环中含0.01～1，000微克dsRNA。

实施例5

对T₄细胞群体的抗病毒作用

外源给予dsRNA，特别是失配dsRNA可恢复受病毒感染的病人对病毒攻击的反应能力。作为病毒疾病的一个例子，选择HIV作为一种最有破坏性的病毒。HIV感染的第一靶细胞是T₄淋巴细胞，随着病毒感染的加剧，T₄淋巴细胞群体显著减少。此外，T₄细胞群体的减少是一个讨厌的，可确定病情的参数，它的下降可反映疾病的恶化。反之，T₄细胞群体的增加是表明治疗方法有所改进的一个有利的诊断指征。

健康个体的正常T₄细胞群体是每立方毫米血液含400个细胞。测定了39位诊断患有前ARC或ARC患者（见图4）并根据每mm³血液中T₄细胞的绝对数将其分成三类：（a）大于300（18位患者，数据未示出）;（b）150-300（13位患者）;和（c）小于150（8位患者，平均为92）。静脉滴注100-200mg r In·（C₁₂，U）（Ampligen

），每周两次，对（b）和（c）组患者治疗3到16个月（平均为8.4个月）。为了比较，给出了得自未经治疗的HIV感染患者（181位）的T₄细胞群体数据（相连的三角形），在这些个体中显示出T₄细胞群体在其它方面不可避免的下降。

基线是开始治疗前起始绝对T₄淋巴细胞浓度。如图4所示改进情况是以该基线的正、负变化百分数表示的。开始观察患者并测定T₄细胞浓度。在图4中以空心圆连线表示的（b）组患者T₄细胞浓度在150到300个细胞/mm³范围之内。这些患者最初接受100mg（预防量）Ampligen（静脉内滴注，每周两次）并观察逆反应，然后将剂量增加到200mg，以同样频率给药。T₄细胞浓度小于150个细胞/mm³的第二组病人（c）给300mg Ampligen（静脉内滴注，每周两次）。以连接实心圆的线表示基线的变化百分率。如连接三角形的线所示，未经治疗的患者（181人），绝对T₄淋巴细胞继续明显减少。

30位患者在4个月后平均T₄细胞增加4.3%，10位患者在8个月后增加8.0%，6位患者在12个月后增加17%。只有2位患者（平均基线T₄＝82个细胞）尽管接受连续的r In·（C₁₂，U）n治疗还是患了爱滋病，另一位中止治疗2个月的ARC患者患了卡波济氏肉瘤。

这些数据表明绝对T₄淋巴细胞水平小于150个细胞/mm³的受感染个体需要有效量的药物以减慢T₄细胞减少的速度;然而，在150-300范围内的患者有效地维持在较低剂量的水平。这些数据也强调在HIV患者的状况大幅度下降之前开始治疗的重要性。

这些数据进一步表明dsRNA亏空数量（通过绝对T₄细胞群体间接但精确地测定）与校正缺陷和使病人完全康复所需的外源dsRNA的量（使T₄细胞群体恢复到接近轻度感染和未感染个体的T₄细胞群体量）之间的直接关系-T₄亏空越多，使之恢复所需dsRNA的量就越大。

实施例6

双链RNA（dsRNA）取代法治疗付粘病毒感染

需用适当的替换法治疗的暂时性dsRNA缺陷的另一个例子可发生在新生儿和婴儿发育的不同时期，这时人体的免疫系统尚未发育完全。在这些情况下，潜在威胁生命的感染是从青春期和成人期自我限制感染出现的。一个特定的例子如下：付粘病毒族的一些成员如：呼吸道合胞病毒（RSV）可引起抗病毒免疫系统发育不全婴儿（一般为6-18个月）的急性毛细支气管炎。这种情况下，用dsRNA[r In·r（C₁₂，U）n]替换治疗是急救措施，否则将导致死亡。

为发展这一新方法，在本试验室标准条件下培养了人羊膜衍生的命名为CC125的细胞株。CCL25株（从ATCC，Maryland    USA得到的）以与人新生儿细支气管组织类似的形式支持RSV的生长和繁殖。附表说明用人类可耐受的99%的dsRNA剂量可减少RSV的繁殖。

表4

从人PBMC分离的2-5A和

RNA酶L对同质聚核糖核苷酸的活性

RNA酶L    PBMC    L929细胞

来源    降解%a    降解%a

聚（U）-    聚（C）-    聚（U）-    聚（C）-

（³²P）pCp （³²P）pCp （³²P）pCp （³²P）pCp

真实2-5A    84    0    93    0

从PBMC    34    0    45    0

分离的2-5A

a：三次独立测定的平均值，标准偏差为20%。

方法：将从健康人PBMC提取液（100μg蛋白质）或L929细胞纯化的RNA酶L在核心纤维素试验条件下，有poly（U）（P）pCp（11000dpm，0.10μCi/mmole）或poly（C）（³²P）pCp（12400spm，0.33μCi/nmole）参于下，加入真正2-5A（P₃A₃，5×10^-7M）或从经过9周失配dsRNA治疗后的5号病人PBMC提取液（12.5μg蛋白）提取的2-5A后温育。poly（U）（³²P）pCp和poly（C）（³²P）pCp是用T₄连接酶（Bethesda Research Laboratories产品）从poly（U）或poly（c）（Sigma产品）和（³²P）pCp（Amersham产品合成得来的。在对照试验中（无P₃A₃）3300dpm的poly（U）（³²P）pCp和1000dpm的poly（C）（³²P）pCp被保留在玻璃纤维滤器上，作为没有降解（0%）。

由于RSV诱导的感染中心的形成涉及病毒直接从细胞到细胞的传播，我们可简便地提高dsRNA细胞内的浓度而有效地降低RSV在细胞间的传播，但对人体组织又无明显的不利影响。

因此，由其它潜在自我限制的病原体如：RSV（付粘病毒族）及其它影响鼻/气管/小支气管树的产生RNA病毒如：鼻病毒或流感病毒引起的病理学是在dsRNA替换治疗机制的范围内。病厚体侵入的局部门户如：导气管（但不限于此）可在内部暂时地降低dsRNA含量（这里的dsRNA可被定义为任何能触发有关免疫/抗病毒防御连锁反应以阻止病原体的繁殖/组织诱导病理学的分子）。

实施例7

最近两三年有文献报道艾滋病毒感染的病人引起的肝病。重新提到大量直接针吸活组织检查和尸解时检查样品的组织学发现。下面提及的所有研究中，美国防病中心（US    Centrer    for    Disease    Control，Atlanta，Georgia，USA）制定的诊断艾滋病标准是令人满意的。出现的典型症状及发现病人有肝病的信号完全是非特异性的，其它症状还包括体重减轻，高烧，淋巴结病，肝脾大和腹痛。大多数艾滋病人血清转氨酶升高。碱性磷取酶不成比例地升高说明这种升高与肉芽肿疾病的诊断有关。未选择病人的尸解研究（没有偏见的选择病人是与选择肝脾大肝功高的病人进行活检相对立的）说明了肝内的病理学。对艾滋病人80-90%例尸检说明均有肝解剖学异常。肝组织破坏包括血管充血，入口肿大，脂肪变性，病灶坏死，肉芽肿，胆汀滞，肝硬变和枯否氏细胞增生（以几何级数），在一项研究中令人感兴趣的结果是尸检时卡波济氏肉瘤肝内诊断是最常见的特异性肝内病原体（18%）（见Schneiderman等人，Annals    lnternal    Med.，Vol.105，p207，1987）。

近来有报道在少数艾滋病人中有胆病症状。个别病例报道有关艾滋病人有硬化胆管炎，肝内破坏性胆管损伤和良性肝外胆阻塞。这些病例没有特异性病原，活检发现细胞巨病毒可能是其病因。有良性肝外胆阻塞症状的艾滋病人主诉还有肝四分区右上方疼痛及中度胆红素升高等症状。在尸检和腹壁部分切除术中进行纤维变性继发的十二指肠乳头诊断。在至少两例肝外阻塞中，从胆管树中分离出Cryptospoidia。其它病例在十二指肠乳头中发现细胞巨病毒侵染体内。在上述肝内胆管炎病人中特异病原是未知的，特异病原体可能只引起这些症状的病理变化。

我们还确定了用dsRNA注入[r I·r（C₁₂，U）n，200mg，每周两次，静脉内滴注]校正或有效改善了与乙型肝炎病毒（HVB）增殖有关的潜在的细胞异常。具体用下列方法进行：

估价血清或血浆中的HBV-特异DNA：用糟吸印杂交测定与HBV DNA有关的血清（或血浆）的存在，它作为乙肝病毒的指示剂。将血清样品用NH₄OAC稀释到终浓度为1M。用72孔的微滤器（schleicher & schuell，Keene，N.H.）将样品直接载于硝化纤维素滤纸上，该滤纸先用1M NHOAC浸泡10分钟。用碱将DNA原位变性，再中和。用正常人血清稀释纯化的HBV DNA，以定量测定每个糟吸印杂交同样方式测该血清稀释液。烘干滤纸，预杂交，杂交，在高度约束条件下洗涤，在标准条件下放射自显影（Mariatis，T.，Fritsch，E.F.和Sambrook，J.，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，1982）。用于杂交的HBV探针DNA得自含一个单位长克隆在EcoRI点的HBV DNA拷贝（HBs AG血清型adw2）的重组质粒。用EcoRI酶解该质粒，再用两次制备性琼脂糖凝胶电泳再电泳洗脱来纯化该HBV DNA。根据随机引物标记技术（Feinberg，A.P.和Vogelstein，B.Analyt.Biochem.，132：6-13，1983）用³²P-dCTP标记的HBV DNA使其比活性为1-2×10⁹cpm/μg。该试验的敏感水平是1pg的HBV DNA。根据这个敏感水平，我们探测到2.9×10⁵个分子的HBV DNA。

估计放射自显影照片的相对密度并根据观察到的密度以数字评级，结果列在下表中。括号是治疗天数。

表4

施用dsRNA对体液中HBV浓度降低的效果

1号病人（施用天数）    2号病人（施用天    3号病人（施用天

样品号    治疗后吸印的密度    数）吸印的密度    数）吸印的密度

T＊    3+（0）    3+（0）    3+（0）

1    3+（20）    3+（21）    3+（31）

2    3+（64）    2.5+（42）    3+（72）

3    3+（106）    2+（56）    3+（86）

4    2+（162）    2+（84）    3+（115）

5    2+（219）    1.5+（140）    2+（170）

6    2+（266）    1（180）    2+（227）

7    1.5+（310）    1，5+（270）

8    1+（353）    1.5+（296）

9    1+（400）    1.5+（324）

10    1+（450）    1.5＝（387）

T＊＝0（予处理）

+是指在含³²P的病毒DNA中暴光5天的X-射线胶片的相对密度。较大的带加号数字（如：3+对1+）表示更密，在X射线胶片上取印糟更大，即说明有更多的病毒DNA存在。

为加强病毒测量的敏感性，用不同稀释度的病人血清，常用的有1∶40，1∶200，1∶40和1∶1，500。用糟吸印量密度仪验证其结果。基于Schleicher和Schnell提供的试剂（材料命名为No370    2/284）。用病毒特异性抗原分析得到补充的结果（测定人血清或血浆乙肝表面抗原的免疫试验），药盒可从阿伯特实验室得到（Abbott    Laboratories，命名为83-0804/R12，1985，7）。

由于本发明结果已公知，并进一步开发和应用于附加条件/感染/疾病，所以不用靠试验室资料及本发明人在本申请文本中推出的科学洞察力和新颖性即可将其用于dsRNA缺陷的临床诊断。很多不明显的dsRNA缺陷症也可包括其中，如：由于天然IFN作为增殖途径的反馈抑制因子（Aullo等人，Cell，Vol.43，p793，1985），又由于依靠dsRNA介体可补充，从而正分化的细胞或潜在成癌/转移的细胞均可是dsRNA缺陷的。

从上述例子可看出通过有关生物机能（如：细胞对外源IFN的反应）或生化机能（如：提高的2-5A合成酶）或出现2′-5′寡腺苷取代中间体等，我们可很容易地诊断出dsRNA缺陷症和用下列各种方法测定紊乱的程度：

（1）测定内源2′-5′寡腺苷酸浓度

（2）从高压液相色谱得到的病人样品定量分析2-5A的浓度和分子量

（3）用核糖体RNA切割试验证实病人体内合成的2-5A的生物机能。

（4）用2，′，5′-P₃A₄｛³²P｝-3′-pCp结合试验测定病人样品中游离核糖核酸酶L的水平

（5）用polyU-｛³²P｝-p Cp进行纤维素芯试验（亲合层析），根据病人样品中合成的2-5A测定核糖核酸酶的活化特异性。

（6）核糖体RNA酶切割试验，根据病人样品中合成的2-5A测定激活的核糖核酸酶水平。

这些方法已详述在我的专利申请题为“在体液中制作宿主防御介体”系列号No028，823，于1987年8月12日递交，和“用双链RNA矫正紊乱代谢途径”，系列号No074，649，于1987年7月17日递交，它们均列在参考资料中。

双链RNA充足状态也可以存在。如：CML和茸毛细胞白血病（HCL）对作为唯一治疗的IFN常有应答，反应了细胞内天然dsRNA充足。为支持增长观点，我们发现从未治疗的HCL病人得来的单核血细胞核中2-5A合成酶激活的dsRNA与用IFN治疗过的海拉细胞的核中的水平相似。

失配dsRNA：然而很多dsRNA可诱导不同的淋巴因子，包括IFN和激活的2-5A合成酶，但不是所有dsRNA都有这些性质。在合成的dsRNA中，poly（I）∶poly（C）是IFN和2-5A合成酶最好的诱导因子，然而也是毒性很大的。被称作“失配dsRNA”或Ampligen CHEM Research，Inc.，Rockville，Maryland，USA）的poly（I）∶poly（C₁₂，U）在聚嘧啶链中含有周期性的尿嘧啶残基。失配导致迅速的生物降解但不丧失生物功能。例如：poly（I）∶poly（C₁₂，U）显示抗病毒，抗肿瘤和加强免疫活性的功能，但无毒。

在广谱病毒和癌治疗中将dsRNA用作替换治疗：

失配dsRNA特别适用于慢性病毒感染，包括治疗ARC，因为它说是广谱抗病毒剂，又是免疫加强剂;既使用高剂量也基本上无长期毒性。我的45个病例，用200-250mg poly（I））∶poly（C₁₂，U）静脉注射，每周两次，显示了病毒浓度CHIV，CMV和泡疹急剧下降，持续加强T和B细胞免疫而又无付作用。很多病人临床效果持续约18个月，或随着继续的dsRNA治疗而延长（100-400mg，每周两次）。某些情况下，可能需用较大剂量或用的更频。艾滋病人病毒感染和免疫损伤因人而异，没有单一药物可逆转所有潜在的临床问题。然而，dsRNA在各种治疗方案中可能起到枢钮作用。例如：由于失配dsRNA与AZT协同作用，封锁T₄细胞的HIV感染（见我的共同未决申请No028，823），失配dsRNA和非常低用量的AZT在治疗包括ARC在内的感染可是一个重要组合。dsRNA和IL-2加强T细胞，NK细胞和LAK细胞活性都体现两种生物活性物质协同作用而又没有附加的毒性。进而还预见到，在IFN加强B细胞和单核细胞分化范围内，某些淋巴因子可以增强dsRNA促进特异性中和抗HIV抗体的能力及单核细胞杀生能力。与此相似，由于树脂样增加T₄细胞数目和用IFN促进T和B细胞分化，dsRNA和树脂样组合可对ARC和AIDS额外有益。dsRNA和胸腺多肽结合也可有T₄细胞恢复效果，特别是对T₄细胞数目很低的病人尤为有效。最后，dsRNA还显示抗卡波济肉瘤细胞增殖的直接抗增殖活性，加IFNα或IL-2可增强该活性说明这是一种新的抗癌途径。控制艾滋病血细胞参数显示增加的CNS问题。要想解决这个问题，用以足够量失配dsRNA跨过脑血障，激活脑实质细胞中寡2′-5′腺苷合成酶，从而结合dsRNA和包括淋巴因子的其它因子可跨过脑血障。用于与病毒有关的痴呆。淋巴因子可理解为包括干扰素，优选的是α-干扰素，白细胞介素，具体地说是白细胞介素-2（IL-2），重组白细胞介素2（rIL-2）和肿瘤坏死因子（TNF）。还包括暴露于淋巴因子应答中动物形成的淋巴因子激活杀生细胞（LAK）。

当α干扰素用作淋巴因子时，要要0.01～100，000IRU/ml病人体液。当用IL-2，特别是rIL-2作为淋巴因子时，施用量为10²-10⁶IL-2单位/kg病人体重，最高值为接近毒性水平。然而，最有效又能控制毒性的值为10³-10⁴IL-2单位/kg体重。

dsRNA通常施用量使每ml病人体液达到0.1到1，000μg    dsRNA水平。术语“体液”是指含血清，盐，维生素等在机体中循环浸在组织中的溶液。两种制剂（dsRNA和淋巴因子）同时施入时，它们可以混合物形式，或同时但分别施用，或先后施用。

dsRNA与淋巴因子“结合”施用包括以治疗混合物形式一起施用这两种药剂，也包括同时但分别施用这两种药剂。

图1流程图表示典型dsRNA缺陷导致宿主病态和dsRNA充足导致宿主康复。细胞内产生的生物活性dsRNA或由某些病毒（如：EMC）引入的活性dsRNA触发了一系列酶反应产生淋巴因子，激活介体，从而导致抗病毒状态及免疫细胞分化，从而使宿主康复。由各种病毒（如：HIV）或肿瘤细胞引入的dsRNA作为抑制剂可通过激活搅乱这一途经。生理活动可限制dsRNA产生或引起异常dsRNA的产生。这些异常导致慢性感染和宿主病态。在HIV和其它慢性病毒感染中，由于抑制了核糖核酸酶L（作为补充的途径给出）也可导致免疫功能消失，但可通过供给合适构型的外源dsRNA克服这一缺陷。

图2A和2B表示在MNC或CML病人中用失配dsRNA诱导2′5′寡腺苷酸合成酶。单独用IFN处理CML病人7天（图2A）再用失配dsRNA和IFN结合处理（见图2B）。在处理前或处理期间在Ficoll纯化的MNC中测定合成酶活性。

图3A是聚丙烯酰胺凝胶电泳平板照片，标出了泳道号和每个泳道的带或区。该平板上显示出在CML病人的MNC中与新酶解产物有关的提高了的核糖核酸酶L活性。提供rRNA而非核糖核酸酶L的匈牙利L929细胞根据布达佩斯条约被保藏在美国典型培养物收集中心，贮藏号为ATCC    NoCRL9659;L929细胞作为CCL1被贮存，而从CML病人得到的MNC是根据Kariko和Ludwig及Silverman等人方法制备的。根据本发明人共同未决申请No074，649，（于1981年7月17日递交）描述的方法测定从MNC中提取的核糖核酸酶L，揭示的细节见参考资料。

图3B也是一个聚丙烯酰胺凝胶电泳平板照片，表示在rRNA酶解试验测定时ARC病人PBMC萃取物中存在核糖核酸酶L抑制剂。L929细胞萃取物（它既提供核糖核酸酶也提供rRNA）和MNC可分别根据Kariko和Ludwig和Lujdwig及Silrerman等人的方法制备。

第一泳道18μl    L929细胞萃取物（150μg总蛋白）在有用于MNC溶胞的4μl    NP40缓冲液加5.5μl水时温育。

第二泳道：与泳道一相似，只是用5.5μl 5×10^-8M真正P₃A₃代替水。

第三泳道：与泳道一相似，只是将5.5μl溶于TCA的ARC病人的MNC萃取物（100μg总蛋白）在温育前先加入。

第四泳道：用4μl    ARC病人的MNC萃取物（100μg总蛋白）和5.5μl水温育18μl    L929细胞萃取物。

第五泳道：用4μl得自健康人的MNC萃取物（100μg总蛋白）和5.5.μl水温育18μl    L929细胞。指出了28S和18SrRNA以及正常水平的2′5′A激活的核糖核酸酶L特异酶解产物。

Claims (24)

1、一种诊断患者中dsRNA缺乏状态的方法，且如果缺乏的话，注入足量外源dsRNA以替换dsRNA，从而校正所说缺乏状态。

2、如权利要求1所述的方法，其中RNA缺乏状态是由于免疫紊乱，病毒感染，或失控癌细胞繁殖。

3、如权利要求2所述的方法，其中成因病毒是逆转病毒，副粘病毒，鼻病毒，或疱疹病毒科的病毒。

4、如权利要求1所述的方法，其中dsRNA缺乏状态存在于免疫系列的组成细胞内，而不管组成细胞是处在繁殖还是分化过程。

5、如权利要求1所述的方法，其中dsRNA缺乏状态的预期诊断是基于病毒、癌或免疫紊乱对于另外以合适或生理量注入淋巴因子最初无反应或部分反应而做出的。

6、如权利要求5所述的方法，其中预期诊断被象2-5A途径中间体的生化测定或宿主防御所涉及的其它生化途径所证实，且显示被天然dsRNA部分或完全调整。

7、如权利要求1所述的诊断dsRNA缺乏的方法，它包括首先注入充够量的合成dsRNA，以模仿健康人中天然dsRNA的预期浓度，然后测定在任何dsRNA介导的途径中是否有任何阳性变化，或测定临床状态的参数，以作为所说注入的结果。

8、如权利要求1所述的方法，其中dsRNA替换疗法是用配对dsRNA完成。

9、如权利要求1所述的方法，其中dsRNA替换疗法是用失配dsRNA完成。

10、如权利要求9所述的方法，其中失配dsRNA是由多聚肌苷酸和含有一定比例的尿嘧啶或乌嘌呤碱基（从1/5到1/30）的多聚胞苷酸组成的复合物。

11、如权项9所述的方法，其中失配dsRNA为r In·r（C_11-14）n。

12、如权项9所述的方法，其中dsRNA含有键断裂区，且显示了r In·r（C_11-14）n的可观治疗率性质。

13、如权项9所述的方法，其中失配dsRNA是以导致每毫升人初生物液中产生1-1，000微克dsRNA且在人的次级或分隔液中产生相应量的dsRNA诱导的介体物质的量服用。

14、一种改善由与细胞内病原菌共存的dsRNA的缺乏引起的人组织病变的方法，它包括供给外源dsRNA给患者的受损组织，以恢复细胞内dsRNA水平。

15、如权利要求14所述的方法，其中病原菌是病毒，或癌细胞的失控繁殖物。

16、如权利要求15所述的方法，其中病毒病原菌为逆转病毒，副粘病毒，鼻病毒，或疱疹科病毒。

17、如权项14所述的方法，其中组织病变发生在所有免疫系统的组分上，而不管组成细胞是否处在繁殖或分化过程。

18、如权利要求1所述的方法，其中一种淋巴因子与外源dsRNA结合服用。

19、如权项1所述的方法，其中dsRNA替换疗法是用配对dsRNA完成。

20、如权项1所述的方法，其中dsRNA替换疗法是用失配dsRNA完成。

21、如权项9所述的方法，其中失配dsRNA是多聚肌苷酸和含有一定比例尿嘧啶或乌嘌呤碱基（从1/5至1/30）的多聚胞苷酸的复合物。

22、如权利要求9所述的方法，其中失配dsRNA为r In·r（C_11-14）n。

23、如权利要求9所述的方法，其中dsRNA含有键断裂区，且显示了r In·r（C_11-14）n的可观治疗率。

24、如权利要求9所述的方法，其中失配dsRNA是以导致每毫升人初级生物液中产生1-1，000微克dsRNA，且在人的次级或分隔液中产生相应量的dsRNA诱导的介体物质的量服用。

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