CN100562586C - 检测hbv复制和测试药物敏感性的方法 - Google Patents

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Abstract

可能在有药物产品优选地抗病毒剂存在的情况下，用于测量HBV复制能力的方法，例如存在于生物样品中的HBV。该方法包括：(a)可能地提取包含在生物样品中的核酸；(b)使用至少两对引物进行PCR以扩增HBV的核酸，所选的两对引物能够获得至少两个不同的HBV基因组扩增片段，这两个片段通过组装代表了一个线性连续的、能转录出pgRNA的DNA序列；(c)将由(b)中获得的片段克隆入载体，该片段处于异源启动子控制下，于是就产生一个包含一段线性连续的、在所述启动子控制下能转录出pgRNA的DNA序列的载体；(d)用所述载体转染或转导感受态细胞；(e)在允许从克隆的HBV DNA合成HBV pgRNA的条件下培养转染或转导的细胞；(f)可能地用药物产品特别是抗病毒剂处理培养细胞；并且(g)确定HBV的复制能力，可能地确定药物产品优选地抗病毒剂对于病毒基因表达和/或病毒复制的影响。

Description

检测HBV复制和测试药物敏感性的方法
本发明涉及复制型HBV DNA基因组的克隆，涉及有可能在某一药物产品(特别是抗病毒剂)存在的情况下测量HBV(例如存在于生物样品中的HBV)复制能力的方法。特别地，本发明涉及允许检测HBV对药物的敏感性或者用以筛选对付HBV的药物的表型检测。
更特别的是，本发明涉及用以确定存在于病人体内的病毒株系对可获得药物的敏感性的方法并且由此针对病毒学状况量身定制抗病毒的治疗方法。
本发明亦涉及扩增中使用的引物，引物对和试剂盒，以及包含有复制型HBV DNA基因组的载体和细胞，例如，用这种载体转染的细胞系。
尽管开发了有效的疫苗，在世界范围慢性肝炎B型病毒(HBV)感染仍然是一个主要的公共卫生问题。事实上，超过4亿人是该病毒的慢性携带者并且有很高的风险会发展成(肝)硬化和肝细胞癌。
HBV是一种通过逆转录酶行为模式来复制其基因组的DNA病毒。病毒逆转录酶的自发错误率导致异质的HBV基因组。举例说明后一点，现已鉴定出8种基因型(A到H)，并且已描述了在感染的自然过程中或是治疗过程中选择出来的HBV突变体。
近来，随着能抑制病毒聚合酶的核苷类似物的开发，已经在抗病毒治疗慢性B型肝炎领域取得重大进展。因此，拉米夫定在二年前已得以批准，现今在世界范围内被广泛地应用于临床实践。尽管它能显著地抑制病毒复制，但是在病人中观察到在病毒聚合酶保守结构域中具有突变的抗药性突变体，以从治疗的第一年为15％增加到治疗的第四年达75％的流行趋势出现。由于这些突变体可能对人类健康展现新的威胁，必需有新的抗病毒剂来抵抗它们。于是，近来已针对其它抑制剂，例如阿德福韦二匹伏酯，恩替卡韦，恩曲他滨，克来夫定和telbivudine，在实验模型中的抗HBV性质进行了研究，并且目前在临床实验上对它们进行评估。然而，体外研究已显示拉米夫定抗性株系可能对这些药物中的一些药物(如恩曲他滨)具有交叉抗性而同时对另外一些药物敏感。该观察结果保证了对体内病毒群体的紧密监控并且强调了发展药物抗性检测方法(或表型检测方法)。
因此，了解每个病人的病毒株系对可获得药物的敏感性并由此针对病毒学状况量身定制抗病毒疗法在将来的临床上是很重要的。
迄今为止，还没有开发出针对HBV的有效的表型药物敏感性检测方法。随着目前和将来新的抗HBV分子的开发，在对感染了抗性HBV分离株的病人的治疗上，表型药物敏感性检测应该会成为一个重要的议题。
HBV进入细胞的机制还没有被完全阐明。脱去外壳后，HBV DNA被带入到宿主细胞的细胞核内，在那里它得以修复成共价闭合环形式(cccDNA)。一旦再环化后，增强子和启动子的活性启动产生各种HBVRNA转录物。有一些亚基因组转录物充当表达X蛋白和表面蛋白的mRNA。一个更大的基因组转录物在长度上比一个基因组更长，并且用来生产蛋白质e、核心蛋白和聚合酶蛋白。并且一种编码e蛋白但缺少ATG起始密码子的特定基因组转录物被称作前基因组RNA(pregenomic RNA)(pgRNA)。这个作为模板通过逆转录酶合成HBVDNA的pgRNA在长度上(即大约1.1个基因组单位)比一个基因组还长，并且因此拥有一段末端冗余RNA链。该冗余序列包含约200个核苷酸(包含有正向重复1(DR1)和茎环结构)。详情参见G-H Wang等人(Cell 1992，71：663-670)，G-H Wang等人(J.Virol.1993，67：6507-6512)。
当在体外研究HBV突变体时，使用包含有在细胞转染后启动HBV复制所必需的基因组信息的质粒型载体。这样的质粒是复制型的。这些质粒包含有从1.1到2倍的HBV基因组。研究突变体的经典方法依靠良好建立的复制型HBV构建体(仅为实验室株系，非临床株系)的定点突变或依靠将来源于临床分离株的HBV基因组片段导入(即“盒式交换”)复制型HBV构建体(同上)。例如PCR介导的HBV基因组盒转移或在良好建立的复制型实验室株系内进行定点突变允许确定下列：抗病毒治疗期间，病人体内选择出来的一些突变体的确赋予了对1拉米夫定的抗性(Seigneres B.等，Hepatology 2002，36：710-722；Pichoud C.等人.，Hepatology 1999，29：230-237；Allen M.l.等人.，Hepatology 1998，27：1670-1677；Bock C.T.等人.，Gastroenterology 2002，122：264-273)。然而这些方法不允许研究来自临床分离株系的完整HBV遗传信息，并因此排除了一些位于基因组其他部位的重要突变或造成镶嵌型HBV基因组的重要突变。
Günther等人(J.Virol.1995，69，9：5437-5444)曾第一次描述了用PCR扩增全长HBV基因组(即一个基因组单位)的方法，该方法意在方便天然HBV分离株系的分析。该全长扩增物既可以直接用作对肝细胞瘤细胞系的转染实验又可在使用前对它进行克隆。两个途径都涉及一种非常昂贵而低效的限制性酶Sap-I(得自New EnglandBiolabs)的使用。转染的全长基因组在细胞核内通过宿主的酶(有待确认)得以环化，产生出共价闭合环状HBV DNA，所述共价闭合环状HBV DNA是HBV基因转录的天然模板。在这种情况下使用内源HBV启动子进行转录。同样的方法被S.Günther等人(J.Clin.Microb1998，36，2：531-538)使用。宿主介导的线性HBV DNA的环化过程是非常低效的，因而代表了该方法在分析所有HBV突变体时的一个主要限制。由于产生HBV环形模板的水平低，HBV DNA合成(复制)水平也低。这种低水平HBV DNA复制阻碍了对病毒复制的分析和药物敏感性检测。关于Günther方法的其他限制是细胞转染所必需的大量的扩增产物和缺少“容易使用”的、用于细胞转染和表型研究的、源源不断的材料资源。尽管在基础研究上这个方法具有吸引力，但在标准的表型检测情形下似乎是不合适的，标准的表型检测要求有可靠的复制水平和在细胞培养基上生产出易于检测到的病毒颗粒的量。
M.Schories等人(J.of Hepatology 2000，33，799-811)描述了从病人分离得到的HBV突变体的分子特征，所述HBV突变体通过对交叠区域两次PCR扩增而获得。在鉴定一个目的突变体后，应用亚克隆策略(参考上文“盒式交换”)将该突变种插入实验室HBV株系的背景。所得克隆包含二个HBV基因组。
P.P.Ulrich等人(J.of Medical Virology 1990，32：109-118)描述了通过对环状DNA扩增从病人分离出的一个HBV突变体的分子特征。通过测序检测出突变。为了在体外对这些突变对HBV复制和HBeAg的表达的影响作生物学估计，用克隆好的重新环化的突变体HBV DNA转染HepG2细胞。这篇文献教导可以通过PCR扩增一个完整(一个单位)的HBV基因组，并且其在体外是复制型的。W.E.Delaney等人描述了包含1.3倍HBV单位基因组、允许感染真核细胞并在这些细胞中产生1.3倍基因组的杆状病毒载体的构建。
这些以前的出版物所描述的大部分工作基于诱变或盒式交换策略(片段的克隆或亚克隆)。在所有的情况中，构建的载体使用内源启动子并且克隆(或亚克隆)方法不包含对来自样品中的HBV DNA进行快速和标准克隆的方法。因此，它们不能应用于临床检查或药物敏感性检测。
J.Kruining等人(J.Hepatol.1995，22：263-267)描述了HBV稳定转染的细胞系。这些细胞系用来测试药物，但不涉及测试针对临床HBV突变体的药物。
于是仍旧需要一种有效的，特别是在临床检查上允许估量HBV复制能力和检测HBV分离株系对药物的敏感性和/或检测药物对HBV的抗病毒活力的方法。
本发明的一个目的是提出一个快速的和可重复的从病人样品中克隆复制型HBV DNA基因组的克隆方法。
本发明的另一个目的是提出一个快速和可重复的表型检测方法，该方法允许测试HBV分离株系对药物的敏感性。特别地，这个目的意在确定病人体内病毒株系对可获得药物的敏感性并且由此针对病毒学情况量身定制病毒疗法。
本发明的另一个目的是提出一个允许在体外快速产生可用于表型分析或功能分析的HBV复制型克隆的方法。
本发明还有另一个目的是提出一个快速和可重复的检测方法，该方法允许检测目前和将来的药物对特定HBV或HBV变种或HBV野生分离株系的抗病毒活性。
本发明还有另一个目的是提出一种允许研究野生型和突变型HBV复制能力的方法。
本发明还有另一个目的是允许产生组成型生产HBV颗粒的细胞系。
本发明基于将含有超过全长HBV基因组的HBV DNA(即克隆大约1.1个基因组单位)克隆入载体，因此转染细胞后，可以从该DNA合成pgRNA。随着病毒基因表达，该pgRNA在宿主细胞内的合成启动了HBV在细胞内的周期，它包括细胞内复制中间体的合成，该中间体包括单链DNA，双链线性DNA，松弛型环状DNA和少量存在的复制型中间体。本发明允许快速克隆复制型HBV DNA基因组。于是在待评估的抗病毒剂存在或不存在的情况下，有可能估计HBV DNA在细胞内的合成水平，例如通过Southern印迹法，或估计RNAs的合成水平，例如通过Northern印迹法，或估计病毒蛋白质的表达水平，例如通过Western印迹法，ELISA或RIA。在待评估抗病毒剂存在或不存在的条件下，也可以分析病毒产生的水平，特别是通过使用Southern印迹或实时PCR方法或类似方法测量细胞外培养基或上清液中病毒粒子DNA或Dane粒子的水平来分析病毒产生的水平。
于是本发明的一个首要目的就是一个可能在有药物产品特别是抗病毒剂存在的情况下测量HBV(例如存在于生物样品中的HBV)复制能力的方法，该方法包括：
(a)可能地提取包含在生物样品中的核酸；
(b)使用至少两对引物进行PCR扩增HBV的核酸，所选的两对引物能够获得至少两个HBV基因组扩增片段，这两个片段代表超过全长的HBV基因组，并且通过组装代表了一个线性连续的、能转录出pgRNA的DNA序列；
(c)将由(b)中获得的片段克隆入载体，所述片段处于启动子控制下，优选地处在异源启动子控制下，于是就产生一个包含一段线性连续(长度约为1.1倍基因组单位)的、在所述启动子控制下能转录出pgRNA的DNA序列的载体；
(d)用所述载体转染或转导感受态细胞(susceptible cell)；
(e)在允许由克隆的HBV DNA合成HBV pgRNA的条件下培养转染或转导的细胞；
(f)可能地用药物产品特别是抗病毒剂处理培养细胞；并且
(g)确定HBV的复制能力，可能地确定药物产品(特别是抗病毒剂)对于病毒基因表达和/或病毒复制的影响。
生物样品可能来自病人。它可以是血液或血清样品，但也可以是任何体液或肝脏活体组织检测样品，或由此产生的任何制品。所述生物样品也可以来自病毒培养物。其可以是细胞培养上清液。总的说来生物样品可以是含有一个或几个HBV克隆的任何类型的样品。
步骤(a)提供了从生物样品中提取DNA的方法。其可以通过任何常用的方法制备。这些方法可以包括柱层析纯化，特别是亲和层析，和/或蛋白质和核酸的差异沉淀。也可以使用市售的纯化试剂盒，如那些在实施例中使用的。
通过扩增(步骤(b))至少2个(优先地2个)HBV基因组片段，然后将这些扩增物用合适的限制性酶处理并在载体中将它们连接成一个完整的插入物(step(c))，这样可克隆含有超过全长HBV基因组的HBV DNA。
在步骤(b)中使用合适的引物对对每个HBV基因组片段进行扩增。
基于完整核酸序列的不同，HBV可划分为从A到H的遗传组群。这些序列可以从涉及所述每种基因型的论文和GenBank里获得。在本说明书中，核苷酸的编号可参考由H.Norder等人公开的完整HBV基因组DNA序列(Virology 1994，198，489-503，此处引用作为参考；该文的图1给出了代表基因型C，E和F的不同HBV基因组与长度为3221个核苷酸的pHBV-3200克隆的序列比对)或公布在GenBank上存取号为AB048704的基因型C HBV的序列(此处引用作为参考)。不同HBV的基因组长度是不定的。这就是说核苷酸的编号应当只被当作说明性的实施方案。
如下文更加详细的描述，根据本发明非常有利地的特性，使用了与HBV基因型中充分保守的区域互补的引物。于是这些引物就能够和存在于样品中的各种HBV杂交，这些不同的HBV代表着所谓的准种。该方法允许克隆和扩增准种，因而可以不仅对一个HBV分离株而且对感染病人的HBV群体运用根据本发明的检测方法。
在第一个实施方案中，目的是克隆一个在异源启动子控制下的超过全长HBV基因组(即约1.1个基因组单位)。该载体包含有效地连接到HBV序列的异源启动子，于是pgRNA可在该启动子控制下进行合成。并且被制备用来PCR扩增的引物对允许获得这种能转录成pgRNA的连续HBV DNA序列，所述HBV DNA序列代表超过一个HBV单位的基因组(即大约1.1倍基因组单位；所谓的超过全长长度)。有利地，该异源启动子是个强启动子，意味着具有高于内源启动子的转录水平。
根据本实施方案中的定义，超过全长的HBV基因组包含或基本由下列HBV核苷酸组成(从5’端到3’端)：
-大约1个单位的基因组：其5’端始于代表转录的+1位点的核苷酸并且包括该位点(通常是核苷酸A，位于1818，H.Norder等人；但在某些情况下，发现转录的+1位点的核苷酸位于上述A的5’端，即C，或位于3’端，即A)，直至前C基因的ATG的5’的第一个核苷酸(核苷酸1813)；加上
-亚基因组片段：始于且包括前C基因的ATG的A(核苷酸1814，H.Norder等人)，并且延伸到且包括polyA附着位点(核苷酸1960，H.Norder等人)，于是包含polyA序列TATAAA(核苷酸1916-1920，H.Norder等人)。如果参考环型基因组，这些片段是相互交叠的。整个序列对应于至少大约1.1个基因组单位(其定义为超过全长的基因组)并且能够产生pgRNA。
如果参考H.Norder等人或GenBank AB048704，从5’方向到3’方向，超过全长HBV基因组包括核苷酸1818到1813和1814到1960。核苷酸的数目可能变化，取决于HBV。例如，一些HBV缺少位于2806到2611和2884到2886(Norder等人，图1)的几个核苷酸。然而很明显这个教导自身可扩展到任何HBV。在一个实施方案中，与H.Norder等人或在GenBank AB048704中公开的HBV基因组序列比对(序列比对意思是在缺失的核苷酸处引入空间，如Norder等人所做，或可能的补充核苷酸不予考虑)，超过全长HBV基因组包括(从5’方向到3’方向)核苷酸1818到1813和1814到1960的HBV基因组序列。在特定的实施方案中，当与上面提到的序列比对时，超过全长HBV基因组包括核苷酸从1816到1813和1814到2016的HBV基因组序列。通过序列比对，容易获得HBV克隆的基因组图谱，于是本领域技术人员可以轻易地精确确定每一个HBV克隆的任何HBV基因组区域，特别是本发明中所用到的区域，例如转录的+1位点，前C基因及其ATG，polyA附着位点，于是所谓的超过全长的HBV基因组就能得以确定。
同样，超过全长HBV基因组可以更长，例如可以进一步包括位于所述转录+1位点的5’方向的核苷酸。然而在这种情况下，加长的序列在5’方向必须不能包括前C基因的功能性ATG(A和/或T和/或G突变或删除)并且优选地不包含生理条件下驱动pgRNA表达的内源HBV启动子(位于1744和1795位点之间)。同样，它也可以在3’方向更长。在实践中，需记住：引物的位置决定序列的长度；优选地选择与位于HBV基因型内非常保守的区域互补的引物，该保守区域尽可能地靠近polyA附着位点；并且对于较小的扩增物来说PCR的敏感性越好。
在这第一个实施方案中，扩增优选地由两个DNA序列包含有HBV核苷酸(从5’到3’)的片段来进行。
第一个片段包含一段在其5’端包含有代表转录+1位点的核苷酸的HBV DNA序列，和
第二个片段包含一段在其3’端含有polyA附着位点的HBV DNA序列。
第一个片段的3’端和第二个片段的5’端相互交叠，并且优选地在重叠部位包含限制性位点，这样通过限制性酶处理，两个片段可以连接产生一个超过全长的HBV基因组。
两个引物对设计出来分别扩增这样的第一和第二个扩增子。
此处公开的引物是通过与超过200个完整的HBV基因组进行多序列比对后设计出来的，并且最后经过总共约500个完整的HBV基因组的检验。与此处公开引物的情况一样，根据充分保守区域可较好地设计出在本发明中使用的引物，以允许运用本发明时不用考虑基因型和野生型HBV的主要天然突变。为了允许代表大多数HBV基因组(如果不是全部)，实施方案提供了不同引物混合物的使用方法，所述不同引物仅在代表所有可能性所必需的变异处表现不同。例如，如果HBV基因组可根据引物靶向的特定基因组区域分为2个家族，则设计的与该区域互补的引物可能是两种引物的混合物，每种引物各代表这些群体中的一个群体。
在本文第一个实施方案中，优选的第一引物对包含正向引物A，该引物部分地与前C基因(编码蛋白质e)的5’部分互补，该引物包含代表转录+1位点(如上述定义)的核苷酸但不包含前C基因的ATG。
合适的引物A例如为：
SEQ ID NO：1
5’TGCGCACCGCGGCCGCGC
Figure C0382446200151
3’
这个引物在前C的起始密码子的G核苷酸下游包含一个Not1位点(单下划线标记)，并且与核苷酸1816到1835杂交(H.Norder等人，和GenBank AB048704)。
SEQ ID NO：2
5’TGCGCACCAGGGCGCGCC
Figure C0382446200152
3’
该引物含有一个AscI位点(单下划线)
SEQ ID NO：3
5’TGCGCACCCCTGCAGGGC
Figure C0382446200161
3’
该引物包含一个Sse8387I位点(单下划线)
SEQ ID NO：4
5’TGCGCACCAGGTTTAAAC
Figure C0382446200162
3’
该引物包含一个PmeI位点(单下划线)
SEQ ID NO：5
5’TGCGCACCAGCGGCCGCC
Figure C0382446200163
3’
该引物包含一个NotI位点(单下划线)
SEQ ID NO：6
5’TGCGCACCACCTGCAGGC
Figure C0382446200164
3’
该引物包含一个Sse8387I位点(单下划线)
SEQ ID NO：7
5’TGCGCACCAGGTTTAAAC
Figure C0382446200165
3’
该引物包含一个PmeI位点(单下划线)
SEQ ID NO：8
5’TGCGCACCAGGCGCGCCC
Figure C0382446200166
3’
该引物包含一个AscI位点(单下划线)
SEQ ID NO：9
5’TGCGCACGGCGCGCCTGC
Figure C0382446200167
3’
该引物包含一个AscI位点(单下划线)
SEQ ID NO：10
5’TGCGCACCCTGCAGGTGC3’
该引物包含一个Sse8387I位点(单下划线)
SEQ ID NO：11
5’TGCGCACCGCGGCCGCGC
Figure C0382446200172
3’
该引物包含一个NotI位点(单下划线)
SEQ ID NO：12
5’TGCGCACCATTAATTAAC
Figure C0382446200173
3’
该引物包含一个PacI位点(单下划线)
在本文第一个实施方案中，优选地为了将HBV pgRNA转录的天然+1位点融合到用作克隆的载体或质粒含有的启动子所决定的转录+1位点，而克隆HBV DNA。为了在分子水平获得这种融合物，首先可以通过在基础启动子的TATA盒(或等同物)和转录+1位点之间插入优选地不存在于任何已知的完整HBV序列内的限制性位点来修饰启动子。于是几种识别8个核苷酸形成的回文位点的限制性酶(如NotI，AscI，PacI，PmeI，SSe8387I，不切割HBV基因组)，可用于此策略。相同的限制性位点也整合到用于PCR的引物A的尾部。SEQ ID NO：1到12是在本实施方案中所用到的引物的例子，它们都包含这些限制性位点。当然，很明显本领域的技术人员能够制备出其他合适的引物。
通常说来，在本实施方案中用作优选引物的多核苷酸包含了相应于限制性位点(优选地不存在于HBV基因组内)的核苷酸序列，所述限制性位点位于与前C基因的5′末端互补的序列的5′，但缺少所述前C基因完整的ATG(例如A，或A和T或A和T和G缺失)。正如SEQ IDNO：1到12所指出的序列，限制性位点可直接连接到转录+1位点或与之相隔几个核苷酸(例如1-3)。在优选的实施方案中，引物包含SEQID NO：1。在序列上，双下划线标记的序列与前C基因5’部位互补。当然，它的3’端可以缩短或延伸至包含更多的互补核苷酸。如果想要保持与源于任一HBV DNA杂交的可能性，优选地不延伸引物，使得它包含非保守区域。
因而HBV DNA的克隆涉及利用构建的含有HBV基因组中不存在的限制性位点的异源启动子和利用可与HBV DNA杂交且包含相同限制性位点的引物，这样HBV DNA和启动子的融合就可能发生。优选地，HBVpgRNA转录的天然+1位点就这样融合到由启动子决定的转录+1位点。
所述第一引物对优选地包含一个选出来与HBV基因组内部的一致或基本一致序列互补的反向引物。
合适的反向引物B例如为：
B1：SEQ ID NO：13
5’GGCAGCACASCCTAGCAGCCATGG 3’
该引物包含一NcoI位点(下划线标记)并且用于扩增基因型A，B，D，E和G。该引物可与核酸1395-1372杂交(H.Norder等人，和GenBankAB048704)。
B2：SEQ ID NO：14
5’GGCAGCACASCCGAGCAGCCATGG3’
该引物包含一NcoI位点(下划线标记)并且用于扩增基因型C和F。该引物可与核苷酸1395-1372杂交。
有利地可使用引物B1和B2的混合物。
S是指G或C。这样在SEQ ID NO：13和14中，S可代表G或C。可使用两者的混合物。通常地，利用简并法合成引物，这样就同时包括了两个可能性。
第二对引物优选地包括了一个选出来与HBV基因组内的一致或基本一致序列互补的正向引物；所设计的该引物与HBV DNA的某一个区域互补，所述区域位于与第一对引物中的反向引物互补的序列的5’。此处描述的具有SEQ ID NO：19所列序列的引物E是这种正向引物的一个例子。最好是使这些正向和反向引物与这些交叠的并包含天然单一限制性位点(例如位于核苷酸1372-1377处的NcoI位点)的HBV基因组区域互补。
合适的正向引物例如为：
C1：SEQ ID NO：15
5’ACMTCSTTTCCATGGCTGCTAGG 3’
该引物包含一个NcoI位点(下划线标记)并且用来扩增基因型A，B，D，E和G。该引物可与核苷酸1363-1385杂交(H.Norder等人，和Genbank AB048704)。
C2：SEQ ID NO：16
5’ACMTCSTTTCCATGGCTGCTCGG 3’
该引物包含一个NcoI位点(下划线标记)并且用来扩增基因型C和F。该引物可与核苷酸1363-1385杂交。
有利地使用引物C1和C2两者的混合物。
M是指A或C，W代表A或T。于是在SEQ ID NO：15和16中，M可代表A或C，W可代表A或T。可使用混合物。通常地，利用简并法合成引物，于是就包含各种可能性。
第二个引物对优选地包含一个合适的选出来与HBV基因组内的一致或基本一致序列互补的反向引物；所设计的这个引物与HBV基因组的某一区域互补，所述区域对应于第一引物对中正向引物的3′并且更精确地说是位于polyA附着位点的3’。作为结果，经过两个扩增片段或扩增子之间的重组获得的克隆DNA比HBV基因组更长，并且包括包含有前C基因的起始密码子ATG和polyA附着位点的冗余区域。如上所述，优选地选择与HBV基因型内充分保守的区域互补并且尽可能靠近polyA附着位点的3’方向的引物。
合适的反向引物D例如为：
D1：SEQ ID NO：17
5’CTAAGGGCATGCGATACAGAGCWGAGGCGG 3’
该引物包含一个SphI位点(下划线)。引物的3’部分可与核苷酸2027-1998杂交。5’端的C对应于核苷酸2039。
D2：SEQ ID NO：18
5’CTAAGGGTCGACGATACAGAGCWGAGGCGG 3’
该引物包含一个SalI位点(下划线)。引物的3’部分可与核苷酸2027-1998杂交。5’端的C对应于核苷酸2039。
有利地使用引物D1和D2两者的混合物。
W是指A或T。于是在SEQ ID NO：17和18中，W可代表A或T。可使用混合物。通常地，用简并法合成引物，于是两种可能性都存在。
反向引物包含一个亦存在于载体上的限制性位点(例如SphI或SalI位点)，于是就允许HBV DNA融合到载体内。两个位点在载体和扩增子(由引物C和D经PCR获得)中都是唯一的。
这些特定引物的使用构成优选的实施方案。然而，如前面所提及，本领域技术人员通过本教导能够使用其它引物克隆基因组片段或用合适的引物对克隆超过2个，例如3个基因组片段。在所有情况下优选使用A型的正向引物和/或D型的反向引物。
在第二个实施方案中，目的是克隆在同源增强子和启动子控制下的超过全长的HBV基因组，于是包含了HBV增强子1(EN1或enh1，核苷酸1180到1219，H.Norder等人，和GenBank AB048704)的核苷酸序列，并且终止于polyA附着位点或之后。克隆前，优选地必须扩增两个HBV基因组片段。
第一个引物对包括了一个正向引物E，该引物与HBV基因组内的一致或基本一致序列互补，所设计的这个引物与HBV基因组内位于增强子1的5’的区域互补，优选地尽可能靠近该增强子。
例如，该正向引物E可以为：
SEQ ID NO：19
5’TAAACAATGCATGAACCTTTACCCCGTTGC 3’
该引物包含一个NsiI位点(下划线标记)。该引物与核苷酸1125-1154杂交(H.Norder等人，和GenBank AB048704)。
第一引物对包括一个选出与HBV基因组内一致或基本一致序列互补的反向引物。可使用上面描述的与位于polyA附着位点3’方向的区域互补的反向引物D，例如D1或D2或D1和D2皆可。
引物E和D允许扩增基因组片段，所述片段包含增强子1，位于X基因的ATG水平的单一NcoI位点和polyA附着位点(位置1372-1377，Norder等人和GenBank AB048704)。
第二对引物包括允许扩增一个包含相同NcoI位点的约一倍基因组单位的正向引物和反向引物，所设计的正向引物与HBV DNA的某一区域互补，所述区域位于与第一引物对中的反向引物互补的序列的5’，而所设计的反向引物与HBV DNA的某一区域互补，所述区域位于与第一引物对中的正向引物互补的序列的3’。
例如，可以使用包含实施例中所述SEQ ID NO：20(正向引物)和SEQ ID NO：21(反向引物)的引物或如下引物：
正向引物
SEQ ID NO：22
5’
Figure C0382446200211
TTTTTCACCTCTGCCTAATCATC 3’
包含一个SapI位点；与核苷酸1821-1843杂交。
反向引物
SEQ ID NO：23
5’
Figure C0382446200212
AAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG 3’
包含一个SapI位点；与核苷酸1825-1804杂交。
优选地，这些引物SEQ ID NO：22和23在5’端进一步包含核苷酸，特别地8个或更多，例如8到15个。这样有利于限制性酶的作用。
所有的上面描述的核苷酸序列或多核苷酸和引物以及引物对也是本发明目的。
在实施方案中，本发明涉及用于HBV扩增的引物对，所述引物对包括：(1)正向引物，包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ ID NO：11或SEQ ID NO：12所列序列，和(2)包含SEQ ID NO：13所列序列或SEQID NO：14所列序列的反向引物或由包含有SEQ ID NO：13所列序列的反向引物和包含有SEQ ID NO：14所列序列的反向引物组成的混合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于HBV扩增的引物对，所述引物对包括：(1)包含有SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16或SEQ IDNO：19所列序列的正向引物，或由包含有SEQ ID NO：15所列序列的正向引物和包含有SEQ ID NO：16所列序列的正向引物组成的混合物，和(2)包含有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所列序列的反向引物，或由包含有SEQ ID NO：17所列序列的反向引物和包含有SEQ ID NO：18所列序列的反向引物组成的混合物。
本发明也涉及用于扩增HBV的试剂盒，其包含根据本发明所述的两对引物。在一个实施方案中，试剂盒同时包含刚才前面描述的两对引物。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于HBV扩增的引物对，所述引物对包括：(1)包含有SEQ ID NO：19所列序列的正向引物，和(2)包含有SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所列序列的反向引物，或由包含有SEQ ID NO：17所列序列的反向引物和包含有SEQ ID NO：18所列序列的反向引物组成的混合物。
在另一个实施方案中，本发明涉及用于HBV扩增的引物对，所述引物对包括：(1)包含有SEQ ID NO：20或22所列序列的正向引物，和(2)包含有SEQ ID NO：21或23所列序列的反向引物。
本发明也涉及同时包含刚才前面描述的二对引物的试剂盒。
本领域技术人员能够设计其它引物。按照同样的流程，通过使用相应数目的引物对，他也能扩增出超过2个片段，例如3个片段，并且用这些片段克隆出超过全长的DNA。
并且依据使用的引物，本领域的技术人员也能确定用于扩增的最佳条件。基于解离温度的确定可以用惯用方法确定杂交温度。还有，通常来说，扩增可能涉及多次循环，例如从20到60次，特别地从30到50次，优选地约40次。可使用Taq聚合酶，优选地可以使用高度保真的Taq聚合酶(例如Expand from Roche Diagnostics)
在步骤(c)中，将扩增产物克隆入载体。这样导致一个包含覆盖超过全长HBV基因组的HBV DNA(或连续的线性DNA)和控制细胞转染后从DNA序列合成pgRNA的元件的载体。这种体外表达的载体也是本发明的目标。它优选地是质粒。
该载体包含有控制从HBV DNA序列(如前面定义的)合成pgRNA所必需的元件。这包括能保证(优选地在真核细胞内)将DNA转录成RNA的启动子。
在第一个实施方案中，如上面定义，启动子是可操作性连接到代表pgRNA转录+1位点的核苷酸的异源启动子。此处称为I型载体的该载体在克隆的HBV DNA序列的5’部位不包含前C基因的ATG。
潜在地，可以利用包含遍在性哺乳动物启动子的载体来构建I型载体。有利地，异源启动子是强启动子，其意味着具有比内源启动子更高的转录水平。
在优选的实施方案中，异源启动子是巨细胞病毒或CMV-IE(Cytomegalovirus Immediate Early)的早期启动子，特别是来源于人类或鼠，或任何其它来源如大鼠或豚鼠。CMV-IE启动子可能包含适当的启动子元件，所述元件可能与或可能不与增强子元件相联。优选使用完整启动子，包括增强子。参考EP-A-260 148，EP-A-323 597，US-A-5 168 062，US-A-5 385 839，US-A-4 968 615和WO-A-87/03905，Boshart M.等人，Cell.，1985，41，521-530。
其它启动子包括人类泛素C基因启动子，EF-1α基因启动了，SV40(猿猴病毒40)早期和晚期启动子，劳斯肉瘤病毒(Rous sarcomavirus)的LTR启动子，细胞骨架基因启动子，例如结蛋白启动子(Kwissa M.等人，Vaccine，2000，18(22)，2337-2344)或肌动蛋白启动子(Miyazaki J.等人，Gene，1989，79(2)，269-277)，例如鸡β-肌动蛋白基因启动子(也是一个优选的选择)(Fregien N，Davidson N.Gene 1986 48，1-11)。
优选将增强子和启动子联合使用。在优选的实施方案中，CMV-IE增强子联合了其它来源的启动子，例如与肌动蛋白启动子，特别是鸡的β-肌动蛋白基因的启动子。
等同地，本发明包括这些启动子的亚片段(保持有足够启动子活性)：例如依照WO-A-98/00166截短的CMV-IE启动子。于是根据本发明，启动子的概念包括保持有足够启动子活性的衍生物和亚片段，优选地与它们所衍生的合适启动子具有基本相似的活性。就CMV-IE而言，该概念包括合适启动子部分和/或增强子部分以及衍生物和亚片段。
如上所解释的，优选地将HBV pgRNA的天然转录+1位点融合于用于克隆的载体或质粒包含的启动子所决定的转录+1位点。为了在分子水平获得这种融合，可以通过在基础启动子的TATA盒(或等同物)和转录+1位点之间插入(诱变)限制性位点来修饰启动子，优选地所述限制性位点(例如前面提到的NotI，AscI，PacI，PmeI，SSe8387 I限制性位点中的一种)不存在于已知的完整HBV序列内。该限制性位点必须与存在于引物A中的一样。参照实施例。
克隆必须将HBV DNA片段连接在一起并且插入载体。这项使用几套合适的限制性酶和限制性位点的技术对本领域技术人员来说是非常熟悉的。优选地步骤(c)是一步克隆。并且此处明确公开的引物允许进行快速的一步克隆。
使用A型引物，载体包括：
(a)如前面在第一个实施方案中所定义的一段线性连续的或超过全长的HBV DNA序列(对于在异源启动子控制下的序列)，根据本发明能够产生pgRNA
(b)一个在其5’部位被修饰的启动子(通过在转录+1位点的5’存在限制性位点来进行修饰)，其中DNA序列转录的+1位点与启动子融合，该启动子控制细胞转染后由DNA序列到pgRNA的合成。优选地这个限制性位点不存在于任何已知的完整HBV序列内并且可以是例如：NotI，AscI，PacI，PmeI或SSe8387 I。在一些特定的实施方案中，启动子序列包含了从SEQ ID NO：24到29(本说明书的最后部分)中选出的序列，并具有所述的限制性位点。
载体可能还包含允许将载体转入杆状病毒的杆状病毒序列。这些序列是位于杆状病毒基因组区域侧翼的序列，例如在细胞培养中对病毒复制非必需的基因。这些序列允许载体和杆状病毒基因组之间重组，于是通过将载体转入杆状病毒后，包含有启动子和HBV单位的盒将插入杆状病毒基因组。
众所周知，载体还可包含有复制起始位点和选择标记(诸如抗性基因，例如杀稻瘟素抗性基因)。这将有助于在产生稳定的细胞系过程中选择含有载体的细胞。
包含有杆状病毒序列和选择标记的载体在此处是可以预期的。于是相同的载体既可以用来转染细胞也可以通过杆状病毒来转导细胞，或用来产生稳定的细胞系。特别地，一旦在病人样品中发现目的克隆，就可能产生稳定的细胞系以筛选有效药物。
细胞内pgRNA的合成启动了伴随有病毒基因表达的HBV细胞内周期，所述周期包括细胞内复制中间体(包括单链DNA，双链线性DNA，松弛型环状DNA和少量存在的复制中间体，RNAs)的合成，基因表达和病毒的产生。
这样的载体也是本发明的目的。还有此处描述的修饰过的启动子(包括于实施例中)也构成了本发明的另外的目的。
在第二个实施方案中，启动子是一个存在于HBV DNA克隆内的同源启动子。II型载体经过二步法产生。首先，由第一套引物例如E-D获得的扩增子经过消化并插入载体。然后，由第二套引物例如P1-P2获得的扩增子经SapI消化，用连接酶连接(环化)，接着用NcoI消化并插入到存在于克隆的E-D片段上的NcoI位点。
这个策略产生一个载体，该载体包含：
-根据第二个实施方案的一段线性连续或超过全长的HBV DNA序列
-其中的同源增强子和启动子控制细胞转染后从DNA序列到pgRNA的合成。
更精确地，该载体启动了前C RNA和pgRNA的合成。
这样的载体也是本发明的目的。
在步骤(d)中，根据本发明的载体可用以转染或转导培养的感受态细胞。
在一个实施方案中，可用载体转染感受态细胞，特别是真核细胞例如肝细胞，包括细胞系，特别是来源于肝细胞的细胞系，例如肝细胞癌细胞系，例如Huh7(Nakabayaski，H.等人，Cancer Res.198242，3858-3863)，HepG2(可由ATCC获得，存取号HB-8065)。
在步骤(e)中，通过细胞培养可允许载体合成pgRNA并且有可能启动前面所描述的HBV细胞内周期。
在步骤(g)中，可以估计HBV的复制能力。这可能要涉及测量核酸合成水平，蛋白质合成水平和/或病毒产量。
在一个实施方案中，转染的细胞可用来研究HBV在细胞内的复制能力。这可能涉及通过用分子生物学技术，例如通过Southern印迹法或对合成的核酸进行特异性实时扩增法来对病毒DNA进行定量。
在另一个包含步骤(f)的实施方案中，这些转染的细胞可用来研究抗病毒剂的效果。在步骤(f)中，当使用药物产品特别是抗病毒剂时，将它加入到培养的转染细胞里。在一个实施方案中，为了拥有比较的基础，一部分培养的转染细胞保留用作对照，就是说不用药物产品特别是抗病毒剂处理它。在另一个实施方案中，用另外的药物产品特别是抗病毒剂来处理一部分或更多部分培养的转染细胞，这样允许不同药物产品间特别是抗病毒剂之间的比较。并且在这个实施方案中，可加入不作任何处理的对照。
在特定的实施方案中，所用的抗病毒剂选自拉米夫定，阿德福韦二匹伏酯，恩替卡韦，恩曲他滨，克来夫定，telbivudine，替诺福韦，β-L-FD4c和其任何组合。
在另一个实施方案中，通过感染合适的细胞系统如昆虫细胞，载体可转入杆状病毒并进行繁殖。例如可使用杆状病毒苜蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(Autographa californica Nuclear Polyhedrosis)AcNPV。例如可以利用草地夜蛾(Spodoptera frugiperda)Sf9(ATCCCRL 1711保藏)作为昆虫细胞。含有载体的杆状病毒然后用来转导真核细胞如肝细胞癌细胞，例如Huh7细胞，在该细胞中载体能启动pgRNA合成。接着在步骤(f)中，将药物产品特别是抗病毒剂加入到培养的转导细胞中。在一个实施方案中，为了拥有比较的基础，一部分培养的转导细胞留作对照，就是说不用药物产品特别是抗病毒剂处理它。在另一个实施方案中，用别的药物产品特别是抗病毒剂来处理一部分或更多部分培养的转导细胞，这样允许不同药物产品间特别是抗病毒剂之间的比较。并且在这个实施方案中，可加入不作任何处理的对照。
在另一个实施方案中，载体用来产生能够组成型地生产病毒粒子的细胞系。如上面所提到的，载体可能包含有选择标记。利用上面提到的载体转染诸如来自肝细胞的细胞系，例如肝细胞癌细胞，例如Huh7、HepG2，并且将通过标记选择出来的细胞回收，作为含有本发明载体的稳定细胞系。这些稳定的细胞系亦是本发明的目的。
如前面所解释，本发明导致产生：HBV pgRNA、细胞内复制中间体和HBV病毒颗粒。于是在药物产品特别是抗病毒剂或候选者存在或缺少的情况下，可以测量步骤(g)中的不同参数。
在第一个实施方案中，可以估计或可能地比较细胞内HBV DNA的合成水平。通常的方法是瓦解细胞，例如通过用物理和/或化学处理：例如用Tris-EDTA和Nonidet P-40裂解细胞。对回收的样品离心，用DNA酶处理回收的上清液去除转染的DNA，但合成的DNA或正在合成的DNA被衣壳包裹着。用EDTA或类似物中和DNA酶的活性，然后用蛋白酶K或类似物将DNA从衣壳中释放出来。DNA可用例如酚-氯仿抽提并沉淀下来。可用任何已知的方法特别是Southern印迹法或PCR测量DNA的水平。可以计算出IC50和IC90。
在第二个实施方案，通过应用分子生物学技术，诸如点印迹法，Southern印迹法和定量PCR对细胞外基质或上清液中病毒粒子DNA的水平进行定量和可能地进行比较。可以计算出IC50和IC90(抑制浓度50％或90％，是指引起测量参数减少50％或90％时的药物剂量)。
可以将该结果与标准进行比较。
于是本发明的目的是这种用来测试HBV分离株系对药物敏感性的表型检测方法。特别地，该目的可应用于确定存在于病人体内的病毒株系(例如准种)对可获得药物的敏感性，于是针对病毒学状况采用合适的抗病毒疗法成为可能。在特定的实施方案中，本发明中的方法包括下述步骤：
1)从病人血清中提取DNA
2)PCR扩增
3)克隆入I型载体
4)将载体转染入细胞中，例如Huh7细胞，并且转移到96孔板
5)用待估测的抗病毒剂处理
6)进行定量PCR并确定IC50和IC90
7)与标准进行比较
本发明的另一目的是应用这种表型测试方法检测目前和将来的药物对HBV株系或HBV野生分离株系的抗病毒活力。在特定的实施方案中，本发明的方法包括如下步骤：
1)可能地从病人血清或培养病毒中提取DNA
2)PCR扩增
3)克隆入I型或II型载体
4)将载体转染细胞，例如Huh7细胞，或通过杆状病毒转导细胞或产生稳定的细胞系，并例如转移入96孔板
5)用待估测的抗病毒剂处理
6)进行定量PCR并确定IC50和IC90
7)与标准进行比较
根据本发明的方法，当所有或部分由一个样品(例如准种)获得的克隆用于转染或转导细胞时，将进行多克隆分析。
于是该发明允许进行药物筛选。本发明更进一步的目的在于用来抵抗HBV的药物组合物，所述药物组合物由通过本发明方法筛选出的有活性的药剂制备而来。本发明的另一个目的是一个通过将选择出来具有活性的药剂与制药学上可接受的载体或赋形剂相混合从而制造出充当抗HBV抗病毒药品的药物组合物的方法，所述方法包含根据本发明的检测方法。
本发明的另一个目的是一种从病人样品(如此处公开的)中快速克隆HBV DNA的方法。
为进行此处公开的实施方案，本领域技术人员可参考分子生物学，重组DNA，微生物学中常用的方法，例如：Sambrook和Russel，Molecular Clon ing：A Laboratory Manual，第三版(2001)ColdSpring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New York(此处称为“Sambrook等人，1989”)；DNA Cloning：A PracticalApproach，Volumes I and II(D.N.Glover编，1985)；Oligonucleotide Synthesis(M.J.Gait编，1984)；Nucleic AcidHybridization[B.D.Hames & S.J.Higgins，编，(1985)]；Transcription and Translation[B.D.Hames & S.J.Higgins，编，(1984)]；Animal Cell Culture[R.I.Freshney，编，(1986)]；B.Perbal，A Practical Guide to Molecular Cloning(1984)；F.M.Ausubel等人(编)，Current Protocols in Molecular Biology，JohnWiley & Sons，Inc.(1994).
另外通过下列解释性的、非限制性的实施例(参考附图)对本发明进行描述。
附图简述：
图1表示具有HBV开放阅读框的开环HBV基因组的示意图。标明本研究中所用的不同引物。
图2表示pTriEX-1.1以及其衍生质粒pTriEX-Mod和pTriEX-Bsd的示意图，同时给出了鸡β-肌动蛋白基因的基础核心启动子(BCP)的详细序列。图中显示通过NotI位点插入而修饰的BCP。图8展现了完整的环形pTriEX-1.1示意图。
图3展示用于PCR扩增的正向引物A的序列以及在HBV基因组三链区的引物结合位点。
图4展示I型和II型载体，用I型、II型或pHBV二聚体质粒转染Huh7细胞的示意图以及HBV DNA细胞内复制中间体的Southern印迹分析的结果。泳道TI，TII和pHBV二聚体对应于分别用I型，II型和pHBV二聚体环形质粒转染Hup7细胞后从病毒核心颗粒中提取的DNA。标示有线性HBV的泳道对应于3.2kb长的线性双链形式HBV DNA。图中显示松弛型环状(RC)和单链(SS)形式的HBV基因组位于放射自显影图的右侧边。DNA片段大小的标记显示位于图的左侧。
图5表示克隆实施过程和所获克隆的复制状况。(A)通过使用两对引物即A-B和C-D对提取于治疗前(pre-therapeutic)或病毒抗性出现(breakthrough)时的病人血清里的HBV DNA进行PCR扩增并克隆入I型载体。在呈现于溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶的1，2，4，A-F泳道上发现有展现出限制性模式的阳性克隆。阳性克隆用来转染Huh7细胞。使用携带野生HBV基因组(基因型为D)的I型对照质粒作为对照(泳道C+)。对转染4天后的HBV DNA细胞内复制中间体进行Sothern印迹分析。放射自显影图右侧显示出松弛型环状(RC)和单链(SS)形式的HBV基因组。
图6表示经Sothern印迹分析后得出的两个表型药物敏感性的图样。用两种I型质粒的混合群体转染Hup7细胞，所述质粒获自拉米夫定敏感型的HBV基因组克隆(上面的图框)和抗拉米夫定型的HBV基因组克隆(下面的图框)。从转染后的第三天开始，在5天中不断地增加拉米夫定的浓度对细胞进行处理(显示于每一放射自显影图的上方)。对HBV DNA细胞内复制中间体进行Southern印迹分析。显示对应于敏感型(上面的图框)和抗性型(下面的图框)的放射自显影图样。图7表示表型检测的敏感型图样。用包含有野生型来源的HBV基因组或3TC-抗性来源的HBV基因组(包含突变L528M和M552V)的I型克隆混合物转染Huh7细胞。从转染后的第三天开始，在5天中，细胞不作处理或用两种浓度即2.5或10μM的拉米夫定处理细胞。对HBV DNA细胞内复制中间体进行Southern印迹分析。所用混合物的组成显示在放射自显影图样的顶部。对印迹进行磷成像分析(phosphoimageranalysis)并且用下面的图表展示分析结果，在图表中复制抑制百分比表示为所用拉米夫定量的函数。
图8表示TriEX-1.1质粒。
实施例：
材料和方法
血浆样品。分析前将从慢性HBV-感染的个体中获得的血浆样品于-20℃条件下贮藏。参照血清(BBI Diagnotics(Boston，MA)生产的
Figure C0382446200311
325HBV DNA阳性对照)被用于一些实验。
抗病毒药物。β-L-(-)-2′，3′-双脱氧-3′-硫代胞苷(3TC，拉米夫定)，来自Glaxo SmithKline.
样品制备和PCR扩增。
按照厂商说明书，使用三种不同的商业购买来的试剂盒(MasterpureTMComplete DNA和RNA纯化试剂盒[Epicentre，Madison，W1]，高纯度PCR模板制备试剂盒(High pure PCR template preparationKit)[Roche，Diagnostics，Mannheim，Germany]，和QIAampTMUltraSens病毒试剂盒[Qiagen，Hilden，Germany])从200μl血清中提取病毒DNA。洗脱物或重悬物的终体积是60μl，并且将5到10μl用于随后的聚合酶链式反应(PCR)扩增。根据厂商说明书，利用扩展的高保真PCR系统(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)，使用“热起动”方法进行所有的PCR反应。使用了四组引物。
根据Günther等人(J.Virol.1995，69，9：5437-5444和J Clin.Microbiol.1998，36，2：531-538)描述的方法，使用包含有HindIII/SapI位点的正向引物P1SEQ ID NO：20(5’-CCGGAAAGCTTAT
Figure C0382446200321
TTTTTCACCTCTGCCTAATCATC-3’)和包含有SacI/SapI位点的反向引物P2SEQ ID NO：21(5’-CCGGAGAGCTCAT
Figure C0382446200322
AAAAAGTTGCATGGTGCTGGTG-3’)扩增出全长的HBV。
使用包含有NotI位点(参见图3)的正向引物A(5’-TGCGCACCGCGGCCGCGCAACTTTTTCACCTCTGCC-3’；SEQ ID NO：1)和包含有NcoI位点的反向引物B(用于扩增基因型A，B，D，E和G的B1：5’-GGCAGCACASCCTAGCAGCCATGG-3’，SEQ ID NO：13，或用于扩增基因型C和F的B2：5’-GGCAGCACASCCGAGCAGCCATGG-3’；SEQ IDNO：14)，经历40个循环(热启动；94℃40秒，55℃1分钟，68℃3分钟，每10个循环此步骤增加2分钟)扩增出近2800bp的长PCR产物。
使用包含有NcoI位点的正向引物C(用于扩增基因型A，B，D，E和G的C1：5’-ACMTCSTTTCCATGGCTGCTAGG-3’，SEQ ID NO：15，或用于扩增基因型C和F的C2：5’-ACMTCSTTTCCATGGCTGCTCGG-3’；SEQ ID NO：16和反向引物D(包含一个SphI位点的D1：5’-CTAAGGGCATGCGATACAGAGCWGAGGCGG-3’，SEQ ID NO：17，或包含一个SalI位点的D2：5’-CTAAGGGTCGACGATACAGAGCWGAGGCGG-3’；SEQID NO：18)，经历40个循环(热起动；94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒，从第11个循环开始每经历1个循环此步骤增加5秒)扩增出近665bp的短PCR产物。
使用包含有NsiI位点的正向引物E(5’-TAAACAATGCATGAACCTTTACCCCGTTGC-3’；SEQ ID NO：19)和反向引物D经历40个循环(热起动；94℃30秒，50℃30秒，72℃45秒，从第11个循环开始每经历1个循环此步骤增加5秒)扩增出近900bp的其它PCR产物。图1显示出这些引物相对于HBV基因组的位置。
将超过全长的HBV基因组克隆入两种不同类型的载体。
通过二次修饰将包含有多个启动子和携带杆状病毒侧翼序列的pTriEX-1.1(Novagen Inc，Madison，W1.，图2)载体改造成pTriEX-Mod载体以适应克隆策略。首先去除位于184位点上的NsiI位点，使得另一个位于CMV增强子和肌动蛋白基本启动子之间的1445位上的NsiI位点成为唯一的NsiI位点。第二步，在1717位点(该位点正好在载体的脊椎动物转录起位点(1727位)的上游)引入单一的NotI位点(图2)。通过在MluI位点(pTriEX-Mod中第399位)克隆杀稻瘟素盒进一步修饰质粒pTriEX-Mod，所述杀稻瘟素盒通过PCR从pUB-Bsd(Invitrogen Ltd，Paisley，U.K.)扩增而来，包含有人类泛素C启动子控制下的杀稻瘟素基因。
当需要同时进行转化杆状病毒和产生持续表达HBV的细胞系时，使用最终的载体，pTriEX-Bsd。分别用NotI/NcoI和NcoI/SalI消化由引物A-B和E-D(或C-D)生成的PCR产物，并使用标准方法[Sambrook，J.和D.W.Russell，Molecular clonig：a laboratorymanual.3rd ed.2001，Cold Spring Harbor，N.Y.：Cold SpringHarbor Laboratory Press.3v.]一步将其克隆到pTriEX-Mod的NotI/XhoI位点之间生成I型质粒(图4)。
转染后，包含有约1.1个基因组单位的I型载体能在鸡肌动蛋白启动子控制下合成前基因组HBV RNA(pgRNA)。
作为选择，用NstI/SalI消化由引物E-D产生的PCR产物，并插入到该载体的NsiI/xhoI位点之间。接着利用这个中间质粒将一个HBV基因组单位克隆入单一NcoI位点，该NcoI位点位于HBV的基因X的ATG位置。可以通过对P1-P2全长PCR产物进行SapI消化，接着T4连接酶连接，然后NcoI消化连续处理从而获得所述插入物(一个HBV基因组单位)。这样产生了包含约1.3个基因组单位的II型载体，转染后，该载体能够在天然HBV启动子控制下合成pgRNA(图4)。HBV DNA的转染。
所有克隆的DNA可以通过基于硅胶柱(Qiagen Inc.，Valencia，California，USA)的Qiagen技术予以纯化。根据厂商说明书，可利用Fugene-6试剂(Roche Diagnostics，Mannheim，Germany)将质粒转染入Huh7细胞内。简而言之，将Huh7细胞以7X104细胞/cm2的密度进行接种并在12小时后用每平方厘米150纳克(ng)的质粒去转染细胞。在转染前一小时更换培养基，然后，如果用抗病毒剂处理，则每天更换培养基。
从细胞内核心颗粒纯化HBV DNA并进行Southern印迹分析。
用PBS清洗细胞一次，接着按每35mm直径盘皿用1ml的裂解缓冲液(50mM Tris-HCl[pH8]，1mM EDTA，1％Nonidet P-40)裂解细胞。将裂解产物置于冰上孵育15分钟，然后以14,000rpm的速度离心1分钟沉淀细胞核。将上清液调整到10mM MgCl2并用100μg的DNA酶在37℃处理一个小时。通过加入EDTA到终浓度为25mM来终止DNA酶活性，然后用0.5mg/ml的蛋白酶K在1％SDS和100mM NaCl存在的条件下消化蛋白质。加入10μg tRNA后，用酚-氯仿抽提核酸并用异丙醇将核酸沉淀。用1.2％琼脂糖凝胶分离DNA，将DNA吸附到带正电的尼龙膜上，并用32P标记的全长HBV与之杂交(如前面描述)[Seigneres，B.，等人.，Hepatology，2002.36(3)：p.710-22.]。
从细胞外病毒颗粒中纯化HBV DNA并进行定量PCR分析。
使用商业购买的QIAampTM UltraSens病毒试剂盒(Qiagen，Hilden，Germany)或通过下列方法从细胞培养基中提取病毒DNA。在1ml澄清化的培养基中补充聚乙二醇(PEG)至终浓度10％，然后在4℃条件下用台式离心机以14,000rpm速度离心1小时。用1ml裂解缓冲液重新悬浮沉淀，接着按照上面所述分离来自细胞质内核心颗粒的HBV DNA的方法继续纯化DNA。
结果
从血清中提取病毒DNA和PCR操作
有几种试剂盒可用来从血清中分离HBV DNA。已经对它们中的三个试剂盒进行了测试以优化分离的HBV DNA的数量/质量，所述HBV DNA随后将用作PCR的模板。其中的一些应用基于柱的纯化方式而另一些则是基于蛋白质和核酸的差别沉淀方式。使用这些不同的方法从200微升参照血清中提取DNA并用实时PCR对获得的DNA进行定量。与其它两种基于柱的技术相比，“Master pureTM Complete DNA和RNA纯化试剂盒”获得更高的DNA回收量，收获浓度为2.73×104拷贝/μl的vDNA(病毒DNA)，而所述其它两种基于柱的技术获得DNA的浓度分别是1.08×104拷贝/μl(高纯度PCR模板制备试剂盒)和9.77×103拷贝/μl(QIAampTM UltraSens病毒试剂盒)。为了确定通过这些技术所获得的DNA质量是否有可比性，将这些DNA的稀释物(1/10th)用来建立PCR反应。首先利用来自Gunther’s方法中的引物P1和P2找出PCR的阈值。使用扩展的高保真PCR系统并在前面描述的条件下[Günther等人，1998和1995，上面引用过的]进行PCR。
用QIAampTMUltraSens病毒试剂盒获得的vDNA就DNA质量来说是最好的，因为当用低达5个拷贝的基因组作为起始模板时，所获得的PCR产物能显现在溴化乙锭染色的凝胶上。根据所使用的提取方法(见材料与方法)，这5个拷贝在理论上相当于每毫升300个基因组的血清滴度。为了用Master pureTM Complete DNA和RNA纯化试剂盒提取的DNA获得等量的扩增子，需要每个反应加入20个拷贝基因组(相当于理论上每毫升1200基因组的血清滴度)，意味着这种DNA质量较低。
I型载体的构建：
如上所述，通过基因工程在鸡肌动蛋白启动子(图2)转录位点+1处引入NotI位点改造pTriEx-1.1(Novagen)质粒。通过对报告基因表达的测量，没有观察到改造后质粒(即pTriEX-Mod)启动子活性的改变。位于pgRNA转录+1位点的引物A包含一个NotI尾巴(图3)。将这个引物A和位于HBV X基因的ATG起始位点的反向引物B组合使用以建立PCR反应体系。保守的NcoI位点(克隆策略所必需的)与该ATG重叠。
用NotI/NcoI和NcoI/SalI消化由两对引物A-B和C-D2(或E-D2)获得的PCR产物并同时将它们克隆入pTr iEX-Mod产生I型载体(图4)。该融合导致HBV pgRNA在转染的肝细胞癌细胞中的专有生产保持在一个稳定的水平而与共同克隆的包含在1.1个单位基因组内的信息无关。平均地，有50％到75％获得的克隆表现出预期的限制性图谱，并且Southern印迹分析(图5)证实在细胞转化后有超过75％的这些克隆导致DNA中间体形成。综合起来，这些数据表明当用40个PCR循环来产生插入物A-B和C-D时，有40％到65％的由此产生的I型克隆既具有预期的限制性图谱又是复制型的。
在肝细胞癌细胞中，I型载体能够以鸡肌动蛋白启动子强度所决定的水平合成pgRNA。这种类型的载体对分析发生在转录后的病毒周期事件是有益处的。例如它可以用来分析聚合酶基因突变的特性，这些突变与对核苷/核苷酸类似物的抗性有关。
II型载体的构建：
第二个克隆策略意欲构建II型载体，其中pgRNA的合成由同源启动子控制。获得这些含有1.3个单位HBV基因组的载体必需要经过二个克隆步骤。
首先用NsiI/SalI双酶消化由E-D2引物获得的900bp的PCR产物，并克隆到被NsiI和XhoI打开的pTriEX-Mod中。然后将获得的中间质粒上的单一NcoI位点用来克隆1个HBV基因组单位，通过使用SapI，接着用T4DNA连接酶和NcoI对由P1-P2获得的PCR产物进行连续处理可产生所述的HBV基因组单位。
II型载体允许用来研究HBV突变体(例如核心启动子突变体)的转录特性，或者用来估计pgRNA体内合成水平对观察到的表型有什么影响。
用I型，II型，头尾串联的HBV基因组或具有SapI粘性末端的HBV基因组转染肝细胞瘤Huh7细胞后，观察到的细胞内复制中间体数量的比较。
将明确定义的HBV基因型D(血清型ayw)的基因组克隆入：i)I型和II型载体；ii)首尾串联克隆入pUC载体；或iii)根据Gunther的方法克隆入pUC载体上。将这四种构建体用来转染肝细胞瘤Huh7细胞。
Günther方法克隆的HBV基因组在转染前首先通过Sap1酶解释放出来。使用了相同量的DNA(等同于HBV基因组)。正如所期待的一样，由于强肌动蛋白启动子的存在，I型载体产出了最高水平的细胞内复制中间体(图4)，这样就肯定了这个载体在转录后表型研究中是有用的。II型载体比头尾串联和Günther型构建体产出更高水平的细胞内复制中间体，暗示着II型载体在表型检测中可用作I型载体的替代物。
药物敏感性检测的描述和校正。
将Huh7细胞接种在直径35mm的培养皿里(7×105细胞/皿)并让其附着6小时。将1.5μg至少10个克隆的I型载体混合物转染细胞，所述I型载体从来源于待测血清的HBV克隆获得。
这种多克隆方法反映了病毒的准种。第二天，用含有不同浓度待测药物(例如实施例中给出的拉米夫定)的新鲜培养基更换原有培养基。在4天内每天更新药物处理。按上述方法将细胞裂解并进行Southern印迹分析以测量在药物压力下合成的细胞内复制中间体的量以及确定IC50值。进行了3次重复实验。在给出的例子中(图6)，对野生型HBV基因组群体来讲，拉米夫定的IC50估计小于100nM，而对从病人中克隆出来的病毒群体，IC50增加到超过50μM，所述病人在拉米夫定(3TC)处理下拥有病毒抗药性。
为了解该检测方法的灵敏度，用由包含有野生型来源的HBV基因组或3TC抗性型来源的HBV基因组(包含突变L528M和M552V[Seigneres等人，2002前面所述])的质粒组成的递增混合物(incremental mixture)来转染细胞。图7显示了Southern印迹和密度扫描计分析的结果。这些数据显示该检测法很容易地将包含25，50或75％药物抗性病毒的混合物与包含有100％药物敏感性或100％药物抗性的HBV基因组的样品区分开。
这种模拟分析(modelisation)可用来比较被医治病人样品的IC50值以检测可能的抗药性(breakthrough)。
对下列药物进行了类似的检测：恩曲他滨，克来夫定，阿德福韦二匹伏酯，tgenofovir disoproxil和β-L-FD4C，结果显示本发明方法可以用于表型检测以估计HBV克隆对药物的敏感性。
本发明中使用的各种启动子
已知启动子的部分核苷酸序列列于下面。该序列的3’末端部分列出了斜体和下划线标记的转录+1位点(在左边的核苷酸标记为-1)并且当TATA盒出现时亦用斜体表示。对于每一个启动子，根据本发明的第一个实施方案，用于创建限制性位点的座位以及与之配合使用的引物A已被标明。
鸡β肌动蛋白基因的基本启动子序列：
SEQ ID NO：24
CGGCCCTATAAAAAGCGAAGCGCGCGGCGGGCGGGAGTCGCT
  限制性位点   将要替换核苷酸   引物A SEQ ID NO：
  NotI   -10到-3   1
  AscI   -8到-1   2
  Sse8387 I   -10到-3   3
  PmeI   -8到-1   4
CMV-IE基因的基本启动子序列：
SEQ ID NO：25
TATATAAGCAGAGCTCGTTTAGTGAACCGTCAGA
  限制性位点   将要替换核苷酸   引物A SEQ ID NO：
  NotI   -9到-2   5
  AscI   -8到-1   2
  Sse8387I   -9到-2   6
  PmeI   -8到-1   7
人类泛素C(hUb)基因的基本启动子序列：
SEQ ID NO：26
TATATAAGGACGCGCCGGGTGTGGCACAGCTAGT
  限制性位点   将要替换核苷酸   引物A SEQ ID NO：
  NotI   -11到-4   1
  AscI   -9到-2   8
  Sse8387 I   -9到-2   6
人类EF-1α基因的基本启动子序列：
SEQ ID NO：27
TATATAAGTGCAGTAGTCGCCGTGAACGTTCTT
  限制性位点   将要替换核苷酸   引物A SEQ ID NO：
  NotI   -9到-2   1
  AscI   -10到-3   9
  Sse8387I   -10到-3   10
SV40早期启动子的基本启动子序列(富含GC-缺少TATA的启动子)：
SEQ ID NO：28
GACTAATTTTTTTTATTTATGCAGAGGCCGAGGC
  限制性位点   将要替换核苷酸   引物A SEQ ID NO：
  NotI   -9到-2   1
  AscI   -9到-2   11
  Sse8387 I   -10到-3   3
RSV(劳斯肉瘤病毒)LTR的基本启动子序列：
SEQ ID NO：29
TATTTAAGTGCCTAGCTCGATACAATAAACGCC
  限制性位点   将要替换核苷酸  引物A SEQ ID NO：
  PmeI   -8到-1  7
  PacI   -9到-2  12
  Sse8387 I   -9到-2  6
每一个经附表标明的任何一个限制性位点修饰过的基本启动子序列以及每一个包含有这种修饰序列的启动子和每一个含有这种启动子的载体都是本发明的目的。
应当明白根据附属权利要求定义的本发明不局限于在前面描述中所提到的具体的实施方案，它还包括没有超出本发明范围或精神的变异。
序列表
<110>INSTITUT NATIONAL DE LA SANTE ET DE LA RECHERCHE MEDICALE
(INSERM)
<120>检测HBV复制和测试药物敏感性的方法
<130>BET 02/0923
<140>EP 02356188.9
<141>2002-09-27
<160>29
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>1
tgcgcaccgc ggccgcgcaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>2
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>2
tgcgcaccag ggcgcgccaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>3
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>3
tgcgcacccc tgcagggcaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>4
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>4
tgcgcaccag gtttaaacaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>5
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>5
tgcgcaccag cggccgccaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>6
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>6
tgcgcaccac ctgcaggcaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>7
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>7
tgcgcaccag gtttaaacaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>8
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>8
tgcgcaccag gcgcgcccaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>9
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>9
tgcgcacggc gcgcctgcaa ctttttcacc tctgcc     36
<210>10
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>10
tgcgcaccct gcaggtgcaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>11
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>11
tgcgcaccgc ggccgcgcaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>12
<211>36
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>12
tgcgcaccat taattaacaa ctttttcacc tctgcc    36
<210>13
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>13
ggcagcacas cctagcagcc atgg                 24
<210>14
<211>24
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>14
ggcagcacas ccgagcagcc atgg                 24
<210>15
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>15
acmtcstttc catggctgct agg                          23
<210>16
<211>23
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>16
acmtcstttc catggctgct cgg                          23
<210>17
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>17
ctaagggcat gcgatacaga gcwgaggcgg                   30
<210>18
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>18
ctaagggtcg acgatacaga gcwgaggcgg                   30
<210>19
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>19
taaacaatgc atgaaccttt accccgttgc                   30
<210>20
<211>43
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>20
ccggaaagct tatgctcttc tttttcacct ctgcctaatc atc    43
<210>21
<211>42
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>21
ccggagagctcatgctcttc aaaaagttgc atggtgctgg tg    42
<210>22
<211>30
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>22
gctcttcttt ttcacctctg cctaatcatc                 30
<210>23
<211>29
<212>DNA
<213>人工序列
<220>
<223>寡核苷酸
<400>23
gctcttcaaa aagttgcatg gtgctggtg                  29
<210>24
<211>42
<212>DNA
<213>鸡
<400>24
cggccctata aaaagcgaag cgcgcggcgg gcgggagtcg ct   42
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<211>34
<212>DNA
<213>巨细胞病毒
<400>25
tatataagca gagctcgttt agtgaaccgt caga            34
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<211>34
<212>DNA
<213>人类
<400>26
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<210>27
<211>33
<212>DNA
<213>人类
<400>27
tatataagtg cagtagtcgc cgtgaacgtt ctt    33
<210>28
<211>34
<212>DNA
<213>SV40病毒
<400>28
gactaatttt ttttatttat gcagaggccg aggc   34
<210>29
<211>33
<212>DNA
<213>劳斯肉瘤病毒
<400>29
tatttaagtg cctagctcga tacaataaac gcc    33

Claims (44)

1.用于测量HBV复制能力的方法，该方法包括：
(a)使用至少两对引物进行PCR以扩增HBV核酸，所选的所述两对引物能够获得至少两个不同的HBV基因组扩增片段，这两个片段通过组装代表了一个线性连续的、能转录出pgRNA的DNA序列；
(b)将由(a)中获得的片段克隆入载体，该片段处于异源启动子控制下，因此产生包含一段线性连续的、在所述启动子控制下的能转录出pgRNA的DNA序列的载体；
(c)用所述载体转染或转导感受态细胞；
(d)在允许从克隆的HBV DNA合成HBV pgRNA的条件下培养转染或转导的细胞；
(e)确定HBV的复制能力。
2.权利要求1的方法，其中所述HBV为存在于生物样品中的HBV，并且，该方法在步骤(a)之前还包括提取包含在生物样品中的核酸。
3.权利要求1的方法，所述方法在存在药物产品的情况下进行，并且步骤(e)被下列步骤替代：
(e′)用药物产品处理培养细胞；并且
(f)确定药物产品对于病毒基因表达和/或病毒复制的影响。
4.权利要求3的方法，其中所述药物产品为抗病毒剂。
5.权利要求1-4中任一项的方法，其中所述连续的DNA序列包含HBV核苷酸(从5’到3’)：
-一个基因组单位：其5’端始于并且包含代表转录的+1位点的核苷酸，直至前C基因的ATG的5’的第一个核苷酸；加上
-一个亚基因组片段：始于并且包含前C基因的ATG的A，并且延伸至并包含polyA附着位点，
其中该线性连续DNA序列在其5’末端不包含前C基因的ATG。
6.权利要求5的方法，其中所述连续DNA序列从5’到3’包含与GenBank AB048704所示序列比对的HBV基因组序列的核苷酸1818到1813和1814到1960。
7.权利要求5的方法，其中所述连续DNA序列从5’到3’包含与GenBank AB048704所示序列比对的HBV基因组序列的核苷酸1816到1813和1814到2016。
8.权利要求5的方法，其中在步骤(a)中，使用了第一对引物和第二对引物，每对引物设计来用以分别扩增下列片段的正向引物和反向引物：
-包含HBV DNA序列的第一片段，所述HBV DNA序列在其5′末端包含代表转录+1位点的核苷酸，
-包含HBV DNA序列的第二片段，所述HBV DNA序列在其3′末端包含poly A附着点，
第一片段的3’末端与第二片段的5’末端部分重叠。
9.权利要求8的方法，其中第一片段的3’末端与第二片段的5’末端部分重叠并且在重叠部分包含限制性位点。
10.权利要求8的方法，其中第一对引物包含与前C基因5’部位部分互补的正向引物A，所述引物A包含了代表转录+1位点的核苷酸，但不包含前C基因的ATG。
11.权利要求10的方法，其中所述正向引物A包含了不存在于HBV基因组内的限制性位点。
12.权利要求11的方法，其中所述正向引物A包含了选自NotI，AscI，PacI，PmeI和SSe8387 I的限制性位点。
13.权利要求12的方法，其中所述正向引物A包含了SEQ ID NO：1到SEQ ID NO：12中任一个所列的序列。
14.权利要求8的方法，其中第一对引物包含：含有SEQ ID NO：13或14所列序列的反向引物B，或分别含有SEQ ID NO：13和14所列序列的两个反向引物B的混合物。
15.权利要求8的方法，其中第二对引物包含与HBV DNA某一区域互补的正向引物，所述区域位于与第一对引物中的反向引物互补的序列的5’。
16.权利要求15的方法，其中第二对引物的正向引物和第一对引物的反向引物与HBV基因组区域互补，所述HBV基因组区域是重叠的并包含单一的天然限制性位点。
17.权利要求16的方法，其中第二对引物中的正向引物和第一对引物中的反向引物都包含与单一的天然NcoI位点互补的NcoI位点。
18.权利要求15的方法，其中所述正向引物包含SEQ ID NO：15或16所列的序列，或是分别包含SEQ ID NO：15和16所列序列的两种引物的混合物。
19.权利要求8的方法，其中第二对引物包含反向引物D，所述反向引物D被设计成与polyA附着位点3′的HBV基因组区域互补。
20.权利要求19的方法，其中反向引物D包含SEQ ID NO：17或18所列的序列，或是分别包含SEQ ID NO：17和18所列序列的两种引物D的混合物。
21.权利要求1-4中任一项的方法，其中使用了与HBV中非常保守的HBV基因组区域互补的引物。
22.权利要求1-4中任一项的方法，其中扩增涉及从20到60次循环。
23.权利要求22的方法，其中扩增涉及从30到50次循环。
24.权利要求23的方法，其中扩增涉及40次循环。
25.权利要求1-4中任一项的方法，其中通过一步克隆法将扩增的HBV片段克隆入载体。
26.权利要求1-4中任一项的方法，其中异源启动子的转录+1位点融合至HBV片段的转录+1位点。
27.权利要求1-4中任一项的方法，其中启动子选自CMV-IE启动子、人类泛素C基因启动子、EF-1α基因启动子、SV40病毒的早期和晚期启动子、劳斯肉瘤病毒的LRT启动子和细胞骨架基因启动子。
28.权利要求27的方法，其中启动子是结蛋白启动子或肌动蛋白启动子。
29.权利要求28的方法，其中启动子是鸡β-肌动蛋白启动子。
30.权利要求28的方法，其中β-肌动蛋白启动子与CMV-IE增强子相联。
31.权利要求1-4中任一项的方法，其中在步骤(c)中，细胞是真核细胞。
32.权利要求31的方法，所述真核细胞来源于肝细胞。
33.权利要求32的方法，所述肝细胞为肝细胞癌细胞系。
34.权利要求31的方法，其中所述细胞直接通过载体转染。
35.权利要求31的方法，其中将所述载体转入到杆状病毒，然后再将该杆状病毒转导入细胞。
36.权利要求31的方法，其中将所述载体转入到细胞系产生组成型表达HBV的稳定细胞系。
37.权利要求4的方法，其中在步骤(e′)中，抗病毒剂是拉米夫定，阿德福韦二匹伏酯，恩替卡韦，恩曲他滨，克来夫定，telbivudine，替诺福韦，β-L-FD4C或其任一组合。
38.权利要求3的方法，其中在步骤(e′)中，药物产品被当作一种潜在抗病毒剂来进行检测。
39.可用作HBV扩增的引物的多核苷酸，其为SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQ IDNO：11，SEQ ID NO：12，SEQ ID NO：13，SEQ ID NO：14，SEQ ID NO：15，SEQ ID NO：16，SEQ ID NO：17，或SEQ ID NO：18所列序列。
40.用于HBV扩增的引物对，其为：(1)正向引物为SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：4，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7，SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9，SEQ ID NO：10，SEQID NO：11或SEQ ID NO：12所列的序列，和(2)反向引物为SEQ ID NO：13或SEQ ID NO：14所列的序列，或其组合。
41.用于HBV扩增的引物对，其为：(1)正向引物为SEQ ID NO：15或SEQ ID NO：16所列的序列，或其组合，和(2)反向引物为SEQ ID NO：17或SEQ ID NO：18所列的序列，或其组合。
42.用于HBV扩增的试剂盒，包括权利要求40的引物对和权利要求41的引物对。
43.载体，包含：
-权利要求1到7中任一项所定义的连续HBV DNA，和
-通过在转录+1位的5’存在限制性位点而在5′被修饰的启动子，其中线性连续HBV DNA的转录+1位点和该启动子的转录+1位点融合，所述启动子在细胞转染后控制从所述连续HBV DNA合成pgRNA。
44.包含权利要求43的载体的杆状病毒或细胞系。
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