CN1215058A - 新的三链形成寡核苷酸结构及其在抗乙肝病毒中的应用 - Google Patents

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Abstract

一种新的三链形成寡核苷酸结构,它能与二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA。用上述结构设计了分别能与乙型肝炎病毒的DR区域及前S基因的启动子区域结合的三链形成寡核苷酸。在其3’端也可用单磷酸化修饰。通过凝胶电泳阻滞试验证明本发明提供的三链形成寡核苷酸能与靶双链DNA形成三链DNA。细胞实验证明该三链形成寡核苷酸可应用于抑制乙肝病毒及用作治疗乙型肝炎的药物。

Description

新的三链形成寡核苷酸结构及其在抗乙肝病毒中的应用
本发明涉及一种新的三链形成寡核苷酸结构，尤指一种能于二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA的寡核苷酸结构及其在抗乙型肝炎病毒中的应用。
80年代，发现在体内的均聚嘌呤或均聚嘧啶序列双链DNA可以反折过来，其中一条链与5’上游的均聚嘌呤或均聚嘧啶的双链DNA形成三链DNA，而与之配对的另一条链则成为单链，而且三链DNA还参与了基因表达的调控(Lyamichev VI,Mirkin SM,et al.J Biomol St ruct Dyn,1986,3:667-9.Larsen A,Weintraub H,et al.Cell,1982,29:609-22.HtunH,Dahlberg JE.Science,1989,243:1571-76.)。在体外也可以通过寡核苷酸与特异的靶DNA识别，形成三链DNA，一条均聚嘌呤或均聚嘧啶的寡核苷酸链能够以碱基配对的方式特异地识别相应的均聚嘌呤/均聚嘧啶的双链DNA序列，以Hoogsteen键或反Hoogsteen键与双链DNA中的嘌呤链结合形成稳定的三链DNA结构。与双链DNA形成三链DNA的寡核苷酸片段则称为三链形成寡核苷酸(Triplex Forming Oligonucleotide,TFO),三链DNA的形成可以阻抑蛋白因子与DNA结合。用末端带有EDTA-Fe2+的TFO与特异的靶序列识别形成三链DNA还能在三链DNA形成的位置特异地切断靶双链DNA(Moser HE,Dervan PB.Science 1987,2 38:645-50.)。因此通过三链DNA的形成，有望在DNA水平抑制基因表达，即所谓的抗基因策略(Antigene Strategy)。它与反义技术及核酶相比，有其优越性。三链形成寡核苷酸是以双链DNA的特定序列为结合位点，通过与特定的双链DNA序列形成三链DNA或在三链DNA的位置上切断靶DNA，抑制基因转录或复制。反义核酸及核酶均是以mRNA为作用靶，通过与mRNA结合以阻断翻译或促进mRNA降解的方式来达到阻断基因表达的目的。在细胞中，一个考贝DNA可以转录出多个mRNA考贝。因此，在DNA水平阻断基因的复制或转录方面可能更为有效。根据三链DNA形成的原理及配对规则，在某一特定基因的启动子中设计三链形成寡核苷酸片段与靶基因的特定序列形成三链DNA，阻碍DNA与蛋白质结合或在某一特定部位设计三链形成寡核苷酸片段与其特定序列形成三链DNA，阻碍复制、转录复合体通过，可以抑制基因的复制或表达。1988年Cooney等证实在人c-myc基因起始位点形成的分子间三链结构可抑制c-myc的转录(Cooney,M.Science,1988,241:450-9)。然而，至今关于利用TFO抑制基因表达实际应用的文献报导还很少。有一项美国专利报道用TFO抑制雄激素受体基因的表达(US 5556956,1996年)。其主要原因是在基因的启动子或在某些特定区域中很少有足够长的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列。较短的TFO与较短的双链靶DNA形成的三链DNA稳定性和专一性不高，因而其抑制作用也不强，限制了抗基因策略的实际应用。对于扩大三链DNA形成的靶DNA范围仅作了一些理论的研究，并无实际应用。Horne和Dervan等设计了一种交替式的三链DNA，即两段均聚嘌呤序列位于双链DNA的两条链上，TFO的一部分与双链中的一条嘌呤链配对，而TFO的另一部分则与双链中的另一条嘌呤链配对(Horne,D.A.,Dervan,P.B.J.Am.Chem.Soc.1990,112,2435-37.)。对于三链DNA形成的稳定性，也有人进行了研究。发现虽然含有单个错配碱基仍然可以形成三链DNA，但其稳定性明显降低。因此，研究新的TFO结构并用于抑制有害基因的表达仍是要解决的问题。也有人研究了TFO的化学修饰来提高TFO的稳定性及抑制作用，包括硫磷酸修饰(Tu,et al.J.Biol.Chem.1995,270:28402-7),3’接一个氨基酸(McShan,W.M.et al.J.Biol.Chem.1992,267:5712-21),3’接胆固醇(Ing,N.H.et al.NucleicAcids Res.1993,21:2789-96.)。虽然一些化学修饰可以提高TFO的稳定性及抑制作用，但TFO的长度仍然是决定TFO的稳定性的最主要的因素。
HBV是一种嗜肝性DNA病毒，其感染可引起急性或慢性肝炎。肝细胞癌(Hepatocellular Carcinoma,HCC)患者中，有80％是HBV感染者，受HBV慢性感染的人群患HCC的相对危险性至少增加100倍。我国是乙型肝炎高流行区，有大约8-10％的人群(约1亿人口)为乙型肝炎(病毒)表面抗原(Hepatitis B(virus)Surface Antigen,HBsAg)的阳性者。由HBV感染引起的乙型肝炎与其相关的HCC是世界性的主要健康问题之一。但是，到目前为止，临床上仍缺乏有效的治疗方法。因此，发展抗HBV的三链形成寡核苷酸作为研究新的治疗方法也是当今的科研方向。但在HBV基因中没有足够长的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列可以作为三链形成寡核苷酸的作用靶，所以寻找一种新的三链形成寡核苷酸结构是一个很有意义的科研工作。
为此，本发明的目的是提供一种能与二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA的寡核苷酸结构，以及该三链形成寡核苷酸结构用于抗乙型肝炎病毒，设计一种抑制乙型肝炎病毒基因的表达及乙型肝炎病毒的繁殖的三链形成寡核苷酸，它包括二类分别能与HBV的DR区域及HBV adr亚型前S基因的二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合的三链形成寡核苷酸。它们还能通过3’单磷酸化修饰以提高稳定性。该三链形成寡核苷酸可应用于作为治疗乙型肝炎的药物。
本发明提供一种能与二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA的寡核苷酸结构。根据三链DNA形成的原理及HBV基因序列，针对HBV的DR区域及HBV adr亚型的前S基因上的二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，本发明设计了相应的三链形成寡核苷酸，并在DNA合成仪上合成如下列所示相应的三链形成寡核苷酸及3’单磷酸化修饰的三链形成寡核苷酸：(参见图1和图2)
B1 5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17nt
B2 5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17nt
B3 5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17nt
B4 5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17nt
B5 5’AAG GAG GAG GA 3’ 11nt
B11 5’AGA GGA GGG GG 3’11nt
B12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21nt
B13 5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3’21nt
B14 5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3’21nt
B15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt
B1(3’P) 5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17nt
B2(3’P) 5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17nt
B3(3’P) 5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17nt
B4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17nt
B5(3’P) 5’AAG GAG GAG GAp 3’11nt
B11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11nt
B12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21nt
B13(3’P) 5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGGp 3’21nt
B14(3’P) 5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGGp 3’21nt
B15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt
为了研究三链形成寡核苷酸与HBV的DR区域及HBV adr亚型前S基因的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合的能力，本发明用凝胶电泳条带移位(Band mobility shift assays)的方法测定了三链DNA形成的热力学参数。TFO B1-B5都能与HBV的前S基因的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合。其中TFO B1-B4强于B5,B4的作用最强。TFO B11,B1 2及B15都能与HBV的DR区域的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合，其中TFO B15和B12强于B11,B15的作用最强。B5和B11分别只与HBV adr亚型的前S基因及DR区域的一段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合，TFO B1-B4强于B5说明TFO B1-B4能与HBV的前S基因的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合。TFOB15和B12强于B11，说明TFO B15和B12能与HBV的DR区域的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合。这些结果说明本发明设计的三链形成寡核苷酸可以与两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合形成三链DNA，而且，结合强的TFO中碱基也是以Hoogsteen键或反Hoogsteen键原则与靶双链DNA配对的。本发明的新的三链形成寡核苷酸与HBV的DR区域及HBV adr亚型前S基因的两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合时靶双链DNA结构有从嘌呤到嘧啶到嘌呤的转折。这一转折虽然使三链DNA的稳定性有所降低，但延长了的三链形成寡核苷酸最终与靶双链DNA结合的稳定性及专一性都大大得到了提高，因而其抑制作用也更强。
为了研究三链形成寡核苷酸对于HBV基因表达及病毒自身繁殖的抑制作用，寻找可用于治疗乙型肝炎的三链形成寡核苷酸，本发明采用含HBV基因的质粒(p1.2Ⅱ)转染到肝来源的HepG2细胞作为研究的模型来研究三链形成寡核苷酸的作用。质粒(p1.2Ⅱ)含有1.2倍长度的HBV(adr亚型)基因克隆，包括全长的HBV基因组及1403～1983的重叠区，它能表达所有的HBV mRNA。p1.2Ⅱ转染到HepG2细胞中之后，可以产生完整的有感染活力的病毒颗粒。用已有的测定试剂盒测定HBsAg和HBeAg的表达量，观察三链形成寡核苷酸对HBV基因表达的抑制作用，测定细胞中HBV病毒DNA的考贝数，观察三链形成寡核苷酸对HBV病毒繁殖的抑制作用。考虑到血清中及细胞内有较高活性的核酸水解酶，其中主要为3’→5’核酸外切酶，它要求3’端为OH基团的核酸为底物。根据发明人以前的研究成果，采取了寡核苷酸3’单磷酸化修饰，当寡核苷酸3’的OH基团被磷酸化后，不能作为3’→5’核酸外切酶的底物，延长了其在血清中及细胞内的滞留时间，因此能够更有效地与目的基因相结合。本发明选择与靶序列结合最强的TFO B4(3’P)和TFO B15(3’P)为代表研究三链形成寡核苷酸对HBV基因表达的抑制作用和对HBV病毒繁殖的抑制作用。研究结果证明本发明合成的三链形成寡核苷酸能够抑制HBV基因的表达以及HBV病毒DNA的复制，从而抑制乙型肝炎病毒的繁殖，因此，可用作治疗乙型肝炎的药物。
本发明的优点在于：
1．提供了一种能与两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA的寡核苷酸结构及其设计方法，可以提高形成三链DNA的稳定性和专一性，扩展了三链形成寡核苷酸的抗基因策略的应用范围。
2．提供了一种三链形成寡核苷酸，它能抑制乙型肝炎病毒基因的表达及乙型肝炎病毒的繁殖。这是一种直接抑制乙型肝炎病毒基因的表达及病毒的繁殖的物质，为乙型肝炎的治疗提供了新的方法。
3．用三链形成寡核苷酸抑制HBV基因的表达及病毒的繁殖具有专一性高的特点，而不会对人体细胞本身产生影响。
4．本发明提供的三链形成寡核苷酸还可以通过在3’末端加上一个磷酸提高其在体内的稳定性。使它们的抑制作用更加明显。由于本发明三链形成寡核苷酸不含非天然的修饰成分，其降解产物不会对人体产生毒副作用。
本发明通过以下附图和实施例作进一步的阐述，但并不限制本发明的范围。
图1 HBV前S基因的21bp双链序列及设计的三链形成寡核苷酸序列。
序列上的数字表示有下划线的碱基在HBV基因中的位置，粗斜体碱基为基因中插入的不同性质配对及在TFO中相应位置插入的碱基。
图2 HBV DR区域的25bp双链序列及设计的三链形成寡核苷酸序列。
序列上的数字表示有下划线的碱基在HBV基因中的位置，粗斜体碱基为基因中插入的不同性质配对及在TFO中相应位置插入的碱基。
图3 HBV前S基因的21bp双链序列与TFO B1-B6形成三链DNA的凝胶电泳分析。A,B,C,D,E,F,G分别是TFOB1-B6和对照寡核苷酸(NC)与双链DNA结合的结果。图片旁的S,D,T分别表示单链、双链和三链DNA的位置。图片底部的S为不加TFO的单链DNA对照；D为不加TFO的双链DNA对照；1-7中所用的TFO的浓度分别为1,2,3,4,5,6,7μmol/L。
图4HBV前S基因的21bp双链序列与TFO B1-B6形成三链DNA时三链DNA与双链DNA之比f/(b-f)与TFO浓度a的关系曲线。
图5 HBV DR区域的25bp双链序列与TFO B11-B15形成三链DNA的凝胶电泳分析。A,B,C,D,E分别是TFO B11-B15与双链DNA结合的结果。其余同图3。
图6 HBV DR区域的25bp双链序列与TFO B11-B15形成三链DNA时三链DNA与双链DNA之比f/(b-f)与TFO浓度a的关系曲线。
图7三链形成寡核苷酸对HBsAg表达抑制的时间曲线。
三链形成寡核苷酸或对照脱氧寡核苷酸浓度为10μmol/L。不加寡核苷酸(×)，加B4(3’P)(◆)，加B15(3’P)(■)，对照脱氧寡核苷酸(▲)。
图8三链形成寡核苷酸对HBeAg表达抑制的时间曲线。
三链形成寡核苷酸或对照脱氧寡核苷酸浓度为10μmol/L。不加寡核苷酸(×)，加B4(3’P)(◆)，加B15(3’P)(■)，对照脱氧寡核苷酸(▲)。
图9 TFO B15(3’P)对预转染HBV质粒的HepG2细胞中HBsAg表达的抑制作用。三链形成寡核苷酸B15的浓度为10μmol/L。
图10 TFO B15(3’P)对预转染HBV质粒的HepG2细胞中HBeAg表达的抑制作用。三链形成寡核苷酸B15的浓度为10μmol/L。
图11点杂交检测HepG2细胞中HBV DNA。
1不加寡核苷酸；2加TFO B4(3’P)；3加TFO B15(3’P)；4加对照寡核苷酸
实施例1三链形成寡核苷酸的设计、合成及纯化
1-1三链形成寡核苷酸片段的设计
在乙型肝炎病毒adr亚型的3127-3143核苷酸的位置有一段17bp的序列，除其中第12位插入一个胞嘧啶外，均为嘌呤(如图1所示)。根据三链DNA的配对规则，合成了两条互补的乙肝病毒前S基因片段(片段Ⅰ，片段Ⅱ)、一系列三链形成寡核苷酸片段(TFO B1-B6)及对照寡核苷酸(NC)，其中TFO B1-B4在前S基因片段胞嘧啶的相应位置分别采用胸腺嘧啶，胞嘧啶，腺嘌呤或鸟嘌呤，以确定哪个碱基能较好地与G-C配对，形成较稳定的三碱基体，从而使其形成的三链DNA具有较高的稳定性；TFO B6与TFO B1-B45’端的11个核苷酸相同，都是嘌呤核苷酸，可以与前S基因片段形成三链DNA，而TFO B6 3’端的8个核苷酸均为T，不能与前S基因片段形成三链DNA。通过比较TFO B1-B4及TFO B6与前S基因片段形成三链DNA的稳定性，可以了解TFO B1-B4的3’端能否与前S基因片段形成三链DNA，从而知道在均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的双链DNA中，如果有一个不同性质的碱基插入时，三链DNA形成是否中断，NC为对照寡核苷酸。
在乙型肝炎病毒基因组的DR区域，1734-1754位核苷酸的位置有一段21bp的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，其5’端11bp和3’端8bp为均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，在12、13位插入相反的两个AT对(如图2所示)。根据三链DNA的配对规则，合成了两条互补的乙肝病毒Dr基因片段(片段Ⅲ,片段Ⅳ)及一系列三链形成寡核苷酸(TFO)片段B11-B15,TFO B12-B15在DR区域片段中TT的相应位置分别采用AA,GG,CC或TT，以确定哪个碱基能较好地与两个AT配对，形成较稳定的三碱基体，从而使其形成的三链DNA具有较高的稳定性；通过比较TFO B12-B15及B11与DR区域片段形成三链DNA的稳定性，可以了解TFO B12-B153’端的8个碱基能否与DR区域片段形成三链DNA，从而知道在均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的双链DNA中，如果有两个不同性质的碱基插入时，其两侧的碱基是否能同时与靶DNA形成三链DNA。
1-2三链形成寡核苷酸的末端修饰
对上述TFO B1-B5及TFO B11-B15寡核苷酸采取3’单磷酸化修饰。
1-3三链形成寡核苷酸的合成及纯化
寡核苷酸在PE公司生产的DNA合成仪(ABI391-EP)上，用亚磷酸酰胺三酯法合成，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化。
1-3-1 3’-OH寡核苷酸的合成
用0.2μmole固相柱(Glen Research产品)，在ABI 391EP DNA合成仪上用0.2μmole合成顺序合成。
1-3-2 3’单磷酸化修饰寡核苷酸的合成
使用0.2μmole 3＇磷酸固相柱(3＇-phosphate CPG Glen Research公司产品，全称2-[2-(4,4’-二甲基三苯甲氧基)乙磺酰]乙基-丁二酰长链烷基胺-微孔玻璃珠(2-[2-(4,4’-Dimethoxytrityloxy)ethylsul-fomyl]ethyl-succinoyl long chain alkylamino-CPG)，用相同的合成顺序合成。
1-3-3本实验所合成的脱氧寡核苷酸包括
片段Ⅰ 5’CA TTC CTC CTC CTG CCT CC AC 3’21nt
片段Ⅱ 3’GT AAG GAG GAG GAC GGA GG TG 5’21nt
B1  5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17nt
B2  5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17nt
B3  5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17nt
B4  5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17nt
B5  5’AAG GAG GAG GA  3’11nt
B6  5’AAG GAG GAG GAT TTT TTT T 3’     19nt
B4(3’P) 5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’  17nt
对照   5’GGG ATG CAG TGG TGG AAT TCC ACA 3’24nt
片段Ⅲ 5’AA TCT CCT CCC CCA ACT CCT CCC AG 3’25nt
片段Ⅳ 3’TT AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG TC 5’25nt
B11  5’AGA GGA GGG GG 3’   11nt
B12  5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21nt
B13  5’AGA GGA GGG GGG GGA GGA GGG 3’21nt
B14  5’AGA GGA GGG GGC CGA GGA GGG 3’21nt
B15  5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt
B15(3’P) 5’ AGA  GGA  GGG  GGT  TGA  GGA  GGGp  3’21nt
实施例2三链形成寡核苷酸与靶双链DNA结合
2-1方法
2-1-l寡核苷酸片段的标记及32P标记的双链片段的纯化
取50pmol寡核苷酸片段Ⅰ(或Ⅲ)，加5μCi32p-ATP,2uT4多聚核苷酸激酶，1μl 10×反应缓冲液，加双蒸水至10μl,37℃保温1小时，取4μl于冰浴中，另外6μl加入50pmol寡核苷酸片段Ⅱ(或Ⅳ)，100℃保温5分钟，缓慢退火，然后走15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，做好同位素标记，放射自显影，切割含寡核苷酸片段Ⅰ及Ⅱ(或Ⅲ及Ⅳ)双链DNA条带，压碎凝胶，加500μl蒸馏水，在旋转仪上浸泡过夜，过玻璃棉小柱，去除凝胶碎片，滤过液测定同位素放射性强度并加未标记的双链DNA片段至1pmol/μl,-20℃保存待用。
2-1-2三链DNA形成及凝胶电泳阻滞试验
在10μl反应体系中含0.1pmol/L32P标记的双链DNA片段，10mmol/LTris.HCl pH7.5,0.5mmol/L Spermidinc,10mmol/L MgCl2，分别加入0、1、2、3、4、5、6、7μmol/L不同的TFO，在37℃水浴中保温4小时，冰浴10分钟，走15％非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，4℃、电压100伏特，电泳4小时，然后放射自显影。密度扫描计上分析各条带的黑度。在研究外界条件对三链DNA形成的影响时改变为相应的条件，电泳条件相同。
2-1-3三链DNA形成的结合常数(Ka)、解离常数(Kd)及自由能变化(△G)的计算寡核苷酸与双链DNA结合的化学反应式为：TFO+双链DNA=三链DNA，假设三链形成寡核苷酸与双链DNA的起始浓度分别为a和b，平衡后三链DNA的浓度为f，那么，平衡后三链形成寡核苷酸及双链DNA的浓度分别为(a-f)及(b-f)。那么， Ka = f ( a - f ) ( b - f ) ，当a＞＞f时，a-f≈a，那么， Ka = f a ( b - f ) , ( f b - f ) = Ka × a , 以
Figure A9710666700124
对a作图，可得一直线，其斜率为Ka。 Kd = 1 Ka , △G=-RTlnKa,R为气体常数，T为绝对温度，可计算三链DNA形成的自由能变化△G。
2-2实验结果及分析
2-2-1 TFO与乙肝病毒前s基因两段相近均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的作用
2-2-1-1 TFO与标记的乙肝病毒前S双链基因片段形成三链DNA及凝胶阻滞分析
寡核苷酸片段Ⅰ经5’末端32P标记后部分与片段Ⅱ复性，经聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到32P标记的寡核苷酸单链及32P标记的乙肝病毒前S基因双链片段。用合成的寡核苷酸与32P标记的乙肝病毒前S基因双链片段进行凝胶阻滞分析，本发明设计合成的寡核苷酸除对照寡核苷酸NC之外，其它的寡核苷酸B1、B2、B3、B4、B5、B6均可与乙肝病毒基因片段形成三链DNA，如图3所示。
2-2-1-2 TFO与乙肝病毒前S基因形成三链DNA的平衡常数、解离常数及自由能变化
通过对放射自显影结果进行黑度扫描，计算出三链DNA形成反应平街之后双链DNA及三链DNA的浓度[b-f]及[f]，然后，以
Figure A9710666700131
对a作图，可得一直线，其斜率为Ka(如图4所示)。通过Ka值计算Kd及△G， Kd = 1 Ka ，△G=-RTlnKa。如表1所示。
表1．TFO与HBV前S基因片段形成三链DNA的热力学参数
B1  B2  B3  B4  B5  B6
Ka(×105M-1) 6.97  4.57     6.75     7.71     0.91     1.68
Kd(×10-6M) 1.44  2.19     1.48     1.30     11.0     5.95
△G(-kcal/mol) 8.42  8.16     8.4     8.48     5.71     7.53
从结果可见，在与乙型肝炎病毒的前S基因从3127至3143位的17bp基因片段作用时，TFO B1-B4的5’端11个核苷酸及3’端5个核苷酸都是序列相同的多聚嘌呤核苷酸，可分别与靶序列的5’端11bp及3’端5bp相作用，寡核苷酸B6只有5’端11个核苷酸可与靶双链DNA形成三链DNA，而其3’端的8个多聚T碱基不能与靶双链DNA配对，结果如图3、图4及表1所示，TFO B6与乙肝病毒前s基因片段形成三链DNA的量及其Ka值要明显少于寡核苷酸B1-B4，而与B5相近，说明寡核苷酸B1-B4的5’端及3’端的核苷酸均可以与靶双链DNA结合形成三链DNA。
TFO B1-B4的5’端11个核苷酸及3’端5个核苷酸均是同样序列的多聚嘌呤核苷酸，只是其中第12位分别是T、C、A或G，通过它们分别与乙肝病毒基因前S片段形成三链DNA的稳定性之间的差别，可以了解靶双链DNA均聚嘌呤链中插入单个胞嘧啶时其第三链寡核苷酸中的相应位置应该用哪一种碱基与之配对。通过三链DNA形成及凝胶阻滞试验，结果显示，TFO B4与乙肝病毒基因片段结合形成三链DNA最稳定。因此，如果靶双链DNA的均聚嘌呤链中间有C碱基插入时，在均聚嘌呤的TFO上应用G碱基与之配对，形成GGC三碱基体较为稳定。
TFO B5只有11个核苷酸，TFO B1-B4有17个核苷酸，寡核苷酸B5虽然能与靶序列形成三链DNA，但是稳定性比TFO B1-B4差。所以，相对于同一个靶双链DNA序列，TFO越长，它们所形成的三链DNA越稳定。
2-2-2 TFO与乙肝病毒DR区域两段相近均聚嘌呤/均聚嘧啶序列的作用
2-2-2-1 TFO与标记的乙肝病毒DR区域片段形成三链DNA及凝胶阻滞分析
寡核苷酸片段Ⅲ经5’末端32P标记后部分与片段Ⅳ复性，经非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化得到32P标记的寡核苷酸单链及32P标记的乙肝病毒DR区域双链片段。用合成的寡核苷酸与32P标记的乙肝病毒DR区域双链片段进行凝胶阻滞分析，本发明设计合成的寡核苷酸B11、B12、B13、B14、B15均可与乙肝病毒基因DR片段形成三链DNA，如图5所示。
2-2-2-2寡核苷酸与乙肝病毒基因形成三链DNA，的平衡常数、解离常数及自由能变化
通过对放射自显影结果进行黑度扫描，计算出三链DNA形成反应平衡之后双链DNA及三链DNA的浓度[b-f]及[f]，然后，以
Figure A9710666700141
对a作图，可得一直线，其斜率为Ka，如图6所示。通过Ka值计算Kd及△G， Kd = 1 Ka , ΔG=-RTlnKa。如表2所示。
表2．TFO与HBV DR基因片段形成三链DNA的热力学参数
B11  B12  B13  B14  B15
Ka(×106M-1) 1.23     1.68     1.25     0.93     2.21
Kd(×10-7M) 8.11     5.94     8.02     10.7     4.52
ΔG(-kcal/mol) 8.78     8.97     8.79     8.6     9.14
乙型肝炎病毒DR区域的1734位至1754位的21bp基因片段的5’端11bp及3’端8bp是均聚嘌呤/均聚嘧啶序列，中间第1745、1746位插入两个A-T碱基对。TFO B11的11个均聚嘌呤碱基能与靶DNA的5’端第一段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合，TFO B12-B15的5’端11个核苷酸及3’端8个核苷酸的寡聚嘌呤核苷酸分别可与靶双链DNA的两段均聚嘌呤/均聚嘧啶序列结合，而中间各插入两个核苷酸AA、GG、CC和TT。通过它们分别与乙肝病毒基因片段形成三链DNA的稳定性之间的差别，可以了解靶双链DNA的均聚嘌呤链中存在两个胸腺嘧啶时其第三链寡核苷酸中的相应位置应该用哪一种碱基与之配对。通过三链DNA形成及凝胶阻滞试验，结果表明，寡核苷酸B11-B15均可以与靶双链DNA结合形成三链DNA，但是，它们的稳定性却不同。TFO B13与靶DNA结合形成三链DNA的稳定性和B11与靶DNA结合形成三链DNA的稳定性相近，说明，TFO B13只有5’端的11个碱基参与三链DNA的形成，而TFO B15及B12与靶DNA形成三链DNA的稳定性要明显高于B11与靶DNA形成三链DNA的稳定性，说明TFO B15及B12的5’端11个核苷酸及3’端8个核苷酸均参与三链DNA的形成。而且，插入TT比插入从对在两段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列上形成三链DNA的影响更小。TFO B14与靶DNA结合形成三链DNA的稳定性比B11与靶DNA结合形成三链DNA的稳定性差，表明CC的存在影响了两侧三链DNA的稳定性。TFO B11只有11个核苷酸，TFO B15有21个核苷酸，它们都能与靶序列形成三链DNA，但是TFO B15与靶DNA形成三链DNA的稳定性要明显比TFO B11高。所以，相对于同一个靶双链DNA序列，TFO越长，它们所形成的三链DNA越稳定。
实施例3三链形成寡核苷酸B4(3’P)和B15(3’P)对乙型肝炎病毒基因表达的影响：
3-1实验步骤
3-1-1质粒DNA(p1.2Ⅱ)及三链形成寡核苷酸共转染HepG2细胞
HepG2细胞培养于1×DMEM(含10％胎牛血清)培养液中，37℃，5％ CO2培养，转染前一天，接种细胞于96孔板，培养过夜，转染前2小时换新鲜的培养液。配制溶液A：0.8μg质粒p1.2Ⅱ，及不同浓度的脱氧寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，脱氧寡核苷酸分别是0、40、80、120、160、200pmol。当转染体积是20μl时，脱氧寡核苷酸的终浓度分别是0、2、4、6、8、10μmol/L)，加DMEM至10μl，混匀；溶液B：0.3μl lipofectin,9.7μl DMEM，混匀，室温放置30分钟。溶液A和溶液B混匀，室温放置30分钟。用DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液(每个样孔做6次，其中3个样品的上清用重复测定HBsAg，另三个样品的上清用于重复测定HBeAg),37℃,5％ CO2培养5小时，加入100μl含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续培养120小时，取100μl细胞培养上清用于HBsAg及HBeAg的测定。
3-1-2细胞培养上清中HBsAg及HBeAg的测定
在包被抗HBs或HBe反应板加入100μl待测标本，并设HBsAg或HBeAg阳性对照2孔，阴性对照2孔，空白对照1孔，然后每孔加入酶结合物100μl(空白不加)，充分混匀，封板。37℃孵育1小时。弃去反应板孔内液体，用洗涤液注满每孔，静置20秒钟，甩干，反复5次。然后每孔加底物液100μl，封板。37℃孵育15分钟，加终止液50μl。最后，在酶标仪上用空白孔校零，读取各孔反应液在492毫微米的吸收A492值。
3-1-3三链形成寡核苷酸对HBsAg及HBeAg抑制率的计算方法
3-2实验结果及分析
3-2-1三链形成寡核苷酸与HBV质粒DNA共转染HepG2细胞时对HBV基因表达影响的时间效应
在12孔板培养HepG2细胞，每个孔分别转染带有HBV基因质粒p1.2Ⅱ10μg及10μmol/L的TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，每个样品重复3次，并每隔12小时取200μl培养液，其中100μl培养液用于测定HBeAg，另100μl培养液用于测定HBsAg，三次重复取平均值，结果如图7、图8所示。HBV基因转染HepG2细胞后，当不加三链形成寡核苷酸时，HBeAg及HBsAg在第二天开始表达，随着时间的增加，表达量逐步升高。当10μmol/LTFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)与HBV质粒DNA共转染时，HBeAg及HBsAg的表达比不加TFO时要明显降低，尤其是加入TFO B15(3’P)时，对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用尤其显著，HBeAg及HBsAg的表达量上升很慢。同时，当加入对照寡核苷酸时，HBeAg及HBsAg的表达量也有些降低，这可能是由于DNA转染系统中的寡核苷酸影响了HBV DNA的转染效率，因此，HBeAg及HBsAg的表达量有所下降。但是，HBeAg及HBsAg表达量下降的幅度要明显小于三链形成寡核苷酸对HBeAg及HBsAg表达的抑制作用。
3-2-2 TFO B15(3’P)在预转染p1.2Ⅱ的HepG2细胞中，对HBV抗原表达影响的时间效应
在12孔板培养HepG2细胞，每个孔分别转染带有HBV基因质粒p1.2Ⅱ，然后，在细胞培养液中加入终浓度为10μmol/L的TFO B15(3’P)，每个样品重复3次，并每隔10小时取200μl培养液，其中100μl培养液用于测定HBeAg，另100μl培养液用于测定HBsAg，三次重复取平均值，结果如图9、图10所示。HBV基因转染HepG2细胞后，当不加三链形成寡核苷酸时，HBeAg及HBsAg在第二天开始表达，随着时间的增加，表达量逐步升高。当细胞培养液中含10μmol/L TFO B15(3’P)时，HBsAg的表达比不加TFO时要明显降低，但是对HBeAg的影响较小。
实施例4三链形成寡核苷酸对乙型肝炎病毒在HepG2细胞中繁殖的抑制作用
4-1实验步骤
4-1-1质粒DNA及三链形成寡核苷酸的转染
HepG2细胞培养于1×DMEM(含10％胎牛血清)培养液中，于37℃，5％ CO2培养，转染前一天，接种细胞于12孔板，培养过夜，转染前5小时换新鲜的培养液。配制溶液A：质粒p1.2Ⅱ10μg，三链形成寡核苷酸在转染混合液中的终浓度为10μmol/L，加不含血清的DMEM至110μl，混匀；溶液B：6μl lipofectin,114μl不含血清的DMEM，混匀，室温放置30分钟。用不含血清的DMEM洗细胞两次，加入上述转染混合液(每个样品重复3次)，37℃,5％CO2培养5小时，加入2ml含10％胎牛血清的DMEM培养基，继续在37℃,5％ CO2培养5天。
4-1-2细胞DNA的抽提
10μmol/L三链形成寡核苷酸作用5天后，用胰酶消化细胞，合并重复三次的细胞，在4℃以3000g离心2分钟，收集细胞于1.5ml Eppendorf管中，加入1ml TRIzol试剂，充分混匀，室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，振荡15秒，室温放置2～3分钟，4℃ 1200g离心15分钟，将水相转移至另一个1.5ml Eppendorf管中，用于总RNA的抽提。在中层及下层有机相中加入0.3ml无水乙醇，混匀，室温放置5分钟，然后10,000g离心5分钟，弃上清，加入1ml 0.1mol/L柠檬酸钠，10％乙醇溶液，室温放置30分钟，每5分钟混匀一次，然后于4℃,10,000g离心5分钟，重复用1ml 0.1mol/L柠檬酸钠，10％乙醇溶液洗一次，悬浮于75％乙醇中，室温放置20分钟，每5分钟摇动一次，于4℃,10,000g离心5分钟，置于空气中干燥后，加入100μl 8mmol/L NaOH溶解。
4-1-3 HBV基因探针的制备
质粒p1.2Ⅱ用BamHⅠ酶切、电泳，纯化出含3.2kb长度的完整线性HBV DNA，用随机六核苷酸引物法制备HBV DNA探针，(参见：分子克隆实验指南，第二版，J.Sambrook &,E.F.Fritsch及T.Maniatis著，金冬雁等译，科学出版社，1986年，502-504)。
4-1-4用点杂交(Dot Blot)检测HBV DNA
用抽滤加样器把变性的DNA样品点到尼龙膜上，用紫外交联于膜上，然后与32P标记的HBV DNA探针杂交。(参见：现代分子生物学实验技术，卢圣栋主编，高等教育出版社，1993年，209-210)。
4-2结果：三链形成寡核苷酸对HepG2细胞中HBV基因考贝数的影响
在12孔板培养HepG2细胞，每个孔分别转染带有HBV基因质粒1.2Ⅱ和10μmol/L的三链形成寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)，每个样品重复3次，五天后消化细胞，抽提DNA做点杂交，结果如图11所示。从图中可以看出，用三链形成寡核苷酸TFO B4(3’P)或TFO B15(3’P)作用的HepG2细胞中，其HBV DNA的考贝数要少于不加三链形成寡核苷酸及加不与HBV DNA配对的寡核苷酸的细胞中的考贝数(杂交点直径小，黑度浅)，说明三链形成寡核苷酸可以抑制HBV的繁殖。

Claims (6)

1．一种三链形成寡核苷酸结构，其特征在于它具有能与二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列形成三链DNA的寡核苷酸结构。
2．根据权利要求1所述的三链形成寡核苷酸结构，其特征在于所述二段相近的均聚嘌呤/均聚嘧啶序列是HBV的DR区域及HBV adr亚型的前S基因启动子区域，分别与之结合的是一种抑制乙型肝炎病毒(Hepatitis BVirus,HBV)基因表达及乙型肝炎病毒繁殖的三链形成寡核苷酸。
3．根据权利要求2所述的三链形成寡核苷酸，其特征在于该三链形成寡核苷酸包括5条与HBV adr亚型的前S基因启动子区域结合的三链形成寡核苷酸TFO B1-B5,3条与HBV的DR区域结合的三链形成寡核苷酸TFOB11,B12及B15。它们的序列如下：
B1  5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17nt
B2  5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17nt
B3  5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17nt
B4  5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17nt
B5  5’AAG GAG GAG GA 3’11nt
B11 5’AGA GGA GGG GG 3’11nt
B12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21nt
B15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt。
4．根据权利要求2,3所述的三链形成寡核苷酸，其特征在于该三链形成寡核苷酸可以通过3’单磷酸化修饰得下列三链形成寡核苷酸：
B1(3’P)  5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17nt
B2(3’P)  5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17nt
B3(3’P)  5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17nt
B4(3’P)  5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17nt
B5(3’P)  5’AAG GAG GAG GAp 3’11nt
B11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11nt
B12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21nt
B15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt。
5．根据权利要求2或3所述的三链形成寡核苷酸，其特征在于该三链形成寡核苷酸含有下列序列之一：
B1  5’AAG GAG GAG GAT GGA GG 3’17nt
B2  5’AAG GAG GAG GAC GGA GG 3’17nt
B3  5’AAG GAG GAG GAA GGA GG 3’17nt
B4  5’AAG GAG GAG GAG GGA GG 3’17nt
B5  5’AAG GAG GAG GA 3’11nt
B11 5’AGA GGA GGG GG 3’11nt
B12 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGG 3’21nt
B15 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGG 3’21nt。
可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
6．根据权利要求4所述的三链形成寡核苷酸，其特征在于该三链形成寡核苷酸含有下列之一：
B1(3’P)  5’AAG GAG GAG GAT GGA GGp 3’17nt
B2(3’P)  5’AAG GAG GAG GAC GGA GGp 3’17nt
B3(3’P)  5’AAG GAG GAG GAA GGA GGp 3’17nt
B4(3’P)  5’AAG GAG GAG GAG GGA GGp 3’17nt
B5(3’P)  5’AAG GAG GAG GAp 3’11nt
B11(3’P) 5’AGA GGA GGG GGp 3’11nt
B12(3’P) 5’AGA GGA GGG GGA AGA GGA GGGp 3’21nt
B15(3’P) 5’AGA GGA GGG GGT TGA GGA GGGp 3’21nt
可应用于配制抑制乙肝病毒及治疗乙型肝炎的药物。
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