CN1151168C - 靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 - Google Patents
靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 Download PDFInfo
- Publication number
- CN1151168C CN1151168C CNB991234057A CN99123405A CN1151168C CN 1151168 C CN1151168 C CN 1151168C CN B991234057 A CNB991234057 A CN B991234057A CN 99123405 A CN99123405 A CN 99123405A CN 1151168 C CN1151168 C CN 1151168C
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- antisense
- oligonucleotide
- agccg
- birm
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Landscapes
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
Abstract
本发明涉及靶向蛋白激酶C-α的反义寡核苷酸，含它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。
Description
本发明涉及靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核苷酸，含它们的药物组合物及其用于治疗癌症的用途。
癌症是目前全世界直接导致人类死亡的主要疾病之一。传统的基于细胞毒化学治疗方法具有选择性差、副作用强等缺点，因此，寻找特异性强、尤其是干扰与癌细胞行为密切相关蛋白表达的药物是人们所希望的。Nicholas Dean等人在“通过蛋白激酶C-α表达的反义寡核苷酸抑制剂抑制裸鼠中肿瘤细胞系生长，Cancer Res(癌症研究)，56，3499-3507，1996年8月1日”一文中披露了用于治疗人体癌症的靶向蛋白激酶C-α的反义寡核苷酸，其代表物为编号ISIS 3521的寡脱氧核苷酸，该核苷酸序列为：5′-TGTCT CGCTG GTGAG TTTCA-3′。但人们认为反义寡核苷酸的设计、开发有较大的随机性(W Roush Science1997；276：1192～1193)，因此反义药物的选择还缺乏理论指导。
本发明的目的是以靶点mRNA的二级结构及系统发育保守性为基础，寻找靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义核苷酸药物。
本发明者经广泛深入研究，通过固相合成法合成了一系列硫代寡核苷酸并进行了筛选。现已发现下面八个对PKC-α异常表达如肺腺癌A549细胞株有良好抑制作用的反义硫代寡核苷酸。
因此，本发明第一方面涉及的是具有下面序列1-8的靶向蛋白酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核苷酸：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′，今后简称为BIRM-AP1224(20)，
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，今后简称为BIRM-AP1240(20)。
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，今后简称为BIRM-AP0155(20)，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，今后简称为BIRM-AP0186(20)，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，今后简称为BIRM-AP0478(20)，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，今后简称为BIRM-AP0973(20)，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，今后简称为BIRM-AP1261(20)，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′，今后简称为BIRM-AP1755(20)，
本发明再一方面涉及的是药物组合物，其包括具有下面序列的反义硫代寡核苷酸及药用载体和赋形剂：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′，
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
本发明再一方面涉及的是上述序列1-8的反义硫代核苷酸用于治疗癌症的用途。
本发明再一方面涉及的是上述序列1-8的反义硫代梳苷酸用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
根据本发明，本发明的反义硫代寡核苷酸序列1-8是以PKC-αmRNA的蛋白编码区(5′-CTTGACGCAGCTGCACTCCT-3′，5′-TCCTGCTTCCAGACAGTGGA-3′，5′-TCTTCAAGCAGCCCACCTTC-3′，5′-CACCGACTTCATCTGGGGGT-3′，5′-TGCGGAATGGATCACACTGA-3′，5′-AAAGTCATCAGTCCCTCTGA-3′，5′-CGGCTGTACTTCGTCATGGA-3′，5′-CCCAGCCAAGCGGCTGGGCT-3′)为靶点设计合成与以上靶点反向互补的硫代脱氧寡核苷酸，其对肺腺癌A549和胃癌BGC细胞的增殖有良好的抑制作用。
因此本发明的靶向PKC-α的反义硫代寡核苷酸可用作抗癌药物。
在本发明的优选具体实施方案中，优选作用于肺腺癌A549细胞株的本发明序列1-8的反义硫代寡核苷酸。
根据本发明，本发明的药物组合物中还有含有作用于其它靶点的反义寡核苷酸。
下面的实施例是对本发明的进一步说明，但不意味着对本发明任何限制。
实施例一：
1.人肿瘤细胞系(A549等)的培养及反义寡核苷酸的处理：
接种细胞于含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中(补充青、链霉素各100ku·L-1)，培养器皿置于37℃含有5％CO2的细胞培养箱中。培养细胞达到50～60％融合时，用无血清培养基冲洗2遍。按Gibco BRL公司脂质体转染说明书的要求，将反义寡核苷酸导入到肿瘤细胞内。将脂质体/无血清培养基＝1/5的比例，配制成脂质体溶液，室温下静置30～40分钟。等体积混合用无血清培养基溶解的不同浓度的反义寡核苷酸，静置10～15分钟后，加入到培养器皿中，迅速补充4倍的无血清培养基。置于37℃含5％CO2的培养箱中6小时后，换正常培养基，培养48～72小时后MTT法测定细胞活度。对照组仅含等浓度的脂质体。
2.靶向PKC-αmRNA的反义硫代寡核苷酸对肿瘤细胞的抑制作用：
将对数生长期的肺腺癌A549细胞或其它的细胞接种于96孔培养板中，4000个细胞/孔。培养18～24小时，按上述方法，加入不同浓度的反义寡核苷酸，反应终体积均为200μl。换正常培养基继续培养48～72小时，弃上清。每孔加入200μl新鲜配制的含0.5mg/ml四氮唑盐(MTT)的无血清培养基，37℃培养4小时后弃上清。以200μl DMSO溶解甲。轻度振荡后，用酶标仪在检测波长为570nm、参比波长为450nm下测定光吸收值。
经反转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)，实验证实，本发明反义硫代寡核苷酸对A549细胞内PKC-αmRNA有特异性的抑制作用。
本发明反义硫代寡核苷酸对肺腺癌A549细胞系有强抑制增殖作用。
表1～8显示本发明反义硫寡核苷酸对A549肺腺癌细胞体外增殖的抑制作用，并与对照核苷酸序列ISIS3521进行了比较。结果表明BIRM-AP1224(20)，BIRM-AP1240(20)，BIRM-AP0155(20)，BIRM-AP0186(20)，BIRM-AP0478(20)，BIRM-AP0973(20)，BIRM-AP1261(20)，BIRM-AP1755(20)在抑制肺腺癌A549细胞系增殖上强或近于阳性对照ISIS3521。(数据来自4次重复实验的平均值)
表1 BIRM-P1224-20
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP1224(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 91.1±5.8 | 90.7±4.5 |
| 200 | 88.7±8.5 | 82.4±5.7 |
| 80 | 58.5±22.6 | 49.7±11.5 |
| 32 | 21.7±5.8 | 1 1.3±9.8 |
表2 BIRM-AP1240(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP1240(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 90.2±1.8 | 90.7±4.5 |
| 200 | 82.1±5.8 | 82.4±5.7 |
| 80 | 36.9±3.9 | 49.7±11.5 |
| 32 | 14.3±4.0 | 11.3±9.8 |
表3 BIRM-AP0155(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP0155(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 92.4±5.4 | 90.7±4.5 |
| 200 | 88.9±3.8 | 82.4±5.7 |
| 80 | 49.2±13.8 | 49.7±11.5 |
| 32 | 26.5±11.9 | 11.3±9.8 |
表4 BIRM-AP0186(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP0186(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 96.2±0.9 | 90.7±4.5 |
| 200 | 90.5±8.8 | 82.4±5.7 |
| 80 | 48.3±19.4 | 49.7±11.5 |
| 32 | 30.7±14.4 | 11.3±9.8 |
表5 BIRM-AP0478(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP0478(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 90.2±3.9 | 90.7±4.5 |
| 200 | 77.0±16.5 | 82.4±5.7 |
| 80 | 41.5±20.9 | 49.7±11.5 |
| 32 | 30.7±9.5 | 11.3±9.8 |
表6 BIRM-AP0973(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP0973(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 93.2±1.0 | 90.7±4.5 |
| 200 | 79.0±8.9 | 82.4±5.7 |
| 80 | 36.1±9.8 | 49.7±11.5 |
| 32 | 27.0±8.1 | 11.3±9.8 |
表7 BIRM-AP1261(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP1261(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 91.5±0.7 | 90.7±4.5 |
| 200 | 91.1±1.8 | 82.4±5.7 |
| 80 | 55.2±16.9 | 49.7±11.5 |
| 32 | 29.7±16.5 | 11.3±9.8 |
表8 BIRM-AP1755(20)
| 浓度(nM) | 抑制率(％) | |
| BIRM-AP1755(20) | ISIS3521 | |
| 500 | 89.0±8.4 | 90.7±4.5 |
| 200 | 88.8±6.6 | 82.4±5.7 |
| 80 | 55.2±6.6 | 49.7±11.5 |
| 32 | 11.7±7.8 | 11.3±9.8 |
实施例二：反义硫代脱氧寡核苷酸的合成
合成方法：用寡核苷酸固相合成亚磷酰胺法，使用美国ABI公司生产的ABI 390Z核酸合成仪的250umol合成程序合成。主要原料为四乙基秋兰姆化二硫(TETD)、亚磷酰胺单体(phosphoramidite monomers)。制备时，将固相支持物连接保护的、通过固相合成的含本发明核苷酸序列的硫代寡核苷酸，用浓氨水在55℃条件下，作用15个小时脱保护，从固相支持物上切离，用HPLC法进行纯化。
序列表
(1)一般资料：
I.序列数量：8
(2)序列BIRM-AP1224(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP1224(20)
AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG 20
(3)序列BIRM-AP1240(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP1240(20)
TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA 20
(4)序列BIRM-AP0155(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP0155(20)
GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA (20)
(5)序列BIRM-AP0186(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP0186(20)
ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG (20)
(6)序列BIRM-AP0478(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP0478(20)
TCAGT GTGAT CCATT CCGCA (20)(7)序列BIRM-AP0973(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP0973(20)
TCAGA GGGAC TGATG ACTTT (20)
(8)序列BIRM-AP1261(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP1261(20)
TCCAT GACGA AGTAC AGCCG (20)
(9)序列BIRM-AP1755(20)的资料：
II.序列特征：
a)核苷酸长度：20
b)类型：核酸
c)链型：单链
d)拓扑特征：链状
III.是否反义：反义
IV.序列描述：BIRM-AP1755(20)
AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG (20)
Claims (7)
1.靶向蛋白激酶C-α的具有序列1-8之一的反义硫代寡核苷酸：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′，
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
2.权利要求1的反义硫代寡核苷酸，反义硫代寡核苷酸具有序列1：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′。
3.权利要求1的反义硫代寡核苷酸，反义寡核苷酸具有序列2-8之一：
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
4.药物组合物，其包括作为活性成份的具有序列1-8之一的反义硫代寡核苷酸和可药用载体。
5.权利要求4的药物组合物，其中的反义硫代寡核苷酸具有序列1：
序列1：5′-AGGAG TGCAG CTGCG TCAAG-3′。
6.权利要求4的药物组合物，其中所述反义硫代寡核苷酸具有序列2-8之一：
序列2：5′-TCCAC TGTCT GGAAG CAGGA-3′，
序列3：5′-GAAGG TGGGC TGCTT GAAGA-3′，
序列4：5′-ACCCC CAGAT GAAGT CGGTG-3′，
序列5：5′-TCAGT GTGAT CCATT CCGCA-3′，
序列6：5′-TCAGA GGGAC TGATG ACTTT-3′，
序列7：5′-TCCAT GACGA AGTAC AGCCG-3′，
序列8：5′-AGCCC AGCCG CTTGG CTGGG-3′。
7.具有序列1-8之一的反义硫代寡核苷酸用于制备用于治疗癌症的药物的用途。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB991234057A CN1151168C (zh) | 1999-11-03 | 1999-11-03 | 靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CNB991234057A CN1151168C (zh) | 1999-11-03 | 1999-11-03 | 靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN1295078A CN1295078A (zh) | 2001-05-16 |
| CN1151168C true CN1151168C (zh) | 2004-05-26 |
Family
ID=5282879
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CNB991234057A Expired - Fee Related CN1151168C (zh) | 1999-11-03 | 1999-11-03 | 靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN1151168C (zh) |
Families Citing this family (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| EP1414841B1 (en) * | 2001-07-10 | 2012-11-14 | Lakewood-Amedex, Inc | Oligonucleotide-containing pharmacological compositions and their use |
-
1999
- 1999-11-03 CN CNB991234057A patent/CN1151168C/zh not_active Expired - Fee Related
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1295078A (zh) | 2001-05-16 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| CN1170367A (zh) | 利用2'-取代寡核苷酸负调节基因表达 | |
| CN1194002C (zh) | 短链化多核苷酸及其制备方法 | |
| CN113249380B (zh) | 靶向covid-19新冠病毒的反义寡核苷酸、natac嵌合分子及其应用 | |
| CN1763093A (zh) | 含有hiv转导结构域的生存素突变体及制备方法和应用 | |
| CN1084564A (zh) | 反义多核苷酸 | |
| CN1289681C (zh) | 乙型肝炎病毒siRNA表达载体的构建以及抗病毒治疗应用 | |
| CN1151168C (zh) | 靶向蛋白激酶C-α(PKC-α)的反义硫代寡核酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 | |
| CN1170928C (zh) | 一种肝癌相关基因及其应用 | |
| CN1831132A (zh) | 一种表达黄曲霉尿酸氧化酶的方法及其专用基因 | |
| CN1844387A (zh) | 抑制Sirt1基因表达的反义寡核苷酸结构和用途 | |
| CN101033489A (zh) | 一种与原发性肝癌相关的cdc6基因的单核苷酸多态位点及其应用 | |
| CN1176098C (zh) | 新的三螺旋形成寡核苷酸及其在抗乙肝病毒中的应用 | |
| CN107217054B (zh) | G6pd基因及其表达产物在治疗结直肠癌中的应用 | |
| CN1800387A (zh) | 抑制多效生长因子基因表达的小干扰rna及其应用 | |
| CN101443021A (zh) | 癌和其他疾病的预防和治疗 | |
| CN1699394A (zh) | 高免疫活CpG－S ODN和拮抗CpG－S ODN作用的CpG－N ODN的基因序列及其应用 | |
| CN1883703A (zh) | 无指盘臭蛙丝氨酸蛋白酶抑制剂及其基因和应用 | |
| CN1117097C (zh) | 类胰岛素生长因子受体基因的反义核酸的抑癌作用 | |
| CN1324034C (zh) | 具有释放NO功能的噁二唑并[3,4－d]嘧啶苷类化合物及其药学上的用途 | |
| CN1131234C (zh) | 针对蛋白激酶基因的反义核酸及其抑瘤作用 | |
| CN1176946C (zh) | 一种新型α干扰素 | |
| CN1141319C (zh) | 一种在真核细胞中高效表达重组人白细胞介素12的方法 | |
| CN1120170C (zh) | 靶向c－raf癌基因的反义硫代寡核苷酸,含它们的药物组合及其用于治疗癌症的用途 | |
| CN1472337A (zh) | 一种预测acei类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药 | |
| CN1946845A (zh) | 水解核糖核酸（RNAs）的化合物 |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| C10 | Entry into substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| C06 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| C14 | Grant of patent or utility model | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| C17 | Cessation of patent right | ||
| CF01 | Termination of patent right due to non-payment of annual fee |
Granted publication date: 20040526 Termination date: 20111103 |