CN1472337A

CN1472337A - 一种预测acei类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药

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Publication number: CN1472337A
Application number: CNA021258635A
Authority: CN
Inventors: 邢厚恂; 蒋善群; 朱国英; 张敏敏; 余运贤; 光文伟; 洪秀梅; 陈常中; 陈光亮
Original assignee: ANHUI BIOLOGICAL MEDICAL SCIENCE INST
Current assignee: BEIJNG AOSA MEDICAL RESEARCH CENTER Inc; Shenzhen Ausa Pharmed Co ltd
Priority date: 2002-07-31
Filing date: 2002-07-31
Publication date: 2004-02-04
Anticipated expiration: 2022-07-31
Also published as: CN1217008C

Abstract

本发明涉及一种预测降压药药效的试剂盒、方法和复方药，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测ACEI类降压药药效的方法及其应用。该试剂盒包括组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶HaeIII和限制性内切酶缓冲液2。方法为通过测定受试者的高半胱氨酸通路上MS基因Asp919Gly多态性位点的基因型，可定性预测ACEI类降压药药效。当把基因型检测结果作为参数，结合其他基本生理参数和特殊参数通过计算机语言运算后，可得到预测结果更为精确的血压下降的定量值。该方法可应用于制造一组提高ACEI类降压效果的复合新药。本发明便于医生在用药时根据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用和经济负担的风险。

Description

一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药

技术领域

本发明涉及一种预测降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药，特别用于通过测定功能基因多态性位点基因型，来预测ACEI类降压药药效的方法及其应用。

背景技术

高血压病是我国和全球最常见的慢性疾病之一，在我国患病率为11％，目前已有一亿多患者，每年增加约300万新发病人。高血压病是引起危及生命的心血管病如心肌梗塞、脑卒中，以及肾脏疾病等的主要原因。血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)类降压药，是临床控制高血压最常用的一类药物。它主要通过抑制肾素-血管紧张素-醛固酮系统中ACE酶的活性来发挥降压的药理作用。

现有各类降压药的降压效果并不理想，单一用药的有效率约为60-70％，并且个体差异性大。这主要是由于缺少可预测药物疗效的指示系统，所以医生在用药时无从根据个体差异进行选择药物、配伍和剂量，相对降低了临床用药、治疗的效率和安全性，增加了发生毒副作用和经济负担的风险。本发明的原理如下：一、血压调节的机制及ACEI的降压药物调控作用：

肾素-血管紧张素-醛固酮系统(RAAS)，作为最主要的生物学通路，在血压调节及高血压发病中都有重要的作用。血管紧张素I转化酶(ACE)是该通路上一种调控血压的、具有关键生物学意义的活化酶。血管紧张素转化酶(ACE)的主要作用之一表现在可以降解缓激肽，间接抑制一氧化氮(NO)合成酶作用，改变内皮细胞依赖性的血管舒张作用。缓激肽与G-蛋白耦联的缓激肽B2受体结合，激活血管内皮细胞中的磷脂酶(PLC)和磷脂酶A2(PLA2)，诱生前列环素(PGI2)与一氧化氮(NO)。正常血管内皮细胞，通过分泌内皮衍化收缩因子(EDCF)和内皮衍化舒张因子(EDRF，已证明是内皮生成的一氧化氮)，动态调节血管壁张力平衡。病理情况下，由于ACE过多降解缓激肽产生连锁病理效应，使内皮一氧化氮生成减少，血管壁平滑肌细胞紧张度失衡，内皮细胞依赖性的血管舒张功能损害，血管外周阻力升高。

血管紧张素转化酶抑制剂(ACEI)的成功研制是近代心血管药物进展的里程碑之一。ACEI类降压药，主要通过ACEI与血管紧张素I转化酶结合，抑制ACE的活性，以此达到(1)抑制血管紧张素II(AngII)的生成，减少醛固酮的分泌；(2)限制缓激肽的降解，进而激活一氧化氮合成酶，保护血管内皮细胞及其依赖性舒张功能，降低交感神经引发的血管壁张力；导致综合作用扩张血管，实现降压效果。

临床广泛用于治疗轻、中度高血压病的苯那普利是ACEI类药物的代表之一，是一种非巯基长效ACE抑制剂，每日仅需口服一次，常用剂量为5-80mg。(Moser M，Abraham PA，Bennett WM，et al.，The effects ofbenazepril，a new angiotensin-converting enzyme inhibitor，in mildto moderate essential hypertension：a multicenter study.Clin Pharmacol Ther 1991，49(3)：322-9)。其他ACEI类临床常用药还包括：卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、西拉普利(cilazapril)、贝那普利(benazepril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、福辛普利(fosinopril)等。二、本发明发现的人类同型半胱氨酸代谢通路上的MS基因Asp919Gly多态性对ACEI类抗高血压药物药效的预测作用：

甲硫氨酸合成酶(MS)是同型半胱氨酸的代谢通路上，保证蛋氨酸循环代谢的重要反应酶。同型半胱氨酸(Homocysteine)是一种含巯基的氨基酸，是蛋氨酸和半胱氨酸代谢过程中一个重要的中间产物。同型半胱氨酸从蛋氨酸经一系列脱甲基反应后有两种去路：(1)进入蛋氨酸代谢循环。经甲硫氨酸合成酶(MS)催化，50％代谢生成的同型半胱氨酸经甲基化生成甲硫氨酸；维生素B12作为辅因子、5，10-甲基四氢叶酸作为供体参加该甲基化过程，最后在蛋氨酸合成酶的作用下重新合成蛋氨酸。(2)缩合形成半胱氨酸。经维生素B6(以5-磷酸-吡哆醇的形式)参与活化胱硫醚-β-合成酶(CBS)，另约50％同型半胱氨酸在CBS的催化下与丝氨酸缩合成胱硫醚，最终代谢为更小分子量的半胱氨酸。

MS基因是同型半胱氨酸代谢通路上的重要侯选基因。已发现MS基因存在改变蛋白功能的单核苷酸多态性。其中在MS基因第2756位碱基上存在A/G多态性，它使基因产物的第919位氨基酸由Asp变为Gly。MS基因Asp919Gly位点突变使MS活性降低。Geisel等报道，甲硫氨酸合成酶(MS)基因Asp919Gly(D919G)多态性，与同型半胱氨酸的代谢物胱硫醚水平的升高显著相关，提示该多态性可能阻碍了同型半胱氨酸的甲基化过程。另有报道MS基因Asp919Gly多态性和其他基因多态性相互作用，引起血浆高同型半胱氨酸水平的升高。研究还表明，遗传和环境两方面因素也会影响血浆同型半胱氨酸的水平。例如已经肯定发现血浆叶酸水平与同型半胱氨酸水平及心脑血管疾病呈负反应关系；但与基因突变位点的关系尚有争议。

MS基因多态性与ACEI类降压机制的关系尚无研究报道。根据前述MS基因突变影响同型半胱氨酸甲基化、及由此导致的高同型半胱氨酸血症的特征，MS基因突变与血管紧张素酶抑制剂(ACEI)的抑制作用机制的关系可能是通过血浆同型半胱氨酸浓度变化产生的生物效应，但目前没有研究报导。目前已知，高同型半胱氨酸血症是高血压、冠心病等心脑血管疾病发病的独立危险因子。血浆同型半胱氨酸水平的升高能引起血管损伤，诱导内皮功能紊乱，刺激血管平滑肌细胞增殖。动物试验提示氧化机制是同型半胱氨酸致病的关键，因为同型半胱氨酸对培养的内皮细胞所产生的毒性作用可被过氧化氢酶所抑制。在高同型半胱氨酸血症时，通过产生的一系列活性氧中间产物(超氧化物阴离子自由基、过氧化氢、羟基等)间接抑制一氧化氮合成酶的活性，抑制了NO的合成并促进其降解，使一氧化氮的释放量下降，从而导致血管功能异常，由NO介导的内皮依赖性血管舒张功能明显受损。而ACE抑制剂通过减少缓激肽的降解，进而激活一氧化氮合成酶，改善血管内皮功能，高同型半胱氨酸浓度可能使ACEI的这一功能削弱或形成拮抗作用，因此MS作为调节高半胱氨酸浓度的关键酶之一，从MS基因Asp919Gly多态性可以反应机体同型半胱氨酸代谢水平，可以推测可能和ACEI类综合降压的效应形成关联。但有关因素对血管内皮功能影响的机制仍有待探讨。

吸烟是公认的高血压、冠心病等心血管疾病的危险因子，饮酒和血压的升高也有关。烟能引起脂代谢紊乱、内皮功能失调，酒精能引起血管平滑肌收缩，影响内皮功能。而在澳大利亚人群中已发现MS基因ASP919GLY多态性和吸烟相互作用，可使冠心病的危险性上升。因此吸烟和饮酒也是认识ACEI类降压作用特征时应考虑的重要因素之一。

在本发明涉及研究发现产生之前，虽然目前的研究提示MS基因与高血压的发生及高血压的药物治疗有密切关系，但是关于MS基因ASP919GLY多态性及其与环境因素交互作用和高血压的关系目前还没有报道；MS基因及其在环境因素交互作用下与ACEI类降压疗效关系，也都是有待于进一步研究课题。

本发明涉及的研究发现：

(1)MS基因ASP919GLY多态性，与高血压的发生有相关性；表现为吸烟人群中Gly等位基因携带者的收缩压和舒张压有增高趋势；饮酒人群中Gly等位基因携带者的舒张压显著高于Asp/Asp纯合型；控制其它混杂因素后这种显著性仍然存在。提示该基因突变可能和吸烟、饮酒相互作用，加强了吸烟、饮酒对内皮的损伤，增加高血压发生的危险性；并在评价降压效应时予以考虑。

(2)在已知MS基因的Asp919Gly多态性情况下，高血压病人经ACEI类药治疗后，在服药后第8、11、14、16天，Asp/Asp野生纯合型个体的收缩压、舒张压下降幅度，都显著高于突变型Gly等位基因携带者，提示MS基因Asp919Gly多态性和ACEI类的降压作用有关；MS基因的基因型，作为预测ACEI类抗高血压药物的指示系统之一：(2.1)可以指示并定性和定量地预测ACEI类降压药的药效；(2.2)且可以指示MS基因多态性对应的代谢(酶)活性/功能状态，作为新药的功能靶点，指导复方降压药物的研发；(2.3)并可以指示结合研制的复方降压药物，更合理选择ACEI类药物的个体最适剂量和最适复合药物的配伍。三、用高半胱氨酸代谢通路上MS基因Asp919Gly多态性预测ACEI类抗高血压药物药效与指导复方降压药物研发的原理：

依据本发明中人MS基因Asp919Gly多态性与ACEI类降压药效密切相关的特征，对于MS基因Asp919Gly多态性，在Asp/Asp野生纯合型个体服用苯那普利降压效果好于Asp/Gly或Gly/Gly突变型个体。因此MS基因多态性反映体内同型半胱氨酸甲基代谢的不同活性状态。可以把MS功能基因对应的影响降压机制，作为新药药用机制的功能靶点，设计一组效果更好的普遍适用的复方降压药物，其原理是利用ACEI类药与血浆高同型半胱氨酸在改变内皮功能上存在着交互作用。ACEI类药可通过改善内皮功能来降低血压；联合配伍促进同型半胱氨酸甲基化等代谢的叶酸供体和维生素辅酶因子，将有利于降低血浆同型半胱氨酸水平，促进NO合成酶活性，促进内皮细胞释放NO及其扩血管作用，保护内皮功能；对于任何MS基因Asp919Gly多态性，都将在不同程度上形成对ACEI类药物作用机制上的协同或补充，提高ACEI类药物的降压效果。形成一组可选择性好的ACEI类高效复合药物。

依据本发明中人MS基因Asp919Gly多态性与ACEI类降压药效密切相关的特征，以及前述基本原理，当MS基因型有Gly等位基因时，MS酶功能受抑制，阻碍了半胱氨酸的甲基化，引起血浆同型半胱氨酸浓度增高，从而导致内皮功能障碍。据此推测，对于Gly等位基因携带的个体，通过最适配伍和组合，能更有针对性地加强同型半胱氨酸甲基化等代谢的叶酸供体和维生素辅酶因子。

因此，无论对一般人群或特殊MS基因Asp919Gly多态性人群，维生素B12、甲基供体四氢叶酸及维生素B6与ACEI类降压药联用，均可增进ACEI类降压药的降压药效。测定MS的上述基因型，，更合理可以指导的复方降压药物配伍、选择和剂量应用，使之更适用于个体。

维生素B12、甲基供体四氢叶酸及维生素B6逐一或联合配伍，可制成一组为任一种MS基因型个体使用，综合提高ACEI类药物的降压药效。已有大量的临床观察和研究表明，体内缺少了上述某些重要维生素可能导致高同型半胱氨酸水平；叶酸、维生素B12、维生素B6可单独或联合作用，都可降低几乎所有原因导致的高同型半胱氨酸水平，目前增加富含上述营养成分(叶酸和维生素)食品的合理摄入，结合服用单独或复合维生素制剂，已广泛用于临床高同型半胱氨酸血症的治疗。有些个体可能因存在遗传缺陷或因基因多态性，表现为同型半胱氨酸的新陈代谢效率低下或差异，因此需要摄取比常人更多剂量的叶酸和维生素(包括B6和B12)等，使血浆同型半胱氨酸水平控制在正常范围。关于联合用药的剂量配伍，已积累了相当丰富的常用临床经验和研究结果，可应用于复合药物的配伍中。

此外，长期服用叶酸已有临床研究提示将可能形成对内皮细胞功能等靶器官的长期保护，将使这类复方药具有更持久稳定的降压疗效，扩大了药物应用的范围，提高了其价值。目前，尚无上述治疗高血压的ACEI类复合药物。

发明内容

解决的技术问题

为提高临床用药的个体选择性，提高药物疗效，减少毒副作用的发生，本发明提供了一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药，通过测定受体基因多态性位点基因型来预测和改善ACEI类降压药的药效。

技术方案

为实现上述发明目的，采取以下技术方案：

一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，通过测定MS基因Asp919Gly多态位点预测降压药药效，其组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶HaeIII(对MS基因)，、限制性内切酶II、耐热DNA聚合酶(Taq)和脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)。

所述MS基因的引物(Primer)的序列为：

上游引物：5’GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3’

下游引物：5’CATGGAAGAATATCAAGATATTAGA3’

该引物为人工设计并采用寡核苷酸合成仪合成。G/C比例合理，正反链的退火温度接近，扩增片段内该酶酶切位点的特异性强。

一种预测ACEI类降压药药效的方法，该方法通过测定受试者的MS基因Asp919Gly多态位点，预测ACEI类降压药药效。

所述测定MS基因Arg16Gly多态位点基因型中包括下述步骤：

(1)提取宿主细胞的基因组DNA；

(2)使用聚合酶链式反应扩增MS功能基因；

(3)限制性内切酶消化；

(4)电泳检测MS基因Asp919Gly多态位点基因型；

所述预测药效中，按检测基因类型预测ACEI类降压药药效：MS基因型为Asp/Asp基因型时，其降压疗效将较高，而当MS基因型为Gly/Asp或Gly/Gly，其降压疗效较差。

一种预测ACEI类降压药药效的软件，在测定MS功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取MS功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y₀(ΔSBP)＝(-2.5*MS野生型)+(-0.23*年龄-0.14*体重-0.01*身高-1.19*性别+0.33*基线SBP)-21.1Z₀(ΔDBP)＝(-2.4*MS野生型)+(-0.13*年龄-0.08*体重-0.03*身高-1.65*性别+0.38*基线DBP)-13.1；(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。

一种改善ACEI类降压药药效的复方药，在测定MS基因多态性位点基因型的基础上改善ACEI类降压药的疗效，该复方药包括主要成分ACEI类降血压药物和药效增强成分，其中药效增强成分为叶酸、四氢叶酸、叶酸复合制剂、维生素B12、维生素B12复合制剂、维生素B6和维生素B6复合制剂中的一种或几种。

所述的ACEI类降压药为卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、西拉普利(cilazapril)、贝那普利(benazepril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)中的一种或几种。

有益效果

本发明提供了利用功能基因预测ACEI类抗高血压药物疗效的一种试剂盒、一套方法和一套软件，可作为ACEI类降压药药效的指示系统，通过测定MS功能基因Asp919Gly多态位点基因型，预测ACEI类降压药疗效；还可将基因型作为参数结合基本生理参数和特殊参数通过计算定量地预测ACEI类降压药的药效，提高预测精度；便于医生在用药时限据个体差异进行选择，提高了临床用药和治疗的效率与安全性，降低了发生毒副作用和经济负担的风险。本发明通过测定基因型，还可以指导新药研发形成一组ACEI类复合新药，特别对于目前治疗效果不佳的患者，提供了更好的选择。总之，应用这类功能基因多态性的发明成果，对今后更加经济有效地指导抗高血压药物的临床选药、预测用药疗效和指导新药研制具有产业与服务的应用价值。

附图说明

图1为MS基因型分析琼脂糖凝胶电泳图谱

具体实施方式实施例1：使用试剂盒预测ACEI类降压药药效

一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，该试剂盒包括：

A液：PCR缓冲液(PCR buffer)，成分为KCL、Tris-HCl及MgCl₂；

B液：脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)；

C液：引物(Primer)，由寡核苷酸合成仪合成；

D液：耐热DNA聚合酶(Taq)；保存温度为-20℃；

E液：限制性内切酶HaeIII；保存温度为-20℃；

F液：限制性内切酶缓冲液2，成份为Tris-HCl，NaCl，MgCl₂，二硫苏

糖醇。

该试剂盒中的引物的序列为：

上游引物：5’GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3’

下游引物：5’CATGGAAGAATATCAAGATATTAGA3’

使用本试剂盒预测ACEI类降压药药效的步骤如下：(1)扩增目的基因片段：10μl PCR反应体系中加入基因组DNA 20ng，A液1ul，B液1.6ul，C液0.2ul，D液0.05ul；按如下条件进行PCR反应：

95℃ 10min，

72℃ 7min。PCR产物大小：189bp(2)限制性内切酶消化：按如下体积将反应物混合，置37℃恒温箱保温4小时以上：

PCR产物 10ul

F液 1.5ul

E液 0.3ul

双蒸水加至15ul(1×消化体积)(3)电泳检测MS Asp919Gly多态性位点基因型：

酶切后产物用3.5％的琼脂糖凝胶电泳，使用TAE电泳缓冲液，DNA Marker使用50bp或100bp DNA ladder(购自上海生物工程技术服务有限公司)，用量为1ug/孔，电压为250V，电泳时间为20～50分钟。电泳后的凝胶经溴化乙锭染色，在紫外分析仪下观察结果。

如图1所示，M为DNA marker，以其100bp和200bp片段的位置作为本发明检测结果的参照。本发明涉及的189bp和159bp两片段出现在上述两条参照条带之间。电泳结果只显示189bp片段的为纯合野生型Asp/Asp，如1、2、4、6、9；电泳结果显示189bp和159bp两片段的为杂合子Asp/Gly，如5、7、8；电泳结果只显示159bp片段的为纯合突变型Gly/Gly，如3。(4)预测药效：

基因型为Asp919/Asp919纯合野生型时，ACEI类降压药药效的降压幅度较大；

基因型为Asp919Gly19杂合子或Gly919/Gly919纯合突变时，ACEI类降压药药效的降

压幅度较低。实施例2：测定高半胱氨酸通路上MS基因Asp919Gly多态性位点并预测ACEI类降压药卡托普利的药效(一)测定MS基因的Asp919Gly多态位点基因型：(1)提取宿主细胞的基因组DNA：

(a)在全血中加入30ml红细胞裂解液，缓慢摇匀，室温静置10分钟，期间，摇动数次，彻底裂解红细胞；

(b)于4℃、2000转离心/分10分钟，去上清，将沉淀之白细胞在旋转震荡器上打散，加蛋白酶40ul、RNA酶50ul，摇匀，加白细胞裂解液置15ml，混匀37℃水浴20分钟后取出，置冷水中；

(c)加冷的蛋白沉淀液4ml，混匀后放在-20℃冰箱5分钟，取出于4℃、3000转/分离心10分钟。将上清液倒入已加好15ml异丙醇的50ml离心管中缓慢摇动数次，至DNA絮状物析出；

(d)将析出的DNA絮状物移至另一1.5ml已装入75％乙醇的滤纸上，使液体挥发干。

(e)加DNA水化液1.5ml，置摇床，摇动过夜，备用；

(f)DNA浓度的测定采用紫外分光光度法，分别测定260nm及280nm两个波长下的OD值，以OD260nm×50所得值为DNA浓度。并以OD260nm/OD280nm比值估计DNA纯度；

(2)使用PCR-RFLP方法扩增MS功能基因：

用PCR仪扩增MS功能基因，10ul PCR反应体系中含有基因组DNA 20ng，1.5mmol/LMgCl₂，200μmol/L dNTP，50mmol/L KCl，10mmol/L Tris-HCl(pH9.0)，0.5U/μl Taq DNA聚合酶，反应缓冲液，每一引物0.2μmol/L(0.1～0.4μmol/L均可)，引物的序列为：

上游引物：5’GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3’

下游引物：5’CATGGAAGAATATCAAGATATTAGA3’PCR反应条件：

95℃ 5～10min，

72℃ 7～10min。PCR产物大小：189bp(3)限制性内切酶消化酶切过程如下 1×消化体积(15ul)

PCR产物 10ul

BufferII 1.5ul

HaeIII 2～4U

双蒸水加至总体积为15ul。

(4)电泳检测MS基因Arg16Gly多态位点基因型：方法与结果同实施例1。(二)、预测药效：方法同实施例1。

以上方法通过两组临床观察进行验证，结果如下：

1、MS基因Asp919Gly多态性与高血压发病风险的关系：

在高血压病例和正常对照中，发现在特定人群中Asp919Gly基因多态性与高血压状态之间有显著的相关性(OR＝1.46，P＝0.033)，表现为在吸烟人群中Gly等位基因携带者(的收缩压和舒张压有增高趋势，并达到显著性水平(见表1)；

表1.经吸烟状态分层后Arg919Gly多态性和高血压状态的关系

病例对照未调整OR 调整OR

基因型 P值 P值

n(％) n(％) (95％Cl) (95％Cl)

吸烟组

Asp/Asp 419(76.9) 284(83.0) 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 126(23.1) 58(17.0) 1.46(1.0，2.1) 0.033 1.47(1.0，2.1) 0.034

非吸烟组

Asp/Asp 1171(82.7) 579(82.0) 1

Gly/Gly+Asp/Gly 245(17.3) 127(18.0) 0.95(0.8，1.2) 0.692 0.94(0.7，1.2) 0.629

注：调整性别、年龄、饮酒等因素。

在饮酒人群中Gly等位基因携带者的舒张压显著高于Asp/Asp基因型，控制其它混杂因素后这种显著性仍然存在(P＝0.003)(见表2)；

表2.经饮酒状态分层后Arg919Gly多态性和高血压状态的关系

N SBP 未调整调整 DBP 未调整调整

基因型

(％) (mmHg) P值 P值 (mmHg) P值 P值饮酒组

ASP/Asp 611(81.5) 144.7±25.2 91.6±14.4

Gly/Gly+Asp/Gly 139(18.5) 145.7±22.5 0.654 0.206 95.0±14.5 0.01 0.003非饮酒组

ASP/Asp 1761(81.6) 147.8±25.0 91.2±14.0

Gly/Gly+Asp/Gly 397(18.4) 149.5±25.2 0.248 0.315 90.7±13.4 0.525 0.467

注：调整性别、年龄、吸烟等因素。

2、MS基因与高血压降压疗效关系：

在高血压病人服用苯那普利后第8、11、14、16天的舒张压(DBP)降压效果在Asp919/Asp919纯合个体中显著高于Asp919Gly919基因型或Gly919/Gly919(P＜0.05)，提示MS基因Asp919Gly多态性和苯那普利的降压作用有关(见表3)。

表3苯那普利的降压疗效与MS基因ASP919GLY多态位点的关系

有效率未调整OR 未调整未调整OR 未调整

基因型 N

(％) (95％CI) P值 (95％CI) P值第5天 ASP/Asp 699 58.1 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 156 57.7 0.98(0.7-1.4) 0.929 0.92(0.6-1.3) 0.659第8天 ASP/Asp 688 72.7 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 152 65.1 0.70(0.5-1.0) 0.064 0.63(0.4-0.9) 0.023第11天 ASP/Asp 671 69.9 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 153 62.1 0.71(0.5-1.0) 0.062 0.64(0.4-0.9) 0.024第14天 ASP/Asp 597 72.2 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 141 66 0.75(0.5-1.1) 0.143 0.64(0.4-1.0) 0.048第16天 ASP/Asp 644 57.5 1 1

Gly/Gly+Asp/Gly 145 41.4 0.52(0.4-0.8) 0.001 0.52(0.4-0.8) 0.001

注：调整了性别、年龄、BMI等因素。实施例3：测定高半胱氨酸通路上MS基因Asp919Gly多态性位点并预测ACEI类降压药卡托普利的药效

方法同实施例2，在ACEI类药物卡托普利(captopril)的动物实验中观察到与苯那普利相似的结果。实施例4：测定高半胱氨酸通路上MS基因Asp919Gly多态性位点，并预测ACEI类降压药福辛普利的药效

方法同实施例2，在ACEI类药物福辛普利(fosinopril)的动物实验中观察到与苯那普利相似的结果。实施例5、一种预测ACEI类降压药药效的软件

在测定MS功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取MS功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y₀(ΔSBP)＝(-2.5*MS野生型)+(-0.23*年龄-0.14*体重-0.01*身高-1.19*性别+0.33*基线SBP)-21.1Z₀(ΔDBP)＝(-2.4*MS野生型)+(-0.13*年龄-0.08*体重-0.03*身高-1.65*性别+0.38*基线DBP)-13.1(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。

以上步骤(1)中的基因型参数值的取值方式如下：按测定的MS基因多态性位点的基因型取值，当发生突变时(Asp/Gly或Gly/Gly型)，MS突变型参数取1；当为纯合野生型时(Asp/Asp型)，MS突变型参数取0。以上步骤(1)中的基本生理参数值的取值方式如下：年龄参数取实际年龄数值，单位为岁；体重参数取实际体重值，单位为公斤(kg)；性别参数为男取1，为女取2；身高参数取实际身高值，单位为米(m)；基础SBP参数为基础收缩血压值，单位为毫米汞柱；基础DBP参数为基础舒张血压值，单位为毫米汞柱。

经过步骤(2)的计算得出的Y₀值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效。实施例6、一种预测ACEI类降压药药效的软件

在测定MS功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：

步骤同实施例5，在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数：目前吸烟、既往吸烟、目前饮酒、既往改酒；在步骤(2)中进行运算之后，对Y₀和Z₀值进行如下校正计算：Y₀(ΔSBP)＝(-2.5*MS野生型)+(-0.22*年龄-0.14*体重-0.01*身高-1.62*性别+0.33*基线SBP)-21.2Z₀(ΔDBP)＝(-2.5*MS野生型)+(-0.13*年龄-0.08*体重-0.04*身高-1.24*性别+0.39*基线DBP)-12.2；

以上步骤(1)中的特殊参数值的取值方式如下：目前吸烟参数依受试者现在的吸烟情况取值，为是时取1，为否时取0；既往吸烟参数的取值同前述，为是时取1，为否时取0；目前饮酒参数依受试者的目前饮酒情况取值，为是时取1，为否时取0；既往饮酒参数依受试者的既往饮酒情况取值，为是时取1，为否时取0；其余参数的取值方式同实施例5。

将以上参数代入步骤(2)，经计算得出的Y₁值为收缩压的变化量(毫米汞柱)和Z₁值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，Y₁(ΔSBP)＝Y₀(-0.29*目前吸烟-0.82*既往吸烟-0.12*目前饮酒-2.54*既往饮酒)Z₁(ΔDBP)＝Z₀(+1.44*目前吸烟+0.27*既往吸烟+0.05*目前饮酒-1.96*既往饮酒)

通过这个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效，并且通过简单的询问方式获得现吸烟、既往吸烟、饮酒、教育、职业等特征参数，经计算得到的较实施例5更为精确的血压下预测降值。实施例7、一种预测ACEI类降压药药效的软件

在测定MS功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序算实现以下步骤：

步骤同实施例6，在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数和吸烟、饮酒参数之后，再获取特殊参数QTc；进行以下校正计算：Y₁(ΔSEP)＝(-2.7*MS突变型)+(-0.23*年龄-0.14*体重-0.007*身高-2.02*性别+0.33*基线SBP)+(-0.14*目前吸烟-1.43*既往吸烟-0.15*目前饮酒-2.67*既往饮酒)-15.5Z₁(ΔDBP)＝(-2.8*MS突变型)+(-0.13*年龄-0.07*体重-0.07*身高-1.72*性别+0.38*基线DBP)+(+1.42*目前吸烟+0.02*既往吸烟-1.21*目前饮酒-1.10*既往饮酒)-6.64

以上步骤(1)中的特殊参数值的取值方式如下：特殊参数QTc为心率校正Q-T间期，QTc＝QT/RR，其中QT为心电向量Q-T间期值，RR为R-R间期值。其余参数的取值方式同

实施例6。

将以上参数代入步骤(2)，经计算得出的Y₂值为收缩压的变化量(毫米汞柱)，Z₂值为舒张压的变化量(毫米汞柱)，Y₂(ΔSBP)＝Y₁+(-6.47*QTC)Z₂(ΔDBP)＝Z₁+(-1.10*QTC)

通过这两个值可以定量地预测ACEI类降压药的药效，并且可通过心电图客观测量结果获得特殊参数QTc，经计算可得到的较实施例6更为精确的血压下降预测值。实施例8：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+叶酸或四氢叶酸或叶酸复合制剂

该复方药在测定高半胱氨酸代谢通路MS多态性位点基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。对于一般使用ACEI类药物的个体，该复合药会在不同程度上从改善血浆同型半胱氨酸水平协同或补充ACEI的药理作用。可以根据个体代谢特征选择不同配伍或剂量的复合药物。尤其对于Gly基因型携带者，改善ACEI类药物的降压效果应更为明显。

二肾一夹型高血压和自发型高血压大鼠的动物实验表明，苯那普利+叶酸或四氢叶酸或叶酸复合制剂的复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例9：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B12

该复方药在基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。对于一般使用ACEI类药物的个体，该复合药会在不同程度上从改善血浆同型半胱氨酸水平协同或补充ACEI的药理作用。可以根据个体代谢特征选择不同配伍或剂量的复合药物。尤其对于Gly基因型携带者，改善ACEI类药物的降压效果应更为明显。

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，苯那普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B12复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例10：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B6

二肾一夹型高血压和自发型高血压大鼠的动物实验表明，苯那普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B6复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例11：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+维生素B12

该复方药在基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。对于一般使用ACEI类药物的个体，该复合药会在不同程度上从改善血浆同型半胱氨酸水平协同或补充ACEI的药理作用。可以限据个体代谢特征选择不同配伍或剂量的复合药物。尤其对于Gly基因型携带者，改善ACEI类药物的降压效果应更为明显。

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，苯那普利+维生素B12的复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例12：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：苯那普利+维生素B6

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，苯那普利+维生素B6的复方药物，降压作用大于苯那普利药物组。实施例13：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：福辛普利+叶酸或四氢叶酸或叶酸复合制剂

二肾一夹型高血压和自发型高血压大鼠的动物实验表明，福辛普利+叶酸或四氢叶酸或叶酸复合制剂的复方药物，降压作用大于福辛普利药物组。实施例14：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：福辛普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B12

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，福辛普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B12复方药物，降压作用大于福辛普利药物组。实施例15：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：福辛普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B6

该复方药在测定高半胱氨酸代谢通路MS多态性位点基因型的基础上设计制造，改善ACEI类降压药的疗效。对于一般使用 ACEI类药物的个体，该复合药会在不同程度上从改善血浆同型半胱氨酸水平协同或补充ACEI的药理作用。可以根据个体代谢特征选择不同配伍或剂量的复合药物。尤其对于Gly基因型携带者，改善ACEI类药物的降压效果应更为明显。

二肾一夹型高血压和自发型高血压大鼠的动物实验表明，福辛普利+叶酸或四氢叶酸+维生素B6复方药物，降压作用大于福辛普利药物组。实施例16：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：福辛普利+维生素B12

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，福辛普利+维生素B12的复方药物，降压作用大于福辛普利药物组。实施例17：一种本发明应用所述的ACEI类降压复方药：福辛普利+维生素B6

二肾一夹型高血压大鼠和自发型高血压的动物实验表明，福辛普利+维生素B6的复方药物，降压作用大于福辛普利药物组。

序列表<110>安徽省生物医学研究所<120>一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒、方法、软件和复方药<130><160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>21<212>DNA<213>人工序列<400>1gaactagaag acagaaattc tcta 24<210>2<211>22<212>DNA<213>人工序列<400>2catggaagaa tatcaagata ttaga 25

Claims

1、一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于通过测定高半胱氨酸通路上MS基因上多态性位点预测降压药药效，其组成包括：引物(Primer)；限制性内切酶HaeIII限制性内切酶缓冲液2。

2、如权利要求1所述的一种预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述引物(Primer)的序列为：

上游引物：5’GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3’

下游引物：5’CATGGAAGAATATCAAGATATTAGA3’。

3、如权利要求1或2所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括PCR缓冲液(PCR buffer)和耐热DNA聚合酶(Taq)。

4、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述试剂盒还包括脱氧三磷酸单核苷酸(dNTP)。

5、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述PCR缓冲液的成分为KCL、Tris-HCl及MgCl₂。

6、如权利要求3所述的预测ACEI类降压药药效的试剂盒，其特征在于：所述限制性内切酶缓冲液2的成分为Tris-盐酸、氯化镁、氯化钠和二硫苏糖醇。

7、一种预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：该方法通过测定受试者的高半胱氨酸代谢通路上MS基因Asp919Gly多态性位点的基因型，预测ACEI类降压药药效。

8、如权利要求7所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：在所述预测药效中，按检测的基因型预测ACEI类降压药药效，MS基因型为Asp919/Asp919纯合野生型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；MS基因型为Asp919Gly919或Gly919/Gly919突变型时，ACEI类降压药药效的降压最少。

9、如权利要求7所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述测定多态位点MS基因Asp919Gly基因型中包括下述步骤：(1)提取宿主细胞的基因组DNA；(2)使用聚合酶链式反应扩增MS功能基因；(3)限制性内切酶消化；(4)电泳检测MS基因Asp919Gly多态位点基因型；(5)所述预测药效中，按检测基因类型预测ACEI类降压药药效：

按检测的基因型预测ACEI类降压药药效，MS基因型为Asp919/Asp919纯合野生型时，ACEI类降压药药效的降压幅度最大；MS基因型为Asp919Gly919或Gly919/Gly919时，ACEI类降压药药效的降压最少。

10、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增MS功能基因步骤中，引物的序列为：

上游引物：5’GAACTAGAAGACAGAAATTCTCTA3’

下游引物：5’CATGGAAGAATATCAAGATATTAGA3’。

11、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增MS功能基因步骤中，引物的浓度为0.1μmol/L～0.4μmol/L。

12、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述聚合酶链式反应扩增MS功能基因步骤中，PCR反应的反应条件为：

95℃ 5～10min，

72℃ 7～10min。

13、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述限制性内切酶消化步骤中，反应体系为：

PCR产物 10ul

BufferII 1.5ul

HaeIII 2～4U

ddH₂O 加至总体积为15ul。

14、如权利要求9所述的预测ACEI类降压药药效的方法，其特征在于：所述限制性内切酶消化步骤中，反应体条件为：37℃恒温箱保温4小时以上。

15、一种预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在测定MS功能基因多态性位点基因型的基础上，通过计算机语言程序运算实现以下步骤：(1)获取MS功能基因型参数和基本生理参数：年龄、体重、性别、身高、基础SBP和基础DBP；(2)进行如下运算：Y₀(ΔSBP)＝(-2.5*MS突变型)+(-0.23*年龄-0.14*体重-0.001*身高-1.19*性别+0.33*基线SBP)-21.1Z₀(ΔDBP)＝(-2.4*MS突变型)+(-0.13*年龄-0.08*体重-0.03*身高-1.65*性别+0.38*基线DBP)-13.1；(3)根据运算结果定量预测ACEI类降压药药效。

16、如权利要求15所述的预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数之后，再获取特殊参数：目前吸烟、既往吸烟、目前饮酒、既往饮酒；在步骤(2)中进行运算之后，对Y₀和Z₀值进行校正计算，将以上参数代入步骤(2)，再做以下计算：Y₁(ΔSBP)＝Y₀+(-0.29*目前吸烟-0.82*既往吸烟-0.12*目前饮酒-2.54*既往饮酒)Z₁(ΔDBP)＝Z₀+(+1.44*目前吸烟+0.27*既往吸烟烟+0.05*目前饮酒-1.96*既往饮酒)。

17、如权利要求16所述的预测ACEI类降压药药效的软件，其特征在于：在步骤(1)中获取了基因型参数和基本生理参数和吸烟、饮酒参数之后，再获取特殊参数QTc；对Y₁和Z₁进行校正运算；将以上参数代入步骤(2)，再做如下计算：Y₂(ΔSBP)＝Y₁+(-6.47*QTC)Z₂(ΔDBP)＝Z₁+(-1.10*QTC)。

18、一种改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于在测定MS基因多态性位点基因型的基础上改善ACEI类降压药的疗效，该复方药包括主要成分ACEI类降血压药物和药效增强成分，其中药效增强成分为叶酸、四氢叶酸、叶酸复合制剂、维生素B12、维生素B12复合制剂、维生素B6和维生素B6复合制剂中的一种或几种。

19、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的ACEI类降压药为卡托普利(captopril)、依那普利(enalapril)、西拉普利(cilazapril)、贝那普利(benazepril)、培哚普利(perindopril)、雷米普利(ramipril)、福辛普利(fosinopril)、赖诺普利(lisinopril)中的一种或几种。

20、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为苯那普利和叶酸、或四氢叶酸、或叶酸复合制剂。

21、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为苯那普利、叶酸或四氢叶酸和维生素B12。

22、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为苯那普利、叶酸或四氢叶酸和维生素B6。

23、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为苯那普利和维生素B12。

24、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为苯那普利和维生素B6。

25、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为福辛普利和叶酸、或四氢叶酸、或叶酸复合制剂。

26、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为福辛普利、叶酸或四氢叶酸和维生素B12。

27、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为福辛普利、叶酸或四氢叶酸和维生素B6。

28、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为福辛普利和维生素B12。

29、如权利要求18所述的改善ACEI类降压药药效的复方药，其特征在于：所述的复方药的成分为福辛普利和维生素B6。