CN1699394A - 高免疫活CpG-S ODN和拮抗CpG-S ODN作用的CpG-N ODN的基因序列及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸及其对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸的基因序列,同时公开了高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在制备治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物中的应用;对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在制备治疗SIRS和脓毒症药物中的应用。
Description
技术领域
本发明涉及一种寡核苷酸及其在医药学上的应用,具体地说,涉及一种免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)及对其有拮抗作用的寡核苷酸(CpG-N ODN)。
背景技术
含有未甲基化CpG的寡核苷酸片段是细菌DNA的最小作用单位,因此具有免疫刺激作用的含未甲基化CpG的寡核苷酸被称作免疫刺激寡核苷酸(Immnostimulatory oligonucleotides,CpG-S ODN)。其结构特征为含有CpG基元即6个碱基互补回文结构的六聚体,该六聚体中必须至少含有一个CpG二核苷酸,CpG的5’端必须有一个嘌呤,结构类似ApA,GpA或GpT等,3’端必须有二个嘧啶如TpT,目前已知具有免疫刺激作用的六聚体包括AACGTT,AGCGCT等。
CpG-S ODN具有两方面的作用:小剂量CpG-S ODN对小鼠免疫细胞具有广泛的免疫活性,大剂量则可诱导全身性炎症反应综合征(Systemic inflammatoryresponse syndrome,SIRS)和脓毒症的发生。
大量研究表明:①小剂量CpG-S ODN能够直接或间接激活树突状细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞(CTL);诱导IFN-γ等Th1型细胞因子释放。因此,单独使用即可有效抑制小鼠肿瘤生长、促进肿瘤消退,并可形成保护性免疫记忆,从而能够有效防止肿瘤复发。除此之外,由于CpG ODN是一种优良的Th1型疫苗佐剂,因此也可与肿瘤疫苗配伍治疗恶性肿瘤,在肿瘤预防与治疗方面具有良好的应用前景。由于目前尚缺乏对人免疫细胞具有高免疫活性的CpG-S ODN,因此需要寻找高免疫活性的CpG-S ODN对肿瘤预防与治疗具有重要意义。②CpG-S ODN诱导Th1型细胞因子释放而抑制Th2型类免疫应答,所以可用来治疗Th2型类免疫应答介导的过敏性疾病如哮喘。③CpG-S ODN能活化树突状细胞、B细胞、单核-巨噬细胞等细胞,因此治疗细菌或病毒等病原体引起的感染性疾病、免疫功能低下性疾病。
由于CpG-S ODN广泛存在于细菌DNA中,当细菌感染发生时,细菌大量繁殖可以导致CpG-S ODN大量复制。过量的CpG-S ODN通过激活单核-吞噬细胞系统大量释放TNF-α、IL-1、IL-6和IL-12等多种细胞因子引起SIRS和脓毒症的发生,其病死率高达50-80%,至今尚无有效的治疗手段。有文献报告细菌基因组DNA中含有未甲基化的CpG基元不一定具有免疫刺激作用,甚至具有阻断或中和CpG-SODN作用,此类寡核苷酸被称为CpG-N ODN(CpG-neutralizing oligonucleotides,CpG-N ODN),因此研究对CpG-S ODN具有拮抗作用的CpG-N ODN对SIRS和脓毒症的治疗具有重要意义。
发明内容
本发明的目的在于提供一种免疫刺激寡核苷酸,其具有高免疫活性,可形成保护性免疫记忆,能抑制Th2型类免疫应答。
本发明的另一目的在于提供一种高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在预防和治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物中的应用。
本发明的再一目的在于提供一种对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-NODN),具有阻断或中和CpG-S ODN的作用。
本发明的还一目的在于提供一种对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在用于制备治疗SIRS和脓毒症药物中的应用。
为了实现本发明目的,一种免疫刺激寡核苷酸,具有如下基因序列:
GGC GGC GGC GCG;
CGC GGC GCC GGG;
GGC GGC GGC GGA;
CCG CGC GCG GGC;
TGG CGC GGG GCG;
GCC GGC GCC CGG;
GCG CGC GCG GTA;
CCA GGC GGC GGG;
GGC CGC GGG GGT;
CAG CCC GGG GGA;
GCT CCC GGG CTT;
GCG CTC GGG CTT;
CCG CCC GCG CCT;或
GCA CCC GCG CGC其中的一种。
其中,优选的基因序列:
GGC GGC GGC GCG;
CCG CGC GCG GGC;
TGG CGC GGG GCG;
GCC GGC GCC CGG;
GGC CGC GGG GGT;
CAG CCC GGG GGA;
GCT CCC GGG CTT;
GCG CTC GGG CTT;或
CCG CCC GCG CCT其中的一种。
本发明所述的一种高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸具有高免疫活性,可形成保护性免疫记忆,能抑制Th2型类免疫应答,其用于制备治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物中的应用。
为了实现另一发明目的,一种对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸,具有如下基因序列:
GGC CGC GGG GAC;
GCC GCC GCC GCC;
CGC CTC GGG GAG;
TGC CGC GGC AGA;
CTC CAC GTG CCG;
GCC GCC GCC GTC;或
GCT GCC GCC GCC其中的一种。
其优选的基因序列:
CGC CTC GGG GAG;
TGC CGC GGC AGA;
CTC CAC GTG CCG;
GCC GCC GCC GTC;或
GCT GCC GCC GCC其中的一种。
本发明所述的一种对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸具有阻断或中和CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的能力,其在用于制备治疗SIRS和脓毒症药物中的应用。
为了得到高活性的CpG-S ODN和CpG-N ODN,本发明的研究人员从病毒的基因组入手进行。
本领域技术人员了解所有小病毒和逆转录病毒基因组DNA存在众多的未甲基化CpG二核苷酸,其中许多具有CpG-S ODN结构特征。因此理论上推测其应具有很强的免疫刺激作用。但事实恰恰相反,病毒DNA不仅可逃脱机体免疫系统对其的免疫识别和清除,而且可在宿主细胞内进行复制,这种能力在逆转录病毒中表现得更为显著。因此病毒DNA中应存在阻断或中和CpG-S ODN作用的寡核苷酸序列,但并不知道其结构特征是什么?
有关腺病毒DNA(Adenoviral DNA,Adv DNA)的研究给予了研究人员非常有益的启示。尽管血清型2、5Adv DNA(亚属C)和血清型12Adv DNA(亚属A)中均含有数量相当的未甲基化CpG二核苷酸,因此推测它们均应具有相同的免疫刺激作用。但是Krieg等的实验结果显示血清型12Adv DNA具有很强的免疫刺激作用,而血清型2、5Adv DNA则不仅无免疫刺激作用,而且具有阻断CpG-S ODN诱导TNF-α、IL-6分泌的作用。本发明的研究人员也重复了该实验,结果与Krieg的一致。该结果说明:(1)血清型12Adv DNA中存在CpG-S ODN,血清型2、5Adv DNA中存在具有阻断或中和EC DNA或CpG-S ODN作用的寡核苷酸序列;(2)血清型12Adv DNA中CpG二核苷酸参与CpG基元的组成并发挥免疫刺激作用;(3)血清型2、5Adv DNA中CpG二核苷酸可能未完全参与CpG-S ODN的组成而发挥免疫刺激作用,因为对血清型2、5Adv DNA序列分析表明,参与CpG基元组成的CpG只占CpG总数量的1/15-30,提示这些CpG基元的作用可能被其它具有中和作用的寡核苷酸所抑制。
根据以上分析,本发明的研究人员推测血清型12Adv DNA含有具有很强免疫刺激作用的CpG-S ODN,而血清型2、5Adv DNA中存在天然的具有阻断或中和CpG-S ODN的CpG-N ODN,CpG-N ODN的序列特征可能与CpG两端寡核苷酸序列特点改变有关。
因此,本发明的研究人员采用生物信息学技术,以CpG二核苷酸为“电子探针”(CpG二核苷酸为检索“标签”),以CpG-S ODN中的六聚体为比较模板,对血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA进行序列分析,寻找血清型2、5Adv DNA中具有共同结构特征的12个碱基的寡核苷酸序列;并通过体外生物活性的筛选后,得到具有阻断或中和CpG-S ODN作用的寡核苷酸(CpG-N ODN);观察CpG-NODN对细菌DNA介导SIRS动物模型小鼠的保护作用,明确CpG-N ODN在SIRS防治中的作用。
本发明的研究人员从PubMed上的Nucleotide数据库中获取了血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA序列(ACCESSION:NC 001405、M73260、NC 001460、NC 000913)。
采用生物信息学技术,使用Primer Premier 5、BioEdit version 5.0.6等生物软件,对血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA中256种含CpG的六核苷酸序列进行了分析和比较,确定了血清型2、5Adv DNA中特有的19种含CpG的六核苷酸序列;使用BioEdit version 5.0.6,查找出血清型2、5Adv DNA中以这19种CpG六核苷酸为核心的12碱基寡核苷酸(ODN);使用生物软件RNAstructure version 3.71,对12碱基ODN的二级结构进行了预测,找出了4种可能的共同结构特征:(1)c-g位于干环顶端;(2)g-c位于干环顶端;(3)c-g或g-c位于干环侧面;(4)无干环结构(见图1),从而完成了对CpG-N ODN分子的初设计。
根据此设计合成了10条磷酸硫代骨架的ODN,其中c-g位于干环顶端的3条(ODN1-3)、g-c位于干环顶端的3条(ODN 4-6)、c-g或g-c位于干环侧面的2条(ODN7-8)、无干环结构形成的2条(ODN9-10)。本发明的研究人员对10条ODN的体外生物学活性进行鉴定,发现2条无明显刺激性的ODN,8条ODN具有诱导hPBMC释放TNF-α的能力,即8条ODN为免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)。
使用生物软件RNAstructure version 3.71,对ODN的二级结构自由能进行了分析,在此基础上,对10条ODN的刺激性与结构之间的关系进行了分析并发现,ODN的生物活性可能与预测二级结构的4种共同结构特征无关;而可能与预测二级结构的自由能高低密切相关。因此,使用生物软件RNAstructure version 3.71对CpG-NODN分子进行了再设计。根据此设计合成了11条磷酸硫代骨架的ODN,本发明的研究人员对11条ODN的体外生物学活性进行鉴定,发现5条无明显刺激性的ODN,6条ODN为免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)。
本发明的研究人员在两次筛选实验中共获得14条免疫刺激寡核苷酸(CpG-SODN),其基因序列为:GGC GGC GGC GCG;CGC GGC GCC GGG;GGC GGC GGCGGA;CCG CGC GCG GGC;TGG CGC GGG GCG;GCC GGC GCC CGG;GCG CGCGCG GTA;CCA GGC GGC GGG;GGC CGC GGG GGT;CAG CCC GGG GGA;GCT CCC GGG CTT;GCG CTC GGG CTT;CCG CCC GCG CCT;或GCA CCC GCGCGC其中的一种;其中优选的为:GGC GGC GGC GCG;CCG CGC GCG GGC;TGG CGC GGG GCG;GCC GGC GCC CGG;GGC CGC GGG GGT;CAG CCC GGGGGA;GCT CCC GGG CTT;GCG CTC GGG CTT;或CCG CCC GCG CCT其中的一种。
同时本发明的研究人员对7条无明显刺激性的ODN抑制CpG-S ODN的活性进行鉴定,表明该7条ODN均有抑制CpG-S ODN诱导的hPBMC释放TNF-α的能力,即7条ODN为对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-N ODN),其基因序列为:GGC CGC GGG GAC;GCC GCC GCC GCC;CGC CTC GGG GAG;TGCCGC GGC AGA;CTC CAC GTG CCG;GCC GCC GCC GTC;或GCT GCC GCCGCC其中的一种;优选的为:CGC CTC GGG GAG;TGC CGC GGC AGA;CTC CACGTG CCG;GCC GCC GCC GTC;或GCT GCC GCC GCC其中的一种。
本发明所述的免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)及对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸(CpG-N ODN)可采用本领域常用合成方法合成,比如固相亚磷酰胺三酯法。
本发明的研究人员经过对本发明所设计并合成的核苷酸进行药理学分析研究,发现本发明所述的免疫刺激寡核苷酸(CpG-S ODN)具有广泛的免疫活性,直接或间接激活树突状细胞、B细胞、单核-巨噬细胞、NK细胞和细胞毒性T细胞(CTL);诱导IFN-γ等Th1型细胞因子释放,可形成保护性免疫记忆,能抑制Th2型类免疫应答,其用于制备治疗感染性疾病、过敏性疾病如哮喘、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物中的应用。
本发明所述的拮抗寡核苷酸(CpG-N ODN)具有阻断或中和CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的能力,其在用于制备治疗SIRS和脓毒症药物中的应用。
附图说明
图112碱基ODN预测的二级结构4种可能的共同结构特征
具体实施方式
下面实施例为进一步描述本发明,但所述实施例仅用于说明本发明而不是限制本发明。
实验例1
本实验例在于通过采用生物信息学技术,获取CpG-S ODN和CpG-N ODN基因序列。
1.从PubMed上的Nucleotide数据库中获取了血清型2、5和12Adv DNA、ECDNA序列(ACCESSION:NC_001405、M73260、NC_001460、NC_000913)。
2.采用生物信息学技术,使用Primer Premier 5、BioEdit version 5.0.6等生物软件,对血清型2、5和12Adv DNA、EC DNA中256种含CpG的六核苷酸序列进行了分析和比较(见表1),根据:①在血清型2、5Adv DNA中出现频率较高;②在Adv 12 DNA和EC DNA中出现频率较低;③Adv2:Adv12≥2或Adv2:EC≥5等3条原则,确定了血清型2、5Adv DNA中特有的19种含CpG的六核苷酸序列。
表1 Adv2、5、12 DNA和EC DNA中256种含CpG的六核苷酸序列分析和比较
序号 | 序列 | Adv 2 | Adv 5 | Adv 12 | EC DNA | Adv2:Adv12 | Adv2:EC | ||||
频度 | 频率 | 频度 | 频率 | 频度 | 频率 | 频度 | 频率 | ||||
1 | aacgaa | 5 | 2.06E-03 | 8 | 3.31E-03 | 6 | 4.00E-03 | 1246 | 3.59E-03 | 0.51 | 0.57 |
2 | aacgag | 10 | 4.12E-03 | 10 | 4.14E-03 | 8 | 5.33E-03 | 589 | 1.70E-03 | 0.77 | 2.42 |
3 | aacgac | 10 | 4.12E-03 | 8 | 3.31E-03 | 4 | 2.67E-03 | 1136 | 3.28E-03 | 1.54 | 1.26 |
... | ... | ||||||||||
254 | ttcgtg | 2 | 8.24E-04 | 1 | 4.14E-04 | 4 | 2.67E-03 | 848 | 2.45E-03 | 0.31 | 0.34 |
255 | ttcgtc | 4 | 1.65E-03 | 3 | 1.24E-03 | 8 | 5.33E-03 | 1296 | 3.74E-03 | 0.31 | 0.44 |
256 | ttcgtt | 4 | 1.65E-03 | 4 | 1.66E-03 | 3 | 2.00E-03 | 1321 | 3.81E-03 | 0.82 | 0.43 |
总计 | 2428 | 1.00 | 2414 | 1.00 | 1500 | 1.00 | 346636 | 1.00 | |||
理论平均值 | 9.48 | 3.91E-03 | 9.43 | 3.91E-03 | 5.86 | 3.91E-03 | 1354.05 | 3.91E-03 |
3.使用BioEdit version 5.0.6,查找出血清型2、5Adv DNA中以这19种CpG六核苷酸为核心的12碱基寡核苷酸(ODN);使用生物软件RNAstructure version 3.71(该软件既可预测RNA的二级结构,也可预测DNA的二级结构),对12碱基ODN的二级结构进行了预测,找出了4种可能的共同结构特征:(1)共同特征1:c-g位于干环顶端;(2)共同特征2:g-c位于干环顶端;(3)共同特征3:c-g或g-c位于干环侧面;(4)共同特征4:无干环结构(见图1)。
4.合成了10条磷酸硫代骨架的12碱基ODN,其中c-g位于干环顶端的3条(ODN1-3)、g-c位于干环顶端的3条(ODN 4-6)、c-g或g-c位于干环侧面的2条(ODN7-8)、无干环结构形成的2条(ODN9-10)。
5. 10条ODN的体外生物学活性的鉴定工作:分离并培养人外周血单个核细胞(hPBMC),调整hPBMC细胞悬液浓度为1×106/ml,加入24孔板中,每孔1ml。置37℃ CO2孵箱培养2h后,加入10μg/ml各待筛选的ODN,置37℃ CO2孵箱培养4h后取细胞培养上清,采用双抗体夹心ELISA法测定细胞培养上清中TNF-的浓度,明确10条ODN诱导hPBMC释放TNF-α的能力(见表2),据此筛选出了2条无明显刺激性的ODN:ODN1和ODN 6;而其它8条ODN具有诱导hPBMC释放TNF-α的能力。
表2. 10条寡核苷酸10μg/ml刺激时诱导hPBMC释放TNF-α能力的测定(n=3,
x±s)
序号 | 序列 | TNF-α(pg/ml) |
空白对照 | - | 52±4 |
ODN1 | GGC CGC GGG GAC | 92±4 |
ODN2 | GGC GGC GGC GCG | 2034±414 |
ODN3 | CGC GGC GCC GGG | 579±97 |
ODN4 | GGC GGC GGC GGA | 871±150 |
ODN5 | CCG CGC GCG GGC | 1090±207 |
ODN6 | GCC GCC GCC GCC | 285±15 |
ODN7 | TGG CGC GGG GCG | 2592±66 |
ODN8 | GCC GGC GCC CGG | 1198±386 |
ODN9 | GCG CGC GCG GTA | 674±171 |
ODN10 | CCA GGC GGC GGG | 773±105 |
6.使用生物软件RNAstructure version 3.71,对ODN的二级结构自由能进行了分析,在此基础上,对上述10条ODN的刺激性与结构之间的关系进行了分析并发现,ODN的生物活性可能与预测二级结构的4种共同结构特征无关;而可能与预测二级结构的自由能高低密切相关:不含GGCG结构且自由能大于-1.0的ODN可能为无免疫刺激性的ODN(见表3)。因此,使用生物软件RNAstructure version 3.71对CpG-N ODN分子进行了再设计,根据此设计合成了11条磷酸硫代骨架的ODN。
表3. 10条ODN的刺激性与结构之间的关系
ODN | 序列 | 自由能(kcal/mol) | 共同结构特征 | TNF-α(pg/ml) |
1 | GGC CGC GGG GAC | -0.4 | 共同结构特征1 | 92±4 |
2 | GGC GGC GGC GCG | -3.9 | 共同结构特征1 | 2034±414 |
3 | CGC GGC GCC GGG | -0.1 | 共同结构特征1 | 579±97 |
4 | GGC GGC GGC GGA | -1.6 | 共同结构特征2 | 871±150 |
5 | CCG CGC GCG GGC | -1.0 | 共同结构特征2 | 1090±207 |
6 | GCC GCC GCC GCC | -0.2 | 共同结构特征2 | 285±15 |
7 | TGG CGC GGG GCG | -1.7 | 共同结构特征3 | 2592±66 |
8 | GCC GGC GCC CGG | -3.1 | 共同结构特征3 | 1198±386 |
9 | GCG CGC GCG GTA | 共同结构特征4 | 674±171 | |
10 | CCA GGC GGC GGG | 共同结构特征4 | 773±105 |
7. 11条ODN的体外生物学活性的鉴定工作:方法同步骤5,据此筛选出了5条无明显刺激性的ODN:ODN15、18、19、20、21;而其它6条ODN具有诱导hPBMC释放TNF-α的能力(见表4)。
表4. 11条寡核苷酸10μg/ml刺激时诱导hPBMC释放TNF-α能力的测定(n=3,
x±s)
序号 | 序列 | TNF-α(pg/ml) |
空白对照 | - | 36±2 |
ODN11 | GGC CGC GGG GGT | 2979±7 |
ODN12 | CAG CCC GGG GGA | 2485±35 |
ODN13 | GCT CCC GGG CTT | 2153±166 |
ODN14 | GCG CTC GGG CTT | 1867±98 |
ODN15 | CGC CTC GGG GAG | 200±130 |
ODN16 | CCG CCC GCG CCT | 1842±133 |
ODN17 | GCA CCC GCG CGC | 676±135 |
ODN18 | TGC CGC GGC AGA | 156±17 |
ODN19 | CTC CAC GTG CCG | 134±10 |
ODN20 | GCC GCC GCC GTC | 241±99 |
ODN21 | GCT GCC GCC GCC | 251±43 |
实验例2
本实验例在于研究寡核苷酸的合成方法。
本发明所述的方法采用固相亚磷酰胺三酯法,简单地说,是溶液中的单体通过缩合反应形成3’→5’磷酸二酯键,从而连接到固相支持物上。
1.基本材料:
(1)支持物:固相合成是将核酸固定在固相载体上完成合成反应的,最常用的固相载体为可控微孔玻璃珠(CPG,controlled pore glass),CPG的孔径根据所合成的寡核苷酸的长度而定,一般合成链长小于60nt时,选择孔径500埃,链长大于60nt时,使用1000埃CPG,使用CPG的缩合效率高达98%-99.9%,可以满足合成长达175nt的寡核苷酸的条件。CPG通过连接化合物与初始核苷酸的羟基共价结合,核苷酸的5’羟基用二甲氧基三苯甲基(DMT)保护。
(2)单体:合成所用单体为核苷亚磷酰胺,是经过化学修饰的核苷酸,含下面几个功能基团。
1. 3’位P上二异丙胺基,缩合所用的功能基
2. 3’位P上腈乙基,保护基,合成完毕后脱去。
3. 5’-DMT,保护基,缩合前脱去。
4. A和C的杂环氨基上的苯甲酸保护基,合成完毕后脱去。
5. G上嘌呤环氨基上的异丙酰保护基,合成完毕后脱去。
(3)反应步骤:
合成的第一步----去封闭(Deblocking),用三氯乙酸去除CPG所连核苷上的DMT,以暴露5’羟基,供下一步缩合。此步需要注意TCA为一较强的酸,可能会有脱嘌呤作用,故TCA与寡核苷酸接触时间不要超过规定时间。
第二步----活化(Activation),在缩合之前,单体与四唑混合并进入合成柱,此时四唑提供一个质子给3’磷酸上二异丙胺基的N原子,质子化的二异丙胺是一个良好的游离基团,与四唑形成亚磷酰胺四唑这种活性中间体。此步四唑过量保证了单体活化充分。
第三步----连接(Coupling),亚磷酰胺四唑与CPG所连的核苷酸碰撞时,与其5’羟基发生亲核反应,发生缩合并脱掉四唑,合成的寡核苷酸链延长一个。此步单体相对于CPG所连核苷酸上5’-羟基过量保证了连接的高效率。
第四步----盖帽(Capping),为了防止未反应的与CPG相连的5’羟基在随后的循环中被延长,需要在连接反应充分进行之后使之封闭,常用乙酰化来封闭此羟基。临用前混合乙酸酐和N-甲基咪唑等形成一活性很强的乙酰化试剂,与少量为参与连接反应的5’羟基缩合成酯键。由于须封闭的羟基少且乙酰化试剂活性高和充分过量,此步反应速度很快,几秒钟即足够。太长的盖帽时间有在非预期位置发生乙酰化反应的可能,且增加乙酸酐与痕量水形成酸攻击新生成的亚磷酯键的危险性。
第五步----氧化(Oxidation),连接反应后新加上的核苷酸通过亚磷酯键(磷为三价)与CPG上相连的寡核苷酸链连接,此亚磷酯键不稳定,易被酸、碱水解,因此需将此处三价磷氧化为五价的磷。常用的氧化剂为碘的四氢呋喃溶液。此步反应速度亦很快。应注意最后一个循环时,氧化步骤不可省略。此外亦可用其他氧化剂来完成氧化,从而得到各种符合实验需要的寡核苷酸。
循环上述一至五步,寡核苷酸链即可延伸至所需长度时即可完成。
2.合成后处理:
(1.)切割:将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG上连接化合物与初始核苷间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。
(2.)脱保护基:须在此步前选好后续的纯化方法。一般用新鲜的浓氨水处理较长时间以脱掉腈乙基、苯甲酰基、异丙基,用三氟乙酸脱5’-DMT.
(3.)纯化:根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有:C18柱、OPC柱、PAGE和HPLC。
(4.)定量。根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。
(5.)储存。通常一次合成提供的寡核苷酸的量会比所需要的量大得多,所以会涉及到寡核甘酸的储存问题。一般来说,这不成为问题,因为寡核甘酸的稳定性很好。需要注意的是避免紫外线等剧烈的物理环境,避免反复冻融,-20C可稳定保存一年以上。
实验例3
本实施例是对7条无明显刺激性的ODN抑制CpG-S ODN的活性进行鉴定。
分离并培养人外周血单个核细胞(hPBMC),调整hPBMC细胞悬液浓度为1×106/ml,加入24孔板中,每孔1ml。置37℃ CO2孵箱培养2h后,加入10μg/ml各待筛选的ODN 30分钟后,再加入5μg/ml的CpG-S ODN(TGG CGC GGGGCG),置37℃ CO2孵箱培养4h后取细胞培养上清,采用双抗体夹心ELISA法测定细胞培养上清中TNF-α的浓度,明确上述7条ODN抑制CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α的能力,此次实验结果表明上述7条ODN均有抑制CpG-S ODN诱导hPBMC释放TNF-α释放的能力,因此我们正式称之为CpG-N ODN(见表5)。
表5.CpG-N ODN对CpG-S ODN诱导人PBMC释放TNF-α的影响(n=6,
x±s)
序号 | TNF-α(pg/ml) | 抑制率(%) |
对照组 | 108±7 | - |
CpG-S ODN | 2776±136 | - |
ODN1 | 2133±242★ | 23.2 |
ODN6 | 2434±124★ | 12.3 |
ODN15 | 1012±342★ | 63.5 |
ODN18 | 957±272★ | 65.5 |
ODN19 | 1121±380★ | 59.6 |
ODN20 | 1252±144★ | 54.9 |
ODN21 | 1557±251★ | 43.9 |
★:与CpG-S ODN组比较,p<0.01
实验例4
本实施例在于研究CpG-N ODN对CpG-S ODN攻击小鼠的保护作用。
清洁级昆明种小白鼠90只(第三军医大学实验动物中心提供),体重19.9±0.5g/只,雌雄不拘,随机分为对照组、CpG-S ODN、ODN1、ODN6、ODN15、ODN18、ODN19、ODN20、ODN21组。对照组给予注射用水,注射体积为200μl/20g体重。CpG-S ODN组,给予80μg/20g体重的CpG-S ODN;其余各组在给予相应的CpG-NODN 400μg/20g体重后,立即给予80μg/20g CpG-S ODN;给药方式为尾静脉注射,观察7天内小鼠一般情况及死亡率(表6)。结果显示CpG-S ODN可导致小鼠3天内全部死亡,7条CpG-N ODN可降低CpG-S ODN攻击小鼠的死亡率。
表6. 7条CpG-N ODN对CpG-S ODN攻击小鼠的保护作用
组别 | 小鼠死亡时间(天)及数量(只) | 死亡率(%) | ||||||
D1 | D2 | D3 | D4 | D5 | D6 | D7 | ||
对照组 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0 | 0(0/10) |
CpG-S ODN | 8 | 9 | 10 | 10 | 10 | 10 | 10 | 100(10/10) |
ODN1 | 4 | 5 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 60(6/10)★ |
ODN6 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 60(6/10)★ |
ODN15 | 3 | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 | 5 | 50(5/10)★ |
ODN18 | 3 | 4 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 60(6/10)★ |
ODN19 | 2 | 3 | 4 | 5 | 5 | 5 | 5 | 50(5/10)★ |
ODN20 | 2 | 3 | 4 | 4 | 4 | 4 | 4 | 40(4/10)★ |
ODN21 | 5 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 6 | 60(6/10)★ |
★:与CpG-S ODN组比较,p<0.05
Claims (6)
1.一种高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸,其特征在于,具有如下基因序列:
GGC GGC GGC GCG;
CGC GGC GCC GGG;
GGC GGC GGC GGA;
CCG CGC GCG GGC;
TGG CGC GGG GCG;
GCC GGC GCC CGG;
GCG CGC GCG GTA;
CCA GGC GGC GGG;
GGC CGC GGG GGT;
CAG CCC GGG GGA;
GCT CCC GGG CTT;
GCG CTC GGG CTT;
CCG CCC GCG CCT;或
GCA CCC GCG CGC其中的一种。
2.根据权利要求1所述的一种高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸,其特征在于,具有如下基因序列;
GGC GGC GGC GCG;
CCG CGC GCG GGC;
TGG CGC GGG GCG;
GCC GGC GCC CGG;
GGC CGC GGG GGT;
CAG CCC GGG GGA;
GCT CCC GGG CTT;
GCG CTC GGG CTT;或
CCG CCC GCG CCT其中的一种。
3.一种对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸,其特征在于,具有如下基因序列:
GGC CGC GGG GAC;
GCC GCC GCC GCC;
CGC CTC GGG GAG;
TGC CGC GGC AGA;
CTC CAC GTG CCG;
GCC GCC GCC GTC;或
GCT GCC GCC GCC其中的一种。
4.根据权利要求3所述的对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸,其特征在于,具有如下基因序列:
CGC CTC GGG GAG;
TGC CGC GGC AGA;
CTC CAC GTG CCG;
GCC GCC GCC GTC;或
GCT GCC GCC GCC其中的一种。
5.权利要求1或2所述的高免疫活性的免疫刺激寡核苷酸在用于制备治疗感染性疾病、过敏性疾病、免疫缺陷性疾病和肿瘤药物中的应用。
6.权利要求3或4所述的对免疫刺激寡核苷酸拮抗的寡核苷酸在用于制备治疗SIRS和脓毒症药物中的应用。
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