CN1042397C - 一种猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法，注射剂包括有白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、病毒液和培养液，经原料制备→混和→水浴搅拌诱导培养→离心收获→灭活病毒→解冻除菌→分装→成品包装工序制成，其功能是作为一种广谱抗病毒，治疗猪瘟，猪病毒性腹泻，猪病毒性感冒等病毒性疾病。田间控制和推广治疗试验总治愈率为91.7%，人工控制治疗猪瘟和猪病毒性腹泻总治愈率为73.3%和100%。

Description

一种猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法

本发明涉及一种生物制剂及其制造方法，特别是一种治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法。

猪病毒性疾病是猪传染病中危害养猪业最严重的疫病，猪病毒性疾病中，尤以猪瘟危害最大，其发病率和病死率都很高，而且又无有效的治疗方法。目前，主要是以防疫为手段来控制猪毒性疾病的发生。近年来各方面的研究发现，干扰素(病毒的干扰作用是由一种物质引起的，该物质称之为干扰素)具有抗病毒作用外，还具有抗肿瘤作用，对免疫系统的调节作用和抗细胞等一系列的生理活性，但在兽医学领域，动物干扰素未能被广泛应用，主要原因在于目前所获得的动物干扰素安全性不高，制造工艺复杂，成本高，售价昂贵，效果不显著，推广受到限制。

本发明的发明目的是旨在克服上述缺点，提供一种治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂及其制造方法。该猪白细胞干扰素注射剂作为一种广谱抗病毒注射剂，适用于治疗猪瘟，猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等病毒性疾病。

本发明的发明目的是这样实现的：治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂包括以下组成成份：白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、病毒液和培养液，其中：猪血清、病毒液和培养液的体积比为：

猪血清∶病毒液∶培养液=(250～350)∶(250～350)∶5000

白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含猪白细胞个数为4×10⁷～10×10⁷个，启动干扰素加入培养液中，使每毫升培养液中含干扰素抗病毒活性为50-150单位，病毒液的血凝效价为1∶(320～1280)。

本发明的制造方法为：原料制备→混合→水浴搅拌诱导培养→离心收获→灭活病毒→解冻除菌→分装→成品包装。

具体的猪白细胞干扰素注射剂的制造方法是：

一、原料制备

1、制备白细胞悬液

无菌采集健康猪鲜血，在无菌室内，通过大型离心机在4℃和3000转/分钟时，离心分离20分钟，先抽吸出血浆后，吸取中层白细胞灰黄层至血浆瓶内，用0.85％的NH₄Cl两次处理，再次离心分离，收集沉淀白细胞，用Hank’s液洗去残余NH₄Cl，用培养液把沉淀白细胞稀释成悬液。

2、制备猪血清

无菌采集健康猪鲜血，自然析出，采用0.2％CaCl₂处理血浆，除去其中的纤维蛋白。用澄清板(K₇板)澄清，除菌板(EKS板)除菌，置-20℃保存备用。

3、制备启动干扰素

选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素。首次研究，用人白细胞干扰素作为启动干扰素。

4、制备病毒液

在36℃～38℃时，把授精鸡蛋孵化7～15天后，用病毒接种，再孵化65～79小时后，收获病毒液，病毒液的血凝效价为是1∶(320～1280)，置-20℃保存备用。

5、制备培养液

把粉剂1640与蒸馏水配成1％～2％的1640溶液，加入谷氨先胺，使1640溶液含谷氨先胺的浓度为3％，再加入青链霉素，使1640溶液中含青链霉素达100～1000单位/毫升。

二、混合

1、把白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含猪白细胞个数为4×10⁷～10×10⁷个。

2、然后加入猪血清，在每5000毫升培养液中加入猪血清250毫升～350毫升。

3、再加入启动干扰素，使每毫升培养液中含干扰素抗病毒活性50～150单位。

4、最后加入血凝效价在1∶(320～1280)的病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液250～350毫升。

三、水浴搅拌诱导培养

将混合后的混合液置于水浴搅拌装置中，在37℃时诱导培养20小时，其中，在第2小时时，用5％的NaHCO₃调PH值为7.0～8.0；在第6小时时再用5％的NaHCO₃调PH值为7.0～8.0。

四、离心收获

将水浴搅拌诱导培养后的液体在无菌室内，用大型离心机在4℃和3000转/分钟情况下，离心分离10～20分钟，收集上清干扰素，除去沉淀及杂质。

五、灭活病毒

将收获的干扰素液体用当量数为6.0的NHCl调PH值至2.0，在4℃的冷库中存放5～7天，再用当量数为6.0的NaOH调回PH值至7.0～8.0后，存入-20℃冰库中冻存。

六、解冻除菌

从-20℃冰库中取出干扰素，先溶化，再离心，取上清干扰素，在无菌室内，用澄清滤器先澄清，再用除菌滤器除菌，解冻除菌后的猪白细胞干扰素存入4℃冰库中。

七、分装

首先对安瓶进行洗刷，干燥灭菌，然后在无菌室内把解冻除菌后的猪白细胞干扰素用分装机进行定量分装于安瓶中，内含干扰素抗病毒活性≥5000单位/毫升。

八、成品包装

用纸盒定量盒装。

本发明是一种广谱抗病毒制剂，主治猪瘟、猪病毒性腹泻、猪病毒性感冒等猪病毒性疾病。干扰素的抗病毒作用，不是直接抗病毒，而是与周围的细胞发生反应，并诱导细胞产生抗病毒蛋白，这种蛋白能改变病毒蛋白合成，使新病毒不能装配，病毒繁殖受到抑制，从而起到抗病毒作用，猪白细胞干扰素注射剂注入猪体内后，猪白细胞干扰素对猪病毒性疾病弱毒，强毒均有明显的抑制增殖作用。

本发明经田间控制治疗试验和田间推广治疗试验，猪白细胞干扰素作为一种广谱抗病毒药物，对治疗猪病毒性疾病疗效显著，共治疗病毒性疾病病例7253例。

疗效    例数    百分率

治愈    6664    治愈率91.7％

其中：治疗疑似猪瘟有效率85.1％，治愈率为83.47％；治疗猪病毒性腹泻有效率99.95％，治愈率95.81％；治疗仔猪白痢有效率100％，治愈率98.3％；

治疗猪病毒性感冒的治愈率为100％。猪白细胞干扰素田间控制治疗试验统计表(单位：头)

病例	凝似猪瘟			病毒性腹泻			仔猪白痢
										治疗	有效	治愈	治疗	有效	治愈	治疗	有效	治愈
	合计	276	229	213	158	157	153	122	122										120

猪白细胞干扰素田间推广治疗试验统计表(单位：头)

病例	凝似猪瘟			病毒性腹泻			仔猪白痢			病毒性感冒
													治疗	有效	治愈	治疗	有效	治愈	治疗	有效	治愈	治疗	有效	治愈
	合计	2550	2184	2146	2102	2102	2012	1013	1012	977	1023	1033													1023

人工控制治疗试验统计(单位：头)病例        疗效    例数    百分率    总例数1、猪瘟        治愈     8    有效率73.3％  30头

           显效    142、病毒性腹泻  治愈    45    治愈100％     45头

        体重增加   7天内大剂量组与对照组平均每

                   只增重2.33公斤；

                   7天内常规剂量组与对照组平

                   均每只猪增重2公斤。

本制剂用健康猪鲜血制成，具有安全性高，制造工艺科学合理，成本低，效果显著，无毒副作用，易于推广的特点。

本制剂的用法用量：肌肉注射，按猪体重用药，每20公斤每天注射10000单位，病重者加量使用，或遵医嘱，连续使用3-5天为一个疗程。

本药品贮藏与效期：本品宜在2-8℃条件下贮存，有效期1年半。

本药品安瓶开封后，药剂一次用完，没有用完的药剂不能再用，本药品可与抗菌类药物同时使用。

实施例：

一、原料制备

1、制备白细胞悬液

无菌采集健康猪鲜血，在无菌室内，通过大型离心机在4℃和3000转/分钟时，离心分离20分钟，先抽吸出血浆后，吸取中层白细胞灰黄层至血浆瓶内，用0.85％的NH₄Cl两次处理，再次离心分离，收集沉淀白细胞，用Hank’s液洗去残余NH₄Cl，用培养液把沉淀白细胞稀释成悬液。

2、制备猪血清

无菌采集健康猪鲜血，自然析出，采用0.2％CaCl₂处理血浆，除去其中的纤维蛋白。用澄清K₇板澄清，用除菌EKS板除菌，置-20℃保存备用。

3、制备启动干扰素

选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素。

4、制备病毒液

在36℃时，把授精鸡蛋孵化7天后，用病毒接种，再孵化65小时后，收获病毒液，病毒液的血凝效价是1∶320，置-20℃保存备用。

5、制备培养液

把粉制1640与蒸馏水配成1％的1640溶液，加入谷氨先胺，使1640溶液含谷氨先胺的浓度为3％，再加入青链霉素，使1640溶液中含青链霉素达100单位/毫升。

二、混合

1、把白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含猪白细胞个数为4×10⁷个。

2、然后加入猪血清，在每5000毫升培养液中加入猪血清250毫升。

3、再加入启动干扰素，使每毫升培养液中含干扰素抗病毒活性50单位。

4、最后加入血凝效价是1∶320的病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液250毫升。

三、水浴搅拌诱导培养

将混合后的混合液置于水浴搅拌装置中，在37℃时诱导培养20小时，其中，在第2小时时，用5％的NaHCO₃调PH值为7.0；在第6小时时再用5％的NaHCO₃调PH值为7.0。

四、离心收获

将水浴搅拌诱导培养后的液体在无菌室内，用大型离心机在4℃和3000转/分钟情况下，离心分离10分钟，收集上清干扰素，除去沉淀及杂质。

五、灭活病毒

将收获的干扰素液体用当量数为6.0的NHCl调PH值至2.0，在4℃的冷库中放5天，再用当量数为6.0的NaOH调回PH值至7.0后，存入-20℃冰库中冻存。

六、解冻除菌

从-20℃冰库中取出干扰素，先溶化，再离心，取上清干扰素，在无菌室内，用澄清滤器先澄清，再用除菌滤器除菌，解冻除菌后的猪白细胞干扰素存入4℃冰库中。

七、分装

首先对安瓶进行洗刷，干燥灭菌，然后在无菌室内把解冻除菌后的猪白细胞干扰素用分装机进行定量分装于安瓶中，内含干扰素抗病毒活性≥5000单位/毫升。

八、成品包装

用纸盒定量盒装。

实施例二：

同样道理，如上所述，在下列条件下，同样实现本发明。

1、制备病毒液过程中，在38℃时，授精鸡蛋孵化15天后，病毒接种，再孵化79小时，病毒液的血凝效价1∶1280，

2、制备培养液过程中，青链霉素在2％的1640溶液中，达1000单位/毫升，

3、混合时，每毫升培养液中含猪白细胞个数10×10⁷个，含干扰素抗病毒活性150单位，每5000毫升培养液中加入猪血清350毫升，加入血凝效价为1∶1280的病毒液350毫升，

4、在水浴搅拌诱导培养和灭活病毒过程中，PH值控制为8.0。

本发明是一种广谱抗病毒制剂，主治猪瘟，猪病毒性腹泻，猪病毒性感冒等猪病毒性疾病。

本制剂用健康猪鲜血制成，具有安全性高，制造工艺科学合理，成本低，效果显著，无毒副反应，易于推广的特点。

本制剂的用法用量：肌肉注射，按猪体重用药，每20公斤每天注射10000单位，病重者加量使用，或遵医嘱，连续使用3-5天为一个疗程。

本药品贮藏与效期：本品宜在2-8℃条件下贮存，有效期1年半。

本药品安瓶开封后，药剂一次用完，没有用完的药剂不能再用，本药品可与抗菌类药物同时使用。

Claims (2)

1、一种治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂，其特征在于：该注射剂包括有以下组成成份：白细胞悬液、猪血清、启动干扰素、病毒液和培养液，其中：

猪血清、病毒液和培养液的体积比是：

猪血清∶病毒液∶培养液=(250～350)∶(250～350)∶5000

白细胞悬液和启动干扰素是加入到培养液中的，每毫升培养液中含有4×10⁷～10×10⁷个猪白细胞，每毫升培养液中含有50～150单位的干扰素抗病毒活性；

其中所说的“白细胞悬液”、“猪血清”、“启动干扰素”、“病毒液”、“培养液”是通过以下方法制备的：

(1)白细胞悬液

无菌采集健康猪鲜血，在无菌室内，通过大型离心机在4℃和3000转/分钟时，离心分离20分钟，先抽吸出血浆后，吸取中层白细胞灰黄层至血浆瓶内，用0.85％的NH₄Cl两次处理，再次离心分离，收集沉淀白细胞，用Hank′s液洗去残余NH₄Cl，用培养液把沉淀白细胞稀释成悬液；

(2)猪血清

无菌采集健康猪鲜血，自然析出，采用0.2％CaCl₂处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板(K₇板)澄清，除菌板(EKS板)除菌，置-20℃保存备用；

(3)启动干扰素

首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素；

(4)病毒液

在36℃～38℃时，把授精鸡蛋孵化7～15天后，用病毒接种，再孵化65～79小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1∶(320～1280)，置-20℃保存备用；

(5)培养液

把粉剂1640与蒸馏水配成1％～2％的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液含谷氨酰胺的浓度为3％，再加入青链霉素，使1640溶液中含青链霉素达100～1000单位/毫升。

2、一种制造按照权利要求1所说的治疗猪病毒性疾病的猪白细胞干扰素注射剂的方法，该方法包括如下步骤：

一、制备原料

(1)制备白细胞悬液

无菌采集健康猪鲜血，在无菌室内，通过大型离心机在4℃和3000转/分钟时，离心分离20分钟，先抽吸出血浆后，吸取中层白细胞灰黄层至血浆瓶内，用0.85％的NH₄Cl两次处理，再次离心分离，收集沉淀白细胞，用Hank′s液洗去残余NH₄Cl，用培养液把沉淀白细胞稀释成悬液；

(2)制备猪血清

无菌采集健康猪鲜血，自然析出，采用0.2％CaCl₂处理血浆，除去其中的纤维蛋白，用澄清板(K₇板)澄清，除菌板(EKS板)除菌，置-20℃保存备用；

(3)制备启动干扰素

首次采用人白细胞干扰素作为启动干扰素，以后各次选用前批次效价最高的猪白细胞干扰素作为启动干扰素；

(4)制备病毒液

在36℃～38℃时，把授精鸡蛋孵化7～15天后，用病毒接种，再孵化65～79小时后，收获病毒液，该病毒液的血凝效价为1∶(320～1280)，置-20℃保存备用；

(5)制备培养液

把粉剂1640与蒸馏水配成1％～2％的1640溶液，加入谷氨酰胺，使1640溶液含谷氨酰胺的浓度为3％，再加入青链霉素，使1640溶液中含青链霉素达100～1000单位/毫升。

二、混合

(1)把白细胞悬液加入培养液中，使每毫升培养液中含猪白细胞个数为4×10⁷～10×10⁷个；

(2)然后加入猪血清，在每5000毫升培养液中加入猪血清250毫升～350毫升；

(3)再加入启动干扰素，使每毫升培养液中含干扰素抗病毒活性50～150单位；

(4)最后加入血凝效价在1∶(320～1280)的病毒液，每5000毫升培养液中加入病毒液250～350毫升；

三、水浴搅拌诱导培养

将混合后的混合液置于水浴搅拌装置中，在37℃时诱导培养20小时，其中，在第2小时时，用5％的NaHCO₃调PH值为7.0～8.0，在第6小时时再用5％的NaHCO₃调PH值为7.0～8.0；

四、离心收获

将水浴搅拌诱导培养后的液体在无菌室内，用大型离心机在4℃和3000转/分钟情况下，离心分离10～20分钟，收集上清干扰素，除去沉淀及杂质；

五、灭活病毒

将收获的干扰素液体用当量数为6.0的NHCl调PH值至2.0，在4℃的冷库中放5～7天，再用当量数为6.0的NaOH调回PH值至7.0～8.0后，存入-20℃冰库中冻存；

六、解冻除菌

从-20℃冰库中取出干扰素，先溶化，再离心，取上清干扰素，在无菌室内，用澄清滤器先澄清，再用除菌滤器除菌，解冻除菌后的猪白细胞干扰素存入4℃冰库中。