CN1769453A - GRF（1－32）与SS－HBsAg融合基因组合及其构建成的表达系统和药物制剂 - Google Patents

GRF（1－32）与SS－HBsAg融合基因组合及其构建成的表达系统和药物制剂 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种与促进动物生长有关的基因的组合方法，以及构建的一种真核表达载体。与生长有关的基因包括生长激素释放因子GRF(1－32)和生长激素释放抑制激素SS与乙肝表面抗原(HBsAg)融合基因；其组合既将GRF(1－32)与SS－HBsAg融合基因组合，构建成的一个表达质粒pIRES－GRF－HBsAg－SS；或将其克隆到腺相关病毒载体。将质粒通过裸质粒和PLGA微球包裹注射到动物肌肉组织，均能促进动物的生长。双基因的组合，促生长效果均优于单个基因，PLGA微球包裹能提高基因的表达水平，起到优于裸质粒注射的效果。本发明为应用基因转移技术促进动物的生长提供了新的有效的方法。

Description

GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合及其 构建成的表达系统和药物制剂
技术领域：
本发明涉及一种促进动物生长的基因组合，将GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合，并构建成表达系统，还制成了有促动物和人生长作用的药物制剂，属于促进动物生长的基因药物及其应用技术领域。
背景技术：
生长激素(growth hormone，以下简称：GH)是调解动物和人生长的主要激素，具有促进生长、提高瘦肉率和抑制脂肪合成的作用，在畜牧业上有着重要的应用价值。GH的水平高低主要受正性调控因子即生长激素释放因子(growth hormone releasing factor，以下简称：GRF)或称生长激素释放激素(growth hormone releasinghormone，以下简称：GHRH)和负性调控因子即生长激素释放抑制激素(somatostatin，以下简称：SS)或简称生长抑素的调控。GRF控制着GH的脉冲式分泌，SS控制着基础分泌，且SS对GRF有拮抗作用，影响GRF基因的表达。
将GRF的基因克隆到真核表达载体，并转移到动物体内表达，或将SS融合基因诱导动物产生SS抗体，可以促进GH的释放，从而起到对动物的促生长和提高生产性能的作用。将GRF与SS和HBsAg融合基因组合并构建共表达系统，可以使二者起到协同作用，既同时表达GRF和HBsAg-SS而诱导产生SS的抗体，增强GH的正调控作用和仰制负调控作用，起到优于每单个基因的促生长效果。
发明内容
本发明提供一种GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合。
本发明还提供了应用上述基因组合构建的真核表达系统。
本发明进一步提供了应用上述真核表达系统制成药物制剂。
本发明的技术解决方案包括以下步骤：
将GRF和SS与乙肝表面抗原(HBsAg)融合基因间的组合。
1、经基因构改造后的GRF(1-32)基因克隆，其改造后的基因序列如下：
ATG CTG CTC TGG GTG TTC TTC CTC GTC ACC CTCACC CTC AGC ACC GGC TCC CTC AGC TCC CTG CCCTCC CAG CGC CTC AGG ATG CCG CGG CAC GTG GATGCC ATC TTC ACC CAG AAC TAC CGG AAG GTG CTGGCA CAG CTC TCT GCC CGA AAG CAC CTC CAG GACATC TCT AGC AGG CAG CAG GAG
2、将改造后GRF(1-32)基因克隆到pcDNA3，构建真核表达载体pcDNA3GRF(1-32)；
克隆SS基因，与HBsAg基因融合，并克隆到pIRES，得到pIRES-HBsAg-SS；
将GRF(1-32)和HBsAg-SS基因同时克隆到pIRES，得到双基因共表达载体pIRES-GRF-HBsAg-SS。
或将上述双基因组合克隆到腺相关病毒载(rAAV2)，得到双基因组合的rAAV2表达系统rAAV2-GRF-HBsAg-SS。
一种真核表达系统制成药物制剂，其特征在于：由GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合构建成的表达系统制成的质粒，应用碱变性法大量提取上述质粒制成药物制剂，按下面方式注射到动物体内：
将裸质粒直接或通过PLGA微球包裹注射到动物肌肉组织：
1后肢前肢肌肉直接注射在肌肉组织表达；
2将质粒制备成聚乳酸和聚乙醇酸(PLGA)微球(直径3um左右)，肌肉注射。
经动物实验表明：上述质粒都能促进动物的生长，特别是两种双基因表达方式即与pIRES-GRF(1-32)-PACAP具有更好的促生长效果。具体实验结果见附表。
不同质粒对动物的促生长作用(以家兔实验为例)：
                        表1  PLGA包裹及裸GRF基因表达质粒对家兔平均日增重的影响
  0～5   5～10   10～15   15～20   20～25   25～30
  GRF-MSGRF空微球生理盐水   30.51±9.6226.00±2.3916.53±7.5618.33±4.62   31.43±10.52a，b13.60±5.15a0.75±0.2110.07±4.65   33.07±9.98a19.50±5.27a4.00±10211.42±4.22   34.11±843a，b，c17.32±3.18a1.07±0.1213.33±3.52   17.56±4.438.00±3.4212.42±33418.12±6.52   29.00±4.889.12±5.2720.84±3.8728.75±5.47
注：GRF-MS：PLGA微球包裹pcDNA3-GRF(1-32)质粒，GRF：pcDNA3-GRF(1-32)裸质粒。a：与空微球组比差异显著(P＜0.05)；b：与盐水组比差异显著(P＜0.05)；c：与GRF组比差异显著(P＜0.05).
              表-2  GRF与HBsAg/SS基因及其组合对家兔生长的影响(g)
时间(d) 生理盐水 p-GRF p-HBsAg/SS p-GRF-HBsAg/SS
15   333.75±36.84 500.00±25.35** 413.25±29.61* 528.75±29.69**
30   488.75±32.92 767.50±33.58料 785.00±69.26** 848.75±54.95**
45   871.25±58.23 1170.00±38.91** 1135.00±65.44** 1221.25±59.00**
注：p-GRF：PLGA包裹GRF表达质粒；p-HBsAg/SS：PLGA包裹HBsAg/SS基因表达质粒；p-GRF-HBsAg/SS：PLGA包裹GRF和HBsAg/SS双基因表达质粒。
**P＜0.01
*P＜0.05
上述所指的动物包括小鼠、兔、猪、牛、羊及毛皮动物等。
本发明的积极效果在于：对GRF进行基因改造以增强其生物学活性，构建了两种单基因的表达载体和一种双基因的表达载体，提出了GRF与HBsAg-SS融合基因共表达的新方法，上述三种质粒对动物均有促生长作用。提出了应用质粒促进动物生长的新概念，为保进动物的生长和提高生产性能提供了新的方法。
附图说明
图1为本发明所构建的质粒图。
图2为本发明制备的PLGA包裹质粒微球。
图3为本发明质粒的克隆方法示意图。
图4为PCR鉴定图。
图5为双酶切鉴定图。
具体实施方式：
通过以下实施例进一步举例描述本发明，并不以任何方式限制本发明，在不背离本发明的技术解决方案的前提下，对本发明所作的本领域普通技术人员容易实现的任何改动或改变都将落入本发明的权利要求范围之内。
实施例1
按GRF(1-32)的序列，用化学合成的方法合成基因片断，两端设有EcoRI和HindIII的酶切位点，同时用上述酶酶切GRF(1-32)基因和pcDNA3，经T4连接酶连接并转化JM109感受态细胞，鉴定阳性克隆，既为真核表达载体pcDNA3-GRF(1-32)。
实施例2
化学合成SS的基因，用PCR扩增HBsAg基因，制备融合基因HBsAg-SS。用SmaI、XbaI酶切的方法(同实施例2)将HBsAg-SS克隆到pIRES，鉴定阳性克隆，既为真核表达载体pIRES-HBsAg-SS。
实施例3
将pcDNA3-GRF(1-32)中的GRF基因用双酶切(参照实施例1)并亚克隆到pIRES-HBsAg-SS从而得到GRF(1-32)和HBsAg-SS双基因表达载体pIRES-GRF(1-32)-HBsAg-SS。
质粒的克隆方法见图3。
通过PCR和双酶切的方法鉴定质粒结果。
见图4；PCR鉴定图。
图5：双酶切鉴定图。
实施例4
将双基因组合GRF-HBsAg-SS用PCR的方法扩增，酶切，构建穿梭载体pSNAV-GRF-HBsAg-SS。设计引物两端加设穿梭载体多克隆位点中的两个酶切位点(Smal I和EcoRI)及保护碱基，设计标准的PCR反应从GRF、SS-HBsAg和GRF-SS-HBsAg质粒中扩增相应的基因，其中GRF-SS-HBsAg包括GRF基因、IVS(内含子)、IRES(核糖体进入位点)和SS-HBsAg，以保证双基因的同时表达。用相应的内切酶(SmalI和EcoRI)酶切穿梭载体和PCR扩增的基因，分别用琼脂糖纯化并回收酶切片段，用T4连接酶将相应的酶切片段连接，转化到致敏的大肠杆菌细胞(JM109)，培养过夜，用PCR和双酶切筛选并鉴定相应的阳性克隆。提取并纯化上述含各种基因的穿梭质粒，用Lipofectinamine转染培养好的BHK-21细胞，经筛选后得到rAAV2-GRF-SS-HBsAg。
实施例5
微球制备工艺如下：
(1)取三种质粒p-GRF、p-HBsAg/SS、p-GRF-HBsAg/SS溶液各500μl，分别置25ml烧杯中，加入CH2Cl21.25ml，丙酮0.15ml，PLGA 0.25g，充分溶解。
(2)超声功率为15W，间隔3S超声3S，超声时间40～70S，使溶液均匀。
(3)向每个烧杯中加入4％的PVA4ml，超声60～120S。(取1滴混悬液轻轻滴入水溶液中，观察能否沉散)。
(4)向每个烧杯中加入0.4％PVA20ml，室温磁力搅拌8～10h。
(5)用4层灭菌尼龙布将上述溶液过滤至一40ml无菌离心管(精确称取离心管重量)中，尽量让溶液滤尽。
(6)将收集的溶液10000～12000rpm离心10min。
(7)取上清，估测体积，同时对上清进行核酸含量测定。
(8)用20ml蒸馏水重悬沉淀，按(5)(6)步骤操作2次。
(9)弃掉上清，沉淀放置-20℃冰箱保存。
为白色粉末，注射时用生理盐水制备悬浊液。
实施例6
将上述质粒以不同方式(将裸质粒直接或通过PLGA微球包裹)注射到动物肌肉组织，可以促进动物的生长，提高动物体内的IGFI的浓度。且GRF与SS和HBsAg融合基因共表达，促生长效果高于单个基因；肌肉注射PLGA微球包裹质粒比裸质粒促生长效果好。具体结果见表1、表2。
                                序列表
<110>张永亮
<120>GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合及其构建成的表达系统和药物制剂
<130>1
<160>1
<170>PatentIn version 3.3
<210>1
<211>186
<212>DNA
<213>人(Homo sapiens)
<220>
<222>(1)..(186)
<223>
<400>1
atgctgctct gggtgttctt cctcgtcacc ctcaccctca gcaccggctc cctcagctcc      60
ctgccctccc agcgcctcag gatgccgcgg cacgtggatg ccatcttcac ccagaactac     120
cggaaggtgc tggcacagct ctctgcccga aagcacctcc aggacatctc tagcaggcag     180
caggag                                                                186

Claims (4)

1、一种GRF(1-32)基因克隆，具有以下基因序列：
ATG  CTG  CTC  TGG  GTG  TTC  TTC  CTC  GTC  ACC  CTC
ACC  CTC  AGC  ACC  GGC  TCC  CTC  AGC  TCC  CTG  CCC
TCC  CAG  CGC  CTC  AGG  ATG  CCG  CGG  CAC  GTG  GAT
GCC  ATC  TTC  ACC  CAG  AAC  TAC  CGG  AAG  GTG  CTG
GCA  CAG  CTC  TCT  GCC  CGA  AAG  CAC  CTC  CAG  GAC
ATC  TCT  AGC  AGG  CAG  CAG  GAG。
2、一种GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合。
3、根据权利要求2融合基因组合构建成的表达系统，包括pIRES-GRF-HBsAg-SS质粒表达系统，或AAV2-GRF-HBsAg-SS病毒表达系统。
4、一种真核表达系统制成药物制剂，其特征在于：由GRF(1-32)与SS-HBsAg融合基因组合构建成的表达系统制成的质粒。
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