CN1309824C - 抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌及其制备方法和应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌及其制备方法和应用。昆虫抗菌肽具有广谱杀菌作用，本发明根据柞蚕天然抗菌肽氨基酸序列的特点，设计新的抗菌肽基因，合成其DNA序列转化于粘质芽胞杆菌中表达，形成抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌。同时优化该菌培养基的配方及发酵条件，在发酵罐中发酵，达到高密度培养和高效表达的效果。将发酵液分离、纯化成为抗菌肽制剂。该抗菌肽制剂应用作兽药及人的外用药，能代替抗生素，预防小鸡疾病以及作为消毒剂的原料。

Description

抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌及其制备方法和应用

技术领域

本发明涉及基因工程领域，具体地说是一种抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌及其制备方法和应用。

背景技术

天然抗菌肽(Cecropin)，已发现有A、B及D等多种，具有广谱杀菌作用。抗菌肽在医药上的应用已有初步成效。如育成蛹粉，作为“肾肝宁”药物原料，治疗肾炎及肝炎有较好效果。蚕蛹免疫血淋巴制成冻干粉，配制成柞蚕素胶囊，作为西药二类治疗乙型肝炎，已进入二期临床观察。抗菌肽作为饲料添加剂代替抗生素喂养小鸡、小猪及对虾预防禽畜及水产疾病已正在推广应用。在现有技术中，是通过注射大肠杆菌于柞蚕蛹，诱导产生抗菌肽的，从柞蚕蛹提取天然抗菌肽得率低，成本高，大规模工业化生产尚有困难。

抗菌肽基因转化啤酒酵母已投入中间试验，作为饲料添加剂有一定效果。由于酵母生长较慢，周期较长(72小时)，产生抗菌肽的效价较低(5000单位/mL)，应用受到限制，主要用于畜禽饲料添加剂。

发明内容

本发明的目的在于提供一种抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌。

本发明的另一个目的在于提供该抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌的制备方法。

本发明的进一步目的在于提供该抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌的应用。

抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌的生产方法包括：

(1)用DNA合成仪合成抗菌肽ADC基因

所述抗菌肽ADC基因根据天然抗菌肽的氨基酸序列设计得到，其DNA序列和推导的氨基酸序列如序列表所示。

合成抗菌肽ADC基因流程图如图1所示，其中Cecropin5为82bp由5’→3’；cecropin3，为78bpm由3’→5’。Frist PCR，第一次PCR扩增，用以上两段Cecropin互为模板。第二次PCR用Cecropin1及Cecropin2为引物，用第一次PCR产物为模板，PCR扩增后，得到抗菌肽ADC基因。ADC基因全长141bp。

40个氨基酸残基推导的抗菌肽ADC基因结构如下：

5’端上游9个碱基为连接表达载体启动子的核苷酸序列，具有XhoI切口；3’下游15个碱基为终止密码及连接表达载体的核苷酸序列，具有EcoRI切口。

(2)合成的抗菌肽ADC基因，通过XhoI及EcoRI限制性内切酶消解后，用T₄ DNA连接酶与质粒pHIL-SI连接，构成重组质粒pHIL-ADC；转化于大肠杆菌DH5(市售)，得到含抗菌肽ADC基因的大肠杆菌DH5；

质粒pHIL-S1可以市售，购自Invitrogen公司，其物理图如图2所示，其中：8260bp，5′AOX1启动子1-941bp。5′AOX1引物856-870bp，多克隆位点(Multiple Cloning Site)1006-1026bp，His4ORF：组氨酸酶阅读框架：4286-1753bp，氨苄青霉素抗性基因(Amplicillin)：6651-7106bp，Bgl II、XhoI、EcoRI、SmaI、BamHI均为内切酶切口。

(3)含抗菌肽ADC基因的大肠杆菌DH5，在含氨苄青霉素的LB培养基中培养，挑取单菌落；提取质粒，用XhoI及EcoRI酶切后电泳，得到约141 bp的DNA区带，如图5，图中1.λDNA/HindαIII分子量标记；2.pHIL-SI/EcoRI，阴性对照；3.pPICZα-A重组质粒/EcoRI+XhoI；4.pHIL-ADC PCR扩增的抗菌肽ADC区带；所述质粒用以下引物

——引物1：5’GAG CTC GAG ATG AAA TTG AAG TTC AAAAAG 3’

——引物2：3’CGA GTT CGA TGA CGG AAC CAA TTG TTGATT CTT 5’

进行PCR扩增；

2％琼脂糖凝胶电泳，得到约141 bp的DNA区带；如图6所示，图中：1.λDNA/Hind III分子量标记；2.pPICZα-A/EcoR1，阴性对照；3.pADC/EcoR1示抗菌肽ADC基因；4.PCR Marker；5.抗菌肽ADC基因阳性对照。

(4)以pHIL-ADC质粒为模板，用引物1及引物2作PCR扩增，扩增产物用EcoRI酶切，低融点凝胶电泳，回收抗菌肽ADC片胶，经小牛肠碱性磷酸酶(CIPA)处理后用T₄ DNA连接酶与质粒 -A连接，构成-A-ADC重组质粒，简称pADC，其构建流程图如图4所示。

质粒pPICZαA可以市售，购自Invitrogen公司，其谱图如图3所示，其中：质粒3595bp；5′AOXI醇合成酶：1-940bp；α因子(α-factor)序列：941-1207 bp：α因子引导肽序列：1144-1164bp；多克隆位点：1208-1274bp；myc末端终止子：1275-1307bp；组氨酸合成酶(polyhistidine)：1320-1340bp。Bgl II、EcoRI、NotI等为内切酶切口。

在图4中：pHIL-ADC：含抗菌肽ADC的重组质粒；PCR：DNA内切酶的链反应；E、E：EcoRI酶切口。EcoRI、CIAP：EcoRI内切酶CLAP为小牛肠碱性磷酸酶；pPICZα-A，E.E：为EcoRI切开的质粒。T₄DNA连接酶将抗菌肽ADC基因与pPICZ1α-A质粒重组；pADC为含抗菌肽ADC基因的重组质粒；5′AOX1为醇合成酶起动子；黑线示抗菌肽ADC基因；zeocin^R对Zeocin抗生素抗性基因。

(5)将pADC转化于大肠杆菌Top10(市售)的感受态细胞，在含Zeocin(100μg/mL)的LB平板上挑选转化子；

(6)含抗菌肽ADC基因的大肠杆菌Top10中，提取重组质粒pADC，用氯化钙法转化于粘质芽胞杆菌Q中，在含Zeocin(100μg/mL)的LB培养基上培养，32℃，48小时，得到转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌Q；

粘质芽胞杆菌Q是本发明中的转基因受体菌，从10株野生芽胞杆菌中筛选而获得。菌体具有多种抑菌物质，包括多粘菌素(Polymyxin)及芽孢菌粘素(Biocillomyxin)，具有抑制细菌及某些真菌的作用，故选作转抗菌肽基因的受体菌。

(7)发酵

50升发酵罐，加入40升培养基，通入1气压蒸汽，灭菌30分钟；

放冷到32℃，在灭菌条件下接入3％(体积)的转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌Q(OD_s70mm0.8～1.0)；

在32℃，pH7.0，拌搅500rpm，保持溶氧量8mg/L的条件下，连续发酵36小时，取样检测菌体密度达OD_570mm10以上，杀菌效价10000单位/mL；

通入100℃蒸气，10分钟，灭菌。放料，发酵液离心除去菌体。用升膜式真空浓缩器，在75～80℃，600mmHg条件下浓缩到1/10体积；

浓缩液用喷雾干燥，130℃进气，60～63℃排气的条件下，得到转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌的制品。产品杀菌效价10万～12万单位/g。

为了达到筛选工程菌的，本发明可以挑取单菌落，摇瓶培养，检测多个单菌落菌株的培养液中的杀菌效价，筛选工程菌株。

本发明可以用地高辛试剂盒(市售)标记抗菌肽基因作为探针，与工程菌的DNA，经EcoRI酶切后进行Southern印迹杂交，筛选出发酵效价高的工程菌株。

抗菌肽ADC是一个新设计合成的抗菌肽基因，推导的氨基酸序列符合天然抗菌肽的要求，即N-端形成亲水α-螺旋，C-端形成疏水α-螺旋，两个螺旋之间有丙氨酸-甘氨酸-脯氨酸(A-G-P)的β摺叠将两个α-螺旋连接起来。在C-端为天门冬酰胺，与天然抗菌肽酰胺基末端相似。因而具有高而稳定的杀菌作用。重组抗菌肽ADC基因的质粒pPICZα-A-ADC(简称pADC)，具有在芽胞杆菌及酵母中穿梭的特性。抗菌肽基因的启动子α-factor及其前导序列能将菌体合成的抗菌肽分泌到胞外，有利于分离、纯化。抗菌肽基因的终止子为C-myc-GxHis，即含有组氨酸合成酶，可以在缺组氨酸的合成培养基中生长，作为报告基因之一。该质粒又含有Zeocin抗性的基因，工程菌可以在25-100μg/mL Zeocin抗生素的培养基上生长，有利于防止杂菌的污染。粘质芽胞杆菌Q生长迅速，发酵周期短，仅36小时能高密度培养和高效表达抗菌肽，较啤酒酵母及毕赤酵母更为优越。

抗菌肽制剂有广谱杀菌作用，抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌的制品应用作畜禽药物代替抗生素，能预防小鸡白痢等消化道疾病，能促进生长，增加体重，除细菌外对白色念珠菌及阴道毛滴虫也有效。其作为调配成呼吸道喷雾剂及阴道栓剂等消毒剂原料，有广阔开发前景。同时对预防及治疗人的呼吸道、阴道疾病有较好的作用。

在现有技术中，抗菌肽的获得是通过注射大肠杆菌于柞蚕蛹，诱导其产生天然抗菌肽的，采用该方法得到的抗菌肽的量非常有限。本发明提供的抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌所得到的抗菌肽制品可以应用于工业化生产，降低生产成本。

附图说明

图1是合成抗菌肽ADC基因流程图；

图2是质粒pHIL-S1图谱；

图3是pPICZαA物理图：

图4是转抗菌肽ADC基因表达载体构建图；

图5是pHIL-ADC重组质粒酶切电泳图；

图6是pPICZα-A-ADC重组质粒酶切电泳图；

图7是抗菌肽ADC基因测序图。

具体实施方式

实施例1抗菌肽ADC基因转化粘质芽胞杆菌的制备方法

(1)抗菌肽ADC基因的设计、合成

根据天然抗菌肽杀菌活性结构，设计、合成抗菌肽ADC基因，分别合成F₁(82bp)及F₂(78bp)两大片段。两片段之间有20bp互补，互为模板作PCR扩增。

F₁：5’GGATCCGT ATG AAA TGG AAG TTG TTC AAA AAG ATT GAA AAGGTT GGT CAA AGA GTT AGA GAC GCT GTC ATC TCT GCT GGT CC-3’

F₂：3’CGA CAG TAG AGA CGA CCA GGA CGA CAA CGG TGA CAA CGAGTT CGA TGA CGG AAC CGA TTC ATTATFCTTAAGCAGCTG-5’

反应条件：

F₁、F₂片段(25mmol/L)        各1.0μl

dNTP(pmol/L)                   2.5μl

10×PCR缓冲液                  5.0μl

Taq酶(5单位)                   1.0μl

双蒸水                         39.5μl

合计                           50μl

反应条件：92℃变性1min，加入Taq酶。按52℃ 60sec，70℃ 60sec，90℃ 30sec，共35个循环。终止后72℃延伸5min。

第一次PCR的产物作为模板，用引物1及2作为第二次PCR扩增。

引物1：5′GGA TCC GTA ATG AAA TGG AAG 3′

引物2：3′TCA TTA TTC TTA AGC AGC TG 5′

反应条件同上，最后一步延伸72℃ 10min。PCR产物回收后，在2％低融点琼脂糖凝胶电泳，得到抗菌肽ADC基因。-20℃保存备用。

(2)抗菌肽ADC基因表达载体的构建

抗菌肽ADC基因用EcoRI酶切后，用T₄DNA连接酶与pHIL-SI质粒(市售)连接，成为pHIL-ADC重组质粒，转化于大肠杆菌DH5。在含氨苄青霉素的LB培养基中挑选转化子。提取转化子质粒DNA，用EcoRI酶切，电泳得到141bp的DNA区带。经ABI 377DNA自动测序仪测序测定抗菌肽ADC基因序列与设计完成一致，如图7所示。

(3)粘质芽胞杆菌Q表达载体的构建

将上述pHIL-ADC重组质粒与pPICZα-A分别用EcoRI酶切后，用T₄DNA连接酶连接成pADC重组质粒，转化于大肠杆菌Top10，在含100μg/mL Zeocin的LB培养基中筛选转化子。

(4)转化于粘质芽胞杆菌Q

pADC质粒，用CaCl₂法转化于粘质芽胞杆菌Q。取50μL芽胞杆菌感受态细胞，离心后加入240μL50％聚乙二醇4000，36μL无水氯化钙(mol/L)，25μL pADC质粒。充份混合后，30℃放置30min，42℃热激10-20min，冷至室温，5000rpm离心10min，沉淀物垂悬于1mL L B培养基中。吸取200μL涂布于含100μg/mL Zeocin的LB平板上，30℃培养1-2天，挑选转化子，即为转抗菌肽ADC粘质芽胞杆菌。

(5)转抗菌肽ADC粘质芽胞杆菌工程菌的鉴定

提取转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌的DNA，以地高辛试剂盒标记抗菌肽ADC基因片段作探针。EcoRI酶切后进行Southern印迹杂交，电泳后为阳性141bp的DNA区带。

转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌在LB液体培养基(按优化配方)中发酵，在50升发酵罐中按改进的发酵条件，发酵36小时。检测培养液发酵物的杀菌效价达10000单位/mL，即可通入直接蒸汽，以终止发酵并杀死菌体。培养液离心除去菌体，检测上清液的杀菌效价达10000单位/mL。

(6)抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌杀菌活性的测定：

将转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌的培养液用100℃水浴处理20min，离心5000rpm 5min，取上清液作杀菌活性检验。在固体LB培养液中接入大肠杆菌K₁₂D₃₁，吸取6mL融化的培养基注入7.5cm直径的培养皿中，放冷后制成平板。用2.7mm直径打孔器打孔，每孔分别注入5μL发酵液，阴性对照孔注入5μL无菌水，阳性对照孔注入100单位/mL青霉素5μL。每处理重复三次。倒置培养皿，30℃培养过夜。培养皿上出现不同的抑菌圈，用卡尺测定各处理的抑菌圈的直径(mm)，取平均值。

按下列公式计算其杀菌效价(单位/ml)。

抗菌活性(单位/mL)＝2X×1000

举例：抗菌肽孔穴平均抑菌圈直径为8mm，按公式计算

$X=\frac{8-2.7}{2.1}=2.52$

注：2.1为抗菌肽浓度与抑菌圈直径的斜率。

抗菌活性(单位/mL)＝2^2.52×1000

                 ＝log(2.52×0.301)×1000

                 ＝5.735×1000

                 ＝5735单位/mL

实施例2抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌株培养实验

本发明对抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌株进行了培养基优化试验，具体见表1。

              表1.培养基组成优化的正交试验

89

33

1.52.0

0.010.02

0.1000.050

1412

最佳配方为蛋白胨3.0％，淀粉1.5％，MgSO₄·7H₂O 0.03％，K₂HPO₄·3H₂O O.1％，发酵杀菌效价达10000单位/mL的水平。

发酵条件的优化：在上述优化培养基的配方条件下，寻找最佳发酵条件，具体见表2。

        表2.发酵条件优化的正交试验

最佳发酵条件为32℃，pH7.0，拌搅次数500rpm，溶氧量8mg/L。发酵效价达11000单位/mL。

实施例3抗菌肽ADC基因转化粘质芽胞杆菌的应用

转抗菌肽ADC基因粘性芽胞杆菌的产品加入小鸡饮水中，自由饮用，能预防小鸡白痢等消化道病症。加入小猪饲料中饲喂可以防预小猪细菌病。应用于小鸡饮水的最佳剂量，列于表3。饲喂小鸡的效果见表4。

    表3.转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌饲喂小鸡的剂量

            表4.转抗菌肽ACD基因粘质芽胞杆菌喂养小鸡的效果

项目	抗菌肽区(7.5mL/羽)	抗菌肽区(10.0mL/羽)	金霉素(500mg/kg)	对照
					供试羽数(羽)开始体重(g/羽)1周(g/羽)2周(g/羽)3周(g/羽)4周(g/羽)净增体重(g/羽)消耗饲料(g/羽)料肉比发病数(羽)发病率(％)死亡数(羽)死亡率(％)	9036.3±0.2475.5±0.31158.0±2.68238.4±5.68362.4±10.32326.1*785.4±6.512.407.38.12.02.22	9037.2±0.2576.3±0.38160.3±3.72244.1±7.21369.3±5.78331.8*788.4±5.322.375.46.000	9037.1±0.3876.4±0.39156.0±6.43230.4±5.88349.4±7.32312.3780.4±8.532.497.88.62.22.22	9036.3±0.5175.3±0.51153.3±7.72228.3±3.64348.0±6.67311.1740.4±6.352.4813.414.84.44.8

          供试羽数三个重复，每区30羽，共90羽。*P＜0.05.

试验表明转抗菌肽基因粘质芽胞杆菌制剂喂养小鸡四周，能预防疾病增加体重，减少发病率及死亡率。可以代替抗生素。

菌肽基因粘质芽胞杆菌制剂用作消毒剂的原料：将发酵液离心除去菌体，用SepharoseFF离子交换树脂层析纯化，收集有杀菌活性的组份，测定并调整其杀菌效价为10000单位/mL，用作消毒剂的原料。

呼吸道(口鼻腔)消毒剂的配方是：

抗菌肽制剂(10000单位/mL)                100

薄荷油乳化剂                            300

合计                                    400

薄荷油乳化剂的配方：

薄荷油                                  2

吐温20                                  2

无菌水                                  96

合计                                    100

以上抗菌肽薄荷油制剂作为呼吸道喷雾剂，可用于预防感冒及鼻炎。

阴道栓剂的配方是：

抗菌肽制剂(10000单位/mL)            100

石腊油                              20

凝固填充剂(乳酯)                    80

合计                                200

以上抗菌肽栓剂可由小型塑料管送入阴道内使用。可以防治白色念珠菌和阴道毛滴虫感染的炎症。

转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌制剂的杀菌谱

      表5、转抗菌肽ADC基因粘质芽胞杆菌制剂的杀菌谱

病原菌种类	有效抑菌浓度(单位/mL)	抑菌效果
			全黄葡萄球菌ATCC25923绿脓杆菌ATCC27853大肠杆菌ATCC25922芽胞杆菌26003白色念珠菌98001阴道毛滴虫	5-610-1510-1515-2010-1510	++++++++++++++++++

青霉素对以上4种细菌的有效浓度100-150单位/mL，对白色念株菌及阴道毛滴虫无效。

                     抗菌肽~1.TXT

                  SEQUENCE LISTING

<110>广州维观生物科技有限公司

<120>抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌及其制备方法和应用

<130>

<160>2

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>141

<212>DNA

<213>柞蚕(oak silkworm)

<220>

<221>CDS

<222>(10)..(126)

<400>1

gagctcgag atg aaa tgg aag ttg ttc aaa aag att caa aag aag gtt ggt    51

          Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gln Lys Lys Val Gly

          1               5                   10

caa aga gtt aga gac gct gtc atc tct gct ggt gct gct gtt gcc act      99

Gln Arg Val Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Thr

15                  20                  25                  30

gtt gct caa gct act gcc ttg gct aac taagaattcg gcccg                 141

Val Ala Gln Ala Thr Ala Leu Ala Asn

                35

<210>2

<211>39

<212>PRT

<213>柞蚕(oak silkworm)

<400>2

Met Lys Trp Lys Leu Phe Lys Lys Ile Gln Lys Lys Val Gly Gln Arg

1               5                   10                  15

Val Arg Asp Ala Val Ile Ser Ala Gly Ala Ala Val Ala Thr Val Ala

            20                  25                  30

Gln Ala Thr Ala Leu Ala Asn

        35

Claims (5)

1、一种抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌，其特征是一种由抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌而制得的工程菌；所述的抗菌肽基因是抗菌肽ADC基因，其核苷酸序列如序列1所示。

2、根据权利要求1所述的抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌，其特征在于所述的粘质芽胞杆菌是粘质芽胞杆菌Q。

3、权利要求1所述的抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌的制备方法，其特征在于包括如下步骤：

(1)抗菌肽ADC基因的获得：

抗菌肽ADC基因的核苷酸序列如序列1所示；

(2)抗菌肽ADC基因表达载体的构建：

将抗菌肽ADC基因用EcoRI酶切后，用T₄DNA连接酶与质粒pHIL-S1连接，成为pHIL-ADC重组质粒；

(3)粘质芽胞杆菌Q表达载体的构建：

将pHIL-ADC重组质粒与pPICZ α-A分别用EcoRI酶切后，用T₄DNA连接酶连接成pADC重组质粒；

(4)转化于粘质芽胞杆菌Q：

将pADC重组质粒，转化于粘质芽胞杆菌Q，制得抗菌肽基因转化粘质芽胞杆菌工程菌。

4、一种生产抗菌肽的方法，其特征在于利用权利要求1或2所述的抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌发酵生产。

5、权利要求1或2所述的抗菌肽基因转化的粘质芽胞杆菌工程菌发酵生产的抗菌肽在制备抗菌杀菌药物中的应用。

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