CN1046463A - 无毒微生物及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种用于对脊椎动物或无脊椎动物免疫的疫苗，它包含一种猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物。该衍生物基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和/或环AMP受体蛋白。本发明还提供了一种用于对脊椎动物和无脊椎动物免疫的疫苗，它包含一种病原微生物的毒性衍生物，所述衍生物基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和/或环AMP受体蛋白，但能够表达一种从所述脊椎动物的病原体衍生的重组基因，以产生一种能够在所述脊椎动物体内诱导针对所述病原体的免疫应答的抗原。

Description

本发明涉及无毒微生物，其制备方法和在疫苗中的应用。
猪沙门氏菌病是幼猪易患的，从经济上讲最严重的肠道和败血病之一，并被认为是猪饲养业中一个不容忽视的卫生问题。虽然已从猪体内分离出许多沙门氏菌（Salmonella）的血清型，猪霍乱沙门氏菌库氏变种（S.choleraesuis    var    kunzendorf）和鼠伤寒沙门氏菌（S.typhimurium）是与临床猪沙门氏菌病有关的最常分离出的血清型，Wilcock，B.P.，《猪疾病》（Leman.A.D.等编，1986）。猪霍乱沙门氏菌可寄生于猪体内，并常常是对肠道有很少影响的致命的败血病的病原。人们关注猪霍乱沙门氏菌在猪体内的存在，不仅因为它可能引起猪的疾病，还在于人类的公共健康意义。
由猪霍乱沙门氏菌引起的疾病表现为多种临床症状。这种生物具有天然侵染性，不象鼠伤寒沙门氏菌那样需要在腔内大量增生。在肠道的粘膜下层和粘膜固有层出现损伤和坏死。死亡率很高，而且这种疾病的周期和严重性是无法预料的。
目前，很少有关于用于控制猪霍乱沙门氏菌病的疫苗的信息。Smith，H.W.在J.Hyg.63∶117-135（1965）中证实，使用毒性猪霍乱沙门氏菌进攻后可产生保护作用。然而，试验动物出现发热、亚致死疾病、并成为该菌的排出者。Smith的菌株以Suscavax'''在欧洲出售，由Wellcome试验室制造和销售。在Vet.Microbiol.3∶303-309（1979）中，Hanna，J.等人报道了以肌肉注射的方式，在怀孕母猪体内使用Smith的减毒的猪霍乱沙门氏菌活疫苗。猪仔出生后具有很高的循环母体抗体的滴度，对鼻道攻击试验表现出抵抗力。虽然已报道鼠伤寒沙门氏菌的galE突变体是无毒和具有免疫原性的，但galE变异的猪霍乱沙门氏菌株在小鼠中象野生型gal+母体一样有毒。由于aroA突变而需要芳香氨基酸的猪霍乱沙门氏菌营养缺陷型减少了在小鼠中的毒性，但即使在三次免疫剂量后它也不能导致免疫性保护。目前唯一许可在美国使用的猪霍乱沙门氏菌是一种死的细菌种，但它在产生保护性免疫方面不是特别有效。
申请人已发现一种新的防止毒性感染的方法，其疫苗应用了使毒性微生物产生转座子无毒突变体，这种导致无毒的损害作用不会由于食物或动物寄主所提供的任何物质而恢复。申请人的初步工作包括在鼠伤寒沙门氏菌的腺苷酸环化酶基因（cya）和环AMP（cyclicAMP）受体蛋白基因（crp）中导入缺失突变，从而制备一种无毒细菌，该初步工作已公开于EP315682（1989.5.7.）和PCT    WO88/09669（1988.12.15公开）中。这些专利申请及任何相关国家的专利申请在这里作为参考加以引用。这些申请除了其他内容以外，特别讲授了钝化鼠伤寒沙门氏菌的cya和crp基因活性的DNA重组法，即在无毒鼠伤寒沙门氏菌的异源病原体中导入一种重组基因，从而产生一种能够导致免疫应答的新抗原，导入一种能够抑制、调节或增加免疫应答的产品的重组基因，以及应用这种鼠伤寒沙门氏菌构建体的疫苗和免疫方法。
本发明在某种程度上，以未在EP315682中公开的新的无毒猪霍乱沙门氏菌衍生物为基础。本发明包括这些新的猪霍乱沙门氏菌衍生物，特别是在商品化疫苗中的应用，激发免疫系统对猪霍乱沙门氏菌免疫抗原的应答的方法，和激发免疫系统对病原体的免疫抗原的应答的方法。在此提供的菌株可直接或间接用来制造防止由猪霍乱沙门氏菌或其他其抗体与猪霍乱沙门氏菌有交叉反应的肠道细菌引起的疾病的商品化疫苗。这些菌株还可用作载体微生物以制取由细菌内重组基因编码的表达产物。
因此，本发明的一个具体方案是一种用于免疫个体的，含有猪霍乱沙门氏菌病原体的无毒衍生物的疫苗，所述衍生物由于一个cya基因内的突变，基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶。
本发明的另一具体方案是一种激发免疫系统对猪霍乱沙门氏菌免疫原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物由于一个cya基因内的突变而基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶。
本发明的另一个具体方案是一种激发免疫系统对病原体的免疫抗原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和环AMP受体蛋白，并能表达一个编码该免疫抗原的重组基因，以而产生一种能够在所述脊椎动物体内诱导针对所述病原体的免疫应答的抗原。
本发明的另一具体方案是一种分离出的猪霍乱沙门氏菌的无毒菌苗，它基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶。
本发明的另一具体方案是一种免疫个体的疫苗，它含有病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物由于一种crp基因内的突变而基本上不能产生功能性环AMP受体蛋白（CRP）。
本发明的另一个具体方案是一种激发免疫系统对猪霍乱沙门氏菌免疫抗原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物由于在一个crp基因内的突变而基本上不能产生功能性的CRP。
本发明的另一具体方案是一种激发免疫系统对病原体的免疫抗原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物基本上不能产生功能性的CRP，并能表达一种编码该免疫抗原的重组基因，从而产生一种能在所述脊椎动物体内诱导针对所述病原体的免疫应答的抗原。
本发明还有一个具体方案是一种分离出的由于在一种crp基因内的突变而基本上不能产生功能性CRP的猪霍乱沙门氏菌的无毒菌株。
本发明进一步的具体方案是一种用于对个体免疫的疫菌，它包括一种病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物由于在cya和crp基因内的突变而基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和CRP。
本发明的另一个具体方案是一种激发免疫系统对一种猪霍乱沙门氏菌免疫抗原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物由于在cya和crp基因内的突变而基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶或CRP。
本发明的另一具体方案是一种激发免疫系统对一种病原体的免疫抗原产生应答的方法，包括给所述个体施用病原体猪霍乱沙门氏菌的无毒衍生物，所述衍生物基本上不能产生腺苷酸环化酶和CRP，并能够表达一种编码该免疫抗原的重组基因，从而产生一种能够在所述脊椎动物体内诱导针对所述病原体的免疫应答的抗原。
本发明的另一个具体方案是一种分离出的，由于在cya和crp基因内的突变而基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶和CRP的猪霍乱沙门氏菌的无毒菌株。
本发明的另一具体方案是从由菌株ATCC53647、ATCC53648、ATCC67923、ATCC53885和ATCC67922构成的一组中选出的一种菌株、其突变体和衍生物。
此处所用的“疫苗”是指一种用来激发活生物体的免疫系统，从而提供对未来伤害的保护的制剂。“免疫”是指在机体内诱导连续的高水平抗体和/或细胞免疫应答的过程，在该过程中，T淋巴细胞能够杀死病原体和/或使其他细胞（和吞噬细胞）活化来杀死这种病原体，而这种细胞是针对生物体先前暴露过的病原体或抗体的。虽然词组“免疫系统”可以包含单细胞机体对异体存在的反应，例如干扰素的产生，但在本申请中，该词组的解剖学特征和机制仅限于一个多细胞生物产生针对侵入该机体细胞或胞外液的抗原物质的抗体。这样产生的抗体可属于免疫学的任何一类，如免疫球蛋白A、D、E、G或M。特别有关的是激发免疫球蛋白A（Ig    A）产生的疫苗，因为这是恒温动物分泌系统产生的基本免疫球蛋白，但本发明的疫苗不限于激发Ig    A产生的疫苗。例如，在此描述的疫苗可以产生除Ig    A形成外的范围很广的其他免疫应答，如细胞和体液免疫。人们已对抗原的免疫应答作了很多研究，并作了广泛报道。Barrett，James，T.在Textbook    of    Immunology第四版（C.V.Mosby    Co.，St.Louis，MO1983）中作了免疫学概论，在此引入该书全部作为参考。
在此所用的“脊椎动物”意为任何脊椎动物亚门的成员，脊椎动物亚门为脊索动物门的一个基本划分，包括鱼、两栖动物、爬行动物、鸟类和哺乳类动物，所有这些动物的特征为节骨或软骨的脊柱。所有的脊椎动物都有功能性免疫系统，并通过产生抗体对抗原应答。这样，所有脊椎动物都是能够对疫苗产生应答的。虽然疫苗通常用于哺乳动物，如人或狗（狂犬病疫苗），对于商业化饲养的其他纲的脊椎动物，如鱼和鸟（如果具有这里所描述的特征）的疫苗也在本发明的范围之内。
“无脊椎动物”意为动物界内除脊椎动物外的任何其他成员。这些动物构成无脊椎动物部，它们没有脊骨或脊椎。这一类包括除鱼、两栖类、爬行动物、鸟类和哺乳类外的所有动物。许多无脊椎动物能够引发一种对抗原刺激的原始的免疫应答，并对本发明公开的感染脊椎动物的同样的微生物敏感。这些无脊椎动物的例子有水生贝壳类、软体动物和其他有关的动物。虽然迄今尚无文献很好地记载应用疫苗对无脊椎动物保护，但熟悉该领域的人可以看出，本发明主题可通过无脊椎动物的原始免疫系统用于这类动物。例如，根据本发明，水生贝壳动物对猪霍乱沙门氏菌的敏感性使得人们能在其中导入无毒的猪霍乱沙门氏菌种的菌株，从而为原始的免疫系统提供应答的可能性。因此，应用一种能够感染无脊椎动物的病原体微生物的无毒衍生物来激发无脊椎动物体内存在的抵抗病原体的免疫系统的应答是在本发明的范围内。
这里所述的用本发明的疫苗治疗的“个体”被定义为包括所有脊椎动物，如哺乳类，包括家畜和人，和各种鸟，包括家禽，特别是那些在农业上重要的种。此外，软体动物和某些其他具有原始免疫系统的无脊椎动物也包括在“个体”中。
此处所用“无毒的”一词，并非指那些永远无病原体功能的微生物属或种，而是指所用的某些微生物相对于被处理的某种动物是无毒的。这种微生物可能属于一个通常是病原体的属或甚至一个种，但必须属于一种无毒的菌株。这里所用的“病原体的”一词是指能够引起疾病或者削弱通常的生理功能。一种“无毒的菌株”不能引起其毒性病原体通常能引起的疾病的全部症状。这里所用的“微生物”一词包括细菌、原生动物和单细胞真菌。
猪霍乱沙门氏菌无毒微生物的衍生物也在本发明所注视的范围内。“衍生物”意为有性或无性衍生的该无毒菌株的后代或突变体，包括单或多碱基取代、缺失、插入或倒位，它们保留了不能产生功能性腺苷酸环化酶和cAMP受体蛋白的特点，并有或没有自然发生的有毒质粒。例如，象菌株Chi 4062和Chi 4064载有赋予萘啶酸抗性的gyrA突变，在这里被用来作为口服接种后追踪菌株的一个方便标记。但是，药物抗性不是作为疫苗菌株的所希望的特征。这样，通过遗传选择与其紧密连接的Tn 10而将gyrA+（赋予萘啶酸敏感性）基因传导至菌株中，然后通过选择镰刀霉酸抗性以去除Tn 10就可很容易地将gyrA+突变除去。
本申请中所用的“重组基因”一词涉及从一个生物体转移到第二个生物体内的遗传物质，转移的方式能使第二生物体在繁殖后产生含有该同样基因物质的后代。作为迅速发展的DNA重组技术的结果，用于将遗传物质从第一生物体转移到一个通常不与该第一生物体交换遗传物质的第二生物体的技术已经广泛地可以获得。
“基因”一词在这里广义地表示任何生物学的遗传单元。重组基因不必是母体生物内的一个完整基因，它能够生成一个大分子，如功能性多肽或调节其生成。只要该基因能够在抗原产物的生成过程中作为模板就行。该产物的形态不一定与其母体生物的完全一样。例如，一个编码含有100个氨基酸残基的多肽抗原的功能基因可以部分地转入一个载体微生物中，这样一种仅含75，甚至10个氨基酸残基的肽可由寄主细胞的细胞机制生成。然而，如果这个基因产物是一个抗原，并将导致针对母体生物中存在的一种类似抗原的抗体的形成，则该基因被认为是在这里定义的“基因”一词的范围内。或者，如果已知某抗原的氨基酸顺序或其片段，则能够用自动基因合成仪或类似物化学合成该DNA片段或其类似物，并将所述DNA顺序导入适当的表达载体中。在该谱的另一端是一个编码若干基因产物的DNA长片段，其中之一或全部都可以是抗原性的。因此，在这里限定和要求保护的是任何能够产生一种抗原的遗传单元。该基因可以是染色体、质粒或病毒来源的。
这里所用的“基因表达”一词意思是，在基因结构里遗传的信息通过该基因位于其中的细胞的生化机制，被转化为一种形式为RNA分子、多肽或其他生物学分子的物理产物。这样生成的生物分子称为基因产物。这里所用的“基因产物”一词是指任何作为基因控制下的生化反应的结果的生物学产物。这种基因产物可以是，例如，一种RNA分子、一种肽或一种在酶或其他该基因的初始产物分子控制下生成的产物，即一种代谢产物。例如，一个基因可能首先控制一个RNA分子的合成，它再在核糖蛋白体的作用下，被转译为一种酶，该酶则在该基因所存在的原初细胞中所没有的环境中控制聚糖的形成。该RNA分子、酶和聚糖都是这里所指的基因产物。任何这些和其他许多种基因产物，如糖蛋白和聚糖，如果被导入动物的免疫系统中则将作为抗原起作用。蛋白基因产物，包括糖蛋白和脂蛋白是优选的用作疫苗中抗原的基因产物。
这里所用的“变应原”一词是指引起变应反应的物质，即在针对它们而被免疫的动物体内发生的变应反应。许多不同的物质可以是变应源，如动物皮屑和花粉，各种动物对任何特异变应原的变应反应不同。在一种通常显出变应反应的动物体内诱发出对一种变应原的耐性是可能的。诱发耐性的方法是广为人知的，通常包括给予该动物以增大剂量的该变应原。在前面引述过的Barret的教科书中对耐性的诱发问题作了进一步的讨论。
本发明的根据是发现某些突变可以在基本上不影响微生物免疫原性的情况下使该微生物变为无毒。更具体说，载有缺失（△）突变△-cya和△crp的微生物疫苗使本发明成为可能。正如EP    315682中所描述的，这些缺失分别消除了合成腺苷酸环化酶（ATP焦磷酸裂合酶（环化）EC4.6.1.1）和环AMP受体蛋白（CRP）的能力。
EP315682描述了如何通过△-cya和△-crp突变消除环-3′，5′-腺苷单磷酸（cAMP），腺苷酸环化酶和环AMP受体蛋白而使鼠伤寒沙门氏菌无毒的方法。本发明接着这个问题解决了获得那些突变体的方法，以及将其应用到一种新的菌苗、猪霍乱沙门氏菌上，以获得其无毒突变体，该无毒突变体可用作引起猪霍乱沙门氏菌病免疫的疫苗的免疫原成分。
在本发明的另一实例中，该无毒的猪霍乱沙门氏菌衍生物可被用作一种载体细菌，向与肠相关的淋巴组织（GALT），例如回肠的淋巴集结传递选择的抗原。EP315682中报道了来自鼠伤寒沙门氏菌病原生物的重组基因的表达，从而在宿主内诱导针对该病原体的抗体生成。该公开还解释了载体微生物如何向寄主提供重组的由病原体衍生的抗原。
DNA重组技术已充分为人所知，并已普及到视为惯例的程度，借助于这种技术，遗传物质从一个生物体转入第二个生物体，并永久地成为其部分遗传物质。通常，来自母体生物的一小段DNA从一个质粒或母体染色体获得。质粒（也称为染色体外成分）是与细胞染色体物理分离的遗传单元。该DNA大小不限，常常由限制性核酸内切酶在特异的碱基对位点分裂DNA分子而获得。与质粒、噬菌体或柯斯质粒载体连接后，可以通过不同的方法，如转化（从外部环境中吸收DNA，此环境可用各种化学品，如钙离子的存在而人为地造成），或转导（包裹DNA重组体后将其导入噬菌体，如转导噬菌体或柯斯质粒载体中）而将新的重组分子导入宿主细胞中。载体细胞中的重组DNA可继续作为分离的DNA分子存在，也可嵌入寄主细胞染色体中并在细胞分裂时同染色体一起增殖。本发明有时利用转座子作为转移物质。转座子是嵌入DNA中的非常易动的DNA分子，它也可被切下来。这种切割可带走周围的遗传物质而产生缺失突变。然后由抗生素残基遗传标记监测转座子是否存在。
若希望得到病原体衍生的抗原，通过“鸟枪法”选择接受了转移的遗传物质的生物。鸟枪法在EP315682中给予了描述，在Naniatis，T.等人所著《分子克隆》，Cold    Spring    Harbor    Laboratories（1982）中给予了详细阐述，这里引用作为参考。该基因转移技术不被认为是本发明的一部分，任何一种能够产生重组生物的方法都可使用，该生物含有来自表达为无毒微生物的生物体的基因。如果所用种通常能交换遗传信息，则可使用如接合、转化、转导等经典的基因转移法。
在另一具体方案中，如果疫苗的免疫原成分是寄主的变应原，这种疫苗可以用于为使变应寄主特异性地脱敏而设计的施用法（exposure    regimen）。
本发明还有一个具体方案提供了一种脊椎或无脊椎动物的免疫疫苗，它含有一种猪霍乱沙门氏菌的活的无毒衍生物，该衍生物不能产生功能性腺苷酸环化酶和环AMP受体蛋白，但能够表达来自某种生物的重组基因，该生物是所述动物的病原体或能产生所述动物的变应原。
在一个综合上述的具体方案中，本发明的一个主题是猪霍乱沙门氏菌的无毒菌株，它载有cya和/或crp基因突变。
用法和用量
为使疫苗能有效地产生抗体，抗原物质的释放必须使接种动物的抗体产生机制开始起作用。因此，必须将基因产物的猪霍乱沙门氏菌载体适当地导入动物体内。为了激发如前所述的GALT或支气管相关的淋巴组织（BALT）细胞的选择应答，优选将微生物或基因产物直接导入肠或支气管中，例如通过口服，胃插管或以雾化的形式，但该疫苗的其他用法也是可行的，如静脉注射、肌肉注射、皮下注射或乳内用药、阴茎用药、阴道用药等。最后，当免疫调节基因或其他药理活性物质基因由该载体表达时，该寄主生物本身可以起遗传物质源的作用。
可用任何已知的或标准的技术对动物使用上面公开的那种活疫苗。包括口服、胃插管、支气管鼻喷入。所有这些方法都使活疫苗容易接触GALT或BALT，并诱导抗体形成，它们都是优选的使用方法。其他使载体微生物能够到达动物血流中去的用法，如静脉注射是可以接受的。静脉注射、肌肉注射或乳内注射在后面描述的本发明的其他实施例中也是可接受的。
所需剂量因基因产物的抗原性而异，只要足以诱导一种典型的现有疫苗的免疫应答即可。常规试验可以很容易确定所需要的量。需要时可使用多倍剂量以提供所希望的保护作用。
该疫苗悬浮或溶于其中的药物载体可以是任何溶剂或固体或胶囊，其材料对于接种动物是无毒的，并与该载体生物或抗原基因产物相容。合适的药物载体包括液体载体，如正常的生理盐水或接近生理浓度的无毒盐溶液，和固体载体，如滑石或蔗糖，也可掺在饲养动物的饲料中。如果希望加强抗原性，可以加入佐剂。若通过支气管服用，该疫苗以雾状提供为好。
用一种病原体衍生的基因产物进行的免疫，也可与病原体的无毒衍生物的预免疫结合使用，后者作为表达来自病原体的重组基因编码的基因产物的载体起作用。一旦病原体衍生的基因产物的分泌型免疫系统由表达该病原体衍生的基因产物的载体微生物引发后，则刺激了GALT或BALT的淋巴细胞，这种非肠道的免疫作用可以作为加强该分泌型免疫应答的表达的增强剂。人们知道，这种加强反应是继发的，增强的和记忆的应答，并延长了寄主的免疫保护作用。加强免疫可以重复多次并收到有益的效果。
上面的公开对本发明作了一般性的描述。参考下面的具体例子可以得到更完整的理解。这里提供例子的目的只是阐述本发明，并无限定的意图，除非另有说明。
实例
本实例说明猪霍乱沙门氏菌的△-cya，△-crp和△-cya，△-crp衍生物的构建，这些突变体口服（P.O）接种后的毒性和这些衍生物的免疫原性。
细菌菌株
用于本例的猪霍乱沙门氏菌菌株列在表1中。细菌菌株在37℃L肉汤中和L琼脂上生长（Lennox，Virology 1∶190-206，1965;Luria和Burrous，J.Bacteriol.74∶461-476，1957）以及在Penassay琼脂（Difco抗生素培养基＃3+1.5%BBL琼脂，Becton Dickinson Microbiology Systems，Cockeysville MD）和加有1%终浓度的合适的碳水化合物的MacConkey基本琼脂（Difco Laboratories）上生长。如果需要，在培养基中补充MgSO4（10mM），CaCl2（5mM），四环素（12.5μg/ml）和氨苄青霉素（100μg/ml）。如前所述，合成培养基是在最低限度的液体和最低限度琼脂中补以最适量的养分（Curtiss，J.Bacteriol.89∶28-40，1965）。带明胶的缓冲盐水（BSG）作为稀释剂使用（Curtiss，1965，同上）。
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遗传操作
转导可以用噬菌体PIL4或P22HTint以标准方法和培养基进行，参见Curtiss的《一般微生物学方法手册，美国微生物学协会》，P.243（Gerhardt等编，1981），Schmeiger，Mol.Gen.Genet.119∶75（1972）和Davis等人《遗传工程手册，高级细菌遗传学》（冷泉港实验室，冷泉港，NY，1980）。Maloy和Nunn在J.Bacteriol.145∶1110（1981）中描述的方法和培养基被用于镰孢菌酸选择，以选择带有Tn 10嵌入的菌株中的缺失突变。转化由Dagert和Ehrlich在Gene 6∶23（1979）中介绍的方法进行。质粒pSD110载有来自大肠杆菌的crp和Ampr基因Schroede和Dobrogosz在J.Bacteriol.167∶616（1986）中对此给予了描述，这是由C.Schroede慷慨提供的。如下所述，使用pYA2028可促进毒性质粒的消除，该质粒具有克隆在高拷贝质粒pUC18中的毒性质粒的Imc/Par区域。
动物感染性研究
雌性BALB/C小鼠（Harlan    Sprague-Hawley，Indianapolis，IN）用于所有感染性和免疫研究。将7周令的小鼠在隔离室关一周，然后再用于实验。关动物的笼子罩着Nalgene过滤器，提高的笼底用金属丝制作。食物和水随意提供。动物室保持在22℃-23℃，每日12小时照明。
口服接种后确定猪霍乱沙门氏菌株的毒性。小鼠接种的细菌在37℃的L肉汤中静置培养过夜。全部培养物以1∶20稀释到预热的L肉汤中，并在37℃充气约5小时，达到约600nm波长下0.8-1.0光密度。该细胞在室温下以8000xg离心10分钟以浓缩50倍，然后在BSG中悬浮。将稀释液浮在含有1%麦芽糖的MacConkey琼脂平板上，区分cya或crp表型并确定细胞数量。
未口服接种之前，小鼠先停止进食和水4小时。然后给它们30μl    10%（wt/vol）碳酸氢钠，5-10分钟后喂以20μl等分的悬浮在BSG中的猪霍乱沙门氏菌细胞。接种30分钟后再供食水。每天收集关于小鼠的病状和死亡率的资料。保护性免疫的评价。
保护性免疫的评价
对5只/笼分组的小鼠经口服不同剂量的无毒突变体进行免疫，30天后接种不同量的野生型毒性母体Chi    3246。观察病状和死亡状况至少60天。
带cya和crp突变的猪霍乱沙门氏菌株的构建
剧毒菌株Chi    3246用作这些研究中所有疫苗菌株的构建母体（Chi    3246的口服的LD50值提供在下面的表2中）。
所构建的从Chi    3246衍生的菌株在表1中列出。表1中还给出了菌株相应的基因型、得到该菌株的方法，利用该方法通过转导、转座子缺失嵌入转座子和在EP315682的实例1中描述的选择方法，但加上下面所述的修改。
通过P1L4转导（通过中介体鼠伤寒沙门氏菌寄主Chi3385和Chi    3477）和由pSD110的转化，将鼠伤寒沙门氏菌株PP1002、PP1037、Chi    3615和Chi    3623的cya∶∶Tn    10、crp∶∶Tn    10、△-cya-12和△-crp-11（见表1）分别导入猪霍乱沙门氏菌株Chi    3246中。然而，具P22HTint抗性的猪霍乱沙门氏菌株Chi    3246是对P1L4免疫的。这样，P1L4或Pl    Clr    Clm噬菌体可以吸附于并注射DNA入本实例所用的所有猪霍乱沙门氏菌株细胞中，但不能在这些细菌细胞中复制DNA。
由于△-cya-12zid    62∶Tn    10、△-crp-11zhb∶∶Tn    10、crp    733∶∶Tn    10和cya∶∶Tn10突变分别在鼠伤寒沙门氏菌株Chi    3711、Chi    3773、PP1037和PP1002中（见表1），因此必须将这些突变从平滑-LPS鼠伤寒沙门氏菌的环境中移到P22HTint和P1L4都可在其中增殖的沙门氏菌中间寄主中。噬菌体P22HTint和P1L4分别特异于光滑和粗糙LPS外壳的菌株。寄主Chi    3385和Chi    3477是限制性缺乏的和有修饰性能力（modification-proficient）的gal    E鼠伤寒沙门氏菌株。Chi    3385和Chi    3477在低半乳糖浓度的培养基中生长可使UDP-半乳糖合成，导致通常水平的LPS侧链;这些是由P22HTint附着和传染的基本条件。Chi    3385和Chi    3477在含葡萄糖和缺乏半乳糖的培养基中生长，使一种粗糙的或不完整的LPS合成，并能在这些粗糙的菌株中吸附和复制P1L4或Pl    Clr    Clm。通过这些手段构建猪霍乱沙门氏菌株Chi3492、Chi    3751、Chi    3755、Chi    3759、Chi    3820和Chi    3858。在后两种菌株中，连接△-cya或△-crp突变的Tn    10通过选择镰孢菌酸抗性分别产生Chi    3860和Chi    3659而被消除。
为了确定从cya或crp中切除Tn    10而产生的不同缺失突变是否显示不同程度的毒性和/或免疫原性，在猪霍乱沙门氏菌Chi3246中构建两种不同的cya和crp缺失突变体。如上述从鼠伤寒沙门氏菌中分离两种缺失，并从其转导，即为猪霍乱沙门氏菌株Chi    3859（△-cya-12）和Chi    3860（△-crp-11）。另外两种缺失突变通过切除分别嵌入Chi    3492和Chi    3751中的猪霍乱沙门氏菌cya和crp基因而分离，利用镰孢菌酸抗性选择分别产生Chi    3752（△-crp-19）和Chi    3753（△-cya-L4）。
pSD110编码大肠杆菌crp+基因，利用它构
表2.口服接种野生型猪霍乱沙门氏菌及其衍生物30天后的死亡率q
菌株号    基因型    接种剂量（CFU）    存活率，活/总
X3246 野生型 1.9×1050/5
8.0×1044/5
X3492 cya∶∶Tn10 7.8×1085/5
7.8×1065/5
7.8×1045/5
1.5×1095/5
1.5×1085/5
1.5×1075/5
X3751 crp∶∶Tn10 1.3×1093/5
1.3×1075/5
1.3×1055/5
1.3×1094/5
1.3×1084/5
1.3×1075/5
X3752 △crp-19 1.3×1093/5
1.3×1075/5
1.3×1055/5
X3753 △cya-24 1.0×1095/5
1.0×1075/5
1.0×1055/5
9.6×1085/5
9.6×1075/5
9.6×1065/5
X3820 △crp-11 5.6×10815/15
zhb∶∶Tn10
a4小时绝食水后，对8周雌鼠按指定剂量接种指定菌株。接种30天后每天观察病情和死亡资料。
建在cya和crp基因中都有缺失的猪霍乱沙门氏菌株。因此，将pSD110转导至Chi 3752（表1）中，然后转导入△-cya-12突变，通过四环素抗性选择和通过不能发酵麦芽糖的性质进行筛选，该突变与Zid-62∶∶Tn 10紧密相连，这表明导入了cya突变。在选择了Cni 3759对镰孢菌酸的抗性而消除Tn 10之后，通过在43℃生长以去掉pSD110而产生Cni 3781（见表1）。所有构建体的血清型通过与沙门氏菌C1组O-抗原抗血清的粘结而证实。
cya和crp突变体的表型分析
对cya突变体（Chi    3492、Chi    3753、Chi    3859）、crp突变体（Chi    3751、Chi    3752、Chi    3820）和cya    crp突变体（Chi    3783）进行表型分析。这些菌株不能发酵麦芽糖、甘露醇、山梨醇、蜜二糖，并只能缓慢发酵半乳糖。这些表型根据已知的对于cAMP和用于分解代谢活性的CRP的需要正是所期望的。对cAMP和用于调节基因表达的CRP的需要在下列参考中预以描述。Perlman和Pastan，Biochem.Biophys.Res.Comm.37∶151（1969）;Pastan和Perlman，Science    169∶339（1970）∶Schwartz和Beckwith，《lac操纵子》（1970，Zipser和Beckwith等人编）;Pastan和Adhya，Bacteriol.Rev.40∶527（1976）;Scholte和Postma，J.Bacteriol.141∶757（1980）。
毒性质粒消除的猪霍乱沙门氏菌衍生物及其△-cya和/或△-crp菌株的构建
我们已发现，鼠伤寒沙门氏菌的毒性质粒的Inc/Par区域（它编码不亲和性和分离功能），可与猪霍乱沙门氏菌毒性质粒杂交并显示不亲和性。基于此发现，应用包含鼠伤寒沙门氏菌毒性质粒的Inc/Par区域的pYA2028的高拷贝数pUC载体从猪霍乱沙门氏菌中消除毒性质粒。将pYA2028导入猪霍乱沙门氏菌时，基本上利用Dagert和Ehrlich，1979（同上）中描述的转化方法，或Feidler和Worth，Anal.Biochem。170∶38（1988）中的电激法。通过在培养基中包含氨苄青霉素而选择转化体，并在其中保存该转化体。经过几代的生长后，由于不亲和性的排除，该毒性质粒丢失。去除质粒的猪霍乱沙门氏菌株在后续循环中在无氨苄青霉素的培养基中生长，从而导至pYA2028迅速丢失。产生的细胞既无毒性质粒又无pYA2028。Chi    3903代表野生型猪霍乱沙门氏菌株Chi    3246    的毒性质粒消除的衍生物。毒性质粒的丢失减少了沙门氏菌到达和/或聚集于深层组织如肝和脾的能力，但不影响在肠道和GALT上的聚集。因此，消除毒性质粒减少了毒性，但不削弱免疫原性。从双cya    crp突变体中去除毒性质粒可用同样方法。
cya和crp    突变菌株在小鼠中的毒性
为了研究表1中所列的猪霍乱沙门氏菌株的毒性，成组的小鼠口服接种100倍不同剂量的各种菌株。结果在表2中给出。口服接种剂量为亲代野生型菌株（Chi 3246）的LD50，即大约为1×105CFU，这是由Reed和Moench（1938）的方法确定的。该LD50比单独的cya和crp菌株的低得多。
表2中的数据显示，这种突变菌株的毒性最多为母体野生型菌株Chi 3246的LD50的1/6000倍。口服109CFU Chi 3751（crp∶∶Tn10）和Chi 3752（△-crp）感染小鼠，使小鼠变得邋遢、昏睡、无食欲，一些则死亡。然而，所有用同样剂量Chi 3492（cya∶∶Tn10）和Chi3753（△-Cya-24）感染的小鼠只是轻微发病，并且痊愈，并且在此剂量下免于死亡。这个剂量代表12500倍野生型亲代菌株的LD50。因此证明cya∶∶Tn10和△-cya突变体比crp∶∶Tn10和△-crp突变体的毒性更小。这个结果多少有些令人吃惊，因为用鼠伤寒沙门氏菌△-cya和△-crp对小鼠进行感染时发现结果正相反。
这一结果也显示，接种了△-crp-19与接种了△-crp-11菌株的动物相比，以及接种了△-cya-12与接种了△-cya    24菌株的动物相比，以及接种了△-cya12与接种了△-cya    24菌株的动物之间健康没有明显的差别。
用上述方法也可确定既有△-cya又有△-crp的菌株的毒性。
cya和crp突变菌株的免疫原性
检查了不同的猪霍乱沙门氏菌突变体对随后的口服野生型毒性母体Chi    3246诱导免疫作用的能力。小鼠口服接种表3示出的猪霍乱沙门氏菌△-cya和△-crp菌株，剂量也在表3中标出。接种减毒菌株30天后，小鼠口服Chi    3246进行免疫试验。在感染后连续30天每天观察病状和死亡率。表3中的结果揭示了不同菌株免疫程度的明显差别。在口服Chi 3246进行免疫试验感染时，发现接种107、108或109CFU带有crp突变的毒性多少大些的菌株的小鼠比接种毒性较小的cya突变菌株的小鼠显出较好的健康状况和较高的存活率。这样，接种109CFUcya突变体的动物存活率低于50%，而接种109细胞的crp菌株的小鼠在免疫试验时存活率为100%;事实上，接种107或108细胞crp菌株的小鼠在接受109细胞野生型菌株感染时活了下来。
通过用较高的但尚不致命剂量（8×108CFU）的猪霍乱沙沙氏菌cya crp突变体对小鼠免疫来确定该减毒株的免疫原性。30天后，存活者以101、102和103倍的Chi 3246的LD50接触Chi 3246感染。如上述观察病状和死亡条件。
表3.用减毒的猪霍乱沙门氏菌疫苗免疫BALB/C小鼠后对于野生型毒性猪霍乱沙门氏菌浸染的效果a
菌株号    基因型    免疫剂量    野生型攻击    存活率
（CFU）    （CFU）    活/总
X3492 cya∶∶Tn10 7.8×1081.1×1092/5
7.8×1061.1×1090/5
7.8×1041.1×1090/5
1.5×1092.4×1092/5
1.5×1082.4×1091/5
1.5×1072.4×1090/5
X3751 crp∶∶Tn10 1.3×1091.1×1093/3
1.3×1071.1×1092/5
1.3×1051.1×1090/5
1.3×1092.4×1094/4
1.3×1082.4×1093/4
1.3×1072.4×1092/5
X3752 △crp-19 1.3×1091.1×1093/3
1.3×1071.1×1094/5
1.3×1051.1×1090/5
X3753 △cya-24 1.0×1091.1×1092/5
1.0×1071.1×1090/5
1.0×1051.1×1090/5
9.6×1082.4×1092/5
9.6×1072.4×1092/5
9.6×1062.4×1092/5
X3820    △crp-11
znb∶∶10 5.6×1081.0×109
a    在4小时绝食水后，对8周雌鼠以指定剂量接种指定疫苗。接种减毒菌株30天后，小鼠口服野生型毒性X3246以进行感染攻击。试验后每天观察病情和死亡率30天。猪霍乱沙门氏菌asd    cya    crp突变体的构建
通过将编码抗原的基因导入疫苗菌株中，从而使沙门氏菌疫苗菌株能起到向动物寄主传送外源抗原的载体的作用。Nakayama等在Bio/Tech 6∶693（1988）中描述了一种独特的系统，在其中，为了高度稳定地将外源抗原基因表达为△-cya △-crp △-asd鼠伤寒沙门氏菌的目的而构建了一种Asd+表达克隆载体。该△-asd △-crp突变体的无毒性已通过给小鼠施用1000倍的所有以前试验过的沙门氏菌野生型母体的LD50一致地得到证实。用大约1000倍野生型母体进行的感染证实，这些无毒菌株也激发了免疫动物体内的保护性免疫应答。重复的动物试验证实，猪霍乱沙门氏菌△-cya和△-crp菌株在小鼠体内是无毒和具有免疫原性的。可从较早的关于无毒性和免疫原性的研究获得的结果推断，带有△-cya和△-crp突变结构的猪霍乱沙门氏菌应该是无毒和具有免疫原性的。通过将噬菌体P22HTint转导为一种限制性缺乏，但具有修饰能力的中间型鼠伤寒沙门氏菌，随后在该菌的寄主上增殖噬菌体P1L4，和最后将△-asd转导为猪霍乱沙沙门氏菌疫苗菌株，可将该△-asd突变加入猪霍乱沙门氏菌△-cya △-crp Chi 3781中。
鼠伤寒沙门氏菌Chi 3656在含有5mMCaCl2的L肉汤中生长，并以P1L4感染以增殖一种高滴度的溶解产物。然后用P1L4（Chi 3656）溶解产物转导猪霍乱沙门氏菌△-cya △-crp Chi 3781;根据四环素抗性筛选转导体。从一部分抗四环素转导体中筛选Asd表型。作为最后步骤，在镰孢菌酸基质上进行选择来鉴别猪霍乱沙门氏菌△-cya △-crp
    △-asd菌株的四环素敏感的衍生物。通过证实标记物和完整的LPS外壳的存在;以及通过需要附加的营养缺陷表型而完成了对最终构建体的定性。
菌株的保藏
下列菌株根据布达佩斯条约保藏在美国典型培养物收集中心（12301    Parklawn    Drive，Rockville，Maryland）。保藏号是在成功的存活实验后指定的，需要的费用已交付。
菌株    保藏日    ATCC号
Chi    4062    1987.7.15    53647
Chi    4064    1987.7.15    53648
Chi    3781    △-crp-19    1989.3.29    67923
△-cya-12
Chi    3903（野生型，50kb    1989.3.29    53885
质粒消除的）
Chi    3246（野生型）    1989.3.29    67922
商业应用
这里提供的菌株直接或间接地适用于预防由猪霍乱沙门氏菌引起的或其抗体可与这种菌交叉反应的其他肠道细菌引起的疾病的商品化疫苗的生产。这些菌株也可用作制备由该细菌细胞中的重组基因编码的表达产物的载体微生物。

Claims (10)

1、一种用于对个体进行免疫的疫苗，它包含一种病原体猪霍乱沙门氏菌无毒的衍生物，所述衍生物由于cya基因中的一个突变基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶，或者由于crp基因中的一个突变基本上不能产生功能性环AMP受体蛋白，或者基本上二者均不能。
2、一种如权利要求1所述的疫苗，其中所述的无毒衍生物能够表达来自所述个体的病原体生物的重组基因，从而在所述脊椎动物体内产生一种能够诱导针对所述病原体的免疫应答的免疫抗原。
3、一种激发免疫系统对猪霍乱沙门氏菌免疫抗原的应答的方法，包括向所述个体施用权利要求1所述的疫苗。
4、一种激发免疫系统对一种病原体的免疫抗原的应答的方法，包括向所述个体施用权利要求2所述的疫苗。
5、一种分离出的猪霍乱沙门氏菌的无毒菌株，其特征在于它基本上不能产生功能性腺苷酸环化酶、功能性CRP或二者。
6、如权利要求5所述的分离出的猪霍乱沙门氏菌的无毒菌株，其特征在于它能够表达一种来自所述个体的病原体生物的重组基因，从而产生一种能够在所述脊椎动物体内诱导针对所述病原体的免疫应答的抗原。
7、一种如权利要求6所述的菌株，其特征在于该猪霍乱沙门氏菌含有一种致死性染色体突变，并由一种补充该致死性突变的载体基因所平衡，从而构成一个平衡的致死性寄主载体系统。
8、一种如权利要求7所述的菌株，其特征在于该菌株的细胞：
a）缺乏一种编码β-天冬氨酸半醛脱氢酶（asd）的功能性染色体基因：
b）具有一个编码功能性Asd多肽的重组基因，它补偿染色体asd突变，但不能通过重组代替该缺损的染色体基因;
c）在编码功能性Asd多肽和免疫抗原的重组基因之间有一个物理连接，其特征在于当细胞处在缺少功能性Asd而引起细胞溶解的环境中时，编码功能性Asd多肽的重组基因的损失引起细胞溶解。
9、一种如权利要求5、6、7或8所述的分离的无毒菌株，其特征在于缺少一种50kb的毒性质粒。
10、从由菌株ATCC53647、ATCC53648、ATCC67923、ATCC53885和ATCC67922构成的一组中选出的菌株，其突变体以及其衍生物。
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