JPH04506000A - 無毒性微生物類およびそれについての使用 - Google Patents

Abstract

(57)【要約】本公報は電子出願前の出願データであるため要約のデータは記録されません。

Description

【発明の詳細な説明】 ａ）β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードす る機能性天然染色体遺伝子を欠失しており、ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を相補す るが組換えによっては欠損染色体遺伝子を置換できない機能性Ａｓｄポリペプチ ドをコードする組換え遺伝子を有し、 Ｃ）機能性Ａｓｄポリペプチドおよび免疫原性抗原をコードする組換え遺伝子間 に物理的結合を有する（ここに、機能性Δｓｄの欠失により細胞の溶菌が起きる 環境に細胞がある場合に、機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子 の欠失のため該細胞の溶菌が起きる）、 請求項７記載の菌株。

９．５０．ｋｂの毒性プラスミドを欠失している請求項５．６．７または８記載 の単離された無毒性菌株。

１０、菌株ＡＴＣＣ５３’６４７、ＡＴＣＣ５３６４８、ＡＴＣＣ６７９２３、 ＡＴＣＣ５３８８５、ＡＴＣＣ６７９２２およびその突然変異体およびその誘導 体の群から選択される菌株。

明細書 無毒性微生物類およびそれについての使用クチンにおけるその使用に関する。

発明の背景 ブタのサルモネラ症は、幼少ブタを侵す、最も経済的に重要な腸性および敗血性 病の一つであり、ブタの重大な健康問題として記載されてきた。サルモネラ菌の 多くの血清タイプがブタから単離されてきたが、サルモネラ・コレレシュイス・ バール争りンゼンドルフしで最も頻繁に単離されてきた２種の血清タイプである 。しウィルコック・ビイ・ビイ（Ｗ　ｉ　１ｃｏｃｋ、　Ｂ　、　Ｐ　、　）＋ 　ブタの病気（Ｄ）ＳＥＡＳＥＳ　ＯＦ　５ＷＩＮＥ）、５０８〜５１９頁（レ ーマン・エイ・ディら（Ｌｅｍａｎ、　Ａ、　Ｄ、、ｅｔ　ａｌ）Ｉｉｉ、１９ ８６）コ。ニス・コレレシュイスはブタに宿主適合し、しばしば腸管との拘わり をほとんど伴わない死に至る敗血性病の原因となる。ブタにおけるこのニス・Ｊ レレシニイス保有は、ブタに対し病気を引き起こすその能力ゆえのみならずヒト についてのその公衆衛生的重要性のゆえに関心がある。

ニス・フレレシコイスによって引き起こされる病気は多くの臨床的兆候にて現れ る。該生物は本来侵入的であり、かつニス・チフィムリウトに要求される大量の 管腔増殖を必要としない。病変および壊死は消化管の粘膜軍組織および基底膜で 起こる。死亡率は高く、病気の継続および重症度は予測できない。

一般にブタ・サルモネラ症の制御へのワクチン使用に−クいての情報がほとんど ない。ニス・コレレシュイスの凶暴な変種が毒性（ピルレント）ニス拳コレレシ ュイスでの攻撃の後の保護を証明するためにスミス・エイチ・ダブリュー（Ｓｍ ４ｔｈ、　Ｈ，Ｗ、）［ジャーナル・オブ・ハイジーン（Ｊ　、　Ｈｙｇ、　） 旦３：’１１７〜１３５　（１９６５）］によって用いられた。しかしながら、 該動物は発熱・亜致死病に罹り、該細菌の放出体となった。該スミス菌株はスス コバマウス（Ｓ　ｕｓｅｏｖａｘ”）とし２てヨーロッパにて商業的に人手でき 、ウェルカム・ラボラトリーズ（Ｗｅｌｌｅｏｍｅ　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ ）によって生産・販売されている。

ハンチ・ジェイら（Ｈａｎｎａ　Ｊ、）［ベテリナリー・・マイクロバイオロジ 〜（Ｖｅｔ、Ｍｉｃｒｏｌ）ｉｏｌ、）、３　：　３０３〜３０９　（１９７９ ）］は、懐妊中の雌ブタにおいて、ツ、ミスのニス・コレレシュイス弱毒化生ワ クチンの筋肉内径路による使用を報告している。誕生後の子ブタは高力価の循環 する母ブタ由来の抗体を有しており、鼻孔内攻撃を撃退した。ニス・チフィムリ ウムのｇａｌＥ突然変異体は無毒性かつ免疫原性であることが報告されているが 、対照的に、ｇａｌＥ−突然変異を有するニス・コレレシュイス菌株は野生型の ｇａ　！’親と同程度のマウスにおける毒性のままである。ａｒｏＡ突然変異に よるニス・コレレシュイスの芳香族アミノ酸要求菌株はマウスにおいて毒性が減 少したが、３回の免疫化投与の後でさえ、保護免疫を誘導することができなかっ た。現在、アメリカ合衆国で使用が許可された唯一のニス・コレレシュイス・ワ クチンは殺した細菌のノイクトリン（ｂａｃｔｒｉｎ）であり、これは保護免疫 を誘導するのに特に効果的というのではない。

本出願人は、無毒性に導く損傷が動物宿主によ・り供給されるダイエツトまたは 何かによって修復されない病原菌のトランスポゾン誘導無毒性突然変異体を使用 する・ワクチンで毒性感染から保護する新しい方法を発見した。本出願人の最初 の成果は、サルモネラ・チフィとによって無毒性微生物を創製する方法を含めて 、欧州特許出願公開第３１５，６８２号（１９８９年５月１７日公開）およびＰ ＣＴ公開ＷＯ３Ｂ１０９６６９号（１９８８年１２月１５日公開）に記載されて いる。これらの特許出願の開示、並びにすべての対応国内特許出願をここに参照 のために挙げる。これらの出願は、とりわけ、ニス・チフィムリウムにおけるｃ ｙａおよび旦工１遺伝子を不活性化し、それにより異種病原についての組換え遺 伝子を無毒性ニス・チフィムリウムに導入し、それにより免疫応答を誘導できる 新しい抗原を産生じ、免疫応答を抑制・調節・増強できる産生物についての組換 え遺伝子を導入する組換えＤＮＡ法、並びに該無毒性ニス・チフィムリウム構築 体を利用するワクチンおよびワクチン接種法を教示する。

発明の簡単な記載 本発明は、部分的には、欧州特許出願公開第３１５．６８２号に開示されていな い新しい無毒性ニス・コレレシュイス誘導体に基づく。とりわけ、商業的ワクチ ンにおけるこれらの新しいニス・コレレシュイス誘導体の適用、ニス・コレラス イスの免疫原性抗原に応答するように免疫系を刺激する方法、および病原の免疫 原性抗原に応答するように免疫系を刺激する方法が本発明に包含される。本明細 書中にて提供する菌株は、ニス・コレレシコイス、および対ニス・コレラスイス 抗体と交差反応する他の腸細菌によって引き起こされる病気を防ぐ商業的ワクチ ンの生産に直接的および間接的に適する。これらの菌株は、該細菌細胞中の組換 え遺伝子にコードされた発現産物の産生用キャリア微生物としても有用である。

従って、本発明の具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性誘導体よりな り、該誘導体がと１！、遺伝子における突然変異による機能性アデニル酸シクラ ーゼを実質的に産生できることを特徴とする個体の免疫用ワクチンである。

本発明のもう１つの具体例は、病原性ニス・コレラスイスの無毒性誘導体を個体 に投与することよりなり、該誘導体がｃｙａ遺伝子における突然変異による機能 性アデニル酸シクラーゼを実質的に産生できることを特徴とするニス・コレレシ ュイスの免疫原性抗原に応答するように免疫系を刺激する方法である。

さらにもう１つの本発明の具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性誘導 体を個体に投与して該を椎動物において該病原に対する免疫応答を誘導できる抗 原を産生させることよりなり、該誘導体が機能性アデニル酸シクラーゼおよび環 状ＡＭＰレセプタータンパク賀（ＣＲＰ）を実質的に産生でき、かつ免疫原性抗 原をコードしている組換え遺伝子を発現できることを特徴とする該病原の免疫原 性抗原に応答するように免疫系を刺激する方法である。

もう１つの本発明の具体例は、機能性アデニル酸シクラーゼを実質的に産生でき るニス・コレレジ−イスの無毒性単離菌株であ”る。

さらにもう１つの本発明の具体例は、病原性ニス・フレレシュイスの無毒性誘導 体よりなり、該誘導体が１工上遺伝子における突然変異による機能性環状ＡＭＰ レセプタータンパク質（ＣＲＰ）を実質的に産生できることを特徴とする個体の 免疫化用ワクチンである。

さらにもう１つの本発明の具体例は、病原性ニス・コレレシコイスの無毒性誘導 体を個体に投与することよりなり、該誘導体が旦よるように免疫系を刺激する方 法である。

本発明のもう１つの具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性誘導体を個 体に投与して該を椎動物において該病原に対する免疫応答を誘導できる抗原を産 生させることよりなり、該誘導体が機能性ＣＲＰを実質的に産生でき、かつ免疫 原性抗原をコードしてい原に対して応答するように免疫系を刺激する方法である 。

さらにもう１つの本発明の具体例は、ｃｒｐ遺伝子における突然変異による機能 性ＣＲＰを実質的に産生できるニス・・プレレシュイスの無毒性単離菌株である 。

さらにもう１つの本発明の具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性誘導 体よりなり、該誘導体がｃｙａおよび旦エヱ遺伝子における突然変異による機能 性アデニル酸シクラーゼおよびＣＡＲＰを実質的に産生できることを特徴とする 個体の免疫化用ワクチンである。

なおさらにもう１つの本発明の具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性 誘導体を個体に投与することよりなり、該誘導体がｃｙａ遺伝子および以」」− 遺伝子における突然変異による機能性アデニル酸シクラーゼまたはＣＲＰを実質 的に産生できることを特徴とするニス・コレレシュイスの免疫原性抗原に応答す るように免疫系を刺激する方法である。

本発明のもう１つの具体例は、病原性ニス・コレレシュイスの無毒性誘導体を個 体に投与して該を推動物において該病原に対する免疫応答を誘導できる抗原を産 生させることよりなり、該誘導体が機能性アデニル酸ンクラーゼおよびＣＲＰを 実質的に産生でき、かつ免疫原性抗原をフードする組換え遺伝子を発現できるこ とを特徴とする該病原の免疫原性抗原に対して応答するように免疫系を刺激する 方法である。

さらにもう１つの本発明の具体例は、ｃｙａおよびεｒｐ遺伝子における突然変 異による機能性アデニル酸シクラーゼおよびＣＲＰを実質的に産生できるニス・ コレレシュイスの無毒性単離菌株である。

本発明のもう１つの具体例は、菌株ＡＴＣ，Ｃ５３６４７、ＡＴＣＣ５３６４８ 、ＡＴＣＣ６７９２３、ＡＴＣＣ５３８８５、ＡＴＣＣ６７９２２、並びにその 突然変異体、およびその誘導体よりなる群から選択される菌株である。

「ワクチン」とは、ここで用いられているように、将来の危害に対する防御が与 えられるように生体の免疫系を刺激するため１ど用いる薬剤を意味する。「免疫 化」とは、生物が以前に接触したことのある病原体または抗体に対して向けられ ている持続的に高レベルの抗体および／または、生物内において１９７８球が病 原体を殺すか、および／または、他の細胞（例えば、倉食細胞）を活性化してそ のようにさせることができる細胞性免疫応答を誘導する過程を意味する。

「免疫系」という表現には、異物の存在に対する単細胞生物の応答、例えばイン クフェロンの産生を含めることができるが、本願では、この表現は、多細胞生物 が、その細胞または細胞外液を侵食する抗原性物質に対して抗体を産生ずる解剖 学的特徴および機構に限定される。このように産生された抗体は、免疫グロブリ ンＡ、ＤＳＥ。

ＧまたはＭのような免疫学的クラスのいずれかに属しうる。特に興味深いのは、 免疫グロブリンＡ（ＩｇＡ）の産生を刺激するワクチンであるが、これは温血動 物の分泌系により産生される主要な免疫グロブリンだからである。ただし、本発 明のワクチンはＩｇＡ産生を刺激するものには限定されない。例えば、ここに記 載されている天然のワクチンは、ＩｇＡ形成の他に、広範囲な他の免疫応答、例 えば細胞性免疫および体液性免疫を生じさせるようである。抗原に対する免疫応 答は良く研究され、幅広く報告されている。免疫学の概説は、パレット・ジェー ムズ・ティー　（Ｂ　ａｒｒｅｓｔ、　Ｊ　ａｗｅｓ、　Ｔ　、　）の免疫学の テキスト（Ｔｅｘｔｂｏｏｋ　ｏｆ　Ｉ　ｓｍｕｎｏｌｏｇｙ）、第４版、シイ ・ヴイ・モズビイ・カンパニー（Ｃ，Ｖ、Ｍｏ５ｂｙ　Ｃｏ、、）、セントルイ ス、ミズーリ州（１９８３）に与えられている。その全内容は参考文献として、 ここに援用する。

「を推動物」という用語は、ここで用いられているように、魚類、両性類、爬虫 類、鳥類、および哺乳類を含むを索動物量の第１門であるを椎動物亜門の任意の メンバーを意味する。これらは、すべて分節骨性を柱または軟骨性を柱により特 徴づけられる。すべてのを推動物は、機能的な免疫系を有しており、抗体を産生 ずることにより抗原に応答する。したがって、すべてのを推動物は、ワクチンに 応答することができる。ワクチンは最も一般的には、ヒトやイヌ（狂大病ワクチ ン）のような哺乳類に与えられるが、魚類および鳥類のような産業的に飼育され ている他のクラスのを椎動物に対する。ワクチンは、ここに記載されている天然 のものであれば、本発明の範囲内にある。

「無を椎動物」は、を椎動物を除く、動物界の任意のメンバーを意味する。この ような動物は、無を椎動物門を構成し、背骨もを柱も持たない。この分類には、 魚類、両性類、爬虫類、鳥類および哺乳類を除くすべての動物が含まれる。多く の無を椎動物は、抗原刺激に応答する原始免疫を誘導することができ、また、を 椎動物に感染し、かつ本発明に従ってここに開示されている同一の微生物に対し て感受性を有する。このような無を椎動物の例は、甲殻類や軟体類および他の関 連動物である。無を椎動物の保護におけるワクチンの使用は、これまで、充分に 文献に示されていなかったが、当業者は、それらの原始免疫系の使用による該無 を椎動物への本発明の適用性を認識している。例えば、および本発明に従って、 ニス・コレレシュイスの感染に対する甲殻類の感受性は、ニス・コレレシュイス 種の無毒菌株の導入を可能にし、それにより原始免疫系が応答する可能性を与え る。したがって、無を椎動物に感染し、該無を推動物中に存在する免疫系からの 病原体に対する応答を刺激することができる病原性微生物の無毒性誘導体の使用 は、本発明の範囲内にある。

本発明のワクチンで処置される「個体」とは、ここで用いられているように、家 畜やヒトを含む哺乳類、および家禽を含む鳥類の様々な種、特に農業的に重要な 種のような、すべてのを椎動物を含むように定義される。さらに、軟体類や他の 無を椎動物は原始免疫系を有しており、「個体」として含まれる。

「無毒のく非ビルレント）」という用語は、ここで用いられているように、その 属や種の微生物が決して病原体として機能できないことを意味するのではなく、 使用される特定の微生物が処置される特定の動物に対して無毒であることを意味 する。微生物は、通常は病原性であるような属または種にさえ属しうるが、無毒 である菌株に属さなければならない。「病原性の」とは、ここで用いられている ように、疾患を引き起こしたり、正常な生理学的機能を損なわせ得ることを意味 する。「無毒性菌株」は、通常は、その毒性病原性対応物に関連する疾患のすべ ての症状を誘導することができない。「微生物」という用語は、ここで用いられ ているように、線菌、原生動物、および単細胞真菌を含む。

無毒性ニス・コレレシュイス微生物の誘導体は、また、本発明の範囲内にあるも のと意図される。「誘導体」は、天然に存在する毒性プラスミドの有無によらず 、機能的なアデニル酸シクラ・−ゼおよびｃＡＭＰ受容タ受容タンパ卵質生能を 保持するような単一または攪数の塩基置換、欠失、挿入または転位を含む無毒性 菌株の有性的または無性的に誘導された子孫および突然変異体を意味する。例え ば、Ｃｈｉ４０６２およびＣｈｉ４０６４のような菌株は、経口接種の後で菌株 を追跡するのに便利なマーカーとしてここで用いられでいるナリジクス酸耐性を 与えるｇｙｒＡ突然変異を有する。しかしながら、薬剤耐性はワクチンとして用 いるべき菌株の望ましい特質ではない。し°たがって、盈ｌ二Ｊぐ変異は、近接 して連結されたＴｎ対する感受性を与える）遺伝子を株の中へ形質導入し、次い でフザリン酸耐性に関する選択によりＴｎｌＯを除去することにより、容易に取 り除くことができる。

「組換え遺伝子」という用語は、本願で用いられているように、ある生物から第 ２の生物へ、この第２の生物の再生が同じ遺伝物質を含む子孫を生じるように移 入されている遺伝物質を意味する。第１の生物から、通常は、この第１の生物と 遺伝物質を交換しない第２の生物へ遺伝物質を移入する技術は、急速に発展して いる組換えＤＮＡ技術の結果として、幅広く利用することができるようになって きている。

「遺伝子」という用語は、ここでは、遺伝の生物学的単位を表すために最も広い 意味で用いられる。組換え遺伝子は、親生物内で存在するように、巨大分子、例 えば機能的なポリペプチドを生産したり、その生産を調節したりすることができ た完全な遺伝子である必要はない。遺伝子が抗原性産物の生産における鋳型とし て役立つことができることだけが必要である。この産物は、必ずしも、親生物内 での正確な形で見い出されるわけではない。例えば、１００アミノ酸残基を有す るポリペプチド抗原をコードする機能性遺伝子は、わずか７５アミノ酸残基しか 有しないペプチドあもいは１０アミノ酸残基しか有しないブプチドさえが、宿主 細胞の細胞性機能により産生されるように、一部分がキヤ、リア微生物中に移入 されうる。しかしながら、この遺伝子産物が親生物内に存在する類似の抗原に対 する抗体の形成をもたらす抗原であれば、この遺伝子は、ここで定義されている 「遺伝子」という用語の範囲内にあると見なされる。あるいは、特定の抗原また はそのフラグメントのアミノ酸配列が公知であれば、自動遺伝子合成装置などに より、そのＤＮＡフラグメントまたは類似体を化学的に合成し、該ＤＮＡ配列を 適当な発現ベクター中に導入することができる。スペクトルの他端には、そのう ちの１つまたはすべてが抗原性であり得るような、いくつかの遺伝子産物義され 、かつクレームされている遺伝子は、抗原を産生ずることができる遺伝の単位で ある。この遺伝子は、染色体、プラスミド、またはウィルス起源のものでありう る。

「遺伝子発現」という用語は、ここで用いられているようじ、遺伝子の構造に固 有の情報が、この遺伝子が位置する細胞の生化学的機構により、ＲＮＡ分子、ポ リペプチドまたは池の生物学的分子の形をした物理的産物中に形質転換されるこ とを意味する。このように産生された生物学的分子は遺伝子産物と呼ばれる。「 遺伝子産物」という用語は、ここで用いられているように、遺伝子の制御下で生 じる生化学的反応の結果として生産される生物学的産物を意味する。

遺伝子産物は、例えば、ＲＮＡ分子、ペプチド、または遺伝子の初期産物である 酵素や他の分子の制御下で生産される産物、すなわち代謝産物でありうる。例え ば、遺伝子は、まず、この遺伝子が見い出された元の細胞の外部環境におけるグ リカンの形成を制御する酵素へのりボゾームの作用により翻訳されるＲＮＡ分子 の合成を制御する。ＲＮＡ分子、酵素、およびグリカンは、その用語がここで用 いられているような、すべての遺伝子産物である。糖タン／（り質および多糖類 のような他の多くの種類の遺伝子産物だけでなく、これらのいずれもは、動物の 免疫系に導入されれば、抗原として作用する。糖タンパク質およびリポタンパク 質を含むタンノｆり質遺伝子産物は、ワクチン中の抗原として用いるのに好まし い遺伝、子産物である。

「アレルゲン」という用語は、ここで用いられているように、アレルギー性反応 を、この場合は、それらに対してワクチンが接種される動物内で起こす物質を意 味する。動物のふけおよび花粉のような多くの様々な物質がアレルゲンであり得 、個々の動物のアレルギー性反応は特定のアレルゲンに対して変化する。通常は アレルギー性応答を示す動物に、アレルゲンに対する寛容性を誘導することがで きる。寛容性を誘導する方法は良く知られており、一般的には、アレルゲンを動 物に増加用量で投与することを包含する。寛容性誘導に関する更なる考察は、す でに引用したバレ・ノド（Ｂａｒｒｅｔｔ）のテキストに与えられている。

門： 本発明は、ある種の突然変異が、その免疫原性に対して実質釣書こ影響を及ぼす ことなく、微生物を無毒にすることができるという発見に基づいている。さらに 詳しくは、本発明は、微生物が欠失（デルタ）突然変異デルタ−ｃｙａおよびデ ルタ−ｃｒｐを担持するよ許出願公開第３１５，６８２号に記載されているよう に、それぞれ、アデニル酸シクラーゼ（ＡＴＰピロリン酸リアーゼ（環化）、Ｅ Ｃ４゜６．１．１）および環状ＡＭＰ受容体タンパク質（ＣＲＰ）を合成する能 力を除去する。

欧州特許出願公開系３１５，８６２号には、デルタ−ｃｙａ−およびデルタ−ｃ ｒｐ突然変異体による環状−３′、５“−アゾ／シン−リン酸（ｃＡＭＰ）、ア デニル酸シクラーゼおよび環状ＡＭＰレセプタータンパク質の除去が、何如にし てニス・チフイムリウムを無毒性にするかについて開示されている。本発明では 、これらの突然変異体を得る手順に従い、新しい菌株であるニス・コレレシ二イ スに適用して、ニス・コレレシュイス免疫を誘導するワクチンの免疫原性成分と して用いることができる無毒性突然変異体を得た。

本発明の別の実施態様では、無毒性ニス・コレレシュイス誘導体は、選択された 抗原を、腸管関連リンパ組織（ＧＡＬＴ）、例えば回腸のバイエル板へ運ぶため のキャリア細菌として用いることができる。宿主内での病原体に対する抗体産生 を誘導するためにニス・チフィムリウム内で病原性生物由来の組換え遺伝子を発 現させる方法は、欧州特許出願公開第３１５．６８２号に報告された。その公報 は、キャリア微生物が組換え病原体由来抗原を何如にして宿主に与え得るかにつ いて説明している。

ある生物由来の遺伝物質を第２の生物に移入し、かつ該第２の生物の遺伝物質の 不変部分とする組換えＤＮＡ技術は、いまでは充分に良く知られており、定型的 と見なされるように普及している。通常、組生物由来の小さいＤＮＡ片は、プラ スミドまたは親染色体のいずれかから得られる。プラスミド（染色体外因子とも 呼ばれる）は、細胞の染色体とは物理的に区別される遺伝単位である。このＤＮ Ａは、任意のサイズであり得、しばしば、特定の塩基対部位でＤＮＡ分子を分割 するように作用する制限エンドヌクレアーゼ酵素の作用により得られる。プラス ミド、ファージまたはコスミドベクターに結紮した後、新しい組換え分子は、形 質転換（かルシウムイオンのような様々な化学薬剤の存在により人為的に誘導す ることができる、外部環境からの裸のＤＮＡの取り込み）または形質導入（パッ ケージ化され、形質導入ファージようなファージまたはコスミドベクター内に導 入された組換えＤＮＡ）のような様々な手段により、宿主細胞内に移入されうる 。キャリア細胞中の組換えＤＮＡは、独立したＤＮＡ片として存在し続けるか、 あるいは宿主細胞の染色体中に挿入され、細胞分裂の間に染色体と共に再生され うる。本発明は、時には、トランスポゾンを移入物質として利用する。トランス ポゾンは、ＤＮＡ中に挿入する高移動性のＤＮＡ片であり、やはり切断されうる 。切断は周囲の遺伝物質を運び去り、欠失突然変異を起こす。

したがって、トランスポゾンの有無は抗生残基遺伝マーカーによりモニターされ る。

移入された遺伝物質を受け取った生物の選択は、病原体由来抗原が望まれる場合 には、「シヲットガン」アプローチにより行なわれる。

「シゴットガン」アプローチは、欧州特許出願公開第３１５．６８２号に記載さ れ、また、マニアチス・ティー（ＭａｒＩ′１ａＬｉｓ、　Ｔ、）ラノ分子クロ ーニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ　Ｃｔｏｎｉｎｇ）［コールド・スプリング・ハ ーバ−・ラボラトリーズ（Ｃｏｒｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂｏｒ　Ｌａｂｏｒ ａｔｏｒｉｅｓ）（１９８２月に詳述されている。これらは参考文献として、こ こに援用する。遺伝子移入の技術は、本発明の一部であるとは見なされず、無毒 性微生物中で発現される生物由来遺伝子を有する組換え生物を生産することがで きる方法で充分である。種が正規に遺伝情報を交換する場合には、接合、形質転 換または形質導入のような遺伝子移入の古典的方法を用いうる。

別の実施態様では、ワクチンの免疫原性成分が宿主のアレルゲンである場合、こ のようなワクチンは、アレルギー性の宿主を特定的に脱感作するように設計され た接触処方に使用されうる。

本発明の更に別の実施態様は、生きているニス・コレレシュイスの無毒性誘導体 であっ゛Ｃ１機能的なアデニル酸シクラーゼおよびｃＡＭＰ受容体タンパク質を 産生できないが、該動物の病原体である生物または該動物のアレルゲンを産生ず る生物から誘導された組換え遺伝子を発現させることができる誘導体よりなるを 椎動物または無を椎動物の免疫用ワクチンを提供する。

上記の全てを考察する具体例において、本発明の課題はｃｙａおよび／またはｃ ｒｐ遺伝子において突然変異をもたらすニス・コレレシュイスの無毒性菌株であ る。

投与および使用： ワクチンを抗体産生に有効であるようにするために、抗原物質は、予防接種した 動物の抗体産生機構が活動し始め得るような方法で放出されなければならない。

したがって、遺伝子産物のニス・コレレシコイスキャリアを該動物中に正確に導 入しなければならない。前記のようにＧＡＬＴまたは気管支関連（Ｂ　Ａ　Ｉ、 Ｔ）細胞の好ましい応答を刺激するために、例えば経口投与、胃挿管によって、 またはエーロゾルの形態で、消化管または気管支中に微生物または遺伝子産物を 直接導入することが好ましいが、例えば静脈内、筋肉内、皮下注射または乳房内 または陰茎内または膣投与のようなワクチンを投与する他の方法が可能である。

最後に、宿主生物自体は、免疫抑制遺伝子または他の医薬的に活性な物質に関す る゛遺伝子がベクターによって発現されている場合に遺伝物質の供給源としての 役をし得る。

動物への上記のタイプの生ワクチンの投与は、如何なる公知のまたは標準的な技 術にもよる。これらは、経口摂取、背押管法または気管支−鼻スプレイを含む。

これらの方法の全てが生ワクチンをＧＡＬＴまたはＢＡＬＴ細胞に容易に達成さ せ、抗体形成を誘導させ、好ましい投与方法である。キャリア微生物を動物の血 流に到達させる、例えば静脈内注射のような他の投与方法は満足し得る。静脈内 、筋肉内または乳房的注射も、後に記載するように、本発明の他の具体例に関し て満足する。

必要とされる投与量は遺伝子産物の抗原性によって変化し、存在するワクチンの 典型的な免疫応答を誘導するのに充分な量だけ必要である。慣例の実験によって 必要な量が容易に確立されるであろう。

所望の保護レベルを提供するために必要な場合、複数の投薬を使用した。

ワクチンを懸濁または溶解した医薬担体は、溶媒または固体であるか、または接 種した動物にとって非毒性でありかつキャリア生物または抗原遺伝子産物と適合 し得る物質中に包埋させ得る。適切な医薬担体としては、通常食塩生理溶液およ び生理学的濃度またはその付近の他の非毒性塩のような液体担体ならびにタルク またはンｊ糖のような固体担体が挙げられ、これは、家畜の餌中に含ませること もできる。所望により、抗原性を増強するためにアジュバントを添加してもよい 。気管支管を介して投与するために使用する場合、該ワクチンは、好ましくはエ ーロゾルの形態で投与される。

病原体誘導遺伝子産物による免疫化は、病原体由来の組換え遺伝子によって特定 化された遺伝子産物を発現するためのキャリアとして作用する病原微生物の無毒 性誘導体による前免疫化と協力して使用され得る。病原誘導遺伝子産物に対する 分泌免疫システムが病原誘導遺伝子産物を発現するキャリア微生物による免疫化 によって活性化されてＧＡＬＴまたはＢ　Ａ　、Ｌ　Ｔのリンパ球様細胞を刺激 すると、このような非経口免疫化は分泌免疫応答の発現を増強するためのブース ターの役をし得る。増強された応答は、第２の、ブースターまたは既往反応とし て知られており、宿主の持続性免疫保護を生じる。

ブースター免疫化は、有益な結果を伴ってきわめて多くの回数繰り返し得る。

上記のことは、本発明を一般的に記載している。以下の詳細な実施例によってよ り完全な理解が得られ、該実施例は説明のためだけであり、特記しない限り限定 しようとするものではない。

去羞ヨ この実ｍ９１１は、ニス・コレレシュイスのデルタ−ｃｙａ、ｆ’ｔｋ１口（ｐ 、ｏ、）接種後の突然変異体のビルレンス特性、ならびにこれらの誘導体の免疫 原性を説明する。

帆鼠欅 本実施例において用いるニス・コレレシニイス株を第１表に列挙する。細菌株を 、最終濃度１％の適当な炭水化物含有の、Ｌブロス中およびし寒天（レンノック ス（Ｌ　ｅｎｎｏｘ）＋　パイロａジー（Ｖ　ｉｒｏｌｏｇｙ）１　：　１９Ｏ −２０６（１９６５）；ルリアおよびバーロウス（Ｌｕｒｉａ寒天（ディフコ（ Ｄｉｒｃｏ）の抗生培地＃３＋１．５％ＢＢＬ寒天、メリーランド州、コツキー スピル、ベクトン・ディキンソン・マイクロバイオロジー・システムズ（Ｂｅｃ ｔｏｎ　Ｄ　１ｃｋｉｎｔｏｎ　ＭｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇＦＳ　ｙｓｔｅｍｓ） ）および才！クコンキー・ベース（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ　Ｂａ５ｅ）寒天（ディ フコ・ラボラトリーズ（Ｄ　１ｒｃｏ　Ｌ　ａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）上、３７ ℃にて増殖させた。要すれば、培地にＭｇ５Ｏ，（ｆＯｍＭ）、ＣａＣａＣ１２ ｔ（５−、テトラサイクリン（１２，５μｙ／ｘ＆）およびアンピシリン（１０ ０μｖ／ｍ□を補充した。合成培地は、前記のように、最適レベルでの栄養素を 補充した最少液体および最少寒天であった（カーチス（Ｃｕｒｔｉｓｓ）＋　ジ ャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ　、　Ｂ　ａｃＬｅｒｉｏｌ、　）８９ ：２Ｂ−４０（１９６５））。ゼラチン含有の緩衝食塩水（ＢＳＧ）を希釈液と して用いた（カーナス。１９６５．前掲）。

第　１　表：サルモネラ属菌株 ニス・チフィムリウム菌株 Ｘ３０４２　野生型５Ｌ１３４４　ホイセス（Ｈｏｉｓｅｔｌｌ）およびストッ カー（ＳＬｏｃｋｅｒ）、Ｘ３６０５　ｃｒｐ７７３：：ＴｎｌＯＰ２２ＨＴ　 １ｎｔ（ＰＰ１０３７）　→ス３３３９第　１　表：サルモネラ属菌株（続き） ニス・チフィムリウム菌株 Ｘ３７７３　Ａｃｒｐ−Ｉｆ　ｚｈｂ：：Ｔｎｌｌ）　Ｐ２２ＨＴ　ｊｒ＋ｔ（ ３７４１）　→Ｘ３６２３ニス・コレレシュイス菌株 Ｘ３４９２　ｃｙａ：：ＴｎｌＯＰｉ　ｃｌｒ　ｃｌ＋ｅ（Ｘ３４８６Ｔ）　→ Ｘ３２４６第　１　表：サルモネラ属菌株（続き）ニス慟コレレシュイス菌株 Ｘ３７５５　（ＰＳＤＩＩＯ）　Ａｃｒｐ−１９ＰＩＬ４（Ｘ３６７０）　→Ｘ ３７５２Ｘ３７８１　Ａｃｒｐ−１９Δｃｙａ−１２ｍＤ１１０＋７）保存され たＸ（７７５Ｘ３８２０　Ａａｒｐ−１１ｚｈｂ：汀ｎｌＯＰＩＬ４（Ｘ３８１ ９）　→Ｘ３２４６Ｘ３９０３　野生型　５０に１原性プラスミドの保存された Ｘ３２４６第１表における適切な文献は以下のとおりである：ジンダーおよびレ デルバーグ（ＺｉｎｄｅｒおよびＬ　ｅｄｅｒｂｅｒｇ）、ジャーホイセスおよ びスト１カー（ＨｏｉｓｅｔｈおよびＳ　Ｌｏｃｋｅｒ）、ネイチャー（Ｎａｔ ｕｒｅ）２９ユニ２３Ｂ（１９８１）、グリグおよびカーチス（Ｇｕｌｉｇおよ びＣｕｒｔｉｓｓ）、　インフェクショボストマ（Ｐｏｓｔｓａ）ら、ジャーナ ル・オブ・バクテリオロジ−（、！よりａｃｔｅｒｉｏｌ、）　１６８　：　１ １０７（１９８６）、カーチスおよびケリー（Ｃｕｒｔｉｕ＋およびＫｅｌｌｙ ）、　インフェクシ黛ン・アンド・イムニティ−（Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌ５ｓｕｎ 、）　５５　：　３０３５（１９８７）、 グリグおよびカーチス（ＧｕｌｉｇおよびＣｕｒｔｉｓｓ）、　インフェクシッ ン・アンド・イムニテ４−（Ｉｎｆｅｃｔ、　ｌ５ｓｕｎ、）　５６　：　３２ ６２（１９８８）。

通広王盪作 カーチスの「マニュアル・オブ・メソッズ・フォー・ジェネラル・バクテリオロ ジー、アメリカン・ソサイエティー・フォー・マイクロバイオロジー」２４３頁 （ガーハード（Ｇ　ｅｒｈａｒｄｔ）ら編、１９８１）、シュメイガー（Ｓ　ｃ ｈａｅｉｇｅｒ）のモレキニラー拳アンド・ジェネラル・シネティックス（Ｍｏ １．Ｇｅｎ、ＧｅｎｅＬ、）ｌ　１９　：　７５（１９７２）およびディビス（ Ｄ　ａｖｉｓ）らの［ア・マニュアル・フォー・シネティックス・エンジニアリ ング：アドバンスト・バクチリアル・シネティックス」にューヨーク、コールド ・スプリング・ハーバ−（ＣｏｌｄＳｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ）、コールド・ スプリング・ハーバ−・ラボラトリ−（Ｃｏｌｄ　Ｓｐｒｉｎｇ　Ｈａｒｂａｒ 　Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）、１９８０）に記載されているように、標準的方法お よび手段を用い、形質導入をバクテリオファージＰ１し４またはＰ　２２　ＨＴ ±ｎｔで行った。マロイおよびヌン（ＭａｌｏｙおよびＮｕｎｎ）によりジャー ナル・オブ・バクテリオ口る方法および手段を、ＴｎｌＯ挿入の菌株における欠 失突然変異用のフザリン酸選択に用いた。ダガートおよびエルリッチ（Ｄａｇｅ ｒｔおよびＥ　ｈｒｌｉｃｈ）、ジーン（鍾）旦：２３（１９７９）の方法を用 いて形質転換を行った。シュロイダーおよびドブロゴズ（Ｓ　ｃｈｒｏｅｄｅｒ およびＤ　ｏｂｒｏｇｏｓｚ）のジャーナル・オブ・バクテリオロジ−（Ｊ、Ｂ ａｃ−ドｐＳＤ１１０が、シー・シュレダー（Ｃ、Ｓ　ｃｈｒｏｅｄｅｒ）によ り提供された。毒性プラスミドの脱落は、後記のように、高コピー数のプラスミ ドｐＵＣ１Ｂにクローンされた毒性プラスミドのＩｎｃ／Ｐａｒ領域を有するｐ ＹＡ２０２８を用いることにより促進された。

動物の感染性研究 雌のＢ　Ａ　Ｌ　Ｂ　／　ｃマウス（インディアナ州、インディアナポリス、パ ーラン畳スプラギニーーハウレイ（Ｈａｒｌａｎ　Ｓ　ｐｒａｇｕｅ　−Ｈａｗ ｌｅｙ））を、すべての感染性および免疫化実験に用いた。実験に用いる前、７ 週齢のマウスを、１週間隔離室に閉じ込めた。動物を、１段高いワイヤーフロア −（ｒａｉｓｅｄ　ｗａｒｅ　Ｎｏｏｒ）を備えたナルゲン・フィルター（Ｎａ ｌｇｅｎｅ　ｆｉｌｔｅｒ）をカバーしたケージに収容した。食料および水は自 由に与えた。該動物室は１日に１２時間の照明で２２℃〜２３℃に維持した。

経口（ｐ、　ｏ、）接種後、ニス・コレレシコイス菌株の毒性を測定した。マウ スにおける接種用細菌を、静的培養体として、Ｌグロス中、３７℃にて一夜増殖 させた。すべての培養体を、予め加温したしブロス中に１＝２０に希釈し、６０ ０ｎ鵬で約０，８〜１．０の光学濃度まで、３７℃にて約５時間曝気した。該細 胞を、室温にて１０分間、８０００Ｘｇで遠心分離することにより５０倍に濃縮 し、つづいＣＢＳＧに懸濁させた。希釈体を１％マルトース含有のマツクコンキ −（ＭａｃＣｏｎｋｅｙ）寒天上にて平板培養し、ＣｙａまたはＣｒｐ表現型を 照合して細胞を計数した。

経口接種前、感染前の４時間はマウスに食料および水を与えなかった。ついで、 ＢＳＧに懸濁させたニス・コレレシニイス細胞２０μｇアリコートを与える５〜 １０分前に、１０％（重量／容ｌ）炭酸水素ナトリウム３０μσを付与した。接 種の３０分後、食料および水を元の状態に戻した。マウスの罹患率および死亡率 についてのデータを毎日収集した。

保護免疫性の評価 １群５匹のマウス／ケージを、種々の用量の無毒性突然変異体で経口的に免疫処 理し、ついで３０日後、種々の用量の野生型の毒性親菌株、Ｃｈｉ３２４６で攻 撃した。罹患率および死亡率の状況を少なくとも６０日間観察した。

ニス・コレレシュイス菌株のｃｙａおよびｃｒｐ突然変異での構築 本研究に用いるすべてのワクチン菌株の構築において、高毒性菌株Ｃｈｉ３２４ ６を親菌株として用いた（Ｃｈｉ３２４６の経口しＩ）ｓｏ値を下記の第２表に 示す）。

構築された菌株で、Ｃｈｉ３２４Ｂ由来の菌株を第１表に示す。

さらに、該菌株の関連遺伝子型、および以下に記載の修飾法を用い、形質導入を 介するトランスボドン挿入、トランスポドン欠失ならびに欧州特許出願公開第３ １５６８２の実施例１に記載されている選択方法を用いることにより該菌株を誘 導する方法の記載が第１表に示されている。

ｃｙａ：：ＴｎｌＯｌｃ、ｒｐ：：ＴｎｌＯ，デルタ−ｃｙａ−１２およびデル タ−εｒｐ−１１の各ニス・チフィムリウム菌株ＰＰ１００２、ＰＰ１０３７、 Ｃｈｉ３６１５およびＣｈｉ３６２３（第１表参照）からのニス・コレレシコイ ス菌ＫＣｈｉ３２４６への導入は、ＰＩＬ４形質導入（ニス・チフィムリウム宿 主の中間体、Ｃｈｉ３３８５およびＣｈ　ｉ　３４７７を介する）およびｐｓｏ ｔ　１０での形質転換によって促進された。しかし、ｐ２２ＨＴｉ口を耐性であ るニス・コレレシュイス菌株Ｃｈ　ｉ　３２４６はＰＩＬ４免疫性である。した がって、ＰＩＬ４またはＰｉ　ｃｌｒ　ｃ１ｍバクテリオファージが吸着し、該 実施例に用いられるすべてのニス・コレレシュイス菌株中にＤＮＡを注入するこ とはできるが、これらの細菌細胞にてそのＤＮＡを複製することはできない。

第２表　野生型サルモネラ・コレレシュイスおよびその銹導体０で経口接種した ３０日後のＢＡＬＢ／ｃマウスの死亡率菌株番号　遺伝子型　接種用量　生存数 ／全数（ＣＦＵ） Ｘ３８２０Δｃｒｐ−１１ｚｈｂ：：ＴｎｌＯ５，６Ｘ　１０”　１５／　１５ ａ：食料および水を断って４時間後、８週齢の雌のマウスを所定の菌株および用 量で接種した。接種後、３０日間、罹患率および死亡率データを毎日観察した。

デルタ−ｃｙａ−１２ｚｉｄ−６２：：ＴｎｌＯ、デルタ−Ｃｒｐ−１１ｚｈｂ ：：ＴｎｌＯｌｃ　ｒｐ７７３　：　：Ｔｎ　ｌσおよびｃｙａ：：ＴｎｌＯ突 然変異は、各々、ニス・チフィムリウム菌株Ｃｈ　ｉ　３７１Ｌ　Ｃｈ　ｉ　３ ７７３、ＰＰ１０３７およびＰＰｌ００２にあるため（第１表参照）、該突然変 異を滑−ＬＰＳニス・チフィムリウム・バックグラウンドからＰ２２ＨＴ　ｉ　 ｎ　ｔおよびＰＩＬ４の両方を増殖させることのできるサルモネラ宿主中間体に 移動させる必要があった。バクテリオファージＰ２２ＨＴｉｎｔおよびＰＩＬ４ は、各々、滑および粗ＬＰＳ外殻での菌株に対して特異的である。宿主Ｃｈｉ３ ３８５およびＣｈｉ３４７７は、制限−欠失、修飾−熟達ｇａｌＥニス・チフィ ムリウム菌株である。低濃度のガラクトース含有培地でのＣｈｉ３３８５および Ｃｈｆ３４７７の増殖は、ＵＤＰ−ガラクトース合成を可能とし、正常なレベル のＬＰＳ側鎖をもたらす；これらの条件はＰ２２ＨＴｉｎｔの結合および感染に 欠くことができない。グルコースを有し、ガラクトースを欠く培地でのＣｈ　ｉ 　３３８５およびＣｈ　ｉ　３４７７の増殖は、粗または不完全ＬＰＳを合成し 、これら粗菌株におけるＰＩＬ４またはＰｌ　ｃｌｒ　ｃｌｍの吸着および複製 を可能にする。これら手段により、ニス・コレレシュイス菌株Ｃｈ　ｉ　３４９ ２、Ｃｈｉ３７５１．８５８を構築した。後者の２つの菌株において、デルタ− ｃｙａまたはデルタ−εｒｐ突然変異に結合したＴｎｌＯを、フザリン酸耐性の 選択により除去し、各々、Ｃｈｉ３８６０およびＣｈｉ３６５９を得た。

ｃｙａまたはｃｒｐからのＴｎｌＯの切除により得られる種々の欠失突然変異が 種々の毒性および／または免疫原性レベルを示すかどうかを測定するため、ｃｙ ａおよび旦エヱの２つの異なる欠失突然変Ｘ体をニス・コレレシュイスＣｈｉ３ ２４６にて構築した。２つの欠失菌株を単離し、前記のようにニス・チフイムリ ウムから形質導入し、ニス・コレレシニイス菌株Ｃｈｉ３８５９（デルタ−εｙ ａ−１２）およびＣｈ　ｉ　ａ８６０（デルタ−三二旦−１１）と称した。池の ２つの欠失突然変異は、フザリン酸耐性の選択を用い、各々、Ｃｈｉ３４９２お よびＣｈｉ３７５１におけるニス・コレレシュイス旦り旦および１工１遺伝子に 挿入したＴｎｌＯを切除することドする、ｐｓＤｌｌｏを用いることにより容易 になされた。すなわち、ｐｓｏｉｔｏをＣｈｉ３７５２に形質導入しく第１表） 、っづい−スを発酵させる。フザリン酸耐性についてｃｈ　ｉ　３７５９を選択 し、ＴｎｌＯを除去した後、ｐｓＤｌ　１０を４３℃にて脱落させ、Ｃｈｉ３７ ８１を得た（第１表参照）。サルモネラ群ＣＩ〇−抗原抗血清を用いて凝集させ ることにより、すべての構築体の血清型を確認した。

ｃｙａおよびｃｒｐ突然変異体の表現型分析表現型分析に付した。これらの菌株 はマルトース、マンニトール、ソルビトールおよびメリピオースを発酵せず、ゆ っくりとガラクトースを発酵した。該表現型は、異化活性についてのＣＲＰおよ びｃＡＭＰの公知要件に基づくと考えられる。遺伝子発現の調整についてのｃＡ ＭＰおよびＣＲＰの要件は以下の文献に記載されている。

パールマンおよびパスタン（ＰｅｒｌｓａｎオよヒＰ　ａｇｔａｎ）、　バイオ ケミカル・アンド・バイオフィジカル・リサーチ・コミ１ニケーシタン（１９７ ０）；シコワルッおよびベックワイス（Ｓ　ｃｈｖａｒＬｚおよびＢ　ｅｃｋｖ ｉｔｈ）、ザ　Ｉａｃ−・オペロン（ＴＨＥ　Ｉ　ａ　ｃ　０ＰＥＲＯＮ）（１ ９７０，ジブサーおよびベックワイス（ＺｉｐｓｅｒおよびＢ　ｅｃｋｖｉＬｈ ）ＩＩ）；パスタンおよびアゾイヤ（ＰａｓｔａｎおよびＡｄｈｙａ）、バタテ リオール・レビｘ−（Ｂａｃｔｅｒｉｏｌ、　Ｒｅｖ、）且：　５２７（１９７ ６）；およびショルテおよびポストマ（Ｓ　ｃｈｏｌ　ＬｅおよびＰ　ｃ＋ｓｔ ｓ＋ａ）、ジャーナル・０）。

ニス・フレレシュイスおよびそのデルタ−ｃｙａおよび／またはデルタ−ｃｒｐ 菌株の毒性プラスミド−脱落誘導体の構築不和合性および分配機能をコードする ニス・チフィムリウムの毒性プラスミドのＩｎｃ／Ｐａｒ領域が、ニス・コレレ シュイスの毒性プラスミドに交雑し、それと不和合性を示すことが見いだされた 。

この知見に基づき、ニス・チフィムリウムの毒性プラスミドの１ｎｃ／Ｐａｒ領 域を有するｐＹＡ２０２Ｂ、高コピー数のｐｕｃベクターを用い、ニス・コレレ シニイスからの毒性プラスミドの脱落ヲ促進した。ｐＹＡ２０２Ｂのニス・コレ レシュイスへの導入は、本質的に、ダガートおよびエルリッチ（Ｄａｇｅｒｔお よびＥ　ｈｒｉｉｃｈ）　１９７９、前掲に記載の形質転換法、またはフィード ラ−およびワース（Ｆ　ｅｉｄｌｅｒおよびＷ　ｏ　ｒ　ｔ　ｈ　）＋　アナリ ティカル・バイオケミストリー（Ａ　ｎａｌ、　Ｂ　ｉｏｃｈｅｗ＋、）１７０ ：３８（１９８８）のエレクトロポレーション（ｅｌｅｃｔｒｏｐｏｒａｔｉｏ ｎ）法のいずれかを用いて達成さ゛れる。形質転換体は、培地中のアンピシリン の細胞含有体にて選択され、維持される。増殖を数回世代した後、不和合性排除 により、毒性プラスミドは喪失している。アンビシリンネ含培地中、その後のサ イクルに対する脱落ニス・コレレシュイス株の増殖は、ｐＹＡ２０２Ｂの急速な 喪失を伴う。得られた細胞は毒性プラスミドとｐＹＡ２０２８の両方を欠いてい る。Ｃｈ　ｉ　３９０３は野生型ニス・コレレシュイス菌株Ｃｈｉ３２４６の毒 性プラスミド−脱落誘導体を表す。毒性プラスミドの喪失はサルモネラ能を減少 させ、肝臓および肺臓のような深組轍に影響を及ぼし、および／またはコロニー を形成させるが、腸管およびＧＡＬＴのコロニー形成に関しては作用を示さない 。したがって、毒性プラスミドの除去は、免疫原性を減少させることなく、毒力 を減少させる。二重Ｃ）’ａ　Ｃｒｐ突然変異体の毒性プラスミドの除去を同一 の操作に従って行った。

ｃｙａおよびｃｒｐ突然変異菌株のマウスにおける毒性第１表に挙げるニス・コ レレシュイス菌株Ｑ毒性を研究するために各菌株を１００倍に変化させてマウス の群に経口的に接種した。

結果を第２表に示す。粗野性菌株（Ｃｈｉ３２４６）の経口的ＬＤ、。は、約ｌ Ｘ１０’ＣＦＵであり、リード（Ｒｅｅｄ）およびミエンヒ（Ｍｕｅｎ−第２表 のデータは、突然変異菌株が粗野性菌株Ｃｈｉ３２４６のＬＤ、、の少なくとも ６，０００倍は無毒性であることを示す。１０３す、不活発になり、食欲不振と なり、数匹が死亡した。しかしながら、同一用量のＣｈ　１３４９２（ｃｙａ： ：Ｔｎ　１０）およびＣｈｉ３７５３（デルタ−ｃｙａ−２４）で感染させたマ ウスはすべて、軽い病気になり、回復し、該用量で生存した。この用量は、野性 型親株およびデルタ−ｃｙａ工突然変異体は、１二ｐ　：：Ｔ　ｎ　１０　オヨ ヒテル結果は、若干驚くべきことである。ニス・チフイムリウムのデルタ−ｃｙ ａおよびデルタ−１工１によるマウスにおける感染では逆であることがわかって いるからである。

また、結果は、デルタ−εｒｐ−１９とデルタ−ｃｒｐ−１１菌株を接種した動 物の健康に明らかな相異がないことを示す。また、デルタ−ｃｙａ−１２とデル タ−εｙａ−２４菌株についても同様に示される。

また、デルタ−とｌ」−およびデルタ−ｃｒｐの双方を有する株の毒性も前記記 載の方法を用いて確かめることができる。

ｃｙａおよびｃｒｐ突然変異株の免疫原性野生型毒性親Ｃｈｉ３２４６による後 の経口的攻撃に対する、異なるニス・コレレシュイス突然変異体の免疫誘導能を 試験した。第３表に示すニス・コレレシュイスデルターｃｙａ−およびデルタ− による免疫の３０日後、Ｃｈｉ３２４６で経口的にマウスに攻撃した。攻撃後３ ０日間毎日、罹患数および死亡数を観察した。第３表の結果は、異なる菌株の免 疫原性の程度における明らかな相異を示Ｕのわずかにより毒性の菌株で免疫した マウスは、Ｃｈｉ３２４６による経口的攻撃の後、より低毒性−ｃｙａ−突然変 異菌株で免疫したマウスより良好な健康状態および高い生存率を示した。すなわ ち、０％が攻撃において生存した。事実、１０７または１０＠細胞の二ｍ菌株で 免疫したものは、１０１細胞の野性型菌株による攻撃において生存した。

ニスーコレレシュイスのｃｙａ　ｃｒｐ突然変異体の免疫原性は、マウスを高い が亜致死の用量（８Ｘ　１０”ＣＦＵ）の弱毒化菌株で免疫することにより測定 する。３０日後、Ｃｈ　ｉ　３２４６のＬＤｓａ値のｔｏ’、１０茸およびｔｏ ”倍のＣ，ｈｉ３２４６で生存体を攻撃する。罹患および死亡状態を前記と同様 に観察する。

７．８ｘｌＯ’　ｔ、ｌＸ１ｏ”　０１５１．５ＸｌＧ’　２．４ＸＩＯ”　０ １５−４時間、食物および水を絶食した後、表示の株および用量を８週齢雌マウ スに接種した。弱毒化株で免疫後３０日１に、野生型毒性Ｘ３２４６の経口用量 でマウスを攻撃した。攻撃後さらに３０日間、毎日の罹病および死亡状況を観察 した。

ニス・コレレシュイスのａ　ｓ　ｄ　ｃ　ｙ　ａ　ｃ　ｒ　ｐ突然変１４体の構 築サルモネラ　ワクチン菌株は、抗原をコードする遺伝子をワクチン菌株に導入 することにより、異種抗原を動物宿主のＧＡＬＴに運ぶためのキャリアとして働 く。ナカヤマ（Ｎａｋａｙａｓａ）らは、デルタ−ｃｙａ−デルタ−ｃｒｐ−デ ルタ−ａ、竺＋ｄ−ニス拳チフィムリウムにおける異種抗原遺伝子の高レベルな 安定発現のために、Ａｓｄ’発現クローニングベクターを構築するという独特の 系を記載している（バイオ／チック（Ｂ（０／Ｔ　ｅ　ｃ　ｈ）、６　：　６９ ３（１９８Ｂ））。

デルタ−ｃｙａ　デルタ−ε工」−突然変異の無毒性の性質は、以前試験された すべてのサルモネラ種における野生型親のＬＤ、。の約１０００倍用量をマウス に投与することにより矛盾することなく確かめられている。また、野生型親の約 １ｏｏｏ倍での攻撃により示されるように、これらの無毒性菌株は、免疫した動 物において防御免疫反応を刺激した。動物実験を繰り返すことにより、ニス・コ レレシュイスデルターｃｙａおよびデルタ−ｃｒｐ菌株は、マウスにおいて無毒 性かつ免疫原性であることが確認されている。無毒性および免疫原性に関する研 究から得られた以前の結果から、デルタース構成体は無毒性かつ免疫原性である と推論することができる。ニジエンド（ｐｒｏｆｉｃｉｅｎｔ）中間体ニス・チ フィムリウムへのバクテリオファージＰ２２　ＨＴ工旦」形質導入、それに続く 中間体ニス・チフィムリウム宿主上でのバクテリオファージｐｌＬ４の増殖、お よヒテル９−ａｓｄのニス・コレレシュイスワクチン菌株への最終形質導入によ り促進される。

ニス・チフィムリウムＣｈｉ３６５６は、５＋ｅＭ　ＣａＣ７１，を含むエルブ ロス中で増殖させ、ＰＩＬ４で感染させて高力価の溶解質を増やす。ついで、Ｐ 　ＩＬ４（Ｃｈ　ｉ　３６５６）溶解質を用いてニス・コレレシュイスデルター ｃｙａ　デルタ−且エヱＣｈｉ３７８１を形質導入する。形質導入体は、テトラ サイクリン抵抗性によりスクリーニングする。テトラサイタリン抵抗性形賀導入 体をＡｓｃＩ−ａｒｐ　デルタ−ａｓｄ株のテトラサイクリン感受性誘導体を識 別する。さらに、マーカーおよび完全なり、　ｐ　ｓフートの存在を確かめるこ とにより、また栄養要求性変異表現型の非獲得により、最終構成体の特徴づけを 完了する。

菌株の寄託 ブダペスト条約の条項の下、アメリカン・タイプ・カルチャー・コレクシコン（ Δａｅｒｉｃａｎ　Ｔｙｐｅ　Ｃｕ１ｔｕｒｅ　Ｃｏ１１ｅｃｔｉｏｎ）（１２ ３０１パークローン・ドライブ（Ｐａｒｋｌａｗｎ　Ｄｒｉｖｅ）　、ロックビ レ（Ｒｏｃｋｖｉｌｌｅ）、メリーランド（Ｍａｒｙｌａｎｄ））に、以下に挙 げるものを寄託する。表示受託番号は、生存度試験の成功後に付与されたもので あり、必要な料金は納入しである。

菌株　寄託臼　ＡＴＣＣＮｏ。

Ｃｈｉ４０６２　１９８７年７月１５日　５３６４７Ｃｈｉ４０６４　１９８７ 年７月１５日　５３６４８Ｃｈｉ３９０３（野生型、５０ｋｂ　１９８９年３月 ２９日　５３８８５プラスミド脱落） Ｃｈｉ３２４６（野生型）　１９８９年３月２９日　６７９２２商業的有用性 ここに提供する菌株は、直接的および間接的に、ニス・コレレシュイスおよびニ ス・コレレシ二イスに対する抗体が交叉反応する池の腸内細菌によりおこる病気 を防ぐための商業的ワクチンの生産に適する。また、これらの菌株は、バクテリ ア細胞中の組換え遺伝子上にコードされる発現生産物の生産のための運搬微生物 として有用である。

国際調査報告

Claims (10)

【特許請求の範囲】
1. １．病原性サルモネラ・コレレシュイス（Ｓ，ｃｈｏｌｅｒａｅｓｕｉｓ）の無 毒性誘導体からなり、ｃｙａ遺伝子中の突然変異により、該誘導体が機能性アデ ニル酸シクラーゼ産生能を実質的に有さない、またはｃｒｐ遺伝子中の突然変異 により、機能性サイクリックＡＭＰ受容タンパク質（ＣＲＰ）産生能を実質的に 有さない、またはその双方を実質的に有さないことを特徴とする個体の免疫のた めのワクチン。
2. ２．該無毒性誘導体が該個体に対して病原性である物質由来の組換え遺伝子の発 現能を有し、該脊椎動物において該病原体に対して免疫応答の誘導能を有する免 疫原性抗原を産生する請求項１記載のワクチン。
3. ３．請求項１記載のワクチンを該個体に投与することを特徴とする免疫系を刺激 してサルモネラ・コレレシュイスの免疫原性抗原に応答するための方法。
4. ４．請求項２記載のワクチンを該個体に投与することを特徴とする、免疫系を刺 激して病原体の免疫原性抗原に応答するための方法。
5. ５．機能性アデニル酸シクラーゼ、機能性ＣＲＰまたはその双方の産生能を実質 的に有さないサルモネラ・コレレシュイスの単離された無毒性菌株。
6. ６．該個体に対して病原性である物質由来の組換え遺伝子の発現能を有し、該脊 椎動物において該病原体に対して免疫応答の誘導能を有する抗原を産生する請求 項５記載のサルモネラ・コレレシュイスの単離された無毒性菌株。
7. ７．サルモネラ・コレレシュイスが、致死性突然変異を相補するベクター遺伝子 により平衡化されて平衡致死宿主ベクター糸を構築する、致死性である染色体突 然変異を含む請求項６記載の菌株。
8. ８．菌株細胞が ａ）β−アスパラギン酸セミアルデヒドデヒドロゲナーゼ（ａｓｄ）をコードす る機能性天然染色体遺伝子を欠失しており、ｂ）染色体ａｓｄ突然変異を相補す るが組換えによっては欠損染色体遺伝子を置換できない機能性Ａｓｄポリペプチ ドをコードする組換え遺伝子を有し、 ｃ）機能性Ａｓｄポリペプチドおよび免疫原性抗原をコードする組換え遺伝子間 に物理的結合を有する（ここに、機能性Ａｓｄの欠失により細胞の溶菌が起きる 環境に細胞がある場合に、機能性Ａｓｄポリペプチドをコードする組換え遺伝子 の欠失のため該細胞の溶菌が起きる）、 請求項７記載の菌株。
9. ９．５０ｋｂの毒性プラスミドを欠失している請求項５、６、７または８記載の 単離された無毒性菌株。
10. １０．菌株ＡＴＣＣ５３６４７、ＡＴＣＣ５３６４８、ＡＴＣＣ６７９２３、Ａ ＴＣＣ５３８８５、ＡＴＣＣ６７９２２およびその突然変異体およびその誘導体 の群から選択される菌株。