CN1826134A - 用于动员血液干细胞的g－csf和plgf药物组合 - Google Patents
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Abstract
含有作为活性成分的G－CSF和PLGF的联合药物制剂，可用于动员需要治疗的病人或对象体内的血液干细胞。
Description
发明领域
本发明是关于联合应用生物活性分子来动员需要治疗的病人或对象体内的血液干细胞。更具体说，本发明提出，联合应用G-CSF和PIGF能特别有效地刺激外周血祖细胞(PBPC)的动员，从而提高肿瘤病人器官或细胞移植及放-化疗方案的可行性和效果。
发明背景
自身PBPC细胞显著提高了非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)3，复发性霍奇金氏淋巴瘤(HL)4及多发性骨髓瘤(MM)5病人高剂量化学--放射治疗和自身干细胞移植(SCT)1，2的可行性和疗效。
同种异体PBPC为HLA匹配的SCT提供了优选的干细胞来源，也是HLA不匹配的同种异体移植的唯一来源6，7，8，9，10，11，这对缺少HLA匹配相关或不相关供者的高危白血病病人是一种可能的治愈性方法，即全球约40％的病人可能从同种异体移植获益。
用于动员癌症病人自身PBPC的方案包括髓样细胞生长因子单用或在细胞毒性化疗恢复时使用，采用后一方法可达到最佳的PBPC动员效果12，13，14。通常采用重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF)短期处理来动员健康供者的同种异体PBPC，用量为10-20微克/公斤/天15，16，17，18。
自身移植≥5×106 CD34+细胞/公斤的癌症病人会经历迅速而持久的移植造血细胞扩增，而接受≤2×106 CD34+细胞/公斤的人则面临扩增缓慢、移植失败或继发骨髓发育不良的风险19。因此，要建立自身SCT，取得足够数量的CD34+细胞是必须的前提。或由于先前大量的化学--放射治疗所致，或由于疾病相关因素所致，一定比例的化疗无反应(10-20％)或复发性/顽固性(30-40％)的癌症病人没有能力动员出最佳数量的CD34+细胞20，21，22。
收集到足够数目的同种异体CD34+细胞对HLA-相同移植物接受者来说并不是关键问题；然而5-15％正常供血者的干细胞动员量较少，需要提高rhG-CSF的用量和多次采集单种血细胞成分23，24，25。HLA不匹配的同种异体移植接受者需要再次灌注大量的去除T淋巴细胞的CD34+细胞，以预防移植失败和严重的移植物抗宿行反应(GvHD)26。在标准的动员方案中(即7天rhG-CSF治疗)，HLA不匹配的SCT供血者要经历平均4次白细胞抽取来收集目的量的CD34+细胞(12×106 CD34+细胞/公斤体重)，但相当比例的供血者(20-25％)不能提供这种目的量的CD34+细胞。
除了年龄、性别、细胞因子治疗方案及先前的化学—放射治疗可影响干细胞的动员外，尚未明确界定那些具体特征可作为细胞因子动员的预测因素。因此，任何可能应用于癌症病人或正常供血者提高其血循环祖细胞而无增加毒性的方法对自身和同种异体SCT的可行性、毒性和费用都将具有深刻影响。
可利用能干扰造血干细胞运输机制即干细胞在归巢时30，31，32，33穿过血腔内皮迁移到血管外骨髓间隙及动员时相反路径的分子来增强PBPC的动员。另一种增强PBPC动员的方法是采用细胞因子组合，如重组的人(rh)粒细胞—巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF)加rhG-CSF34；白介素-3(rhIL-3)加rhG-CSF、rhGM-CSF35或PIXY-32136。最后，增强PBPC动员可通过在标准动员方案中添加早期作用性细胞因子来实现，如添加能扩增骨髓祖细胞的flt-3配体39的干细胞因子(rhSCF)37，28，从而增加对后续rhG-CSF动员易感细胞的数量。
迄今，rhG-CSF的替代品或辅助剂要么不能实质性提高单用rhG-CSF所达到的血祖细胞动员，要么其毒性的增强甚于有限的改善。
胎盘生长因子(PlGF)是血管内皮生长因子(VEGF)家族的成员，是一种通过VEGF受体-1(VEGFR1)传递信号的血管生成放大剂。近年，已证明给予表达人(h)PlGF的腺病毒载体能产生多重造血效应，包括促进骨髓抑制后的骨髓恢复和增强造血祖细胞动员。然而，注射重组腺病毒载体后给予生长因子与直接注射纯化的因子相比具有较大的差别，并且，不能预知按临床用药程序给药时的效果。
发明内容
由于能增强干细胞动员的任何方法对临床都有相关的影响，我们在动物模型中测试了PlGF的动员活性，所述动物模型模拟临床条件下的PBPC动员。给正常BALB/c小鼠连续5天腹膜内注射(IP)对照运载体(PBS/MSA)，单独的rhG-CSF(10μg/d)，rhG-CSF(10μg/d)联用重组鼠(rm)PlGF(2.5-5μg/d)或联用重组人(rh)PlGF(5-10μg/d)。末次注射细胞因子后2小时收集血液样品，评价以下参数：白细胞(WBC)计数，集落形成细胞(CFC)的比例和绝对数，长期培养诱导细胞(LTC-IC)绝对数。
rmPlGF的作用见下表1-4。显然单独注射rmPlGF对WBC、CFC和LTC-IC动员无效。与单用rhG-CSF相比，5日注射rm PlGF(5μg/d)加rhG-CSF显著增强了CFC和LTC-IC的动员。
表5-8汇总了rhPlGF的动员作用。同样，单独注射rhPlGF对血液循环中的WBC或造血祖细胞无作用。与之相比，rhPlGF和rhG-CSF联合注射显著提高了CFC和LTC-IC的动员。
我们还检测了用rhPlGF(10μg/d)和rhG-CSF(10μg/d)治疗12天的动员作用。在治疗的第5、8、10和12天分析了接受12天治疗的小鼠。与单用rhG-CSF相比，rhPlGF/rhG-CSF联合治疗在我们研究中每个时间点的分析中都显著增强了血中CFC的比例和绝对数(表9-11)。
此外，还在非人灵长类动物模型(弥猴)中测试了PlGF/G-CSF联用的动员活性。此动物模型进一步证实了在小鼠中获得的结果。具体说，根据动力学、比例和绝对数的结果，PlGF/G-CSF联用增强了WBC、CFC、HPP-CFC和LTC-IC的动员。
上述研究的方法和条件近似于病人的造血生长因子给药方式。结果清楚地显示hG-CSF和rhPlGF在动员外周血祖细胞方面存在协同作用。
因此本发明的目的是用于需要治疗的病人或对象以刺激其血液干细胞动员的G-CSF和PlGF的联合制剂。“病人”和“对象”在本文中优选用于指个人，但也可指动物，特别是哺乳动物。可能从这种血液干细胞动员中获益的状态、状况或疾病的例子包括但不限于：器官或细胞移植和肿瘤的化学—放射治疗，具体是NHL、复发性HL4、MM5病人的自身或同种异体SCT1，2，或骨髓抑制化疗后康复期的病人。
所述联合制剂中的各活性成分，可用药学上可接受的运载体和赋形剂配制，同时或分别给予。优选经胃肠道外途径给药。制备适合胃肠道外给药的药物组合物的方法是本领域已知的，详细方法见“Remington：TheScience and Practice of Pharmacy”，Mack Publishing Co。该联用制剂中各活性成分的用量可根据给药途径、所需作用或待治疗疾病及病人的反应而不同。作为一般原则，G-CSF和PlGF的有效量是能产生所需的血干细胞动员反应的量。治疗期间可通过计数循环血液干细胞来监测病人/对象的反应，如果需要可据此修改用量。在本发明的优选实施方案中，重组的rhG-CSF和rhPlGF采用可注射溶液形式，提供的活性成分每日用量包含：1-150μg/kg的G-CSF，优选5-20μg/kg；10-300μg/kg的PlGF为，优选20-150μg/kg。
以下实施例进一步说明本发明。
实施例1-11：PlGF/G-CSF联用在小鼠模型中的动员效果
材料和方法
动物：6-8周龄BALB/c雌鼠，体重20-25克，购自Charles River(MilanoItaly，EU)。按照英国癌症研究协调委员会的指南(UK CoordinatingCommittee on Cancer Reseach，UKCCCR guidelines for the welfare of animalsin experimental neoplasia，Br.J.Cancer.，58：109-113，1998)进行动物实验研究。给小鼠每天经腹膜内注射(IP)对照运载体(PBS/MSA)，单独的rhG-CSF(10μg/d)，rhG-CSF(10μg/d)联合重组鼠(rm)PlGF(2.5-5μg/d)或联合重组人(rh)PlGF(5-10μg/d)，持续五天。各项实验分别进行至少各自独立的三次实验，每组每个时间点采用3-4只小鼠。
细胞因子：重组人粒细胞集落刺激因子(rhG-CSF，Neupogen)购自Roche(Milano，Italy，EU)；rmPlGF购自R&D System Inc.(Abingdon，UnitedKingdom)；rhPlGF由Geymonat SpA(Anagni，Italy，EU)提供。
动员方案：标准动员方案包括给予BALB/crhG-CSF(10μg/每鼠，IP)，每天一次共五天。为了评价PlGF的动员效果，rmPlGF(2.5-5μg/每鼠，IP)或rhPlGF(5-10μg/每鼠，IP)单用或与rhG-CSF联用给药，每天一次共五天。还通过rhPlGF(10μg/每鼠/天)和rhG-CSF(10μg/每鼠/天)的12天治疗测试了rhPlGF的动员效果。对照注射PBS/MSA。
动员参数：采用白细胞(WBC)计数、集落形成细胞(CFC)的比例和绝对数、长期培养诱导细胞(LTC-IC)的绝对数来评价动员。除非另作说明，末次治疗后2小时处死动物。
细胞收获和分离：眼丛(orbital plexus)穿刺收集PB到含有肝素的试管中。计数白细胞后，用PBS稀释PB(1∶4，v/v)，用Ficoll不连续密度梯度离心(280g，30分钟，室温)分离单核细胞。用添加有10％胎牛血清(FBS，Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)、2mM谷氨酰胺和抗菌素的Iscover改进的Dulbecco培养液(IMDM，Seromed，Berlin，Germany，EU)洗涤细胞二次。
WBC计数：用以肝素抗凝的血样和自动计数器(ADVIA 120 Bayer，Milano，Italy，EU)进行WBC计数。
集落形成细胞(CFC)试验：评估了标准甲基纤维素培养物中的集落形成细胞总数，即粒细胞-巨噬细胞集落形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多谱系CFU(CFU-GEMM)。简言之，将每份1ml的血液(5×104-2×105MNC)接种在35-mm平皿甲基纤维素培养基(HCC-3434；Stem Cell Technologies)中，该培养基加有重组小鼠干细胞因子(rmSCF，50ng/ml)、小鼠重组白介素-3(rmIL-3，10ng/ml)、重组人白介素-6(rhIL-6，10ng/ml)和重组人促红细胞生成素(rhEpo，3U/ml)。在含5％CO2的潮湿空气环境中37℃培养12-14天，按标准的评判指标给集落评分(Humphries，RK等，Blood，53：746-763，1979)。
长期培养诱导细胞(LTC-IC)试验：评估大批培养的LTC-IC(Carlo-Stella C等，Blood，1999；93：3973-82)。简言之，将测试细胞(5-8×106)重悬于完全培养基(MyelocultTM 5100，Stem Cell Technologies)中，接种于含有经照射处理(2000cGy)的小鼠AFT024细胞(K，Moore，PrincetonUniversity，Princeton，NJ，USA惠赠)饲养层的培养基中(Moore，KA等Blood，1997；89：4337-47)。
完全培养基由α-培养基组成，添加有FBS(12.5％)、马血清(12.5％)、L-谷氨酰胺(2mM)、2-巯基乙醇(10-4M)、肌醇(0.2mM)、叶酸(20μM)和新鲜溶解的氢化可的松(10-6M)。每周用新鲜的完全培养基置换一半生长培养基。培养4周后，用胰酶消化收获不粘附和粘附细胞，合并，洗涤，在甲基纤维素培养物中测定集落生成细胞。4周龄LTC中的集落生成细胞总数(即CFU-GEMM加BFU-E加CFU-GM)提供了原先存在于测试悬液中的LTC-IC数目的相对测定数。集落生成细胞总数除以4算得LTC-IC的绝对值，这是每个LTC-IC平均产生的集落生成细胞数(Sutherland HJ等，Blood，1989；74：1563-70)。
实施例1
表1：用rmPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠的WBC计数
| 动员方案* | WBC/μL血 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 2,000(850-4,000) | 2,165+929 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 6,000(5,200-21,650) | 9,577±5,575 |
| rmPlGF(5μg/d) | 2,450(1,350-2,950) | 2,450±141 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(2.5μg/d) | 5,600(4,600-13,700) | 7,040±3,778 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(5μg/d) | 9,500(4,800-18,400) | 9,980±5,715 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用，共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时采集血样。
实施例2
表2：用rmPlGF和/或rhG-CSF治疗小鼠的循环血CFC的比例
| 动员方案* | CFC/105MNC | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 7(2-5) | 8±3 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 76(51-148) | 82±29 |
| rmPlGF(5μg/d) | 8(7-9) | 8±1 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(2.5μg/d) | 115(93-184) | 130±37 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(5μg/d) | 195(113-253) | 180±58 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用，共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。
实施例3
表3：用rmPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠循环血CFC的绝对数
| 动员方案* | 每ml血的CFC数 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 57(9-288) | 81±75 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 3,129(1,042-5,518) | 2,977±1,126 |
| rmPlGF(5μg/d) | 96(87-105) | 96±13 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(2.5μg/d) | 2,568(1,480-5,885) | 3,198±1,928 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(5μg/d) | 6,143(2,486-11,520) | 6,015±3,674 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用，共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。血液中循环CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以CFC比值的函数。
实施例4
表4：用rmPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠的循环血LTC-IC绝对数
| 动员方案* | 每ml血的LTC-IC数 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 7(3-29) | 9±5 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 194(57-337) | 208±98 |
| rmPlGF(5μg/d) | 4(3-5) | 4±2 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(2.5μg/d) | 565(279-852) | 565±405 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rmPlGF(5μg/d) | 1,173(852-2,070) | 1,365±364 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。检测大量培养中的循环LTC-IC绝对数。将测试细胞(5-8×106)接种在含有经照射的小鼠AFT024细胞饲养层的培养物中。培养4周后用胰酶消化收获不粘附和粘附细胞，合并，洗涤，测定集落生成细胞。4周时LTC中的集落生成细胞总数(即CFU-Mix加BFU-E加CFU-GM)，提供了原先存在于测试悬液中的LTC-IC数目的相对测定数。血液中循环LTC-IC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以LTC-IC比值的函数。
实施例5
表5：用rhPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠的WBC计数
| 动员方案* | WBC/μL血 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 2,000(850-4,000) | 2,165±929 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 6,000(5,200-21,650) | 9,577±5,575 |
| rhPlGF(10μg/d) | 1,900(1,050-5,000) | 2,296±1,235 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(5μg/d) | 14,400(11,000-14,600) | 13,333±2,023 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(10μg/d) | 12,800(5,100-17,350) | 11,728±4,968 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(5-10μg/d)联用，共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。
实施例6
表6：用rhPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠的循环血CFC的比例
| 动员方案* | CFC/105MNC | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 7(2-15) | 8±3 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 76(51-148) | 82±29 |
| rHPlGF(10μg/d) | 9(6-21) | 10±4 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(5μg/d) | 228(208-237) | 224±14 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(10μg/d) | 264(111-384) | 256±77 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用，共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样品。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。
实施例7
表7：用rhPlGF和/或rhG-CSF治疗的小鼠的循环血CFC绝对数
| 动员方案* | 每ml血的CFC数 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 57(9-288) | 81±75 |
| rhG-CSF(10μg/d) | 3,129(1,042-5,518) | 2,977±1,126 |
| rhPlGF(10μg/d) | 74(12-236) | 82±64 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(5μg/d) | 9,467(7,514-11,325) | 9,435±1,906 |
| rhG-CSF(10μg/d)+rhPlGF(10μg/d) | 11,584(8,105-17,408) | 12,122±2,788 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。血液中循环CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以CFC比值的函数。
实施例8
表8：用rhPlGF和/或rhG-CSF治疗小鼠循环血LTC-IC绝对数
| 动员方案* | 每ml血的LTC-IC数 | |
| 中值(范围) | 均值±SD | |
| PBS/MSA | 7(3-29) | 9±5 |
| RhG-CSF(10μg/d) | 194(57-337) | 208±98 |
| RmPlGF(5μg/d) | ND | ND |
| RhG-CSF(10μg/d)+rhPIGFPlGF(5μg/d) | ND | ND |
| RhG-CSF(10μg/d)+rhPIGFPlGF(10μg/d) | 1,176(1,407-1,990) | 1,724±294 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、单独rhG-CSF(10μg/d)、或rhG-CSF(10μg/d)与rmPlGF(2.5-5μg/d)联用共五天。末次注射rmPlGF和/或rhG-CSF后2小时收集血样。检测大量培养中的循环LTC-IC绝对数。将测试细胞(5-8×106)接种在含有经照射的小鼠AFT024细胞饲养层的培养物中。培养4周后用胰酶消化收获不粘附和粘附细胞，合并，洗涤，测定集落生成细胞。4周时LTC中的集落生成细胞总数(即CFU-Mix加BFU-E加CFU-GM)提供了原先存在于测试悬液中的LTC-IC数目的相对测定数。血液中循环LTC-IC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以LTC-IC比值的函数。
实施例9
表9：接受rhPlGF(10μg/d)和/或rhG-CSF(10μg/d)治疗12天的小鼠的WBC计数
| 动员方案* | WBC/μL血 |
| 均值±SD | |
| PBS/MSA | 2,165±929 |
| 5天rhG-CSF | 18,683±3,001 |
| 5天rhCSF+rhPlGF | 16,083±1,227 |
| 8天rhG-CSF | 22,017±5,778 |
| 8天rhG-CSF+rhPlGF | 16,000±6,354 |
| 10天rhG-CSF | 21,500±3,317 |
| 10天rhG-CSF+rhPlGF | 24,800±6,699 |
| 12天rhG-CSF | 43,100±8,598 |
| 12天rhG-CSF+rhPlGF | 46,167±5,678 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(10μg/d)联用，共12天。治疗第5、8、10、12天收集血液样品。
实施例10
表10：接受rhPlGF(10μg/d)和/或rhG-CSF(10μg/d)治疗12天的小鼠的循环血CFC的比例
| 动员方案* | CFC/105MNC |
| 均值±SD | |
| PBS/MSA | 8±3 |
| 5天rhG-CSF | 63±12 |
| 5天rhCSF+rhPlGF | 297±80 |
| 8天rhG-CSF | 70±5 |
| 8天rhG-CSF+rhPlGF | 180±20 |
| 10天rhG-CSF | 102±8 |
| 10天rhG-CSF+rhPlGF | 274±34 |
| 12天rhG-CSF | 106±19 |
| 12天rhG-CSF+rhPlGF | 299±49 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(10μg/d)联用，共12天。治疗第5、8、10、12天收集血液样品。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。
实施例11
表11：接受rhPlGF(10μg/d)和/或rhG-CSF(10μg/d)治疗12天的小鼠的循环血CFC绝对数
| 动员方案* | 每ml血的CFC |
| 均值±SD | |
| PBS/MSA | 81±75 |
| 5天rhG-CSF | 3,427±232 |
| 5天rhCSF+rhPlGF | 11,649±1,827 |
| 8天rhG-CSF | 6,361±1,931 |
| 8天rhG-CSF+rhPlGF | 10,341±799 |
| 10天rhG-CSF | 4,335±923 |
| 10天rhG-CSF+rhPlGF | 14,104±2,687 |
| 12天rhG-CSF | 10,968±2,183 |
| 12天rhG-CSF+rhPlGF | 32,024±4,915 |
*BALB/c小鼠IP注射PBS/MSA、rhG-CSF(10μg/d)单独或与rmPlGF(10μg/d)联用，共12天。治疗第5、8、10、12天收集血液样。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。血液中循环性CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以CFC比值的函数。
实施例12-18：PlGF/G-CSF联用在非人灵长类动物模型中的动员效果
材料和方法
实验设计：一组弥猴(n＝4)起初单用G-CSF(100μg/kg/天，SC，5天)动员(第1轮)，6周的药物清除期后，接受第二次rhPlGF(130μg/kg，IV，5天)加rhG-CSF(100μg/kg/天，SC，5天)动员(第2轮)。再经6周的药物清除期后，给予该组弥猴rhPlGF(260μg/kg，IV，5天)加rhG-CSF(100μg/kg/天，SC，5天)作第三轮动员(第3轮)。按照该研究设计，将第一轮后的动员动力学数据作为猴子内部对照来评估后面第二和第三轮的动员。
动员参数：我们分析了白细胞(WBC)的动员动力学，以及指定的集落形成细胞(CFC)、高增殖性潜在祖细胞(HPP-CFC)和长期培养诱导细胞(LTC-IC)的比例和绝对数。分析治疗期()中每天(第1-5天)和治疗结束后第3天和5天的动员参数。采用无菌操作从麻醉(ketamin，10mg/kg)猴子的前肢静脉中获取外周血液样品。
WBC计数：用EDTA-抗凝的血样和自动计数器(ADVIA 120Bayer，Milano，Italy，EU)进行WBC计数。
CFC和HPP-CFC试验：按照已知技术(41，42)用肝素化血测定总CFC[即粒细胞-巨噬细胞形成单位(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多谱系(粒细胞、红细节、巨噬细胞、巨核细胞)CFC(CFU-GEMM)]和HPP-CFC数。简言之，用Ficoll不连续密度梯度(密度＝1,077g/ml)离心获得单核细胞，一式4份(1×104-2×105/ml接种在含甲基纤维素培养基(HCC-4100，Stem Cell Technologies，Vancouver，Canada)的35-mm平皿中，该培养基添加有重组人干细胞因子(rhSCF，50ng/ml，Stem Cell Technologies)、白介素-3(rhIL-3，20ng/ml，Stem Cell Technologies)、白介素-6(rhIL-6，20ng/ml，Stem Cell Technologies)、rhG-CSF(20ng/ml，Stem CellTechnologies)、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(rhGM-CSF，20ng/ml，StemCell Technologies)和促红细胞生成素(rhEpo，3U/ml，R&D System Inc.，Abingdon，United Kingdom)。37℃、5％CO2培养12-14天后，按标准的评判指标给CFC评分。用添加有rhSCF(50ng/ml)，rhIL-3(20ng/ml)，rhIL-6(20ng/ml)，rhG-CSF(20ng/ml)，rhGM-CSF(20ng/ml)和rhEpo(3U/ml)的甲基纤维素培养基培养28天后，给HPP-CFC评分，HPP-CFC定义为显微镜下可见的直径大于1mm的紧密生长的集落(43)。血液中循环性CFC或HPP-CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以CFC或HPP-CFC比值的函数。
LTC-IC试验：评估了在有限稀释条件下的LTC-IC比例(44)。简言之，将系列稀释的测试细胞(2×105-3×103)重悬于150μl完全培养基中(MyelocuitTM5100，Stem Cell Technologies)，组成该培养基的是α培养基添加胎牛血清(12.5％)、马血清(12.5％)、L-谷氨酰胺(2mM)、2-巯基乙醇(10-4M)、肌醇(0.2mM)、叶酸(20μM)加新鲜溶解的氢化可的松(10-6M)，将细胞接种在96孔平底板中。对每种测试细胞量，接种16-22重复孔。接受测试细胞接种的平板上含有经照射(8000cGy)并受逆转录病毒基因转染而能产生人IL-3和G-CSF的小鼠M2-10B4细胞饲养层(3x104/cm2，Dr.C Eaves，Terry Fox Laboratory，Vancouver，Canada惠赠)(45)。每周用新鲜的完全培养基置换一半培养基。培养5周后，用胰酶消化收获各孔中的不粘附和粘附细胞，洗涤和检测CFC的生长。培养12-14天后，评定诸培养物是阳性(≥1个克隆)还是阴性(没有克隆)评分，并用L-Cale软件(Stem CellTechnologies)计算出LTC-IC的比例。评估大批培养中的循环LTC-IC绝对数(46)。简言之，将测试细胞(5-8×106)重悬于完全培养基中，接种在含有经照射的小鼠M2-10B4细胞(3×104/cm2)饲养层的培养物中。培养5周后用胰酶消化收获不粘附和粘附细胞，合并，洗涤，测定集落生成细胞。5周龄LTC中的集落生成细胞总数(即CFU-GEMM加BFU-E加CFU-GM)提供了原先存在于测试悬液中的LTC-IC数目的相对测定数。集落生成细胞总数除以4计算出LTC-IC的绝对值，这是每个LTC-IC平均产生的集落生成细胞数。
实施例12
循环性WBC 单独给予rhG-CSF五天，与治疗前测定值相比，所诱导WBC数量(平均值±SD)平均增加了5倍。在rhG-CSF中加入130或260μg/kg的rhPlGF使治疗第5天时检测的WBC值略有增加。
表12：单用rhG-CSF或rhPlGF加rhG-CSF治疗的弥猴的WBC计数
| 每微升血的WBC计数* | |||
| 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(130μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(260μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 8,708±2,458 | 13,498±5,514 | 8,370±1,585 |
| 2 | 31,313±3,889 | 24,533±2,789 | 41,180±7,364 |
| 3 | 40,600±6,274 | 35,388±2,207 | 44,085±6,588 |
| 4 | 43,055±6,562 | 39,440±6,744 | 37,960±3,598 |
| 5 | 43,523±13,790 | 60,040±9,508 | 49,048±7,120 |
| 8 | 14,363±4,163 | 23,073±9,017 | 17,783±5,964 |
| 10 | 12,145±5,421 | 16,398±8,314 | 11，150±2,915 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhPlGF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析WBC计数。数据以平均值±SD表示。
实施例13
CFC的比例 与基线值相比，测得在单用rhG-CSF时，用rhG-CSF/rhPlGF(130μg/kg)时和用rhG-CSF/rhPlGF(260μg/kg)时的血CFC平均比例(每105个MNC)峰值分别增加了19、53和52倍。与单用rhG-CSF相比，rhG-CSF/rhPlGF联合治疗诱导的CFC比例在高峰日提高了2倍。
表13：单用rhG-CSF治疗，或rhG-CSF加rhPlGF治疗的弥猴的循环血CFC的比例
| CFC/105MNC* | |||
| 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | RhPlGF(130μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(260μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 6±1 | 4±1 | 5±3 |
| 2 | 4±2 | 9±1 | 19±8 |
| 3 | 9±1 | 39±13 | 48±26 |
| 4 | 114±51 | 213±87 | 245±151 |
| 5 | 63±26 | 196±26 | 261±83 |
| 8 | 66±11 | 40±11 | 60±39 |
| 10 | 10±7 | 19±10 | 21±18 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhP1GF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析CFC。数据以平均值±SD表示。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。
实施例14
CFC的绝对值 计算血液中循环性CFC的绝对数，该值是每毫升血MNC总数乘以CFC比值的函数。与基线值相比，单用rhG-CSF治疗，用rhG-CSF/rhPlGF(130μg/kg)治疗和用rhG-CSF/rhPlGF(260μg/kg)治疗，导致CFC分别增加了85、335和358倍。第二和第三轮CFC的峰值水平比第一轮(单用rhG-CSF)提高了4倍和5倍。
表14：单用rhG-CSF治疗，或rhG-CSF加rhPlGF治疗的弥猴的循环血CFC的绝对数
| 每ml血的CFC数* | |||
| 第一轮 | 第二轮 | 第三轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | RhPlGF(130μg/kg，IV,5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(260μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 134±9 | 138±38 | 170±129 |
| 2 | 344±207 | 724±254 | 6,552±4,365 |
| 3 | 472±60 | 6,420±4,775 | 9,634±7,006 |
| 4 | 11,406±4,093 | 32,347±14,206 | 53,002±25,250 |
| 5 | 5,397±3,074 | 46,283±8,287 | 60,777±8,563 |
| 8 | 3,952±2,666 | 4,532±3,714 | 3,719±1,899 |
| 10 | 224±164 | 448±168 | 943±994 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhPlGF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析CFC。数据以平均值±SD表示。CFC包括：粒细胞-巨噬细胞CFC(CFU-GM)、爆式红系集落形成单位(BFU-E)和多能CFC(CFU-Mix)。CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。血液中循环性CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以CFC比值的函数。
实施例15
HPP-CFC的比例 与基线值相比，动员第5天时测到的血HPP-CFC平均比例(每105个MNC)在单用rhG-CSF时，或rhG-CSF/rhPlGF(130μg/kg)时，分别增加了5和12倍。与单用rhG-CSF相比，rhG-CSF/rhPlGF联合治疗诱导的HPP-CFC比例在高峰日提高了2倍。
表15：单用rhG-CSF治疗，或rhG-CSF加rhPlGF治疗的弥猴的循环血HPP-CFC比例
| HPP-CFC/105MNC* | ||
| 第一轮 | 第二轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(130μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 4±1 | 3±1 |
| 2 | 6±1 | 3±1 |
| 3 | 13±4 | 11±3 |
| 4 | 15±4 | 27±10 |
| 5 | 20±9 | 37±8 |
| 8 | 18±6 | 6±4 |
| 10 | 6±1 | 5±4 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhPlGF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析HPP-CFC。数据以平均值±SD表示。HPP-CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。
实施例16
HPP-CFC的绝对值 rhG-CSF治疗第5天时检测到的每ml血液中HPP-CFC绝对数比治疗前高17倍。接受rhG-CSF/rhPlGF(130μg/kg)联合治疗的猴子与基线值相比较，HPP-CFC提高了158倍。第二轮第5天时的HPP-CFC水平比第一轮的提高了5倍。
表16：单用rhG-CSF治疗，或rhG-CSF加rhPlGF治疗的弥猴的循环血HPP-CFC的绝对数
| 每毫升血中的HPP-CFC | ||
| 第一轮 | 第二轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(130μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 96±17 | 54±49 |
| 2 | 493±218 | 258±34 |
| 3 | 683±155 | 1,709±989 |
| 4 | 1,521±332 | 3,383±1,309 |
| 5 | 1,593±405 | 8,557±1,142 |
| 8 | 998±541 | 603±384 |
| 10 | 121±52 | 121±87 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhPlGF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析HPP-CFC计数。数据以平均值±SD表示。HPP-CFC数据得自每只动物的血样的一式四份培养物。血液中循环性HPP-CFC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以HPP-CFC比值的函数。
实施例17
LTC-IC的比例 有限稀释试验所分析的LTC-IC比例表明，与单用rhG-CSF相比，联合给予rhPlGF(130μg/kg)和rhG-CSF使LTC-IC的比例提高了11倍(1/5，829细胞比1/64,064细胞)。
表17：接受单用rhG-CSF或rhPlGF加rhG-CSF五天治疗弥猴的循环性LTC-IC比例
| 动物编号 | 动员方案 | LTC-IC比例(均值)* | 95％CI | LTC-IC/105个MNC | |
| 比例下限 | 比例上限 | ||||
| 12341234 | rhG-CSFrhG-CSFrhG-CSFrhG-CSFrhPlGF(130μg/kg)+rhG-CSFrhPlGF(130μg/kg)+rhG-CSFrhPlGF(130μg/kg)+rhG-CSFrhPlGF(130μg/kg)+rhG-CSF | 1/84,2651/65,835ne**1/42,0911/4,0091/7,562ne1/5,916 | 1/69,2091/54,341ne1/34,8371/5,9771/11,100ne1/8,725 | 1/102,5981/79,761ne1/50,8541/2,6891/5,152ne1/4,011 | 1.21.5ne2.424.913.2ne16.9 |
*用小鼠M2-10B4细胞作为基质细胞(stromal)层，在有限稀释条件下测定了LTC-IC的比例。动员治疗第5天收集血液样品。将测试细胞的系列稀释液(2×105-3×103)培养5周，测试细胞的每种量重复接种16-22复孔。5周后对各孔的粘附和不粘附细胞进行分析，测定克隆生成细胞，并用Poisson统计学方法和最大相似法(maxium likelihood)计算LTC-IC的比例。
实施例18
LTC-IC的绝对值 与基线值相比，单用rhG-CSF治疗4天后循环性LTC-IC绝对值增加了53倍。rhG-CSF/rhPlGF(130μg/kg)联合治疗的LTC-IC比治疗前增加389倍，比单用rhG-CSF增加15倍。
表18：单用rhG-CSF或rhPlGF加rhG-CSF治疗的弥猴的循环性LTC-IC绝对值
| 每ml血的LTC-IC* | ||
| 第一轮 | 第二轮 | |
| 天 | rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) | rhPlGF(130μg/kg，IV，5d)+rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，5d) |
| 1 | 4±7 | 8±5 |
| 2 | 92±43 | 56±20 |
| 3 | 111±30 | 624±340 |
| 4 | 211±41 | 742±176 |
| 5 | 130±25 | 3,115±988 |
| 8 | 63±22 | 533±270 |
| 10 | 6±2 | 112±40 |
*弥猴(n＝4)接受了三轮动员，间隔以6周的药物清除期。第一轮单用rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第二轮用rhPlGF(130μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)，第三轮用rhPlGF(260μg/kg，IV，第1-5天)加rhG-CSF(100μg/kg/d，SC，第1-5天)诱导动员。治疗期间(第1-5天)每天，以及治疗结束后第3天和5天分析LTC-IC计数。数据以平均值±SD表示，得自各时间点每只动物的血样的一式四份培养物。测定了大批培养中循环性LTC-IC的绝对数。将测试细胞(5-8×106)接种在含有经照射的小鼠M2-10B4细胞饲养层的培养液中。培养5周后，用胰酶消化收获不粘附和粘附细胞，合并，洗涤，测定集落生成细胞。5周龄LTC中的集落生成细胞总数(即CFU-Mix加BFU-E加CFU-GM)，提供了原先存在于测试悬液中的LTC-IC数目的相对测定数。血液中循环性LTC-IC的绝对数是每毫升血MNC总数乘以LTC-IC比值的函数。
参考文献
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Claims (10)
1.包含G-CSF和PlGF作为活性成分的联合药物制剂，用于动员需要治疗的病人或对象的血液干细胞。
2.如权利要求1所述的联合制剂，其特征在于，G-CSF和PlGF同时或分别给予所述病人或对象。
3.如权利要求1-2所述的联合制剂，用于胃肠道外给药。
4.如权利要求1-3所述的联合制剂，含有重组的hG-CSF和PlGF。
5.如权利要求1-4所述的联合制剂，含有1-150μg/kg的G-CSF和10-300μg/kg的PlGF。
6.G-CSF和PlGF相联合在制备用于需要动员血液干细胞的状态、症状或疾病的药物组合物中的用途。
7.如权利要求6所述的用途，所述组合物是胃肠道外给药的组合物。
8.如权利要求6所述的用途，所述G-CSF是重组hG-CSF，所述PlGF是rhPlGF。
9.如权利要求6所述的用途，其中所述状态、症状或疾病包括：器官或细胞移植和肿瘤的化学-放射治疗，特别是非霍奇金氏淋巴瘤(NHL)、复发性霍奇金氏淋巴瘤(HL)、多发性骨髓瘤病人，或骨髓抑制性化疗后康复期病人的自身或同种异体干细胞移植。
10.如权利要求6所述的用途，其中所述药物组合物提供的每日剂量为10μg/kg的G-CSF和130μg/kg的PlGF。
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