CN113699117B

CN113699117B - 经基因改造的少突胶质祖细胞在多发性硬化症中的应用

Info

Publication number: CN113699117B
Application number: CN202111033274.7A
Authority: CN
Inventors: 顾雨春; 吴理达
Original assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Current assignee: Chengnuo Regenerative Medical Technology Beijing Co ltd
Priority date: 2021-09-03
Filing date: 2021-09-03
Publication date: 2023-06-30
Anticipated expiration: 2041-09-03
Also published as: CN113699117A; WO2023030489A1

Abstract

本发明公开了经基因改造的少突胶质祖细胞及其制备方法和用途，本发明提供了一种能够同时修复髓鞘、促进髓鞘的生成、减少炎症反应和自身免疫损伤的方法，所述方法中包括一种经基因改造的少突胶质祖细胞，通过基因改造的少突胶质祖细胞的移植，实现了直接修复髓鞘，减轻了神经的炎症反应，改善神经功能，在临床治疗多发性硬化症方面具有非常好的应用前景。

Description

经基因改造的少突胶质祖细胞在多发性硬化症中的应用

技术领域

本发明属于生物医学领域，具体而言，本发明涉及一种经基因改造的少突胶质祖细胞在多发性硬化症中的应用，更具体地，本发明涉及一种经基因改造的少突胶质祖细胞及其制备方法和用途。

背景技术

多发性硬化症(Multiple sclerosis，MS)是中枢神经系统(Central nervoussystem，CNS)最常见的、主要发生于年轻患者的免疫介导的慢性脱髓鞘疾病，是除了创伤外导致年轻人残疾最常见的原因。该病急性活动期中枢神经白质有多发性炎性脱髓鞘斑，陈旧病变则由于胶质纤维增生而形成钙化斑，以多发病灶、缓解、复发病程为特点，好发于视神经、脊髓和脑干，多发病于青、中年，女性较男性多见。发病的中位年龄为29岁女性是男性的3倍，不能根治，致残率高，严重影响健康和生活质量。MS国际联合会(MSIF)联合世界卫生组织(WHO)发布了首个MS地图集，其中的数据显示MS的发病区域更多集中在欧洲及地中海东部，患病率在100～200/10万，亚洲属于低发区，其中中国的发病率为0～5/10万人，但近年来有上升趋势(Milo R,Kahana E.Multiple sclerosis:geoepidemiology,geneticsand the environment[J].Autoimmun Rev,2010,9(5):A387-A394.)。

目前为止，MS的主要治疗分为急性期治疗和缓解期治疗，在缓解期的治疗为疾病修正治疗(Disease Modified therapy，DMT)，主要应用的药物包括β-干扰素、特立氟胺、那他珠单抗、米托蒽醌等。由于MS是因为自体免疫细胞对神经髓鞘的损伤，因此在治疗上采取的措施主要包括抑制免疫细胞，减少免疫细胞透过血脑屏障，以及促进少突胶质祖细胞(Oligodendrocyte progenitor cells，OPC)分化重新生成髓鞘(Wingerchuk D M,CarterJ L.Multiple sclerosis:current and emerging disease-modifying therapies andtreatment strategies[C]//Mayo Clinic Proceedings.Elsevier,2014,89(2):225-240.；Gholamzad M,Ebtekar M,Ardestani M S,et al.A comprehensive review on thetreatment approaches of multiple sclerosis:currently and in the future[J].Inflammation Research,2019,68(1):25-38.)。

由于MS患者的复发率高，难以根治，致残率高，因此，目前的研究学者关于干细胞治疗MS在临床上做了相关的探索，包括骨髓来源的间充质干细胞(Mesenchymal stemcells，MSC)、脂肪来源的MSC、脐带来源的MSC、神经干细胞(Neural stem cell，NSC)、MSC分化的神经前体细胞(Neural precursors，NPs)、造血干细胞(Haematopoietic stem cell，HSC)等相关的干细胞移植治疗，干细胞的使用虽然在一定程度上促进了髓鞘的生成，但是不能减少炎症反应和自身免疫损伤，因此，目前研究的相关干细胞移植治疗MS的整体改善症状效果不明显。此外，由于OPC从人体内不能分离，因此虽然OPC能够修复髓鞘，但目前在临床上仍然不能推进。

本发明旨在提供一种能够同时修复髓鞘、促进髓鞘的生成、减少炎症反应和自身免疫损伤的方法，本发明通过基因改造的OPC的移植，实现了直接修复髓鞘，同时通过分泌抗炎症因子IL-27、IL-10等在神经周围局部形成了一个防护层，减轻了神经的炎症反应，同时通过CXCL11等招募T-reg、M2细胞富集在神经髓鞘周围保护髓鞘的损伤，通过IL-3的分泌维持星形胶质细胞(Astrocyte)、小胶质细胞(Microglia)和神经的信号调节，改善神经功能。

发明内容

鉴于此，为了克服目前本领域存在的上述技术缺陷，本发明的目的在于提供一种能够同时修复髓鞘、促进髓鞘的生成、减少炎症反应和自身免疫损伤的方法，所述方法中包括一种经基因改造的少突胶质祖细胞。

本发明的上述目的通过以下技术方案得以实现：

第一方面，本发明提供了用于基因改造诱导多能干细胞以获得经基因改造的少突胶质祖细胞的构建体。

进一步，所述构建体包含编码抗炎性细胞因子的核苷酸、和/或编码趋化因子的核苷酸；

优选地，所述抗炎性细胞因子包括IL-10、IL-27、IL-3、IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-16、IL-18、IL-22、IL-27、IL-35、IL-37、IL-38、IL-1Ra、TGF-β；

更优选地，所述抗炎性细胞因子为IL-10、IL-27、IL-3；

优选地，所述趋化因子包括CXC趋化因子亚族、CC趋化因子亚族、XC趋化因子亚族、CX3C趋化因子亚族；

更优选地，所述CXC趋化因子亚族包括CXCL11、CXCL1、CXCL2、CXCL3、CXCL4、CXCL5、CXCL6、CXCL7、CXCL8、CXCL9、CXCL10、CXCL12、CXCL13、CXCL14、CXCL15、CXCL16、CXCL17；

更优选地，所述CC趋化因子亚族包括CCL1、CCL2、CCL3、CCL4、CCL5、CCL6、CCL7、CCL8、CCL9、CCL10、CCL11、CCL12、CCL13、CCL14、CCL15、CCL16、CCL17、CCL18、CCL19、CCL20、CCL21、CCL22、CCL23、CCL24、CCL25、CCL26、CCL27、CCL28；

更优选地，所述XC趋化因子亚族包括XCL1、XCL2；

更优选地，所述CX3C趋化因子亚族包括CX3CL1；

最优选地，所述趋化因子为CXCL11。

第二方面，本发明提供了一种载体。

进一步，所述载体包含本发明第一方面所述的构建体；

优选地，所述载体包含编码IL-10的核苷酸、编码IL-27的核苷酸、编码IL-3的核苷酸、和/或编码CXCL11的核苷酸；

优选地，所述载体包括DNA载体、病毒载体；

最优选地，所述DNA载体包括DNA质粒载体、结合DNA质粒的脂质体、结合DNA质粒的分子耦联体、结合DNA质粒的多聚物；

最优选地，所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、双生病毒载体。

第三方面，本发明提供了一种经基因改造的诱导多能干细胞。

进一步，所述经基因改造的诱导多能干细胞表达IL-10、IL-27、IL-3、和/或CXCL11；

优选地，所述经基因改造的诱导多能干细胞过表达IL-10、IL-27、IL-3、和/或CXCL11；

更优选地，所述经基因改造的诱导多能干细胞过表达IL-10、IL-27、IL-3、和CXCL11；

优选地，所述经基因改造的诱导多能干细胞包含本发明第一方面所述的构建体、和/或本发明第二方面所述的载体。

第四方面，本发明提供了一种经基因改造的少突胶质祖细胞。

进一步，所述经基因改造的少突胶质祖细胞表达IL-10、IL-27、IL-3、和/或CXCL11；

优选地，所述经基因改造的少突胶质祖细胞过表达IL-10、IL-27、IL-3、和/或CXCL11；

更优选地，所述经基因改造的少突胶质祖细胞过表达IL-10、IL-27、IL-3、和CXCL11。

第五方面，本发明提供了一种本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞的制备方法。

进一步，所述方法包括：向诱导多能干细胞中递送本发明第二方面所述的载体；

优选地，所述递送是通过将本发明第二方面所述的载体导入到诱导多能干细胞中实现的；

更优选地，所述导入的方式包括显微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染、病毒载体介导的转染、转座子技术、CRISPR-Cas9技术；

最优选地，所述非病毒载体介导的转染包括脂质体转染、磷酸钙转染、壳聚糖转染；

最优选地，所述病毒载体介导的转染包括慢病毒感染、逆转录病毒感染、腺病毒感染、腺相关病毒感染。

第六方面，本发明提供了一种本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞的制备方法。

进一步，所述方法包括：将本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞进行诱导分化，得到经基因改造的少突胶质祖细胞；

优选地，所述诱导分化包括如下步骤：

(1)第一阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、SB431542、LDN193189、维生素A酸、胰岛素的基础培养基培养本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞；

(2)第二阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethano、N2supplement、SAG、维生素A酸的基础培养基培养步骤(1)得到的细胞；

(3)第三阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27supplement、SAG、维生素A酸、胰岛素的基础培养基培养步骤(2)得到的细胞；

(4)第四阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27 supplement、PDGF-AA、IGF-1、HGF、NT3、T3、Biotin、cAMP、胰岛素的基础培养基培养步骤(3)得到的细胞，即得经基因改造的少突胶质祖细胞；

更优选地，所述第一阶段诱导分化共5-9天；

更优选地，所述第二阶段诱导分化共2-6天；

更优选地，所述第三阶段诱导分化共6-10天；

更优选地，所述第四阶段诱导分化共9-13天；

最优选地，所述第一阶段诱导分化共7天；

最优选地，所述第二阶段诱导分化共4天；

最优选地，所述第三阶段诱导分化共8天；

最优选地，所述第四阶段诱导分化共11天；

更优选地，所述培养的条件为37℃、5％CO₂；

更优选地，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基。

第七方面，本发明提供了一种将本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞进行诱导分化得到经基因改造的少突胶质祖细胞的诱导分化剂。

进一步，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂；

优选地，所述第一阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、SB431542、LDN193189、维生素A酸、胰岛素；

更优选地，所述第一阶段诱导分化剂还包含非必须氨基酸；

最优选地，所述第一阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、10μM SB431542、0.25μM LDN193189、100μM维生素A酸、25μg/mL胰岛素；

优选地，所述第二阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethano、N2supplement、SAG、维生素A酸；

更优选地，所述第二阶段诱导分化剂还包含非必须氨基酸；

最优选地，所述第二阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethano、1％N2 supplement、1μM SAG、100μM维生素A酸；

优选地，所述第三阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27supplement、SAG、维生素A酸、胰岛素；

更优选地，所述第三阶段诱导分化剂还包含非必须氨基酸；

最优选地，所述第三阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、1％N2 supplement、2％B27supplement、1μMSAG、100μM维生素A酸、25μg/mL胰岛素；

优选地，所述第四阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27 supplement、PDGF-AA、IGF-1、HGF、NT3、T3、Biotin、cAMP、胰岛素；

更优选地，所述第四阶段诱导分化剂还包含非必须氨基酸；

最优选地，所述第四阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、1％N2 supplement、2％B27supplement、10ng/mL PDGF-AA、10ng/mL IGF-1、5ng/mL HGF、10ng/mL NT3、60ng/mL T3、100ng/mL Biotin、1μM cAMP、25μg/mL胰岛素。

第八方面，本发明提供了一种用于产生本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞的试剂盒。

进一步，所述试剂盒包含：

(Ⅰ)本发明第一方面所述的构建体，和/或

(Ⅱ)本发明第二方面所述的载体，和/或

(Ⅲ)诱导多能干细胞，和/或

(Ⅳ)一种或多种培养基；

优选地，所述培养基为添加本发明第七方面所述诱导分化剂的基础培养基；

更优选地，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基。

第九方面，本发明提供了一种组合物。

进一步，所述组合物包含本发明第一方面所述的构建体、和/或本发明第二方面所述的载体、和/或本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞。

优选地，所述组合物包括药物组合物；

更优选地，所述药物组合物包含本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞；

更优选地，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料；

更优选地，所述药物组合物还包括一种或多种治疗剂；

最优选地，所述治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、miRNA、dsRNA、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、抗体、化学治疗剂、免疫调节药物。

进一步，所述药学上可接受的载体和/或辅料包括(但不限于)：缓冲液，例如中性缓冲盐水、磷酸盐缓冲盐水等；碳水化合物，例如葡萄糖、甘露糖、蔗糖或葡聚糖、甘露醇；蛋白质；多肽或氨基酸，例如甘氨酸；抗氧化剂；螯合剂，例如EDTA或谷胱甘肽；佐剂(例如氢氧化铝)；以及防腐剂。所述适合的药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂在Remington'sPharmaceutical Sciences(19th ed.,1995)中有详细的记载。

进一步，所述药物组合物还可以与其他药物联合使用，所述其他药物包括(但不限于)：甲泼尼龙(Methylprednisolone，MPL)、干扰素-β-1a(Interferon-β-1a，IFN-β-a)、干扰素-β-1b(interferon-β-1b，IFN-β-b)、格拉替雷(Glatiramer)、米托蒽醌(Mitoxantrone)、那他珠单抗(Natalizumab)、芬戈莫德(Fingolimod)、Zeposia(Ozanimod)、特立氟胺(Teriflunomide)、富马酸二甲酯(Dimethyl Fumarate，DMF)、阿仑单抗(Alemtuzumab)、Ocrevus(Ocrelizumab)奥瑞/奥美珠单抗、利妥昔单抗(美罗华)、Rituximab(Rituxan)、西尼莫德(Siponimod)Mayzent、克拉屈滨(Cladribine)、拉喹莫德(Laquinimod)、Kesimpta(ofatumumab)奥法木单抗、Ponvory(Ponesimod)、Ampyra(dalfampridine)氨吡啶缓释片(4-氨基吡啶)。

进一步，所述药物组合物的剂型包括(但不限于)：注射剂、片剂、胶囊剂、气雾剂、免疫制剂、颗粒剂、软膏剂、丸剂、口服液、吸入剂、搽剂、酊剂、栓剂。

进一步，所述药物组合物的给药途径包括(但不限于)：动脉注射、静脉注射、肌肉注射、皮下注射、皮内注射、骨髓注射、吸入给药、鼻腔给药、透皮给药、腹腔注射、硬膜外腔注射、脊髓注射。

进一步，本发明中所述的药物组合物的适合的给药剂量根据制剂化方法、给药方式、患者的年龄、体重、性别、病态、饮食、给药时间、给药途径、排泄速度及反应灵敏性之类的因素而可以进行多种处方，熟练的医生通常能够容易地决定处方及处方对所希望的治疗或预防有效的给药剂量。

第十方面，本发明提供了如下任一方面的应用：

(1)本发明第一方面所述的构建体在制备载体中的应用；

(2)本发明第一方面所述的构建体在制备用于产生本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞的试剂盒中的应用；

(3)本发明第二方面所述的载体在制备本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用；

(4)本发明第二方面所述的载体在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用；

(5)本发明第二方面所述的载体在制备用于产生本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞的试剂盒中的应用；

(6)本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备终端分化细胞或其前体细胞中的应用；

(7)本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用；

(8)本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用；

(9)本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用；

(10)本发明第七方面所述的诱导分化剂在制备经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用；

(11)本发明第八方面所述的试剂盒在产生经基因改造的诱导多能干细胞、和/或经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用；

(12)本发明第九方面所述的组合物在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用；

(13)IL-10、IL-27、IL-3、CXCL11在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的经基因改造的诱导多能干细胞中的应用；

(14)IL-10、IL-27、IL-3、CXCL11在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用；

(15)IL-10、IL-27、IL-3、CXCL11在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用。

本发明还提供了一种在有需要的受试者的中表达IL-10、IL-27、IL-3、CXCL11的方法。

进一步，所述方法包括给有需要的受试者的施用有效量的本发明第二方面所述的载体、和/或本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞。

本发明还提供了一种治疗和/或预防多发性硬化症的方法。

进一步，所述方法包括给有需要的受试者施用有效量的本发明第三方面所述的经基因改造的诱导多能干细胞、和/或本发明第四方面所述的经基因改造的少突胶质祖细胞、和/或本发明第七方面所述的药物组合物、和/或本发明第九方面所述的组合物。

相对于现有技术，本发明具有的优点和有益效果如下：

现有技术虽然在一定程度上促进了髓鞘的生成，但是不能减少炎症反应和自身免疫损伤；而采用本发明制备得到的经基因改造的少突胶质祖细胞进行移植，能够同时修复髓鞘、促进髓鞘的生成、减少炎症反应和自身免疫损伤，对多发性硬化症具有较好的治疗效果，整体改善效果显著；

本发明通过基因修饰的OPC的移植，实现了直接修复髓鞘，同时通过分泌抗炎症因子IL-27、IL-10等在神经周围局部形成了一个防护层，减轻了神经的炎症反应，同时通过CXCL11等招募T-reg、M2细胞富集在神经髓鞘周围保护髓鞘的损伤，通过IL-3的分泌维持星形胶质细胞、小胶质细胞和神经的信号调节，改善神经功能，在临床治疗多发性硬化症方面具有非常好的应用前景。

附图说明

以下，结合附图来详细说明本发明的实施方案，其中：

图1显示TEToff-CXCL-puromycin载体结构图；

图2显示IL10-T2A-IL27-Zeo结构图；

图3显示TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo载体结构图；

图4显示IL3-hygroR结构图；

图5显示TEToff-IL3-hygroR载体结构图；

图6显示第30天OPC标记Olig2(绿色)、Nestin(红色)基因鉴定的结果图；

图7显示髓鞘碱性蛋白抗体(MBP)免疫组化的结果图，MBP为绿色荧光，DAPI为蓝色荧光，其中，A图：对照组，B图：CPZ组；

图8显示小鼠海马区域免疫组化的结果图，MBP为红色荧光，Olig2为绿色荧光，DAPI为蓝色荧光，其中，A图：对照组，B图：OPC给药组。

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明，仅用于解释本发明，而不能理解为对本发明的限制。本领域的普通技术人员可以理解为：在不脱离本发明的原理和宗旨的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由权利要求及其等同物限定。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件或按照厂商所建议的条件实施检测。

实施例1构建慢病毒结构

1、实验材料

骨架载体pCW57.1购买自addgene(货号：plasmid-41393)；

基因合成公司：安徽通用生物科技有限公司。

2、构建方法

在本实施例中构建得到的慢病毒载体分别命名为TEToff-CXCL-puromycin、TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo、TEToff-IL3-hygroR。

(1)TEToff-CXCL-puromycin载体构建

通过基因合成，合成基因CXCL11，基因CXCL11的序列如SEQ ID NO:1所示；

如图1所示，在骨架载体pCW57.1的NheⅠ(3’端)和AgeⅠ(5’端)段，插入基因CXCL11，从而得到TEToff-CXCL-puromycin；

(2)TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo载体构建

通过基因合成，合成如图2所示的结构，核心结构基因IL-10、T2A、IL-27、hPGKpromoter、Zeocin(ZEO)、rtTA-Advanced(rTetR)的序列如SEQ ID N O:2-SEQ ID NO:7所示；

如图3所示，在骨架载体pCW57.1的NheⅠ(3’端)和EcoRⅤ(5’端)段，插入基因合成的IL10-T2A-IL27-Zeo，从而得到TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo。

(3)TEToff-IL3-hygroR载体构建

通过基因合成，合成如下图4结构，核心结构基因IL-3、Hygromycin(hygroR)序列如SEQ ID NO:8、SEQ ID NO:9所示：

如图5所示，在骨架载体pCW57.1的NheⅠ(3’端)和EcoRⅤ(5’端)段，插入基因合成的IL3-hygroR，从而得到TEToff-IL3-hygroR。

实施例2转染和筛选iPSC细胞株

1、实验材料

本实施例中使用的iPSC细胞来源于北京呈诺医学科技有限公司，本实施例中使用的慢病毒载体为实施例1中构建得到的慢病毒载体，本实施例中使用的其他实验材料见表1。

表1实验材料

2、细胞培养

(1)当细胞扩增至75-85％聚合度时开始传代。以T25培养皿为例，吸去旧的培养基，用室温DPBS洗两遍，随后加入3mL 37℃预热过的Accutase，置于37℃、5％CO₂细胞培养箱中5min，显微镜下观察单个细胞间出现空隙；

(2)弃去Accutase，加入3mL的TeSR-E8完全培养基终止消化，转移至15mL离心管中，室温下1000rpm离心5min；

(3)弃去上清，用1mL 37℃预热的加入10μM Rocki的TeSR-E8培养基轻轻吹打细胞然后重悬。计数后铺板，以6孔板为例，每孔细胞悬液2mL，铺板密度为3×10⁴/well。

3、细胞转染

将实施例1中构建得到的慢病毒载体TEToff-CXCL-puromycin、TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo、TEToff-IL3-hygroR导入到iPSC中，并进行转染得到的iPSC细胞的筛选，对筛选得到的单克隆iPSC细jian胞进行培养。

3.1慢病毒包装

(1)细胞接种：10cm培养皿接种1.5×10⁷个293T细胞。加10mL含10％FBS的DMEM，High Glucose，GlutaMAX^TM培养基，37℃，5％CO₂培养箱中过夜培养，16-24h后转染；

(2)细胞转染：细胞生长的交汇度达到80-90％，准备转染。转染体系见表2；B液逐滴加入到A液中，边加边摇匀，室温22-26℃下静置15min，逐滴加到培养皿中，轻轻摇匀，37℃，5％CO₂过夜培养；

表2转染体系

(3)转染换液：16-18h后，去掉含转染试剂的培养基，加入10mL含10％FBS的DMEM，5％CO₂、37℃条件下继续培养，(此时开始细胞上清液中将产出病毒)；

(4)病毒第一次收获：从转染开始算48h后，收获细胞上清，转移到50mL的离心管中，3,000rpm离心10min，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃的条件下保存，细胞加入10mL含10％FBS的DMEM，在5％CO₂、37℃的条件下继续培养；

(5)病毒第二次收获：收获细胞上清，转移到50mL离心管中，3,000rpm离心10min，上清用0.45μm滤膜过滤，4℃保存，细胞用10％消毒液(84消毒液)处理后丢弃；

(6)病毒浓缩：将收集到的慢病毒组分别用0.45μm滤器过滤去除细菌污染，将过滤后组分与按照体积比3:1混合，轻轻颠倒混匀；

(7)4℃孵育30min或过夜；

(8)4℃、1,500g离心45min，离心后会在管底看到白色沉淀；

(9)小心吸去上清液，不能破坏白色沉淀；

(10)用适当体积慢病毒保存液重悬沉淀，并将慢病毒分装、保存于-80℃；3.2iPSC慢病毒感染及筛选

(1)慢病毒转染前18-24小时，将iPSC以3×10⁴/well铺到6孔板中；

(2)第二天，用含有8μg/mL的新鲜TeSR-E8培养基替换原培养基，加入适量TEToff-CXCL-puromycin病毒悬液。37℃孵育；

(3)继续培养24小时，用新鲜培养基替换含有病毒的培养基；

(4)继续培养。在转染后72-96小时后。添加1μg/mL puromycin筛选阳性细胞；

(5)扩增培养阳性细胞；

(6)使用上述阳性细胞，重复1-5步，在第(2)步，使用TEToff-IL3-hygroR病毒液，第(4)步使用50μg/mL hygromycin筛选阳性细胞；

(7)扩增培养阳性细胞；

(8)使用上述阳性细胞，重复1-5步，在第(2)步，使用TEToff-IL10-T2A-IL27-Zeo病毒液，第(4)步使用100μg/mL zeocin筛选阳性细胞；

(9)扩增培养阳性细胞；并命名为super-iPSC。

实施例3 iPSC来源的OPC细胞的制备和鉴定

1、实验材料

本发明实施例2中通过经转染筛选构建得到的super-iPSC细胞，本实施例中使用到的其他实验材料见表3。

表3实验材料

2、iPSC来源的OPC细胞的制备方法

2.1配制以下培养基备用

(1)神经诱导完全培养基：98％DMEM/F-12培养基、1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、10μM SB431542、0.25μM LDN193189和100μM维生素A酸，25μg/mL胰岛素；

(2)N2培养基：97％DMEM/F-12培养基、1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM2-Mercaptoethano、1％N2 supplement、1μM SAG和100μM维生素A酸；

(3)B27培养基：95％DMEM/F-12培养基、1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM2-Mercaptoethanol、1％N2 supplement、2％B27supplement和1μM SAG和100μM维生素A酸、25μg/mL胰岛素；

(4)OPC成熟培养基：95％DMEM/F-12培养基、1％非必须氨基酸、1％GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、1％N2 supplement、2％B27 supplement、10ng/mL PDGF-AA、10ng/mL IGF-1、5ng/mL HGF、10ng/mL NT3、60ng/mL T3、100ng/mL Biotin、1μM cAMP、25μg/mL胰岛素。

2.2诱导OPC细胞

(1)从第0天起，super-iPSC由E8完全培养基更换为神经诱导完全培养基；

(2)置于37℃，5％CO₂培养箱；

(3)之后第1-7天，每天换液；

(4)每天仔细观察细胞形态改变；

(5)从第8天起，神经诱导完全培养基更换为N2培养基；

(6)置于37℃，5％CO₂培养箱；

(7)之后第8-11天，每天换液；

(8)每天仔细观察细胞形态改变；

(9)从第12天起，将N2培养基更换为B27培养基，细胞由贴壁培养转换为悬浮培养；

(10)在第12天，将旧的培养基吸掉，每孔加入B27培养基；

(11)用灭菌的刀片刮细胞，至少刮20下，然后分别将孔旋转90°和45°，同样各刮至少20下；

(12)用细胞刮将整个孔沿着刮线将细胞刮下；

(13)用1mL枪头轻轻吹打3-5次，然后将1孔细胞转移到低吸附的6孔板的两个孔中。然后每个孔分别补加B27培养基，使每孔的终体积为3mL；置于37℃，5％CO₂培养箱；

(14)之后第12-19天，隔天换一次液；

(15)每天仔细观察细胞形态改变；

(16)从第20天起，将B27培养基更换为OPC成熟培养基，细胞由贴壁培养转换为悬浮培养；

(17)在第20天，用1mL枪头将球形聚集体转移到15mL离心管中，静置3min使球形聚集体沉到离心管底部，吸掉2/3的旧的培养基，然后重新补加同样体积的OPC成熟培养基，然后将球形聚集体重新转回到原来的低吸附6孔板中；

(18)之后第20-30天，隔天换一次液。

3、制备得到的OPC细胞的鉴定

3.1工作液的配置

(1)配置10mL封闭血清稀释液(5％BSA+0.5％Triton X-100+DPBS液，以配置10mL为例。即在9.4mL DPBS中加入500μL正常5％BSA和100μL 30％Triton X-100)；

(2)配置一抗工作液：封闭血清稀释液加入合适一抗滴度(见一抗使用说明书中具体滴度值)；

(3)配置二抗工作液：封闭血清稀释液加入合适二抗滴度(见二抗使用说明书中具体滴度值)；

(4)配置90％甘油：用DPBS稀释。

3.2免疫荧光染色

DPBS清洗三遍，3min/次，4％PFA室温固定40min。DPBS清洗三遍，3min/次。0.5％TritonX-100，穿孔15min。5％BSA+0.15％TritonX-100，室温封闭1h。配PBST：DPBS+1％BSA+0.15％TritonX-100。上一抗，4度过夜。回收一抗溶液，PBST清洗三遍，每次10min。上二抗，1：500，4度过夜，避光。PBST清洗三遍，每次10min。5μg/mL DAPI for 2-3min，避光。用DPBS清洗一遍，加入90％的甘油。

4、实验结果

结果见图6，结果显示，诱导day30之后，Olig2表达于细胞中，表明了本发明成功制备了iPSC来源的OPC细胞，同时存在部分细胞表达nestin，说明还有部分神经干细胞。

实施例4 MS动物模型的构建

1、实验材料

C57BL/6雄性小鼠购自于北京维通利华实验动物技术有限公司；双环己酮草酰二腙(CPZ)购自于sigma，货号C9012。

2、实验方法

选8周龄C57BL/6雄性小鼠，分为正常组、急性脱髓鞘组(CPZ组)，正常组每天饲养正常鼠粮；模型组小鼠饲养含有0.2％CPZ的混合鼠粮，连续饲养6周；通过髓鞘碱性蛋白抗体(MBP)免疫组化判断髓鞘脱失程度。

3、实验结果

结果见图7A和图7B，结果显示，对照组髓鞘完整，未出现脱髓鞘病变，而CPZ组髓鞘脱落，表明了本发明成功构建了MS动物模型。

实施例5本发明构建得到的OPC细胞对MS动物模型的治疗作用

1、实验材料

实施例3中制备得到的super-iPSC来源的OPC细胞，实施例4中构建得到的MS动物模型。

2、实验方法

动物麻醉后，固定于脑立体定位仪上(双侧耳杆尖端插入外耳道，使头部固定保持水平，并尽量使前、后囟保持同一平面上)。碘酒消毒，沿正中线切开头皮、皮下组织，剥离骨膜。清晰暴露冠状缝与矢状缝的交点，从而确定前囟位置，以前囟为坐标0点。穿刺定位点以前后(AP)、中线-外侧(ML)、深度(DV)表示，首先进行右侧移植，立体定位点为：前囟后0.75mm、中线偏右0.6mm、深度1.1mm。5μL微量注射器吸取3μL生理盐水，按上述定位点准确定位后，OPC组通过注射器缓慢注入2μL OPC悬液，速度0.2μL/min；对照组通过注射器缓慢注入2μL生理盐水，速度0.2μL/min。注射完毕后留置5min，缓慢取出，用棉签压迫片刻，观察无出血、无液体渗漏后进行左侧移植，立体定位点为：前囟后0.75mm、中线偏左0.6mm、深度1.1mm，其余移植程序、剂量等均与右侧移植相同；两侧移植均完成后缝合头皮。手术3个月后，取小鼠大脑海马区域切片，通过免疫组化判断髓鞘修复修复状况。

3、实验结果

结果见图8A和图8B，结果显示，对照组髓鞘持续脱落，OPC组髓鞘得到修复，表明了经本发明构建得到的OPC细胞移植治疗的MS动物模型的MS相关症状明显得到改善，并且生成了髓鞘。

上述实施例的说明只是用于理解本发明的方法及其核心思想。应当指出，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以对本发明进行若干改进和修饰，这些改进和修饰也将落入本发明权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 呈诺再生医学科技（北京）有限公司

<120> 经基因改造的少突胶质祖细胞在多发性硬化症中的应用

<141> 2021-09-03

<160> 9

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 321

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

atgagtgtga agggcatggc tatagccttg gctgtgatat tgtgtgctac agttgttcaa 60

ggcttcccca tgttcaaaag aggacgctgt ctttgcatag gccctggggt aaaagcagtg 120

aaagtggcag atattgagaa agcctccata atgtacccaa gtaacaactg tgacaaaata 180

gaagtgatta ttaccctgaa agaaaataaa ggacaacgat gcctaaatcc caaatcgaag 240

caagcaaggc ttataatcaa attgaaagaa agaattttta aaaatatcaa aacatatgaa 300

gtcctggaaa agagcatctg a 321

<210> 2

<211> 534

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgcacagct cagcactgct ctgttgcctg gtcctcctga ctggggtgag ggccagccca 60

ggccagggca cccagtctga gaacagctgc acccacttcc caggcaacct gcctaacatg 120

cttcgagatc tccgagatgc cttcagcaga gtgaagactt tctttcaaat gaaggatcag 180

ctggacaact tgttgttaaa ggagtccttg ctggaggact ttaagggtta cctgggttgc 240

caagccttgt ctgagatgat ccagttttac ctggaggagg tgatgcccca agctgagaac 300

caagacccag acatcaaggc gcatgtgaac tccctggggg agaacctgaa gaccctcagg 360

ctgaggctac ggcgctgtca tcgatttctt ccctgtgaaa acaagagcaa ggccgtggag 420

caggtgaaga atgcctttaa taagctccaa gagaaaggca tctacaaagc catgagtgag 480

tttgacatct tcatcaacta catagaagcc tacatgacaa tgaagatacg aaac 534

<210> 3

<211> 54

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

gaaggtagag gttctctcct cacttgtggt gatgttgaag aaaaccctgg tcca 54

<210> 4

<211> 732

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

atgggccaga cggcaggcga ccttggctgg cggctcagcc tgttgctgct tcccttgctc 60

ctggttcaag ctggtgtctg gggattccca aggcccccag ggaggcccca gctgagcctg 120

caggagctgc ggagggagtt cacagtcagc ctgcatctcg ccaggaagct gctctccgag 180

gttcggggcc aggcccaccg ctttgcggaa tctcacctgc caggagtgaa cctgtacctc 240

ctgcccctgg gagagcagct ccctgatgtt tccctgacct tccaggcctg gcgccgcctc 300

tctgacccgg agcgtctctg cttcatctcc accacgcttc agcccttcca tgccctgctg 360

ggagggctgg ggacccaggg ccgctggacc aacatggaga ggatgcagct gtgggccatg 420

aggctggacc tccgcgatct gcagcggcac ctccgcttcc aggtgctggc tgcaggattc 480

aacctcccgg aggaggagga ggaggaagag gaggaggagg aggaggagag gaaggggctg 540

ctcccagggg cactgggcag cgccttacag ggcccggccc aggtgtcctg gccccagctc 600

ctctccacct accgcctgct gcactccttg gagctcgtct tatctcgggc cgtgcgggag 660

ttgctgctgc tgtccaaggc tgggcactca gtctggccct tggggttccc aacattgagc 720

ccccagccct ga 732

<210> 5

<211> 511

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

ggggttgggg ttgcgccttt tccaaggcag ccctgggttt gcgcagggac gcggctgctc 60

tgggcgtggt tccgggaaac gcagcggcgc cgaccctggg tctcgcacat tcttcacgtc 120

cgttcgcagc gtcacccgga tcttcgccgc tacccttgtg ggccccccgg cgacgcttcc 180

tgctccgccc ctaagtcggg aaggttcctt gcggttcgcg gcgtgccgga cgtgacaaac 240

ggaagccgca cgtctcacta gtaccctcgc agacggacag cgccagggag caatggcagc 300

gcgccgaccg cgatgggctg tggccaatag cggctgctca gcagggcgcg ccgagagcag 360

cggccgggaa ggggcggtgc gggaggcggg gtgtggggcg gtagtgtggg ccctgttcct 420

gcccgcgcgg tgttccgcat tctgcaagcc tccggagcgc acgtcggcag tcggctccct 480

cgttgaccga atcaccgacc tctctcccca g 511

<210> 6

<211> 375

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

atggccaagt tgaccagtgc cgttccggtg ctcaccgcgc gcgacgtcgc cggagcggtc 60

gagttctgga ccgaccggct cgggttctcc cgggacttcg tggaggacga cttcgccggt 120

gtggtccggg acgacgtgac cctgttcatc agcgcggtcc aggaccaggt ggtgccggac 180

aacaccctgg cctgggtgtg ggtgcgcggc ctggacgagc tgtacgccga gtggtcggag 240

gtcgtgtcca cgaacttccg ggacgcctcc gggccggcca tgaccgagat cggcgagcag 300

ccgtgggggc gggagttcgc cctgcgcgac ccggccggca actgcgtgca cttcgtggcc 360

gaggagcagg actga 375

<210> 7

<211> 747

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

atgtctagac tggacaagag caaagtcata aacggagctc tggaattact caatggtgtc 60

ggtatcgaag gcctgacgac aaggaaactc gctcaaaagc tgggagttga gcagcctacc 120

ctgtactggc acgtgaagaa caagcgggcc ctgctcgatg ccctgccaat cgagatgctg 180

gacaggcatc atacccactt ctgccccctg gaaggcgagt catggcaaga ctttctgcgg 240

aacaacgcca agtcataccg ctgtgctctc ctctcacatc gcgacggggc taaagtgcat 300

ctcggcaccc gcccaacaga gaaacagtac gaaaccctgg aaaatcagct cgcgttcctg 360

tgtcagcaag gcttctccct ggagaacgca ctgtacgctc tgtccgccgt gggccacttt 420

acactgggct gcgtattgga ggaacaggag catcaagtag caaaagagga aagagagaca 480

cctaccaccg attctatgcc cccacttctg agacaagcaa ttgagctgtt cgaccggcag 540

ggagccgaac ctgccttcct tttcggcctg gaactaatca tatgtggcct ggagaaacag 600

ctaaagtgcg aaagcggcgg gccgaccgac gcccttgacg attttgactt agacatgctc 660

ccagccgatg cccttgacga ctttgacctt gatatgctgc ctgctgacgc tcttgacgat 720

tttgaccttg acatgctccc cgggtaa 747

<210> 8

<211> 459

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

atgagccgcc tgcccgtcct gctcctgctc caactcctgg tccgccccgg actccaagct 60

cccatgaccc agacaacgcc cttgaagaca agctgggtta actgctctaa catgatcgat 120

gaaattataa cacacttaaa gcagccacct ttgcctttgc tggacttcaa caacctcaat 180

ggggaagacc aagacattct gatggaaaat aaccttcgaa ggccaaacct ggaggcattc 240

aacagggctg tcaagagttt acagaacgca tcagcaattg agagcattct taaaaatctc 300

ctgccatgtc tgcccctggc cacggccgca cccacgcgac atccaatcca tatcaaggac 360

ggtgactgga atgaattccg gaggaaactg acgttctatc tgaaaaccct tgagaatgcg 420

caggctcaac agacgacttt gagcctcgcg atcttttga 459

<210> 9

<211> 1026

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

atgaaaaagc ctgaactcac cgcgacgtct gtcgagaagt ttctgatcga aaagttcgac 60

agcgtctccg acctgatgca gctctcggag ggcgaagaat ctcgtgcttt cagcttcgat 120

gtaggagggc gtggatatgt cctgcgggta aatagctgcg ccgatggttt ctacaaagat 180

cgttatgttt atcggcactt tgcatcggcc gcgctcccga ttccggaagt gcttgacatt 240

ggggaattca gcgagagcct gacctattgc atctcccgcc gtgcacaggg tgtcacgttg 300

caagacctgc ctgaaaccga actgcccgct gttctgcagc cggtcgcgga ggccatggat 360

gcgatcgctg cggccgatct tagccagacg agcgggttcg gcccattcgg accgcaagga 420

atcggtcaat acactacatg gcgtgatttc atatgcgcga ttgctgatcc ccatgtgtat 480

cactggcaaa ctgtgatgga cgacaccgtc agtgcgtccg tcgcgcaggc tctcgatgag 540

ctgatgcttt gggccgagga ctgccccgaa gtccggcacc tcgtgcacgc ggatttcggc 600

tccaacaatg tcctgacgga caatggccgc ataacagcgg tcattgactg gagcgaggcg 660

atgttcgggg attcccaata cgaggtcgcc aacatcttct tctggaggcc gtggttggct 720

tgtatggagc agcagacgcg ctacttcgag cggaggcatc cggagcttgc aggatcgccg 780

cggctccggg cgtatatgct ccgcattggt cttgaccaac tctatcagag cttggttgac 840

ggcaatttcg atgatgcagc ttgggcgcag ggtcgatgcg acgcaatcgt ccgatccgga 900

gccgggactg tcgggcgtac acaaatcgcc cgcagaagcg cggccgtctg gaccgatggc 960

tgtgtagaag tactcgccga tagtggaaac cgacgcccca gcactcgtcc gagggcaaag 1020

gaatag 1026

Claims

1.用于基因改造诱导多能干细胞以获得经基因改造的少突胶质祖细胞的构建体，其特征在于，所述构建体包含编码抗炎性细胞因子的核苷酸、编码趋化因子的核苷酸；

所述抗炎性细胞因子为IL-10、IL-27和IL-3；

所述趋化因子为CXCL11。

2.一种载体，其特征在于，所述载体包含权利要求1所述的构建体；

所述载体包含编码IL-10的核苷酸、编码IL-27的核苷酸、编码IL-3的核苷酸和编码CXCL11的核苷酸。

3.根据权利要求2所述的载体，其特征在于，所述载体包括DNA载体、病毒载体。

4.根据权利要求3所述的载体，其特征在于，所述病毒载体包括腺病毒载体、腺相关病毒载体、慢病毒载体、逆转录病毒载体、单纯疱疹病毒载体、杆状病毒载体、仙台病毒载体、痘病毒载体、双生病毒载体。

5.根据权利要求4所述的载体，其特征在于，所述病毒载体为慢病毒载体。

6.一种经基因改造的诱导多能干细胞，其特征在于，所述经基因改造的诱导多能干细胞过表达IL-10、IL-27、IL-3和CXCL11。

7.根据权利要求6所述的经基因改造的诱导多能干细胞，其特征在于，所述经基因改造的诱导多能干细胞包含权利要求1所述的构建体、和/或权利要求2-5中任一项所述的载体。

8.一种权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：向诱导多能干细胞中递送权利要求2-5中任一项所述的载体。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，所述递送是通过将权利要求2所述的载体导入到诱导多能干细胞中实现的。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于，所述导入的方式包括显微注射、电穿孔、DEAE-葡聚糖介导的转染、TALEN方法、ZFN方法、非病毒载体介导的转染、病毒载体介导的转染、转座子技术、CRISPR-Cas9技术。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述非病毒载体介导的转染包括脂质体转染、磷酸钙转染、壳聚糖转染。

12.根据权利要求10所述的方法，其特征在于，所述病毒载体介导的转染包括慢病毒感染、逆转录病毒感染、腺病毒感染、腺相关病毒感染。

13.一种经基因改造的少突胶质祖细胞的制备方法，其特征在于，所述方法包括：将权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞进行诱导分化，得到经基因改造的少突胶质祖细胞；

所述诱导分化包括如下步骤：

(1) 第一阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、SB431542、LDN193189、维生素A酸、胰岛素、非必须氨基酸的基础培养基培养权利要求6所述的经基因改造的诱导多能干细胞；

(2) 第二阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethano、N2 supplement、SAG、维生素A酸、非必须氨基酸的基础培养基培养步骤(1)得到的细胞；

(3) 第三阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2 supplement、B27supplement、SAG、维生素A酸、胰岛素、非必须氨基酸的基础培养基培养步骤(2)得到的细胞；

(4) 第四阶段诱导分化：用添加GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2 supplement、B27supplement、PDGF-AA、IGF-1、HGF、NT3、T3、Biotin、cAMP、胰岛素、非必须氨基酸的基础培养基培养步骤(3)得到的细胞，即得经基因改造的少突胶质祖细胞；

所述第一阶段诱导分化中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、10 μM SB431542、0.25 μM LDN193189、100 μM维生素A酸、25 μg/mL胰岛素；

所述第二阶段诱导分化中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethano、1% N2 supplement、1 μM SAG、100μ M维生素A酸；

所述第三阶段诱导分化中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、1% N2 supplement、2% B27supplement、1 μM SAG、100 μM维生素A酸、25 μg/mL胰岛素；

所述第四阶段诱导分化中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1mM 2-Mercaptoethanol、1% N2 supplement、2% B27 supplement、10 ng/mL PDGF-AA、10ng/mL IGF-1、5 ng/mL HGF、10 ng/mL NT3、60 ng/mL T3、100 ng/mL Biotin、1 μM cAMP、25 μg/mL胰岛素；

所述第一阶段诱导分化共7天；

所述第二阶段诱导分化共4天；

所述第三阶段诱导分化共8天；

所述第四阶段诱导分化共11天。

14.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述培养的条件为37℃、5% CO₂。

15.根据权利要求13所述的方法，其特征在于，所述基础培养基为DMEM/F-12培养基。

16.一种将权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞进行诱导分化得到经基因改造的少突胶质祖细胞的诱导分化剂，其特征在于，所述诱导分化剂包括第一阶段诱导分化剂、第二阶段诱导分化剂、第三阶段诱导分化剂、第四阶段诱导分化剂；

所述第一阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、SB431542、LDN193189、维生素A酸、胰岛素、非必须氨基酸；

所述第二阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethano、N2 supplement、SAG、维生素A酸、非必须氨基酸；

所述第三阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27supplement、SAG、维生素A酸、胰岛素、非必须氨基酸；

所述第四阶段诱导分化剂的组成为：GlutaMAX-I、2-Mercaptoethanol、N2supplement、B27 supplement、PDGF-AA、IGF-1、HGF、NT3、T3、Biotin、cAMP、胰岛素、非必须氨基酸；

所述第一阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1 mM 2-Mercaptoethanol、10 μM SB431542、0.25 μM LDN193189、100 μM维生素A酸、25μg/mL胰岛素；

所述第二阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1 mM 2-Mercaptoethano、1% N2 supplement、1 μM SAG、100μ M维生素A酸；

所述第三阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1 mM 2-Mercaptoethanol、1% N2 supplement、2% B27supplement、1 μM SAG、100 μM维生素A酸、25 μg/mL胰岛素；

所述第四阶段诱导分化剂中各组分的含量分别为：1%非必须氨基酸、1% GlutaMAX-I、0.1 mM 2-Mercaptoethanol、1% N2 supplement、2% B27 supplement、10 ng/mL PDGF-AA、10 ng/mL IGF-1、5 ng/mL HGF、10 ng/mL NT3、60 ng/mL T3、100 ng/mL Biotin、1 μMcAMP、25 μg/mL胰岛素。

17.一种用于产生权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包含：

(Ⅰ) 权利要求1所述的构建体，和/或

(Ⅱ) 权利要求2所述的载体。

18.一种药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包含基于权利要求13-15中任一项所述方法制备得到的经基因改造的少突胶质祖细胞。

19.根据权利要求18所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括药学上可接受的载体和/或辅料。

20.根据权利要求19所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包括一种或多种治疗剂。

21.根据权利要求20所述的药物组合物，其特征在于，所述治疗剂包括肽、细胞因子、检查点抑制剂、丝裂原、生长因子、miRNA、dsRNA、单核血细胞、饲养细胞、饲养细胞组分或其置换因子、抗体、化学治疗剂、免疫调节药物。

22.权利要求1所述的构建体在制备载体中的应用。

23.权利要求1所述的构建体在制备用于产生权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞的试剂盒中的应用。

24.权利要求2或3所述的载体在制备权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞中的应用。

25.权利要求2或3所述的载体在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用。

26.权利要求2或3所述的载体在制备用于产生权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞的试剂盒中的应用。

27.权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备终端分化细胞或其前体细胞中的应用。

28.权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用。

29.权利要求6或7所述的经基因改造的诱导多能干细胞在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用。

30.基于权利要求13-15中任一项所述方法制备得到的经基因改造的少突胶质祖细胞在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用。

31.权利要求16所述的诱导分化剂在制备经基因改造的少突胶质祖细胞中的应用。

32.权利要求17所述的试剂盒在产生经基因改造的诱导多能干细胞中的应用。

33.权利要求18-21中任一项所述的药物组合物在制备用于治疗和/或预防多发性硬化症的药物中的应用。