CN101914492A

CN101914492A - 表达抗炎细胞因子il-10的骨髓源神经干细胞的制备方法

Info

Publication number: CN101914492A
Application number: CN 201010193792
Authority: CN
Inventors: 杨静娴; 王东; 孟宪生; 康廷国; 徐志立
Original assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Current assignee: Liaoning University of Traditional Chinese Medicine
Priority date: 2010-06-08
Filing date: 2010-06-08
Publication date: 2010-12-15

Abstract

本发明提供一种来源于骨髓、可表达抗炎细胞因子IL-10的新型神经干细胞的制备方法，包括①骨髓源神经干细胞的生成与培养、脑源神经干细胞的体外培养。②骨髓源与脑源神经干细胞的自我更新与分化能力的比较，并证实两者具有相同的自我更新与分化能力，都能分化为神经元与神经胶质细能。本发明方法制备的神经干细胞能用于治疗MS疾病及其它多种神经系统疾病，为多发性硬化及其它神经系统疾病的治疗提供了一种全新的途径，具有十分广阔的应用前景。

Description

表达抗炎细胞因子IL-10的骨髓源神经干细胞的制备方法

技术领域：

本发明涉及一种骨髓来源的、可表达抗炎细胞因子IL-10的新型神经干细胞系的建立方法，及此种将细胞替代与基因治疗结合为一体的新型神经干细胞对多发性硬化的治疗作用。

背景技术：

神经干细胞(Neural stem cell，NSCs)是指具有自我更新能力、并能分化为神经元和神经胶质细胞(少突胶质、星形胶质细胞)的一组细胞群。近年来许多学者用神经干细胞移植治疗多发性硬化(multiple sclerosis，MS)、帕金森氏病、阿尔茨海默病等神经系统疾病及神经损伤，取得了显著治疗效果。但该神经干细胞来源于胚胎或成体动物的侧脑室周围和海马等区域，取材困难、损伤较大，胚胎来源的神经干细胞无法回避免疫排斥和道德伦理等问题，降低了临床治疗的可行性^[1-3]。因此，寻找取材方便、来源丰富、无免疫排斥的神经干细胞的新来源具有重要的意义。骨髓间充质干细胞具有较强的自我更新和多分化潜能，在一定条件下可分化为神经干细胞^[4-5]，且取材容易，可直接抽取病人骨髓、经体外分选而获得，无免疫原性，来源丰富稳定，因而日渐受到人们的重视，可成为神经干细胞临床应用的一个理想的新来源。

多发性硬化(multiple sclerosis，MS)是一种常见的由自身免疫反应介导的中枢神经系统炎性脱髓鞘疾病。病灶多发于脑和脊髓的白质，呈多灶性炎性细胞侵润、脱髓鞘及神经元损伤，可导致感觉、运动、意识和神经认知等多方面的功能障碍。该病多发于20-40岁的青壮年人，复发率和致残率高，是青壮年人非外伤性神经残疾最常见的原因，迄今为止还无法治愈^[6-7]。

神经干细胞的发现及成功分离，为MS患者的治疗带来了新的希望。本发明以自体骨髓为来源的神经干细胞移植入体内后，能与脑源神经干细胞一样迁移、整合入CNS病变部位，分化为神经元及少突胶质细胞，成为髓鞘修复和神经元再生的潜在来源。但由于其抗炎作用较弱，不能解除中枢持续性炎症对髓鞘和神经元的损伤，因此治疗效果不十分理想。为增强其疗效，我们选择了白细胞介素10(IL-10)，将其基因转入骨髓源神经干细胞(Bone Marrow-NSCs，BM-NSCs)。IL-10是一种抗炎细胞因子，主要由Th2类细胞产生，可抑制T细胞增殖分化，抑制单核细胞、巨噬细胞和NK细胞的生物学活性，抑制Th1细胞产生致炎细胞因子IL-2、IFN-γ等^[3，8]。表达IL-10的新型BM-NSCs静脉移植后不仅可在外周及中枢发挥抗炎作用，保护中枢病变区的神经细胞免受或减轻炎症反应的损害，维持神经元的存活与髓鞘的完整性，而且还能促进神经干细胞分化为髓鞘修复与再生所必需的少突胶质细胞，抑制形成MS病灶斑块的星形胶质细胞增生，发挥神经修复/保护和免疫调节的双重作用，使疗效显著增强。

综上所述，本发明以自体骨髓为来源的神经干细胞不仅是一种理想的、无限制的神经干细胞的新来源，还是基因治疗的良好载体，可将细胞替代和基因治疗有机地结合为一体，为多发性硬化及其它神经系统疾病的治疗提供了一种全新的途径，具有十分广阔的开发和应用前景。

发明内容：

本发明的目的在于提供一种来源于骨髓、可表达抗炎细胞因子IL-10的新型神经干细胞的制备方法，用于治疗MS及其它多种神经系统疾病。为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种表达抗炎细胞因子IL-10的骨髓源神经干细胞的制备方法，包括下述步骤：

一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定：

1、提取成年小鼠全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪(MiltenyiBiotec)筛选出间充质干细胞[lineage-/CD117(c-kit)⁺]，体外用bFGF和EGF诱导分化为神经干细胞，经免疫组化染色、荧光显微镜检测，证实与脑源神经干细胞(SVZ-NSCs)具有相同的细胞表型，都表达Nestin与SOX2，可鉴定为未分化神经干细胞。见附图1。

2、体外自我更新与分化能力的检测：绘制生长曲线，检测其自我更新能力；以维甲酸(RA)和BDNF为诱导剂，体外诱导分化2周，免疫组化检测NF-M、NG2、GFAP的表达。结果证实BM-NSCs与SVZ-NSCs具有相同的自我更新与分化为神经元和神经胶质细胞的能力。见附图2。

二、构建IL-10和EGFP共表达的质粒、转染骨髓源神经干细胞及检测IL-10的表达：

神经元(NF-M⁺)、少突胶质细胞前体细胞(NG2⁺)、星形胶质细胞(GFAP⁺)，少数细胞仍维持于未分化状态(Nestin⁺)。红色：神经细胞特异性标志蛋白阳性染色。放大倍数：100×。

克隆小鼠IL-10基因、构建共表达IL-10和EGFP的逆转录病毒质粒，由CMV启动子驱动；以293T细胞包装病毒；用病毒上清转染BM-NSCs；以免疫组化法和ELISA法检测，证实被转染的BM-NSCs可有效表达IL-10。见图3。

三、IL-10基因修饰骨髓源神经干细胞移植治疗多发性硬化动物模型

1、MS模型制作与骨髓源神经干细胞移植治疗：雌性C57BL/6小鼠(8-12周)皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白乳化液(MOG35-55)，200ug/只，诱导MS动物模型。22天后尾静脉注射IL-10基因修饰BM-NSCs(IL10-BM-NSCs)和对照组BM-NSCs各1.5×10⁶个细胞/只。结果显示IL10-BM-NSCs治疗组临床症状明显较对照组减轻，证实IL-10表达明显增强了BM-NSCs对MS的治疗作用。见图4。

2、抗炎作用检测：骨髓源神经干细胞静脉移植2周后取模型小鼠脾细胞，用ELISA法检测各种细胞因子的分泌。结果表明IL10-BM-NSCs明显降低了小鼠脾淋巴细胞分泌炎性细胞因子IFN-r和IL-17，而增加了抗炎细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的分泌，从而使抗炎作用显著增强。见图5。

3、体内分化、神经修复与髓鞘再生作用检测：静脉移植6周后，取脑与脊髓制成冰冻切片，免疫组化检测NeuN、GalC、GFAP的表达，以GFP阳性作为外源性移植细胞的追踪标志；电镜观察髓鞘修复与再生。结果证实IL-10的表达促使BM-NSCs更多地分化为能修复髓鞘的GalC⁺少突胶质细胞，抑制其分化为形成MS病灶斑块的GFAP⁺星型胶质细胞；电镜检查结果证实IL-10的表达促进了髓鞘的修复与再生，使有髓鞘轴突所占百分率明显增加。见图6。

本发明提供一种制备神经干细胞的简捷而有效的方法，制备的神经干细胞能为MS患者带来希望，并能治疗其它多种神经系统疾病。

附图说明

图1为骨髓源神经干细胞(BM-NSCs)和脑源神经干细胞(SVZ-NSCs)的生成与鉴定示图。

图2和图3为BM-NSCs与SVZ-NSCs自我更新与分化能力的比较示图。

图4至图7为构建IL-10与EGFP共表达质粒、转染BM-NSCs及IL-10表达的检测示图。

图8为IL-10的表达增强了骨髓源神经干细胞对MS的治疗作用示图。

图9为IL-10的表达增强了骨髓源神经干细胞的抗炎作用示图。

图10至图12为IL10-BM-NSCs的体内分化及促进髓鞘修复与再生作用示图。

图1为骨髓源神经干细胞(BM-NSCs)和脑源神经干细胞(SVZ-NSCs)的生成与鉴定示图。从成年小鼠的腓骨中提取全骨髓细胞，用微珠标记抗体及磁性细胞分选仪筛选出lineage^-/CD117(c-kit)⁺细胞，以1.0×10⁵/ml密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培养，每隔3天换液一次。3-5周后诱导形成神经干细胞球(A)；分离上述小鼠脑组织SVZ区细胞，以上述培养基培养，1-2 周后形成神经干细胞球(B)。免疫组化染色、荧光显微镜检测结果显示BM-NSCs与SVZ-NSCs细胞球及单个细胞都为Nestin(绿色)和SOX2(红色)阳性，可鉴定为未分化NSCs，两者的细胞表型相同。蓝色：细胞核DAPI染色。放大倍数：神经球：10×，单细胞：85×。

图2为BM-NSCs与SVZ-NSCs自我更新与分化能力的比较示图。(A)生长曲线测定：取第三代BM-与SVZ-NSCs神经球，打散成单细胞，以相同细胞密度(1.0×10⁵/ml)置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培养。第5，9，13，16天分别取出，分散为单细胞，计数，绘制生长曲线，结果显示BM-与 SVZ-NSCs增值速度无显著差别；(B)体外分化实验：将上述两种神经球打散成单细胞，加入DMEM/F12+RA 15ug/ml+BDNF 20ug/ml中体外分化，两周后免疫组化检测，显示BM-NSCs与SVZ-NSCs都分化为神经元(NF-M⁺)、少突胶质细胞前体细胞(NG2⁺)、星形胶质细胞(GFAP⁺)，少数细胞仍维持于未分化状态(Nestin⁺)。红色：神经细胞特异性标志蛋白阳性染色。放大倍数：100×。

图3为构建IL-10与EGFP共表达质粒、转染BM-NSCs及IL-10表达的检测示图。(A)共表达IL-10与EGFP(Lv.IL-10)及只表达GFP(Lv.EGFP)的逆转录病毒载体结构图，由CMV启动子驱动；(B)免疫组化法检测IL-10的转染与表达：用293T细胞包装病毒、收集72小时内病毒上清液；用浓缩的病毒上清转染BM-NSCs，3天后以免疫组化染色、荧光显微镜检测，显示两组BM-NSCs都显著表达GFP(绿色)，说明两组BM-NSCs都被病毒质粒有效转染，但IL-10(红色)只在IL10-BM-NSCs中显著表达，在对照组BM-NSCs几乎不表达；(C)ELISA法检测IL-10的表达：转染3天后取两组BM-NSCs培养液上清，用ELISA法检测两组上清液中IL-10含量。结果显示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10浓度高达710ng/ml，而在对照组未能检测到。以上结果说明IL-10基因修饰BM-NSCs能有效表达IL-10。

图4为IL-10的表达增强了骨髓源神经干细胞对MS的治疗作用示图。雌性C57BL/6小鼠(8-12周)皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白乳化液(MOG35-55)200ug/只诱导MS动物模型，22天后尾静脉注射(i.v.)IL10-BM-NSCs和对照组GFP-BM-NSCs各1.5×10⁶/只。结果显示，PBS组呈现典型的疾病进程，两种干细胞治疗组的病情明显轻于PBS组，而IL10-BM-NSCs对疾病的抑制作用较BM-NSCs更快更强。

图5为IL-10的表达增强了骨髓源神经干细胞的抗炎作用示图。BM-NSCs移植2周后取小鼠脾细胞，以1.5×10⁶/ml细胞浓度置于RPMI 1640+10％FBS+10μg/ml MOG35-55中培养。3天后取培养液上清，以ELISA法检测各种细胞因子的含量。结果显示，IL-10的表达明显降低了小鼠脾淋巴细胞分泌炎性细胞因子IFN-r和IL-17，而使抗炎细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的分泌明显增加。^*p＜0.05，^**p＜0.01，PBS组与其它组的比较；^#p＜0.05，^##p＜0.01，IL10-BM-NSCs组与对照组BM-NSCs组的比较，n＝8。

图6为IL10-BM-NSCs的体内分化及促进髓鞘修复与再生作用示图。干细胞移植6周后，取各组小鼠脑制成冰冻切片，免疫组化检测BM-NSCs的体内分化，以GFP阳性作为外源性移植干细胞的追踪标志，结果显示，IL-10的表达促使BM-NSCs更多地分化为GalC+少突胶质细胞，较少地分化为GFAP+星型胶质细胞(A、B)。电镜检查结果显示，IL-10的表达促进了髓鞘的修复与再生，使有髓鞘轴突所占百分率明显增加(C、D)。

具体实施方式

表达抗炎细胞因子IL-10的骨髓源神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：

一、小鼠骨髓源神经干细胞的生成与鉴定：

1)、骨髓源神经干细胞(BM-NSCs)的生成与培养：取8-12周C57BL/6小鼠的腓骨，提取全骨髓细胞，用德国美天旎公司(Miltenyi Biotec)的微珠标记抗体及磁性细胞分选仪(QuadroMACS^TM Separator)分两步筛选出间充质干细胞。首先用系别细胞去除试剂盒(Lineage Cell Depletion Kit)去除成熟造血细胞，如T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和红细胞以及定向祖细胞(CD5⁺，CD45⁺，CD11b⁺，Gr-1⁺，TER119⁺，7/4⁺)，保留系别阴性细胞(lineage^-)；再用抗CD117微(CD117(c-kit)Microbeads)筛选出lineage^-/CD117(c-kit)⁺间充质干细胞，以1×10⁵/ml密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培养，每隔3天换液一次，3-5周后诱导形成神经干细胞球。结果见图1A。

2)、脑源神经干细胞(SVZ-NSCs)的体外培养：分离上述小鼠脑组织SVZ区，切成1cm³小块，胰蛋白酶消化20min、70μm细胞滤网过滤，将提取出的细胞以1×10⁵/ml密度加入DMEM/F 12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中体外培养，1-2周后形成神经干细胞球。结果见图1B。

3)、取第三代神经干细胞球及打散的单个神经干细胞，以抗小鼠Nestin和SOX2抗体进行免疫组化染色、荧光显微镜检测。结果显示BM-NSCs与SVZ-NSCs都为Nestin和SOX2阳性，可鉴定为未分化NSCs。结果见图1A，B。

2、骨髓源与脑源神经干细胞的自我更新与分化能力的比较，证实两者具有相同的自我更新与分化能力，都能分化为神经元与神经胶质细胞(图2)。方法如下：

1)、生长曲线测定：取第三代BM-与SVZ-NSCs神经球，打散成单细胞，以相同细胞密度(1.0×10⁵/ml)置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+20ug/ml+2％B27中培养。第5，9，13，16天分别取出，分散为单细胞，计数，绘制生长曲线。结果显示：BM-与SVZ-NSCs增值速度无显著差别。结果见图2A。

2)、体外分化实验：将上述两种神经球打散成单细胞，加入DMEM/F12+维甲酸(RA)15ug/ml+脑源性神经营养因子(BDNF)20ug/ml中体外诱导分化。两周后免疫组化鉴定，证实BM-NSCs与SVZ-NSCs都分化为神经元(NF-M⁺)、少突胶质细胞前体细胞(NG2⁺)、星形胶质细胞(GFAP⁺)，少数细胞仍维持于未分化状态(Nestin⁺)。结果见图2B。

二、IL-10与EGFP共表达质粒的构建、转染BM-NSCs及IL-10表达的检测(图3)。

1、克隆小鼠IL-10基因，构建可共表达IL-10与EGFP的逆转录病毒表达质粒，由CMV启动子驱动；只表达EGFP的质粒作为对照。见图3A。

2、以293T细胞包装病毒；收集72小时内病毒上清液；用浓缩的病毒上清转染BM-NSCs。3天后以免疫组化染色、荧光显微镜检测，结果显示两组BM-NSCs都显著表达GFP，但IL-10只在IL10-BM-NSCs中显著表达，在对照组BM-NSCs几乎不表达(图3B)；转染3天后取细胞培养上清，用ELISA法(IL-10ELISAKit，BD Bioscience)检测两组BM-NSCs的IL-10表达量。结果显示在IL10-BM-NSCs上清中IL-10浓度高达710ng/ml，而在对照组未能检测到IL-10(图3C)。

三、IL-10基因修饰骨髓源神经干细胞移植治疗MS动物模型(图4，5，6)

1、MS动物模型的建立与骨髓源神经干细胞移植治疗：取雌性C57BL/6小鼠(8-12周)，每组5只，皮下注射髓鞘少突胶质细胞糖蛋白乳化液(MOG35-55)200ug/只，诱导MS动物模型。22天后尾静脉注射(i.v.)IL10-BM-NSCs与对照组BM-NSCs各1.5×10⁶/只，观察、记录临床评分的改变。结果显示，PBS组呈现典型的疾病进程，两个干细胞移植组的发病明显轻于PBS组，而IL10-BM-NSCs对疾病的抑制作用较BM-NSCs更快更强(图4)。

2、IL10-BM-NSCs的抗炎作用：干细胞移植2周后取各组模型小鼠脾脏，用70μm细胞滤网(BD Falcon)挤压、过滤脾脏组织制成单细胞悬液，以1.5×106/ml细胞浓度置于RPMI 1640+10％FBS+10μg/ml MOG35-55中培养。3天后取培养液上清，以ELISA法检测各种细胞因子的改变(IFN-r、IL-17、IL-4、IL-5、IL-13ELISA Kit，BD Bioscience)。结果显示，IL10-BM-NSCs明显降低了小鼠脾淋巴细胞分泌炎性细胞因子IFN-r和IL-17，增加了抗炎细胞因子IL-4、IL-5、IL-13的分泌，从而使抗炎作用显著增强(图5)。

3、IL10-BM-NSCs的体内分化、促进髓鞘修复与再生作用：干细胞移植6周后，取各组小鼠脑与脊髓，制成冰冻切片，免疫组化检测NeuN、GalC、GFAP表达，以GFP阳性作为外源性移植干细胞的追踪标志。电镜观察髓鞘修复与再生。结果显示，IL-10的表达促使BM-NSCs更多地分化为能修复髓鞘的GalC⁺少突胶质细胞，抑制其分化为形成MS病灶斑块的GFAP⁺星型胶质细胞；电镜检查结果显示，IL-10的表达促进了髓鞘的修复与再生，使有髓鞘轴突所占百分率明显增加(图6)。

Claims

1.表达抗炎细胞因子IL-10的骨髓源神经干细胞的制备方法，包括如下步骤：

1)、骨髓源神经干细胞的生成与培养：取8-12周C57BL/6小鼠的腓骨，提取全骨髓细胞，用德国美天旎公司的微珠标记抗体及磁性细胞分选仪分两步筛选出间充质干细胞；首先用系别细胞去除试剂盒去除成熟造血细胞，包括T细胞、B细胞、单核/巨噬细胞、粒细胞和红细胞以及定向祖细胞CD5⁺，CD45⁺，CD11b⁺，Gr-1⁺，TER119⁺，7/4⁺，保留系别阴性细胞；再用抗CD117微筛选出lineage^-/CD117(c-kit)⁺间充质干细胞，以1×10⁵/ml密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培养，每隔3天换液一次，3-5周后诱导形成神经干细胞球；

2)、脑源神经干细胞的体外培养：分离上述小鼠脑组织SVZ区，切成1cm³小块，胰蛋白酶消化20min、70μm细胞滤网过滤，将提取出的细胞以1×10⁵/ml密度加入DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中体外培养，1-2周后形成神经干细胞球；

3)、取第三代神经干细胞球及打散的单个神经干细胞，以抗小鼠Nestin和SOX2抗体进行免疫组化染色、荧光显微镜检测；结果显示BM-NSCs与SVZ-NSCs都为Nestin和SOX2阳性，可鉴定为未分化NSCs；

4)、骨髓源与脑源神经干细胞的自我更新与分化能力的比较，证实两者具有相同的自我更新与分化能力，都能分化为神经元与神经胶质细胞；方法如下：

①、生长曲线测定：取第三代BM-与SVZ-NSCs神经球，打散成单细胞，以相同细胞密度置于DMEM/F12+bFGF 20ug/ml+EGF 20ug/ml+2％B27中培养；第5，9，13，16天分别取出，分散为单细胞，计数，绘制生长曲线；结果显示：BM-与SVZ-NSCs增值速度无显著差别；

②、体外分化实验：将上述两种神经球打散成单细胞，加入DMEM/F12+维甲酸15ug/ml+脑源性神经营养因子20ug/ml中体外诱导分化；两周后免疫组化鉴定，证实BM-NSCs与SVZ-NSCs都分化为神经元NF-M⁺、少突胶质细胞前体细胞NG2⁺、星形胶质细胞GFAP⁺，少数细胞仍维持于未分化状态Nestin⁺。