CN1301711C - 植物黄酮类化合物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明公开了植物黄酮类化合物的用途。本发明发明人的研究表明，植物黄酮类化合物能直接杀伤禽流感病毒，可以用于治疗和预防禽流感病毒，能在制备抗禽流感病毒的药物和添加剂中得到广泛应用。所述药物或添加剂的有效用量为20-250mg/kg体重·天。植物黄酮类化合物作为一种天然植物成分，对禽流感病毒具有明显的抑制作用，制备成药物或添加剂，具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为禽流感病毒的防治开辟新的途径，具有重要的社会价值、经济价值和广阔的应用前景。

Description

植物黄酮类化合物的用途

技术领域

本发明涉及化合物的用途，具体是涉及植物黄酮类化合物的用途。

背景技术

禽流感(Avian influenza，AI)是由A型流感病毒引起的禽鸟类的严重传染性疾病，感染的动物是鹅、鸡、鸭、鸽子以及一些野生鸟类等。流行病学研究显示，禽流感病毒具有高致病性和很强的传播能力，它不但会给养禽业带来巨大的损失，而且已经有渠道使病毒从鸡传播到人。禽流感病毒属于正粘病毒科流感病毒属，具有单股负链RNA，禽流感病毒粒子一般为球形，其表面有两种不同形状的突起：血凝素(HA)和神经氨酸酶(NA)。HA和NA是病毒表面的主要糖蛋白，具有种(亚型)的特异性和多变性，在病毒感染过程中起着重要作用。HA是决定病毒致病性的主要抗原成分，能诱发感染宿主产生具有保护作用的中和抗体，而NA诱发的对应抗体无病毒中和作用，但可减少病毒增殖和改变病程。迄今已知有16种HA和10种NA，不同的HA和NA之间可能发生不同形式的随机组合，从而构成许许多多不同亚型。据报道现已发现的流感病毒亚型至少有80多种，其中绝大多数属非致病性或低致病性，高致病性亚型主要是含H5和H7的毒株。

AI历来被认为是人类流感的最大基因库，是人流感病毒发生变异的新基因来源，不过在自然状态下，AI与人流感之间的联系需要通过中间宿主(如猪、马、海豚等哺乳动物)来实现。但1997年中国香港H5N1以及1999年中国大陆、香港H9N2 AIV首次突破种间障碍直接感染人甚至引起了人的死亡，不但打破了自然条件下仅有H1、H2、H3亚型流感病毒可以感染人和其它哺乳动物的常规，而且为人流感的流行增添了新的毒株亚型(H5和H9)，由此又赋予了AIV全新的公共卫生意义。

目前，对付禽流感尤其是高致病性禽流感病毒的感染，除了用疫苗进行紧急预防外，还没有特效的防治药物。用于抗流感的药物主要有神经氨酸酶抑制剂如：扎那米韦(Zanamivir)及奥司米韦(Oseltamivir)等；离子通道阻滞剂如金刚烷胺(Amantadine)和金刚乙胺(rimantadine)，它们被认为是治疗和预防流感病毒的首选药物；以及核苷类药物：三氮唑核苷即利巴韦林(Ribavirin)亦称病毒唑。

扎那米韦是根据流感病毒NA与唾液酸的复合物结构，通过计算机分子模拟设计而成，结构中的胍基与流感病毒NA活性部位的氨基酸通过氢键、静电力及范德华力的作用，与酶紧密结合，作用强度及选择性均较高；扎那米韦对B型流感病毒也有一定程度的结合。结构式如式(I)。

奥司米韦是GS4071的乙酯型前药，其亲脂性的3-戊氧基侧链与流感病毒NA活性部位的疏水性口袋有较强的亲和力，阻断了流感病毒NA对病毒感染细胞表面的唾液酸残基的裂解，从而抑制了病毒颗粒从感染细胞的释放，因而是一种选择性高的流感病毒NA抑制剂。结构式如式(II)。

盐酸金刚烷胺，英文名：Amantadine Hydrochloride Tablets，其化学名称为：三环[3，3，1，13，7]癸烷-1-胺盐酸盐，其结构式如式(III)。

利巴韦林(病毒唑)，英文名：Ribavirin Injection，主要成份化学名称为：1-b-D-呋喃核糖基-1H1，2，4，-三氮唑-3-羧酰胺。分子式：C8H12N4O5，分子量：244.21。结构式如式(IV)。

但这些药物都存在一定的局限性：神经氨酸酶抑制剂类能有效地抑制A、B型流感病毒，此类药物较为昂贵限制其推广使用；离子通道阻滞剂对A型流感病毒也具有良好的抑制作用，但存在神经毒性、长期用药易产生耐药性，易引起流感的大流行，并对B型流感病毒无效等缺陷；三氮唑核苷(病毒唑)对RNA、DNA病毒引起的感染均有效，但此类化合物具有一定的致畸作用，限制了其在临床的应用。寻找安全、有效、来源广泛，价廉低毒的抗禽流感药物也就显得尤为迫切和重要。

已报道黄酮类化合物具有抗氧化、抗血栓、抗癌、抗炎、调节血管渗透性、抗抑郁、抗焦虑、抗脑缺血、护肝、镇痛、对消化性溃疡的保护作用以及抗心律失常和抗心肌缺血等多种作用，但植物黄酮类化合物应用于禽流感病毒防治尚无报道。

黄酮类化合物是一大类低分子天然植物成分，通指两个苯环通过中央三碳链相互联结而成的一系列化合物类，均具有C6-C3-C6的基本结构，主要包括黄酮(flavone主要结构如式(V))及其异构体异黄酮(isoflavone)类；黄烷酮(flavanone主要结构如式(VI))及其异构体异黄烷酮(isoflavanone)类；查尔酮(chalcone主要结构如式(VII))类；桑酮(Xanthone主要结构如式(VIII))；黄酮醇(flavonol主要结构如式(IX))类及其异构体异黄酮醇(isoflavonol)类等。

本发明中所称的植物黄酮类化合物的化学名称为5，7-二羟基类黄酮，分子结构如式(X)，其中R1为H或OH；R2为OH或3，4，5-三羟基苯甲酰(galloyl)，3，4，5-三羟基苯甲酰的结构如式(XI)。可从传统中药蔷薇科植物中提取得到，例如硕苞蔷薇(Rosa bracteata Wendl.)即含有植物黄酮类化合物。硕苞蔷薇，又名苞蔷薇、猴柿等，为常绿灌木，高2-5米，广泛分布于华中和华南地区。

发明内容

本发明的目的是提供植物黄酮类化合物的一种用途。

本发明发明人的研究表明，植物黄酮类化合物能直接杀伤禽流感病毒，可以用于治疗和预防禽流感病毒，能在制备抗禽流感病毒的药物和添加剂中得到广泛应用。

在以植物黄酮类化合物为活性成分的药物中，需要的时候还可以加入一种或多种药学上可接受的载体。所述载体包括药学领域常规的稀释剂、赋形剂、填充剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、吸收促进剂、表面活性剂、吸附载体、润滑剂等。

本发明的药物可通过口服、注射或粘膜给药，可以制成片剂、胶囊、粉剂、颗粒、锭剂、栓剂，或口服液或无菌胃肠外悬液液体制剂等多种药物形式，还有大或小容量注射剂、冻干粉针或无菌粉分装剂等针剂形式。上述各种剂型的药物均可以按照药学领域的常规方法制备。

将植物黄酮类化合物以饲料添加剂的形式加入到禽类饲料中，可以提高禽类预防禽流感的能力。

以植物黄酮类化合物为主要成分的抗禽流感病毒的药物或添加剂，其有效用量为20-250mg/kg体重·天；优选剂量为60-180mg/kg体重·天。

植物黄酮类化合物作为一种天然植物成分，对禽流感病毒具有明显的抑制作用，制备成药物或添加剂，具有毒性小、作用强、安全有效等优点，为禽流感病毒的防治开辟新的途径，具有重要的社会价值、经济价值和广阔的应用前景。

附图说明

图1为实验小鼠不同组成活率比较图

图2为小鼠肺内病毒增殖随时间变化曲线

图3为小鼠血清抗体随时间变化曲线

具体实施方式

实施例一、植物黄酮类化合物在MDCK细胞模型中的抗H5N1禽流感病毒作用

大量研究表明，禽流感病毒能在MDCK细胞中产生较明显的病变，本发明利用MDCK细胞进行体外抗H5N1亚型禽流感病毒的药效学试验。

MDCK细胞：购于武汉大学中国典型培养物保藏中心。

高致病性H5N1禽流感病毒：由华南农业大学提供，并经中国农科院哈尔滨兽医研究所鉴定，毒株编号为：A/goose/Guangdong/NH/2003(H5)(分离方法来源：中国疾病预防控制中心，《禽流感实验室检测方法》。Characterization of an Avianinfluenza A(H5N1)virus isolated from a child with a fatal respiratoryillness.Kanta Subbarao，Alexander Klimov，et al.Science(1998)，279：393-396)。

将病毒原液作100倍稀释，并在超净工作台中将病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊腔中，每胚0.2ml，石蜡封口，放于37℃温箱中孵育，每12h观察鸡胚生长情况，并每天翻胚2次，将24h内死亡的鸡胚弃去，24h后死去的鸡胚放入4℃冰箱，48小时后将所有的鸡胚均放入4℃冰箱过夜，次日无菌收集尿囊液，3000rpm离心15min，取上清进行血凝试验，以血凝滴度大于1∶256的病毒液作实验材料，分装-20℃贮存备用。

植物黄酮类化合物：由中山大学生命科学院海洋药物研究所提供。

称取200mg植物黄酮类化合物溶于50ml细胞维持液中，待其充分溶解后，用0.22μM滤膜过滤除菌，无菌试验96h(-)，分装，4℃贮存备用。

1、植物黄酮类化合物和病毒唑对MDCK细胞的最大无毒浓度

将浓度为1×105个/ml的MDCK细胞加入96孔板，每孔200μL，细胞铺满单层后，用维持液稀释病毒，按10倍递减，从病毒原液至10-9，每个浓度8个复孔，正常细胞对照加维持液，放入37℃5％CO2细胞培养箱中孵育，观察细胞病变效应(cytopathic effect，CPE)，采用Reed-Muench法计算TCID50。进行植物黄酮类化合物抗H5N1亚型禽流感病毒细胞实验时以100TCID50为病毒接种量。

依次将药物(植物黄酮类化合物和病毒唑)对倍稀释至4μg/ml，即4mg/ml、2mg/ml、1mg/ml、500μg/ml、250μg/ml、125μg/ml、62.5μg/ml、31.25μg/ml、16μg/ml、8μg/ml、4μg/ml共11个浓度。将培养细胞(浓度1×105个/ml)的细胞悬液200μl加入96孔微量培养板，37℃5％CO2培养，待细胞铺满单层后，吸出培养液，用无菌PBS液洗板孔3次，加入上述不同浓度的药液，每孔200μl，每个浓度8个复孔，然后在37℃5％CO2培养箱中培养并动态观察结果，记录由药物产生的细胞病变效应(CPE)，计算CPE不再进展时(约48小时)药物的半数中毒浓度(TD50)和最大无毒浓度(TD0)。并以TD0为正式实验时的药物起始浓度。

结果表明，高致病性H5N1禽流感病毒对MDCK细胞的TCID50为104.29/0.2ml，进行抗病毒实验时用100TCID50即将病毒原液稀释195倍后用于细胞实验；植物黄酮类化合物及病毒唑的最大无毒浓度(TD0)分别为125μg/ml，100μg/ml，半数中毒浓度(TD50)分别为500μg/ml、1976μg/ml。

2、植物黄酮类化合物对MDCK细胞内病毒的直接杀伤作用

先将表1中不同浓度的植物黄酮类化合物溶液和100TCID50病毒液等体积混合，作用2h后接种于长满单层细胞的96孔板中，每孔200μl，每个浓度8个复孔，放入37℃5％CO2培养箱中培养。每12h观察细胞生长情况，设病毒对照组及正常细胞对照组，待细胞对照生长正常，病毒对照CPE达(+++)以上时判定结果，拍照。实验重复三次，每次实验结束时将细胞板反复冻融三次，使细胞裂解，病毒释放，分别收集每次实验各浓度组细胞裂解液于EP管中，-20℃中冻存，进行血凝试验，测其效价以判定病毒的增殖程度，结果如表1所示。

实验结果表明，植物黄酮类化合物对MDCK细胞内禽流感病毒具有直接杀伤作用，其作用的EC50为3.40±0.39μg/ml，TI值为147。血凝测定显示：与病毒对照组相比，2μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，随着浓度的增加，其抑制效果愈加明显，至16μg/ml时已能完全抑制细胞病变的发生。

表1.植物黄酮类化合物I对MDCK细胞内病毒的直接杀伤作用结果

药物浓度(μg/ml)	Log	培养孔数	病变孔数(病变百分率)			血凝效价log( x±s)
							I	II	III
			12562.531.25168421	2.0971.7961.4951.2040.9030.6020.3010	88888888					0(0)0(0)0(0)0(0)1(12.5)3(37.5)5(62.5)8(100)	0(0)0(0)0(0)0(0)1(12.5)2(25)4(50)7(87.5)	0(0)0(0)0(0)0(0)1(12.5)3(37.5)5(62.5)8(100)	----0.50±0.17**1.11±0.15**1.41±0.16*2.21±0.17

0.50.25阳性对照阴性对照

-0.301-0.602

8888

8(100)8(100)8(100)0(0)

8(100)8(100)8(100)0(0)

8(100)8(100)8(100)0(0)

2.51±0.142.41±0.302.61±0.15-

^**P＜0.01；^**P＜0.05。

3、植物黄酮类化合物对MDCK细胞病毒感染的治疗作用

将MDCK细胞在96孔板长成单层后，接种200μL 100TCID50的禽流感病毒于各孔中，放入37℃5％CO2培养箱中感染2h后去病毒液，用无菌PBS洗三次以去除游离的残余病毒，再按表2加不同浓度的植物黄酮类化合物，每孔200μL，每个浓度设8个复孔，放入37℃5％CO2培养箱继续培养。每12h观察细胞生长情况，设正常细胞对照组和病毒对照组。待正常细胞对照组细胞生长正常，病毒对照组细胞CPE达(+++)以上时判定结果，拍照。实验重复三次，每次实验结束时将细胞板反复冻融三次，使细胞裂解，病毒释放，分别收集每次实验各浓度组细胞裂解液于EP管中，-20℃中冻存，进行血凝试验，测其效价以判定病毒的增殖程度，结果如表2所示。

结果表明，当植物黄酮类化合物浓度为0.5μg/ml时，MDCK细胞的CPE达(++++)，可见细胞完全脱落并聚集；浓度为16μg/ml时，CPE为(++)；浓度为31.25μg/ml时，细胞形态与正常对照细胞无异。经计算，植物黄酮类化合物对病毒感染细胞治疗作用的EC50为4.01±0.58μg/ml，TI值为124.69。血凝测定显示：与病毒对照组相比，2μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，随着浓度的增加，其抑制效果愈加明显，至31.25μg/ml时已能完全抑制细胞病变的发生。

表2.植物黄酮类化合物对MDCK细胞病毒感染的治疗作用结果

药物浓度μg/ml	Log	培养孔数	病变孔数(病变百分率)			血凝效价log( x±s)
							I	II	III
			12562.531.251684210.50.25病毒对照正常对照	2.0971.7961.4951.2040.9030.6020.3010-0.301-0.602--	888888888888					0(0)0(0)0(0)1(12.5)2(25)3(37.5)5(62.5)7(87.5)8(100)8(100)8(100)0(0)	0(0)0(0)0(0)1(12.5)3(37.5)4(50)5(62.5)7(87.5)8(100)8(100)8(100)0(0)	0(0)0(0)0(0)0(0)2(25)3(37.5)5(62.5)6(75)8(100)8(100)8(100)0(0)	---0.30±0.13**1.01±0.17**1.21±0.15*1.61±0.16*1.91±0.172.51±0.192.51±0.172.61±0.18-

4、植物黄酮类化合物对MDCK细胞病毒感染的预防作用

接MDCK细胞于96孔板中，每孔200μl(1×105/ml)待各孔细胞铺满单层时，去生长液，按表3加用细胞维持液配制的不同浓度的植物黄酮类化合物，每个浓度8个复孔，每孔200μl，在37℃5％CO2培养箱中作用2h后，去含药维持液，用灭菌PBS洗涤三次，以去除游离药物，加入100TCID50的病毒200μl，放入37℃5％CO2培养箱中感染2h后去病毒液，用无菌PBS洗涤三次，除去残余游离病毒，各孔补充200μL维持液放入37℃5％CO2培养箱中继续培养，每12h观察细胞生长情况，同时设病毒对照和正常细胞对照。待细胞对照生长正常，病毒对照CPE达(+++)以上时判定结果，拍照。实验重复三次，每次实验结束时将细胞板反复冻融三次，使细胞裂解，病毒释放，分别收集每次实验各药物浓度细胞裂解液于EP管中，-20℃中冻存，进行血凝试验，测其效价以判定病毒的增殖程度，结果如表3所示。

结果表明，当植物黄酮类化合物浓度为1μg/ml时，MDCK细胞CPE为(++++)；浓度为8μg/ml时，MDCK细胞CPE为(++)；浓度为31.25μg/ml时，细胞形态与正常对照细胞无异，表明植物黄酮类化合物对禽流感病毒具有明显的预防作用。经计算，其作用的EC50为5.54±0.74μg/ml，TI值为90.25。血凝试验结果表明：与病毒对照组相比，4μg/ml即能有效抑制病毒的增殖(P＜0.05)，随着浓度的增加，其抑制效果愈加明显，至31.25μg/ml时已能完全抑制细胞病变的发生。

表3.植物黄酮类化合物对MDCK细胞病毒感染的预防作用结果

药物浓度(μg/ml)	Log	培养孔数	病变孔数(病变百分率)			血凝效价log( x±s)
							I	II	III
			12562.531.251684210.50.25病毒对照正常对照	2.0971.7961.4951.2040.9030.6020.3010-0.301-0.602	888888888888					0(0)0(0)0(0)2(25)3(37.5)5(62.5)7(87.5)8(100)8(100)8(100)8(100)0(0)	0(0)0(0)0(0)1(12.5)3(37.5)4(50)6(75)7(87.5)8(100)8(100)8(100)0(0)	0(0)0(0)0(0)2(25)3(37.5)5(62.5)7(87.5)8(100)8(100)8(100)8(100)0(0)	---0.80±0.14**1.10±0.17**1.41±0.15*2.01±0.192.61±0.182.61±0.172.51±0.132.61±0.18-

5、植物黄酮类化合物对MDCK细胞的毒性

植物黄酮类化合物对MDCK细胞的最大无毒浓度为100μg/ml，并在此浓度以下的一定浓度范围内对H5N1亚型禽流感病毒表现出良好的防治作用，对细胞无毒性。

实施例二、植物黄酮类化合物在鸡胚模型中对H5N1禽流感病毒的抑制作用。

禽流感病毒接种鸡胚后能很快引起鸡胚的死亡，用10日龄鸡胚作为实验材料。

1、植物黄酮类化合物和病毒唑对鸡胚的最大无毒浓度

准确称取2g植物黄酮类化合物溶于100ml生理盐水中，待充分溶解后，用0.22μM滤膜过滤除菌，无菌试验96h(-)后分装，4℃保存备用。

以上述植物黄酮类化合物溶液作为原液，用灭菌生理盐水作系列倍比稀释，共作六个浓度梯度即20mg/ml、10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml，接种于10日龄鸡胚尿囊腔中，每胚0.2ml，每个稀释度接种5个鸡胚，37℃孵育96h，连续观察鸡胚生长发育情况，以鸡胚存活96h的最大浓度作为药物的最大无毒剂量。同时作阳性药物病毒唑对鸡胚的毒性作用，病毒唑以100mg/ml为原液依次倍比稀释共六个浓度，接种和观察同植物黄酮类化合物。实验时设正常生理盐水对照。

结果表明，植物黄酮类化合物和病毒唑对鸡胚的最大无毒浓度(TD0)分别为10mg/ml、100mg/ml。

将病毒原液按10倍递减进行稀释，并在超净工作台中将病毒接种于10日龄的鸡胚尿囊腔中，每胚0.2ml，石蜡封口，放于37℃温箱中孵育，每12h观察鸡胚生长情况，并每天翻胚2次，将24h内死亡的鸡胚弃去，24h后死去的鸡胚放入4℃冰箱，48小时后将所有的鸡胚均放入4℃冰箱过夜，次日无菌收集尿囊液，3000rpm离心15min，取上清进行血凝试验，计算病毒对鸡胚的EID50。进行植物黄酮类化合物抗H5N1亚型禽流感病毒鸡胚实验时以100EID50为病毒接种量。

结果表明，病毒对鸡胚的EID50为EID50＝105..67/0.2ml，药物抗病毒实验时用100EID50即将病毒稀释2344倍。。

2、直接杀伤作用组

用100EID50的病毒液与按表4的不同浓度药物溶液等体积混匀，37℃作用2h后，接种于鸡胚尿囊腔中，每胚0.2ml，每稀释度5个鸡胚，37℃孵育48h(24h死亡者为非特异性死亡)，入4℃冰箱过夜，次日收获各鸡胚尿囊液，作血凝试验，结果如表4所示。以上实验均同时设病毒对照及正常对照(生理盐水)，阳性药物病毒唑对照同时进行。

结果表明，在直接杀伤作用组中，植物黄酮类化合物浓度为10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml、1.25mg/ml、0.625mg/ml时均能有效地杀伤病毒，使鸡胚免于受病毒的攻击(与病毒对照组比较P＜0.01)；浓度为100mg/ml、50mg/ml病毒唑溶液均能有效地杀伤禽流感病毒(与病毒对照组血凝素效价比较，前者P＜0.01、后者P＜0.05)，而25mg/ml以下各浓度杀伤禽流感病毒效果不显著(P＞0.05)。

3、治疗作用组

先每胚分别接种100EID50禽流感病毒0.1ml(每组5个鸡胚)，37℃2h，再将不同稀释度的药物每胚0.1ml接种于鸡胚尿囊腔中，37℃孵育48h，4℃冰箱过夜，次日分别收获各鸡胚尿囊液，作血凝试验，结果如表4所示。以上实验均同时设病毒对照及正常对照(生理盐水)，阳性药物病毒唑对照同时进行。

结果表明，先感染病毒再用药，植物黄酮类化合物各浓度均能有效地抑制禽流感病毒在鸡胚内的增殖；而25mg/ml以下的病毒唑则对抑制禽流感病毒效果不显著(P＞0.05)。

4、预防作用组

将不同稀释度的药物0.1ml接种鸡胚尿囊腔，每个药物稀释度5个鸡胚，37℃2h，再分别接种100EID50禽流感病毒0.1ml，37℃孵育48h，入4℃冰箱过夜，次日收获鸡胚尿囊液，作血凝试验，结果如表4所示。以上实验均同时设病毒对照及正常对照(生理盐水)，阳性药物病毒唑对照同时进行。

结果表明，在先用药物处理鸡胚再接种病毒后，可见植物黄酮类化合物10mg/ml、5mg/ml、2.5mg/ml组能有效预防禽流感病毒对鸡胚的感染(P＜0.01)；病毒唑组中，除100mg/ml组能有效预防禽流感病毒对鸡胚的感染(P＜0.01)外，其余各剂量组均不能有效预防禽流感病毒对鸡胚的感染(P＞0.05)。

                           表4.实验组不同给药方式观察结果

分组	浓度(mg/ml)	血凝效价log( x±s)
					直接作用	治疗作用	预防作用
		植物黄酮类化合物	1052.51.25	0.12±0.17**0.18±0.17**0.18±0.27**0.36±0.25**				0.54±0.25**0.66±0.25**0.66±0.25**1.14±0.57**	0.36±0.25**0.96±0.25**1.51±0.56*1.75±0.75

病毒唑病毒对照正常对照

0.625100502512.56.25

0.66±0.25**0.30±0.30**1.45±1.07*1.99±0.792.35±0.252.41±0.212.53±0.17-

1.51±0.71*0.78±0.17**1.45±0.91*2.17±0.582.41±0.212.35±0.252.53±0.17-

2.41±0.220.66±0.25**1.69±0.461.99±0.462.23±0.352.23±0.172.41±0.21-

由此可见，植物黄酮类化合物在三种作用方式中对禽流感病毒的效果均优于阳性对照药病毒唑。

5、植物黄酮类化合物对鸡胚的毒性

植物黄酮类化合物对鸡胚的最大无毒浓度为10μg/ml，并在此浓度以下的一定浓度范围内对H5N1亚型禽流感病毒均表现出显著的直接作用、治疗作用及一定的预防作用，对鸡胚无毒性。

实施例三、植物黄酮类化合物抗H5N1亚型禽流感的小鼠试验

实验动物：SPF级ICR小鼠320只，体重20±2g，雌雄各半；由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(合格证号：0002710，许可证号：SCXK(沪)2003-003)。实验前随机抽取20只小鼠用血凝试验及血凝抑制试验确认鼠群中无禽流感病毒的感染，并经检验排除其它呼吸道病源感染。

动物实验在广东省实验动物监测所三级生物安全实验室进行，符合三级生物安全实验室标准。所有物品在进入实验室前均经高压消毒或紫外线照射或浸泡消毒，实验空间实验前用高锰酸钾-甲醛液彻底薰蒸。

将160只动物随机分为8组，用于观察小鼠存活率、血清抗体、脏器指数及病理变化、体重、体温，分别为植物黄酮类化合物高剂量组(I组，54mg/ml)，植物黄酮类化合物中剂量组(II组，18mg/ml)，植物黄酮类化合物低剂量组(III组，6mg/ml)，极低剂量组(IV组，2mg/ml)，阳性药物病毒唑对照组(V组，6mg/ml)、盐酸金刚烷胺对照组(VI组，2.5mg/ml)，病毒对照组(VII组)和正常对照组(VIII组)，每组20只，雌雄各半，分笼饲养。

另120只动物随机分为8组，取肺及脑用于分离病毒，观察病毒在肺、脑内的增殖程度，分别为植物黄酮类化合物高剂量组(I组，54mg/ml)、中剂量组(II组，18mg/ml)、低剂量组(III组，6mg/ml)、极低剂量组(IV组，2mg/ml)；阳性药物病毒唑对照组(V组，6mg/ml)；盐酸金刚烷胺对照组(VI组，2.5mg/ml)；病毒对照组(VII组)和正常对照组(VIII组)，每组15只。雌雄分笼饲养。

实验I-VII组动物用0.1ml/20g氯胺酮(20mg/ml)肌肉注射麻醉后从鼻腔滴入含禽流感病毒尿囊液(血凝效价为1∶256)100μL，VIII组则滴入同样量的无病毒鸡胚尿囊液。2h后，I-IV组组动物分别经胃灌入高剂量(54mg/ml)、中剂量(18mg/ml)、低剂量(6mg/ml)、极低剂量(2mg/ml)浓度的植物黄酮类化合物0.2ml；V组动物经胃灌入病毒唑(6mg/ml)0.2ml；VI组经胃灌入盐酸金刚烷胺(2.5mg/ml)0.2ml；VII组、VIII组动物经胃灌入0.5％的羧甲基纤维素钠0.2ml。所有灌胃操作均在清晨清醒状态下进行，每天1次，连续灌胃5天。各组动物每日饲以标准日粮，自由饮水，12h光照、黑暗间隔。每2天更换垫料，为避免交叉感染，接病毒组和正常对照组相对隔离饲养。实验连续观察15天。每天观察各组小鼠的临床症状(包括行为、毛发光泽、呼吸、食欲等)及生存情况，发现动物濒死或死亡、立即采用眼球摘除法处死动物，取肺、心、肝、脾、肾等组织，准确称重(精确到0.1g)，并将肝、肾、肺固定于10％中性缓冲福尔马林液。

将感染病毒并开始用药的当天作为0天，用于分离病毒的各实验组小鼠在实验的第0、3、4、7天各组分别处死3只小鼠，无菌取肺及脑，入EP管中，匀浆后每管加入无菌生理盐水0.5ml，分别各取0.2ml接种10日龄鸡胚，培养48小时后取尿囊液作病毒血凝实验。

将感染病毒并开始用药的当天作为0天，用于观察小鼠存活率、血清抗体、脏器指数及病理变化、体重、体温的各组小鼠在第0、3、6、9、12、15天对存活的各小鼠分别称重及测量体温，计算各时间点的体重、体温变化情况，并在第1、4、7、11天及实验结束时，通过断尾法每次采集各实验组四只小鼠尾静脉血，分离血清作抗体分析，了解小鼠体内抗体水平的动态变化及药物对小鼠抗体水平的影响。血清抗体的检测采用血凝抑制试验方法。实验结束时将所有鼠均剖杀，取肝、肾、脾、肺、心准确称重后，将肝、肾、肺固定于10％中性缓冲福尔马林液中。

计算每组小鼠死亡率、药物保护率％：

药物保护率＝＝病毒对照组小鼠死亡率—试验组小鼠死亡率

效果指数＝＝病毒对照组死亡数/药物组死亡数

病理组织学观察：

小鼠肺、肝、肾等组织常规固定，石蜡包埋，切片5-8μm，HE染色后镜检观察脏器病理变化。

1、小鼠死亡率比较

实验小鼠生存情况如表5所示，结果表明，植物黄酮类化合物各浓度组对禽流感病毒均有显著的抑制作用(P＜0.05)。

                                      表5.各组小鼠生存情况

组别	0d	1d	2d	3d	4d	5d	6d	7d	8d	9d	10d-15d
												高剂量组中剂量组低剂量组极低剂量组病毒唑组金刚烷胺组病毒对照组正常对照组	2020202020202020	2020202020202020	2020202020202020	1919181616181720	1717161214161220	161614101215820	161614101215820	161614101215820	161614101215820	161614101215820	161614101215820

禽流感病毒广泛分布于世界范围内的诸多家禽和野禽中，同时也感染猪、马以及鲸鱼、雪貂，海豚等多种哺乳动物。其致病力的变化范围很大，随病毒型及亚型、动物种属、龄期、并发感染、周围环境及宿主免疫状态的不同而不同。禽流感病毒感染引发的疾病可能是不明显的或是温和的一过性的综合症，也可能是100％发病率和/或死亡率的疾病。因此对于高致病性禽流感病毒而言，能够保护受感染动物或人类免于死亡就成为药物有效性的一个评价指标，这也是研究和开发药物的目的。

图I是实验小鼠不同组成活率比较图，结果表明，与病毒对照组相比，植物黄酮类化合物的高、中、低浓度组及盐酸金刚烷胺对照组均能显著地提高感染小鼠的存活率；病毒唑对照组、植物黄酮类化合物的极低剂量组尽管也能一定程度地提高小鼠的存活率，但与病毒对照组比较无明显差异。与传统的抗病毒药病毒唑及盐酸金刚烷胺相比，植物黄酮类化合物的高、中、低剂量组抗禽流感病毒效果与金刚烷胺相当而优于病毒唑。

表6是实验小鼠不同组的存活率、死亡率等的数据统计表，表明在一定剂量范围内，植物黄酮类化合物能有效保护小鼠免受禽流感感染所引起的死亡，表中I-VIII分别为高剂量组、中剂量组、低剂量组、极低剂量组、病毒唑组、金刚烷组、病毒对照组和正常对照组。

               表6.植物黄酮类化合物对禽流感小鼠模型的保护作用

	I	II	III	IV	V	VI	VII	VIII
									存活率死亡率药物保护率效果指数	80％*20％40％3	80％*20％40％3	70％*30％30％2	50％50％10％1.2	45％55％5％1.1	70％*30％30％2	40％60％--	100％0％--

与病毒对照组相比*P＜0.05。

2、小鼠脏器的病毒浓度比较

小鼠肺内病毒增殖随时间变化情况如表7和图II所示。与病毒对照组比较，实验第四天，植物黄酮类化合物的54mg/ml组、18mg/ml组、6mg/ml组及金刚烷胺组能显著抑制病毒的增殖；第七天，各药物组均能显著抑制病毒的增殖；脑内除病毒对照组检出低滴度病毒外，各药物组均未检出病毒。

表7.各实验组肺内病毒增殖随时间动态变化( x±s)

组别	时间(天)
					0	3	4	7
	高剂量组中剂量组低剂量组极低剂量组病毒唑组金刚烷胺组病毒对照组正常对照组	--------	1.054±0.1251.063±0.1751.204±0.2141.076±0.1871.078±0.2421.055±0.1571.241±0.274-	0.955±0.213**1.054±0.172*1.205±0.117*1.654±0.2131.355±0.213*1.204±0.152*1.957±0.213-					0.451±0.213**0.602±0.00**0.753±0.213**1.806±0.00*0.905±0.00**0.451±0.213**2.559±0.213-

-表示血凝试验阴性，与病毒对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

3、小鼠血清抗体水平比较

小鼠体内血清抗体水平如表8和图III所示。与病毒对照组比较，植物黄酮类化合物54mg/ml组、18mg/ml组及金刚烷胺组能促进小鼠抗体的分泌，其余用药组对小鼠抗体的分泌影响轻微。

                 表8.各实验组小鼠血清抗体水平情况( x±s)

组别	时间(天)
						0	4	7	11	15
	高剂量组中剂量组低剂量组极低剂量组病毒唑组金刚烷胺组病毒对照组正常对照组	--------	0.301±0.2460.376±0.151---0.151±0.174--	0.828±0.288*0.903±0.246*0.376±0.1510.376±0.1510.452±0.1740.828±0.288*0.376±0.150-	1.656±0.174*1.731±0.151*1.279±0.2881.129±0.2881.129±0.1511.731±0.288*0.978±0.151-						2.182±0.1512.333±0.1512.032±0.2881.731±0.2881.957±0.1742.333±0.1511.881±0.151-

-表示血凝抑制试验阴性，与病毒对照组比较^*P＜0.05。

4、小鼠脏器指数比较

实验结束时不同小鼠平均脏器系数比较如表9所示。与病毒对照组比较，各药物组均能有效降低小鼠肺指数，对其它脏器指数的影响不大；各药物组均能有效减轻肝、肾、肺等脏器的病变。

表9.实验结束时不同组小鼠平均脏器系数比较( x±s)

	肺	肝	脾	肾	心
						高剂量组中剂量组低剂量组极低剂量组病毒唑组金刚烷胺组病毒对照组正常对照组	0.70±0.06**0.77±0.06**0.81±0.04**0.92±0.08*0.98±0.06*0.83±0.06**1.45±0.100.69±0.04	5.60±0.295.89±0.355.85±0.386.31±0.336.45±0.765.71±0.446.20±0.425.80±0.20	0.37±0.060.45±0.060.45±0.040.41±0.080.5±0.050.44±0.060.48±0.070.39±0.04	1.54±0.111.58±0.121.62±0.141.84±0.111.76±0.111.41±0.101.46±0.191.39±0.06	0.50±0.070.46±0.050.49±0.050.51±0.070.48±0.050.51±0.050.50±0.080.50±0.06

与病毒对照组比较^*P＜0.05，^**P＜0.01。

5、小鼠体重比较

与病毒对照组比较，实验前三天，各药物组均能减缓小鼠体重的减轻，三天后各药物组均能有效促进小鼠体重的回升。

6、小鼠体温比较

与病毒对照组比较，实验前三天，各用药组对小鼠体温的影响不明显，三天后各药物组均能有效促进小鼠体温的回升。

结果表明：植物黄酮类化合物能显著提高模型小鼠的存活率且呈剂量依赖关系；能有效地抑制病毒在模型小鼠肺内的增殖，抑制病毒对脑的侵袭；能有效地激活机体的体液免疫系统，使机体内血清抗体呈高滴度表达；能有效地促进禽流感病毒感染所致的肺，肝、肾等组织器官病变的修复；能显著抑制模型小鼠体重的下降及促进体重的回升；能在一定程度上加速模型小鼠体温恢复正常和缩短动物的病情。

7、植物黄酮类化合物对小鼠的毒性

实验小鼠的急性毒性实验表明，所使用的有效抗H5N1亚型禽流感病毒浓度均对小鼠无毒。

Claims (6)

1、分子结构式如下的植物黄酮类化合物在制备抗禽流感病毒药物中的应用：

其中R1为H或OH；R2为OH或

2、根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述药物的有效剂量为20-250mg/kg体重·天。

3、根据权利要求2所述的应用，其特征在于：所述药物的有效剂量为60-180mg/kg体重·天。

4、分子结构式如下的植物黄酮类化合物在制备抗禽流感病毒饲料添加剂中的应用：

其中R1为H或OH；R2为OH或

所述饲料添加剂是加入饲料中经口服应用的。

5、根据权利要求4所述的应用，其特征在于：所述的饲料添加剂的有效量为20-250mg/kg体重·天。

6、根据权利要求5所述的应用，其特征在于：所述的饲料添加剂的有效量为60-180mg/kg体重·天。

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