CN1455674A - 绵羊副痘病毒菌株用于制备抗病毒药物和抗癌药物的用途 - Google Patents

Abstract

本发明涉及绵羊副痘病毒菌株作为用于感染或非感染性免疫减弱的免疫治疗剂的用途，以及所述病菌株用于治疗肿瘤疾病和病毒感染的用途。本发明还涉及绵羊副痘病毒菌株制备用于人和动物的药物的用途。

Description

绵羊副痘病毒菌株用于制备抗病毒药物和抗癌药物的用途

本发明涉及绵羊副痘病毒(Parapoxvirus ovis)菌株作为用于感染或非感染性免疫减弱的免疫治疗剂的用途，以及所述Parapoxvirusovis菌株用于治疗肿瘤疾病、病毒感染和由此引起的疾病的用途。本发明还涉及绵羊副痘病毒菌株制备用于人和动物的药物的用途。

此外，本发明涉及绵羊副痘病毒菌株和由其制备的剂型作为免疫治疗剂或者免疫预防剂在应激(例如手术)后的应激调养中用于预防或防止感染性疾病的用途；涉及在感染预防中通过在手术或介入之前(例如在移植假肢之前或者牙科手术之前)施用用于预防或防止感染性疾病的用途，涉及在急性或慢性病毒感染例如呼吸道感染、乳头瘤病毒感染、疱疹病毒感染、HIV感染和内脏器官病毒感染例如肝炎病毒感染的感染后预防或治疗中的用途，涉及在伤口愈合中用于促进伤口愈合的用途，和涉及促进愈合不好或者根本没有愈合(例如腿溃疡)的伤口愈合的用途，涉及用于疾病例如多发性硬化、哮喘、疣和其他皮肤新生物的用途，涉及用于很多过敏性疾病的用途，涉及用于预防全身性过敏发生的用途，涉及用于局部过敏的用途，并且涉及用于例如改善老年人健康的用途，其中本发明中使用的绵羊副疸病毒菌株是NZ2、NZ-7、NZ-10和orf-11。

也可以使用通过传代和/或适应特定的细胞，例如WI-38、MRC-5或非洲绿猴肾细胞得到的这些菌株的子代，或者来自这些菌株或者这些子代的病毒的部分或片段。所谓部分应理解为指借助合适的载体例如牛痘，在合适的系统例如成纤维细胞培养物中表达的基因组或亚基因组片段。片段应理解为是通过经物理破碎例如通过超声破碎的颗粒的生物化学纯化，例如利用色谱法，获得的部分。

本发明进一步涉及所述绵羊副痘病毒菌株用于制备药物和药物制剂的用途。除此之外，本发明涉及所述绵羊副痘病毒菌株与其他药物结合用于制备抗病毒或癌症治疗的药物和药物制剂的用途。

已知通过免疫抑制能够将潜伏和慢性持久的病毒感染激活或再活化，或者，相反，免疫系统抑制潜伏病毒能诱导的急性疾病(例如与免疫抑制相关复发潜伏的疱疹病毒感染：与受力或施用可的松相关嘴唇疱疹)。还已知使用基于低分子量的常规抗病毒物质治疗慢性持久的和潜伏病毒感染是困难的或者甚至是不可能的。

其原因是在这样的感染中没有病毒酶活性(例如没有首先将核苷抑制剂插入到病毒核酸中使得该抑制剂能够例如使得病毒DNA链终止的任何病毒聚合酶活性；例如没有首先将抗病毒化合物磷酸化使得该化合物能够变成活性的任何病毒胸苷激酶活性)，或者也没有感染的或退化的细胞例如癌细胞或者病毒抗原通过宿主免疫系统对其的任何识别。

也已知与慢性持久病毒感染相关，另一种病毒的再度感染能带来针对这种慢性持久病毒的抗病毒作用¹⁾。作者¹⁾能证明干扰素，如由T细胞，由天然杀伤细胞和巨噬细胞分泌的IFN-γ和TNF-α的这种作用。

这些作者获得的结果证实了另一个早期的研究，这项早期研究证明I类-限制性细胞毒素T细胞能抑制HBV-转基因小鼠中肝细胞中HBV基因表达，该过程的发生没有任何肝细胞的破坏，并且TNF-α和IFN-γ激发该过程²⁾。

在兽医实践中，长期以来应用将诱导“类特异性免疫”的产物，即所谓的类免疫诱导剂，用于治疗、病后调养和预防。类免疫诱导剂例如由化学灭活的绵羊副痘病毒菌株D1701(DE 3 504 940)组成。BAYPAMUN^是在该病毒(绵羊副痘病毒菌株D1701)的基础上制备的。

在动物中，灭活的副痘病毒诱导对抗很多种病原体引起的感染的非特异性保护作用。假设这种保护作用通过机体内在防御系统的各种机理而介导。

这些机理包括诱导干扰素，天然杀伤细胞的激活，“集落刺激活性”(CSA)的诱导，和淋巴细胞增殖的刺激。对作用机理的早期研究证明了白细胞介素2和干扰素-α的刺激作用³⁾。

因此，在此背景下，本发明目的在于进一步改进绵羊副痘病毒极好作用的治疗用途，使得在质量上提高上述绵羊副痘病毒菌株D1701的类特异性免疫应答的一般诱导，并且如下述改进它，使得使用低剂量就能够实现更好的抗病毒或抗肿瘤效果。并且还预期这种治疗效果具有更低的副作用。

因此，本发明的目的是提高副痘病毒的免疫效果。该目的通过使用上述绵羊副痘病毒菌株代替常规使用的D1701菌株来实现。

本发明涉及分类学上属于绵羊副痘病毒菌株NZ2、NZ-7、NZ-10或orf-11的病毒用于制备针对人和动物病毒感染的药物的用途。

本发明进一步涉及根据本发明的菌株通过传代或者适应合适的细胞系例如人细胞，例如WI-38，MRC-5，猴细胞，例如非洲绿猴肾细胞，牛细胞，例如BK-K13A47/Reg或MDBK，和绵羊细胞，例如MDOK，得到的子代用于制备人和动物抗病毒感染和癌症的药物的用途，并且还涉及所述菌株和他们的传代和适应的变体的部分或片段用于制备人和动物抗病毒感染和癌症的药物的用途，其中所述部分理解为是借助合适的载体例如牛痘病毒在合适的系统例如成纤维细胞培养物中表达的基因组或亚基因组片段，片段理解为是通过表达的或物理破碎的病毒颗粒的生物化学纯化例如色谱法获得的部分，并且还涉及所述绵羊副痘病毒菌株和如上所衍生的衍生物之一制备在自身免疫疾病和用于呼吸道和内脏器官急性或慢性病毒感染中用作免疫治疗药物或免疫预防药物的药物和药物制剂的用途，还涉及所述病菌株和衍生的衍生物之一在制备用于应激后调养和用于预防或减轻应激后感染疾病以及与手术和牙科手术中感染预防有关的药物和药物制剂中的用途，还涉及所述病菌株和衍生的衍生物之一用于制备在感染后调养或治疗急性和慢性病毒感染例如呼吸道感染，乳头瘤病毒感染，疱疹病毒感染，HIV感染，或者内脏器官的感染，例如肝炎病毒感染，以及用于相关疾病例如多发性硬化，哮喘，疣和其他皮肤新生物的药物和药物制剂的用途，还涉及所述病菌株和衍生的衍生物之一用于制备在伤口上使用促进伤口愈合过程，和用于促进愈合不好或者根本没有愈合的伤口和腿溃疡愈合的药物和药物制剂的用途，还涉及所述病菌株和衍生的衍生物之一制备用于广谱变应性疾病、牛皮癣、神经性皮炎和其他自身免疫疾病例如红斑狼疮，以及用于提高例如老年患者健康的药物和药物制剂的用途，还涉及所述菌株和衍生的衍生物之一用于制备用于抵抗内脏器官、皮肤、血液、中枢神经系统及其附属器官包括眼的炎症、变性和增殖性疾病，例如节段性回肠炎，包括癌症的药物和药物制剂的用途，还涉及所述病菌株和衍生的衍生物之一与其他药物结合制备用于人和动物抗病毒治疗或癌症治疗的药物和药物制剂的用途。

本发明优选涉及所述绵羊副痘病毒菌株之一与其他药物结合制备用于口服的药物和药物制剂，和/或用于口服的胃液抗性制剂的用途。

这里举例提到的绵羊副痘病毒NZ-2在2001年7月10日保藏在细胞培养物欧洲中心，应用微生物学和研究中心，Porton Down，Salisbury，Wiltshire，SP4 0JG，United Kingdom。保藏号是____。

下面举例说明：

1 对乙肝病毒-转基因小鼠治疗活性的证明

乙肝病毒-转基因小鼠(HBV1.3Xtg种)用于“概念检验”实验。每组使用8-10周龄的7只雄性动物。在第一天(实验开始)和第四天腹膜内施用0.15毫升体积内各种剂量。

施用时，对于各个剂量组制备各个病毒菌株的下面稀释液：

第一剂量    1.5×10⁶TCID₅₀

第二剂量    5×10⁵TCID₅₀

第三剂量    1.5×10⁵TCID₅₀

第四剂量    5×10⁴TCID₅₀

灭菌的无致热源PBS被用作空白对照剂。

用下面方法浓缩病毒：将从绵羊副痘病毒菌株NZ2(效价大约2×10⁵TCID₅₀/毫升)和绵羊副痘病毒菌株D1701(效价大约1×10⁷ TCID₅₀/毫升)获得的500毫升上清液调节至相同病毒效价。为此目的使用贝克曼超离心(SW28转子在28000RPM和4℃下工作3小时)。离心之后，使用适当体积的稀释介质将沉积物调节到1×10⁷ TCID₅₀/毫升效价。

使用相应的剂量等份进行对照回滴，证实这些剂量的效价。去除对照等份之后，在56℃下将相应的剂量灭活1小时。

稀释介质：10毫升EMEM10x

          2.7毫升的2克/升碳酸氢盐

          1毫升的1％谷胺酰胺

          86.3毫升的双蒸馏水

第5天，无痛杀死动物，并且取出肝和血。使用QIAamp组织试剂盒(Qiagen，Hilden)处理来自每一只动物的大约20毫克肝，并且光度法测定DNA浓度，同时在1％琼脂糖凝胶中电泳法检查其完整性。在点印迹杂交方法中，该DNA与HBV-特异性探针杂交。为了排除RNA引起的信号，事先用RNAse A(Qiagen，Hilden)处理该DNA。将20微升DNA(10微克)加载到尼龙膜(Boehringer Mannheim)上并且用Soak I(0.5N NaOH；1M NaCl)处理4次，每次3分钟，用Soak II(3MNaCl；0.5N tris-HCl，pH7.4)处理2次；然后将DNA在120℃下烘干半小时，接着在60℃下与其中不含有任何探针的标准杂交缓冲液(5xSSC，N-月桂酰基肌氨酸，0.1％w/v；SDS，0.02％；封闭试剂，1x和100微克鱼精DNA/毫升)预杂交30分钟。此步骤之后，使DNA与含有整个HBV基因组的随机寡核苷酸致敏探针(20-40ng/ml杂交缓冲液)杂交。此后，在4xSSC/0.1％SDS，2xSSC/0.1％SDS和1xSSC/0.1％SDS中在64℃下将滤器冲洗10分钟。

使用CDP-Star^系统(Boehringer Mannheim)根据厂商说明进行免疫检测。评价时使用Lumi Imager^ (Boehringer Mannheim)。利用定量PCR定量测定血液中HBV-特异性DNA。首先通过将EDTA血液离心分离血浆。使用HighPure16系统病毒核酸试剂盒(BoehringerMannheim)纯化DNA，并且利用定量PCR，用ABI PRI SM^TM7700序列系统(PE Applied Biosystems)检测HBV-特异性信号。使用下面的引物和探针：

ayw-570f(有义)5′-CTGTACCAAACCTTCGGACGG-3′

ayw-670r(反义)5′-AGGAGAAACGGGCTGAGGC-3′

探针：

ayw-613t      5′-CCATCATCCTGGGCTTTCGGAAAATT-3′。

在50微升反应体积中扩增DNA(该反应含有1.4mM的各dNTP，4.75mM MgCl₂，15pmol各引物和探针，5微升10倍PCR缓冲液[所有PCR试剂来自TaqMan核心试剂盒；Perkin Elmer/RocheMolecular Systems Inc.]和1.25U Taq DNA聚合酶和0.25U AmpErase。开始的变性步骤(95℃，10分钟)之后，使样品进行40次变性(95℃，30秒)和淬火/延伸(56℃，1分钟)的循环。使用ABI PRISM^TM7700序列测定系统标准软件分析产物。

使用抗乙肝病毒核心抗原(Dako)的抗体进行组织化学分析。为此，将一个肝叶的部分在4％的甲醛中固定过夜，包埋在石蜡中并且切片(5μm)。去除石蜡并且再水化之后，使用3％H₂O₂将内源过氧化物酶活性猝灭20分钟，用正常山羊血清阻断非特异性结合。然后用1：500稀释的抗体将切片在室温下温育30分钟。使用Vectastain ABC试剂盒(Vector Laboratories)根据厂商说明进行所有下面的步骤。

使用3，3’-二氨基联苯胺四氯化物和过氧化氢观察免疫反应。使用苏木精/曙红对切片复染色。

应用方差分析和post hoc比较对结果进行统计学分析。

结果出人意料地发现，与用已知的绵羊副痘病毒菌株D1701相比，当使用NZ2菌株时获得的抗病毒作用增强。这使得第一次有可能使用绵羊副痘病毒诱导具有强的免疫系统的复杂能力，所述能力与用先前已知的副免疫诱导剂实现的作用的强度显著不同。

出人意料地获得下面的结果：

肝脏：与用D1701处理的动物相比，用NZ2处理的动物观察到HBV-特异性DNA显著的更大的减少。NZ2的抗病毒活性比D1701的更有效：在最高剂量组，与施用相同量的D1701相比，施用NZ2减少HBV-特异性DNA更有效，大于45倍，而在最低剂量组，疗效好57倍。在血浆中，施用NZ2减少HBV-特异性DNA，在最低剂量组，比施用相同量的D1701更有效10倍以上。这证明绵羊副痘病毒菌株NZ2比D1701菌株的治疗效力优越得多。

在附图中，给出了与空白对照剂组(等于100％)相比较的HBV-特异性信号的减弱。

附图1说明用D1701或NZ2菌株处理HBV-转基因小鼠的结果。使用两种菌株在所有的剂量组，与空白对照剂组相比，肝脏中HBV-特异性DNA显著减少，当使用NZ2菌株时减少得更多。在两种最低NZ2剂量组中，HBV-特异性DNA的减少显著大于等量D1701剂量组的减少。

附图2说明用D1701或NZ2菌株处理HBV-转基因小鼠在血浆中获得的结果。使用两种菌株在所有的剂量组，与空白对照剂组相比，血浆中HBV-特异性DNA显著减少，当使用NZ2菌株时减少得更多。与最低剂量的NZ2相比，D1701菌株的最低剂量不再具有显著的抗病毒作用。

2. 细胞因子的诱导：7至8周龄的雌性Balb/c小鼠保持在无菌条件下并且用于实验。随机将动物分成组，每组包括6只动物。实施下面的处理方案：

第1组：空白对照剂组

第2组：绵羊副痘病毒菌株D1701；5×10⁴ TCID₅₀/剂量

第3组：绵羊副痘病毒菌株NZ2；5×10⁴ TCID₅₀/剂量

第4组：空白对照剂组

第5组：绵羊副痘病毒菌株D1701；5×10⁴ TCID₅₀/剂量

第6组：绵羊副痘病毒菌株NZ2；5×10⁴ TCID₅₀/剂量

施用体积是10毫升/千克，腹膜内给药。

给药后6小时杀死第1-3组的动物，而给药后12小时杀死第4-6组的动物。使用冰冷却PBS通过清洗获得腹膜细胞，分离门和肠系膜淋巴结。

利用离心步骤(在Eppendorf-台式离心机中在3000rpm和室温条件下离心5分钟)浓缩腹膜细胞，接着溶解于0.2ml溶解缓冲液中(溶解缓冲液：25mM柠檬酸钠，4M异硫代氰酸胍，0.5％N-月桂酰基-肌酐)，速冻并且在-75℃下贮存直到其用于制备RNA。

利用酸性苯酚/氯仿萃取制备全RNA。为此，室温下解冻在溶解缓冲液中冷冻的样品并且用下面的溶液处理萃取：1/10溶解缓冲液体积的2M乙酸钠(pH4.0)，1溶解缓冲液体积的水饱和的苯酚，和1/5溶解缓冲液体积的氯仿/异戊醇(24∶1)。将这些成份在涡流器中混合10秒种，然后在冰上在恒定温度下保持10分钟。在15365g和4℃下离心30分钟分离各相。然后，将含水相转移到新容器中，为了分离该相中存在的RNA，加入来自Rnaid^TM Plus的试剂盒(DIANOVA)的8mlRNA-MATRIX，并在室温下温育15分钟。通过在7000g下离心将得到的RNA/RNA-MATRIX复合物沉积，并且弃除上清液。接着每次用250ml的RNA-WASH(DIANOVA)将沉积物洗涤两次，最后一次洗涤之后，真空离心干燥。通过加入20-30ml的没有RNA的蒸馏水并且全部在55℃下加热15分钟来洗脱RNA。在7000g和室温下离心1分钟之后，通过将RNA溶液转移到新的容器中而分离基质。

利用凝胶电泳检测RNA的质量。在-70℃下贮存RNA。

使用寡(dT)-引物作为聚合作用的起始分子，通过将mRNA逆转录来合成cDNA。合成混合物中存在下面的成份：200ng-2微克的总RNA，2微升M-MLV逆转录酶(200U/微升)(GIBCO/BRL)，8微升的附属的5xRT-缓冲液(GIBCO/BRL)，1微升的DTT(0.1M)(GIBCO/BRL)，4微升的dNTP(2.5mM)(SIGMA)，2微升的寡(dT)_12-18-引物(100微克/ml)(PROMEGA)，1微升的人胎盘RNAse抑制剂(10000U/ml)(GIBCO/BRL)和至40微升总体积的水。将混合物在室温下放置10分钟后在37℃下温育45分钟；然后在95℃下加热3分钟并且立即在冰上冷却。将用这种方法合成的cDNA保存在-20℃下。

使用“管家”基因(β-肌动蛋白)将cDNAs的量标准化。应用ABI PRISM^TM7700序列检测系统(PE Applied Biosystems)进行定量PCR。使用下面的引物：β-肌动蛋白  有义：5′-TGG AAT CCT GTG GCA TCC ATG AAA C-3′

         反义：5′-TAA AAC GCA GCT CAG TAA CAG TCC G-3′IFN-γ       有义：5′-AGC GGC TGA CTG AAC TCA GAT TGT AG-3′

         反义：5′-GTC ACA GTT TTC AGC TGT ATA GGG-3′TNF-α       有义：5′-GGC AGG TCT ACT TTG GAG TCA TTG C-3′

         反义：5′-ACA TTC GAG GCT CCA GTG AAT TCG G-3′IL-15        有义：5′-GCC AAC TGG ATA GAT GTA AGA TAT GAC CT-3′

         反义：5′-CGT GTT GAT GAA CAT TTG GAC AAT GCG

               TAT-3′

在25微升反应体积中扩增DNA(该反应含有1.4mM各dNTP，4mMMgCl₂，0.3微摩尔各引物和探针，2.5微升的含有SYBR Green的10倍PCR缓冲液[所有的PCR试剂来自SYBR Green PCR核心试剂盒；Perkin Elmer/Roche Molecular Systems Inc.]和1.25U Taq DNA聚合酶和0.25U Amp Erase。开始的变性步骤(95℃，10分钟)之后，使样品进行40次变性(95℃，30秒)和淬火/延伸(60℃，1.3分钟)的循环。使用ABI PRISM^TM7700序列测定系统标准软件分析产物。

应用方差分析和post hoc比较对结果进行统计学分析。

出人意料地得到下面的结果：

1.用菌株D1701或者菌株NZ2处理之后，在施用之后6和12小时诱导干扰素γ的表达( 图3)。在菌株NZ2情况下，该诱导显著高于空白对照剂的情况和菌株D1701的情况。施用D1701之后观察到的干扰素γ表达的数值与空白对照剂没有显著区别。该图说明通过腹膜清洗获得的细胞中测定的值。

2.用菌株D1701处理之后，施用之后12小时诱导TNFα的表达，而用菌株NZ2处理之后，施用之后6和12小时诱导其表达(与6小时值相比，12小时之后已经可观察到减少； 图4)。在菌株NZ2的情况下，施用之后6小时诱导比菌株D1701情况观察到的相比高得多。该图说明通过腹膜清洗获得的细胞中测定的值。

3.用菌株D1701或者菌株NZ2处理之后，在施用之后6和12小时诱导IL-5的表达( 图5)。在菌株NZ2情况下，施用之后6小时，该诱导显著高于菌株D1701或空白对照剂的情况。施用D1701之后观察到的IL-5表达的数值与空白对照剂没有显著区别。该图说明通过腹膜清洗获得的细胞中测定的值。

3. 在长有肿瘤的裸鼠中治疗效力的证明

37℃、5％CO₂下，在保温箱中，在完全培养基(885DMEM，10％FBS，1％青霉素/链霉素，1％L-谷氨酰胺(各自都是Gibco LifeTechnologies))中培养MDA-MB231细胞(ATCC#HTB26)。在移植的这一天，细胞大约70％会合。将细胞经胰酶消化，用HBSS洗涤，计数，并且用预先冷却的PBS调节至2.5×10⁷细胞/毫升。使用雌性NCr裸鼠(taconic)。这些小鼠8-10周龄并且约22g重。所有的对动物的操作都在无菌条件下进行。以0.2毫升的总体积对侧肋区皮下注射5×10⁶个细胞。此后，将小鼠再养7天直到肿瘤达到平均质量大约是80毫克。测量肿瘤，并且将小鼠随机分为三个小组，每组10只动物。对每个小组给与下面的物质：

第1组：空白对照剂(PBS)

第2组：绵羊副痘病毒，菌株D1701

第3组：绵羊副痘病毒，菌株NZ2

D1701施用剂量是2.5×10⁵ TCID₅₀，而NZ2施用剂量是1×10⁵TCID₅₀；各种情况下都以三天为间隔各种情况下将这些剂量施加四次。对肿瘤每周测定两次。利用Student’s测试测定统计学意义。

图6说明实验期间(天)在第1-3组的动物中肿瘤的平均大小(毫克)。

(符号：第1组，圈；第2组，三角；第3组，方块)

出人意料地，在实验系统中发现与对照组相比具有统计学意义(p＜0.05)的抗肿瘤活性。发现NZ2菌株就此来说比菌株D1701效力大得多，与D1701相比，为了实现相同效果，需要只有大约一半量的NZ2。

该发现提供了根据本发明的病毒制剂在长有肿瘤的裸鼠中治疗效力的清楚的证明。

裸鼠是免疫缺陷的并且不具有任何功能性T细胞。在实验系统中，假设抗肿瘤活性是由于天然杀伤细胞(NK)，由于其他细胞和由于细胞因子/趋化因子的直接作用。预期在完全和完整的免疫系统情况下NZ2的优越效力将更明确。

4. NZ2和D1701之间的其他生物学差异

已发现与菌株D1701相反，绵羊副痘病毒NZ2在人细胞系上可连续传代。这证明在复制行为和/或病毒受体中NZ2和D1701之间的基本差异。

对于在人细胞系上病毒菌株产生来说，适应人细胞系是一个重要的先决条件。

4.a)在人MRC-5细胞上连续传代的能力。

图7说明使菌株NZ2和D1701适应人二倍体细胞系MRC-5的尝试。MRC-5适合产生生物活性化合物和疫苗。对于这两种菌株使用相同的起始效价，并且相应的细胞培养上清液在MRC-5细胞中连续传代5代。该图说明来自各种情况下感染的以TCID₅₀表示的MRC-5细胞的上清液的样品的效价，对传代次数作图。只有菌株NZ2，而不是D1701对牛肾细胞培养物是有逆向效价的(BK克隆3a)。这表明两种菌株之间在他们的感染和复制行为上存在基本的生物学差异。同时，该结果表明，与D1701相比，NZ2能在更宽范围的细胞中复制，从而带来以人细胞为基础的生产方法的可能性。

4.b)NZ2和D1701对WI-38细胞和BK克隆3a细胞传代的能力

图8和 图9中说明的实验也清楚地证明了NZ2和D1701之间的基本生物学差异。 图8说明对牛BK克隆3a细胞和对人WI-38细胞传代D1701的尝试中获得的病毒效价对传代数作图。可以看到D1701能够在BK克隆3a细胞上传代，但是不能在人WI-38细胞上传代。

这种情况与NZ2菌株不同。该菌株可以在BK克隆3a细胞和在人WI-38细胞上连续传代几天( 图9)。

这些结果还指出NZ2和D1701感染和复制行为中的显著差异。

4.c)在WI-38传代之后在疱疹病毒攻击实验中NZ2的剂量依赖效果

为了研究在WI-38细胞传代的NZ2菌株的免疫刺激性能，对小鼠进行疱疹病毒攻击实验。分别用1×10⁴ TCID₅₀，5×10⁴ TCID₅₀和1×10⁵TCID5₀处理三组动物，每组有10只实验动物，同时给对照组施用空白对照剂。图10说明疱疹病毒感染之后四个实验组随时间的成活率。出人意料地发现，通过在WI-38细胞的传代，NZ2没有丧失其免疫刺激性质。

该实施例中所有的实验结果都指明NZ2和D1701的感染和复制行为的基本生物学差异。出人意料地发现，与D1701的情况相反，NZ2的制剂作为免疫调制剂的用途不局限于牛肾细胞作为生产细胞系。

基于Th1免疫应答对潜伏的和慢性持久的病毒感染^4，5)以及增殖性疾病例如癌症^8，9)的影响的已知的情况，和绵羊副痘病毒菌株NZ2的免疫调制性质优于绵羊副痘病毒菌株D1701的免疫调制性质的事实，以绵羊副痘病毒菌株NZ2或者上述菌株之一为基础的免疫调制剂作为对人和动物单一治疗或者与生物活性例如抗病毒低分子量化合物相结合的用途是可能的，还有可能的是对于乙肝病毒或者丙肝病毒或者来自引起肝炎病毒的组的其他病原体的感染，以及内脏器官的其他病毒感染，还有伴随有其他疾病以及各种类型的单纯疱疹病毒(HSV)，各种类型的人乳头瘤病毒(HPV)，人免疫缺陷病毒(HIV)，水痘-带状疱疹病毒，人巨细胞病毒(HCMV)的感染，和相应的动物病毒疾病的抗病毒治疗的治疗性应用。

此外，在已经证实的作用机理的基础上，可以有效地使用上面提到的绵羊副痘病毒菌株进行下面的预防或治疗处理，特别是：预防与疱疹病毒感染相关的复发，病后调养，即当用暴露之后立即用该方法处理时，预防病毒感染(例如HIV)的形成⁷⁾。在该作用机理的基础上，同样可能治疗癌症^8，9)。

根据临床问题的性质，或者全身使用，即例如肌内，皮下，腹膜内，静脉内或口服，或者还有局部施用以绵羊副痘病毒为基础的治疗药物。与此相关，绵羊副痘病毒或者以纯化的和冻干的状态存在和/或仅在给药之前悬浮于合适的溶剂中，或者以另一种合适的剂型存在或者以胃液抗性给药形式或者另一种口服给药形式存在。

也可以从通过传代和/或适应特定细胞例如WI-38、MRC-5或非洲绿猴肾细胞而获得的NZ2后代，或者其他上述菌株或者NZ2的部分或片段和其他上述菌株或者他们的后代制备合适的制剂。部分理解为指借助合适的载体例如牛痘，在合适的系统例如成纤维细胞培养物中表达的基因组或亚基因组片段。片段理解为是通过物理破碎例如通过超声破碎的颗粒的生物化学纯化，例如利用色谱法，获得的部分。

与此相关，根据符合临床问题要求的顺序方案几次给药，或者长期治疗可能是必需的。

这样，已证明在癌症治疗中，例如(但是不局限于)下面方案的应用特别适合：各种情况下每三天肌内施用10⁶至10⁷ TCID₅₀(组织培养感染剂量)给药四周，接着停药两周；重复各种情况下每三天肌内施用10⁶至10⁷ TCID₅₀给药四周，停药两周；重复各种情况下每三天肌内施用10⁶至10⁷ TCID₅₀给药四周，接着停药两周；根据疾病的严重程度和治疗效果，这些周期可以补充几个周期；或者给药方案可以是每次4-5天给药该制剂至少持续3个月。

例如，在慢性病毒感染情况下，每三天，在腹部皮下或者在三角肌或四头肌肌内给予10⁶至10⁷ TCID₅₀的制剂，一共给药5次。根据疾病的需要，可以与该给药方案有所不同。对于感冒的预防，必须使用该制剂漱口，只要有感染的危险就要每天反复用药。

为了预防口腔区外科手术之后(例如牙科手术)的感染，在手术之前的晚上可用该制剂漱口1-2分钟。

参考文献：

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                 序列表<110>拜尔公司<120>绵羊副痘病毒菌株用于制备抗病毒药物的用途<130>绵羊副痘病毒菌株NZ2<140><141><160>11<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>25<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>β-肌动蛋白引物，反义<400>1taaaacgcag ctcagtaaca gtccg                           25<210>2<211>25<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>β-肌动蛋白引物，有义<400>2tggaatcctg tggcatccat gaaac                           25<210>3<211>26<212>DNA<213>乙肝病毒<220><223>HBV探针，ayw-613t<400>3ccatcatcct gggctttcgg aaaatt                          26<210>4<211>19<212>DNA<213>乙肝病毒<220><223>HBV引物，ayw-670r(反义)<400>4aggagaaacg ggctgaggc                                  19<210>5<211>21<212>DNA<213>乙肝病毒<220><223>HBV引物，ayw-570f(有义)<400>5ctgtaccaaa ccttcggacg g                               21<210>6<211>24<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>γ-IFN引物(反义)<400>6gtcacagttt tcagctgtat aggg                            24<210>7<211>26<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>γ-IFN引物(有义)<400>7agcggctgac tgaactcaga ttgtag                          26<210>8<211>30<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>IL-15引物(反义)<400>8cgtgttgatg aacatttgga caatgcgtat                      30<210>9<211>29<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>IL-15引物(有义)<400>9gccaactgga tagatgtaag atatgacct                       29<210>10<211>25<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>α-TNF引物(反义)<400>10acattcgagg ctccagtgaa ttcgg                           25<210>11<211>25<212>DNA<213>Mus sp.<220><223>α-TNF引物(有义)<400>11ggcaggtcta ctttggagtc attgc                           25

Claims (11)

1.分类学上属于绵羊副痘病毒的NZ2、NZ-7、NZ-10或orf-11菌株用于制备在人和动物中抗病毒感染和肿瘤的药物的用途。

2.根据权利要求1的病毒，通过传代或者适应合适的细胞系例如人细胞，例如WI-38和MRC-5、非洲绿猴肾细胞、牛细胞，例如BK-K13A47/Reg或MDBK，和绵羊细胞，如MDOK得到的后代用于制备在人和动物中抗病毒感染和癌症的药物的用途。

3.根据权利要求1和2的病毒的部分或片段用于制备在人和动物中抗病毒感染和癌症的药物的用途，其中部分理解为是借助合适的载体例如牛痘病毒在合适的系统例如成纤维细胞培养物中表达的基因组或亚基因组片段，片段理解为是通过表达的或物理破碎的病毒颗粒的生物化学纯化例如色谱法获得的部分。

4.根据权利要求1-3的绵羊副痘病毒菌株之一制备作为用于自身免疫疾病和用于呼吸道和内脏器官急性或慢性病毒感染的免疫治疗药物或免疫预防药物的药物和药物制剂的用途。

5.根据权利要求1-3的菌株之一制备用于应激后调养和用于预防或减轻应激后感染性疾病以及在与手术和牙科手术中感染预防有关的药物和药物制剂的用途。

6.根据权利要求1-3的菌株之一制备在急性病毒感染例如呼吸道感染、乳头瘤病毒感染、疱疹病毒感染、HIV感染、或者内脏器官的病毒感染，例如肝炎病毒感染的感染后调养或治疗中，以及用于相关疾病例如多发性硬化、哮喘、疣和其他皮肤新生物的药物和药物制剂的用途。

7.根据权利要求1-3的菌株之一制备在伤口上使用以促进伤口愈合过程，和用于促进愈合不好或者根本没有愈合的伤口和腿溃疡愈合的药物和药物制剂的用途。

8.根据权利要求1-3的菌株之一制备用于各种变应性疾病、牛皮癣、神经性皮炎和其他自身免疫疾病，例如红斑狼疮，以及用于提高例如老年患者健康的药物和药物制剂的用途。

9.根据权利要求1-3的菌株之一制备用于抵抗内脏器官、皮肤、血液、中枢神经系统及其附属器官包括眼的炎症、变性和增殖性疾病(例如节段性回肠炎)，包括癌症的药物和药物制剂的用途。

10.根据权利要求1-3的绵羊副痘病毒菌株之一与其他药物结合制备用于人和动物抗病毒治疗或癌症治疗的药物和药物制剂的用途。

11.根据权利要求1-3的绵羊副痘病毒菌株之一与其他药物结合制备用于口服和/或用于口服的胃液抗性制剂的药物和药物制剂的用途。

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