CN1382211A - 用脱氧核酶治疗炎症性或恶性疾病 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及靶向于编码RelA(p65)(NF－κB的亚基)的mRNA分子的脱氧核酶(DNAzyme)。本发明还涉及包含这些脱氧核酶的组合物和包括给予这些脱氧核酶的治疗方法。

Description

用脱氧核酶治疗炎症性或恶性疾病
发明领域
本发明涉及靶向于编码转录因子NF-κB的亚基的mRNA分子的脱氧核酶(DNAzyme)。本发明还涉及包含这些脱氧核酶的组合物和包括给予这些脱氧核酶的治疗方法。
发明背景
关节炎
最近，关节炎研究大量集中在发现炎症的个别介体的抑制剂，特别是TNFα和IL-1β的抑制剂。这一途径潜在的不当之处是存在大量起炎症介体作用的基因产物，并且炎症介体的任何一种，或甚至几种的抑制可能不足以完全控制类风湿性关节炎(RA)病程。用非甾体抗炎药抑制环加氧酶不能控制关节腐蚀可以说明这种情况。TNFα或IL-1β的抑制比环加氧酶抑制具有更深切的优点，但是，许多炎症介体的抑制可能是完全控制RA所需要的。转录因子与基因启动子区结合以在mRNA合成水平诱导它们的表达，其能够同时控制许多炎症介体。转录因子是大量炎症介体的表达所必需的，所以是RA治疗中适当的靶。
在关节炎中的转录因子NF-κB
可诱导的转录因子NF-κB，通常是p50和RelA(p56)的杂二聚体，在炎症基因表达的调节中特别重要。NF-κB的诱导物包括TNFα、IL-1β、PDGF、氧化应激、病毒产物和细菌细胞壁产物如LPS。依次，NF-κB可以激活细胞因子(TNFα、IL-1β、IL-6、IL-8)、粘附分子(ICAM-1、VCAM-1、E-选择蛋白)和酶(iNOS、COx-2、cPLA2)的转录，活化细胞因子、粘附分子和酶形成炎症过程的主要已知组成部分。NF-κB转录活性极大地受到细胞质中NF-κB被蛋白质族，IκB螯合的控制。在细胞的刺激下，IκB降解，导致NF-κB移位到核中，在核中NF-κB与许多基因的启动子序列，如上面列出的那些结合。因为NF-κB定位于RA中的滑膜细胞的核中(Handel等，1995a)，并且NF-κB的诱导物和靶的列表与RA中的炎症介体的目录非常匹配，人RA中的活化NF-κB的重要作用是很可能的。这得到了动物模型的支持，其中在大鼠中NF-κB诱导(decoy)、IκB阻抑物有效地减少链球菌细胞壁诱导的和降植烷诱导的关节炎(Miagkov等，1998)。
另一种转录因子，AP-1在炎症性关节炎的病理中可能也是重要的。AP-1定位于成纤维细胞样CD14阴性B型滑膜衬细胞核(Handel等，1995a)。AP-1对金属蛋白酶的表达是重要的，特别是对胶原酶和基质溶素，它们很可能是RA中骨和软骨腐蚀的成因(Brinckerhoff，1991)。
应该注意到，虽然NF-κB也存在于成纤维细胞的亚群中，但它主要是在巨噬细胞中发现的。相反，AP-1几乎仅在滑膜衬成纤维细胞中发现(Handel等，1995a；Kinne等，1994)。有人提出存在阶层系统(hierarchy)，由此巨噬细胞(A型滑膜细胞)中的NF-κB活性是邻近成纤维细胞(B型滑膜细胞)中AP-1激活的原因。这一假说的基础起始于观察到TNFα的表达主要限于滑膜衬巨噬细胞(Chu等，1991)，假定这种限制是通过NF-κB的活性发生的。TNFα已经放置于细胞因子的阶层系统的起始，特别是因为TNFα控制滑膜细胞中IL-1β和IL-6表达，反过来却不是。另外，滑膜成纤维细胞的金属蛋白酶表达已经清楚地表明是由TNFα和IL-1β诱导的。正如上面提到的，金属蛋白酶表达是AP-1依赖性的，或者换句话说，成纤维细胞中AP-1依赖性基因的表达是由于细胞因子的作用，细胞因子即TNFα，它在巨噬细胞中是NF-κB依赖性的。巨噬细胞中NF-κB活性是最为重要的假说进一步得到RA中关节腐蚀与滑膜中巨噬细胞的密切相关这一观察的支持。
癌症中的NF-κB和编程性细胞死亡
NF-κB在细胞增殖和编程性细胞死亡的基本过程中起作用。在一些癌症细胞中，化学治疗和放射治疗可以诱导NF-κB活性。NF-κB的激活保护细胞免于编程性细胞死亡，所以导致对这些治疗的抗性。通过反义寡核苷酸或通过NF-κB的抑制剂I-κBa的表达对NF-κB的抑制已经发现引起成人T细胞白血病(Kitajima，1992)和人乳腺癌(Higgins，1993；Cai，1997)肿瘤消退。更近的报道表明，抑制NF-κB在纤维肉瘤模型中通过增加编程性细胞死亡克服对化学治疗的抗性(Wang，1999)。在各种癌症和白血病中，抑制NF-κB将导致消退和/或化学敏感性的假说是合理的。
NF-κB抑制剂
几种现存的药物具有直接或间接抑制NF-κB和/或AP-1的作用。这些药物包括糖皮质激素、视黄醛衍生物类、硫醇金和D-青霉胺。水杨酸以及氯喹和其它氨基喹啉类也对NF-κB具有间接作用。另一种转录因子，NF-AT受环孢菌素和tacrolimus(FK506)的间接抑制。这些药物的名单包括显著比例的有用的抗风湿药，表明转录因子抑制作为治疗风湿性疾病的手段的重要性。参考其对AP-1和NF-κB的作用，分析其作用机制表明NF-κB的选择性抑制剂在治疗类风湿性关节炎方面将是安全而有效的。
糖皮质激素：糖皮质激素抑制炎症的可靠性和有效性意味着它们支持患有RA的多种个体的治疗，并且在危象情况下极为有用。糖皮质激素通过结合细胞内糖皮质激素受体(GR)而起作用，糖皮质激素受体(GR)是转录因子的核受体族的一员。配体激活的GR也可以形成同型二聚体(GR-GR)，以上调节具有GR效应元件(GRE)的基因的表达，或与其它转录因子形成杂二聚体。提高的GRE依赖性基因的表达可能是被称为库欣综合征的糖皮质激素的主要副作用发生的原因，尽管有许多尚未被完全表征的基因参与，以至于难以直接将所有的不希望的代谢作用归因于这种机制。另外，糖皮质激素的这些代谢作用是抗炎作用。在炎症的治疗中使用糖皮质激素时，代谢作用，如肥胖、糖尿病、白内障和骨质疏松症是不希望但不可避免的副作用。
糖皮质激素的抗炎作用很大程度受NF-κB抑制的介导。这得到关于地塞米松对骨关节炎患者关节滑膜的作用的研究的论证。使用电泳迁移率变动分析(EMSA)，在滑膜组织外植块中，DNA与NF-κB的结合由TNFα诱导，并且被地塞米松抑制，清楚地证明糖皮质激素是有效的NF-κB抑制剂(Handel等，1998)。糖皮质激素抑制NF-κB活性有几种机制。配体激活的GR增强IκBα的表达，IκBα是防止NF-κB激活和核移位的抑制剂(Scheinman等，1995；Auphan等，1995)，尽管这一机制似乎不是内皮细胞中糖皮质激素诱导的NF-κB活性退化的原因(Brostjan等，1996)。糖皮质激素抗炎的另一种机制包括GR和RelA(p65)之间杂二聚体的形成，导致糖皮质激素和NF-κB活性之间的相互拮抗作用(Ray和Prefontaine，1994；Caldenhoven等，1995)。有限量的相互重要的转录协同因子，特别是p300和CBP的竞争是GR和促炎转录因子之间的相互拮抗作用的另一种机制(Kamei等，1996)。
金和D-青霉胺：硫醇金和D-青霉胺是硫醇反应性药物。在体外，它们在Jun和Fos的DNA结合域中与半胱氨酸残基的硫醇基团反应，从而抑制AP-1的DNA结合(Handel等，1995b；1996)。侧接于Jun和Fos半胱氨酸残基的带正电的赖氨酸和精氨酸残基促进这些硫醇药物的化学反应，从而加速金-半胱氨酰键和D-青霉胺-半胱氨酸二硫化物的形成。与D-青霉胺的反应是自由基依赖性的，而与金的反应不是。两个反应在炎症的氧化条件下都是有利的。在培养细胞中抑制AP-1介导的转录所需要的硫羟苹果酸金的浓度在低的微摩尔范围。这一浓度范围是药理学相关的，并且低于已报道的用于抑制任何酶的浓度(Shaw，1979)。硫醇金对NF-κB也具有类似的抑制作用(Yang等，1995)。
抗疟氨基喹啉类：氨基喹啉类，包括氯喹和羟基氯喹，是碱性的，它们在溶酶体的酸性环境中积累到非常高的浓度(Poole和Ohkuma，1981)。酸性鞘磷脂酶是在溶酶体中发现的，并且在氨基喹啉治疗后中和的环境中不能起作用，其在核中介导p55-TNFα受体和NF-κB激活之间的信号转导途径的必需步骤(Weigmann等，1994；Schutze等，1995)。所以，NF-κB的抑制可能是抗疟药抗关节炎作用的一部分。
水杨酸、NSAID和花生四烯酸：除了已知的它们对环加氧酶的作用，已经报道水杨酸抑制NF-κB的激活(Kopp和Ghosh，1994)。这一作用所需要的水杨酸浓度非常高，NF-κB抑制的特异性已经成为问题(Frantz和O′Neill，1995)。可能的相关机制是最近观察到的，即花生四烯酸通过稳定IκB直接抗炎，花生四烯酸是许多促炎脂质的前体，IκB是NF-κB抑制剂(Stuhlmeier等，1997)。也可能环加氧酶和脂氧化酶的抑制剂可以增加细胞内的花生四烯酸，在通过NF-κB抑制治疗炎症时，提供第二个优点。
环孢菌素和tacrolimus作用：通过与亲免蛋白复合，环孢菌素(CsA)和tacrolimus(FK506)抑制钙调磷酸酶的活性，从而阻止核因子(NF-AT)的核移位。转录因子NF-AT对于IL-2基因的表达是重要的，尽管在类风湿滑膜中IL-2的相对缺乏表明在RA中CsA的作用可能采用另一种机制。最近已经清楚，钙调磷酸酶也促进IκB的降解，导致淋巴细胞中增加的NF-κB DNA结合和转录活性(Frantz等，1994)。所以，CsA和tacrolimus至少在淋巴细胞中对NF-AT和NF-κB都有抑制作用。
现存药物的概要：简要地说，如它们总的特性，许多药物在治疗类风湿性关节炎中对NF-κB具有抑制作用。在这些药物的副作用都十分不同的基础上，似乎副作用不是它们共同的作用模式介导的，表明NF-κB的选择性药理学抑制将是安全而有效的。
脱氧核酶
在人基因治疗中，反义核酸技术已经是使其表达引起疾病因此是不希望的基因失活所选择的主要工具。反义途径采用与编码不希望的基因的mRNA分子互补，从而杂交的核酸分子。这样的杂交导致基因表达的抑制。
反义技术有一些缺点。反义杂交导致形成DNA/靶mRNA异源双链。该异源双链作为RNAse H介导的靶mRNA成分降解的底物。这里，DNA反义分子的作用方式是被动的，因为它仅仅促进内源RNAseH酶所需的裂解。考虑反义分子与它们的靶mRNA形成稳定的异源双链的化学和能力，这种对RNAse H的依赖性使反义分子的设计受到限制。反义DNA分子也存在与非特异活性和更高浓度时甚至是毒性相关的问题。
作为除反义分子之外的另一个选择，催化性核酸分子已经表现出作为抑制基因表达的治疗剂的前景，在文献中已经有广泛的讨论(Haseloff(1988)；Breaker(1994)；Koizumi(1989)；Otsuka；Kashani-Sabet(1992)；Raillard(1996)；和Carmi(1996))。所以，与常规反义分子不同，催化性核酸分子通过真正裂解其靶mRNA分子而不是仅仅与之结合而起作用。如果靶序列符合某些最低要求，催化性核酸分子能够仅裂解靶核酸序列。靶序列必需与催化性核酸的杂交区互补，而且靶必需在裂解位点含有特异序列。
催化性RNA分子(“核酶”)已经有许多报道(Haseloff(1988)；Symonds(1992)；和Sun(1997))，并且被证实能够裂解RNA(Haseloff(1988)和DNA(Raillard(1996))分子。事实上，体外选择和进化技术的发展已经使使用已知核酶的随机变体或随机RNA序列作为起始点得到针对已知底物的新的核酶成为可能(Pan(1992)；Tsang(1994)；和Breaker(1994))。
但是，核酶在它们试图发挥其作用的细胞内对酶促水解高度敏感。因此，这限制了它们的药学应用。
最近，产生了称为“脱氧核酶”的新的一类催化分子(Breaker和Joyce(1995)；Santoro(1997))。脱氧核酶是单链的，裂解RNA(Breaker(1994)；Santoro(1997))和DNA(Carmi(1996))。已经提出脱氧核酶的一般模型，称为“10-23”模型。依照“10-23”模型的脱氧核酶，也简单地称之为“10-23脱氧核酶”，具有15个脱氧核糖核苷酸的催化域，与两个底物识别域侧接。体外分析表明，这一类型的脱氧核酶在生理条件下有效地在嘌呤：嘧啶接合处裂解其底物RNA(Santoro(1997))。
脱氧核酶表现出作为治疗试剂的前景。但是，脱氧核酶能否成功地抵抗由已知mRNA分子的存在引起的疾病还不可预料。这种不可预测性部分是因为两个因素。首先，某些mRNA二级结构能妨碍脱氧核酶结合和裂解其靶mRNA的能力。第二，表达靶mRNA的细胞对脱氧核酶的吸收可能不足以有效地产生有意义的治疗结果。因为这些原因，没有创造性的劳动，单独依靠仅了解疾病和其成因靶mRNA序列，不能使人合理地预测脱氧核酶针对该靶mRNA的治疗成功。
发明概述
所以，在第一方面，本发明提供特异性裂解RelA(p65)mRNA的脱氧核酶，所述脱氧核酶包括
(i)在嘌呤：嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化域；
(ii)与催化域的5′末端邻接的第一结合域；和
(iii)与催化域的3′末端邻接的第二结合域，
其中结合域与紧密侧接RelA(p65)mRNA的相应于SEQ IDNO：1所示的核苷酸1到1767的区内的嘌呤：嘧啶裂解位点的两个区充分互补，以至于脱氧核酶裂解RelA(p65)mRNA。
在第二方面，本发明提供包含第一方面的脱氧核酶和药学可接受的载体的药物组合物。
在第三方面，本发明提供抑制细胞中NF-κB活性的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶。
在第四方面，本发明提供抑制受试者中NF-κB活性的方法，所述方法包括将第二方面的药物组合物给予受试者。
在第五方面，本发明提供治疗受试者炎症性疾病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
在第六方面，本发明提供治疗受试者动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
在第七方面，本发明提供治疗受试者癌症或白血病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
附图的简要说明
图1：在脂质体，CellFectin(Life Technologies)的存在下，脱氧核酶ND2对NF-κB和AP-1依赖性萤光素酶报道基因的作用。
图2：与其对照ND2c相比，脱氧核酶(Dz)ND2对NF-κB依赖性转录的作用。
本发明的详细说明
本发明提供特异性靶向RelA(p65)mRNA并抑制NF-κB活性的脱氧核酶。
更具体地说，在第一方面，本发明提供特异性裂解RelA(p65)mRNA的脱氧核酶，所述脱氧核酶包括
(i)在嘌呤：嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化域；
(ii)与催化域的5′末端邻接的第一结合域；和
(iii)与催化域的3′末端邻接的第二结合域，
其中结合域与紧密侧接RelA(p65)mRNA的相应于SEQ IDNO：1所示的核苷酸1到1767的区内的嘌呤：嘧啶裂解位点的两个区充分互补，以至于脱氧核酶裂解RelA(p65)mRNA。
在本发明的第一方面的优选的实施方案中，结合域与紧密侧接裂解位点的区完全互补。但是，本领域技术人员认识到，脱氧核酶结合并裂解RelA(p65)mRNA可以不要求严格互补。
如本文所用，“脱氧核酶”指特异性识别并裂解特定靶核酸序列的DNA分子，靶核酸序列可以是DNA或RNA。
本发明的脱氧核酶的催化域可以是任何适当的催化域。适当的催化域的例子如Santoro和Joyce[1997]和美国专利5,807,718所述。在优选的实施方案中，催化域具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO：2)。
在本发明的参数中，结合域长度(本文也称为“臂长度”)可以是任何排列，且可以相同或不同。在优选的实施方案中，结合域长度为至少6个核苷酸，优选两个结合域的总长度为至少14个核苷酸。各种排列如7+7、8+8和9+9是可以设想的。人们已经认识到，结合域越长，其越紧密地结合其互补mRNA序列。因此，在另一个优选的实施方案中，各域的长度是9个或更多个核苷酸。
在优选的实施方案中，裂解位点相应于选自以下的位点：(i)       在核苷酸80-81处的AT位点；(ii)      在核苷酸91-92处的GT位点；(iii)     在核苷酸140-141处的GT位点；(iv)      在核苷酸149-150处的AT位点；(v)       在核苷酸215-216处的AT位点；(vi)      在核苷酸237-238处的AT位点；(vii)     在核苷酸260-261处的AT位点；(viii)    在核苷酸350-351处的GT位点；(ix)      在核苷酸438-439处的GT位点；(x)       在核苷酸479-480处的AT位点；(xi)      在核苷酸525-526处的GT位点；(xii)     在核苷酸572-572处的GT位点；(xiii)    在核苷酸583-584处的AT位点；(xiv)     在核苷酸726-727处的GT位点；(xv)      在核苷酸734-735处的GT位点；(xvi)     在核苷酸749-750处的AT位点；(xvii)    在核苷酸807-808处的AT位点；(xviii)   在核苷酸830-831处的GT位点；(xix)     在核苷酸951-952处的AT位点；(xx)      在核苷酸963-964处的GT位点；(xxi)     在核苷酸1070-1071处的AT位点；(xxii)    在核苷酸1076-1077处的GT位点；(xxiii)   在核苷酸1100-1101处的GT位点；(xxiv)    在核苷酸1125-1126处的AT位点；(xxv)     在核苷酸1175-1176处的AT位点；(xxvi)    在核苷酸1235-1236处的GT位点；(xxvii)   在核苷酸1279-1280处的AT位点；(xxviii)   在核苷酸1307-1308处的GT位点；(xxix)     在核苷酸1313-1314处的GT位点；(xxx)      在核苷酸1387-1388处的GT位点；(xxxi)     在核苷酸1416-1417处的AT位点；(xxxii)    在核苷酸1484-1485处的GT位点；(xxxiii)   在核苷酸1529-1530处的GT位点；(xxxiv)    在核苷酸1553-1554处的AT位点；和(xxxv)     在核苷酸1697-1698处的AT位点。
在特别优选的实施方案中，裂解位点相应于核苷酸91-92处的GT位点。
在另一个实施方案中，脱氧核酶具有选自以下所序列：
5′GTTCGTCCAGGCTAGCTACAACGAGGCCGGGGT 3′(SEQ ID
NO：3)；
5′GAGGGGGAAGGCTAGCTACAACGAAGTTCGTCC 3′(SEQ ID
NO：4)；
5′TGATCTCCAGGCTAGCTACAACGAATAGGGGCC 3′(SEQ ID
NO：5)；
5′GCTGCTCAAGGCTAGCTACAACGAGATCTCCAC 3′(SEQ ID
NO：6)；
5′CGCCTGGGAGGCTAGCTACAACGAGCTGCCCGC 3′(SEQ ID
NO：7)；
5′TTGGTGGTAGGCTAGCTACAACGACTGTGCTCC 3′(SEQ ID
NO：8)；
5′TGATCTTGAGGCTAGCTACAACGAGGTGGGGTG 3′(SEQ ID
NO：9)；
5′CCTTTCCTAGGCTAGCTACAACGAAAGCTCGTG 3′(SEQ ID
NO：10)；
5′TTCTTCACAGGCTAGCTACAACGAACTGGATTC 3′(SEQ ID
NO：11)；
5′TGGTCTGGAGGCTAGCTACAACGAGCGCTGACT 3′(SEQ ID
NO：12)；
5′TAGTCCCCAGGCTAGCTACAACGAGCTGCTCTT 3′(SEQ ID
NO：13)；
5′GGTCCCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCACCTG 3′(SEQ ID
NO：14)；
5′CCTGCCTGAGGCTAGCTACAACGAGGGTCCCGC 3′(SEQ ID
NO：15)；
5′ACCTTGTCAGGCTAGCTACAACGAACAGTAGGA 3′(SEQ ID
NO：16)；
5′CTTTCTGCAGGCTAGCTACAACGACTTGTCACA 3′(SEQ ID
NO：17)；
5′ACACCTCAAGGCTAGCTACAACGAGTCCTCTTT 3′(SEQ ID
NO：18)；
5′CGGTGCACAGGCTAGCTACAACGACAGCTTGCG 3′(SEQ ID
NO：19)；
5′TCCGGAACAGGCTAGCTACAACGAAATGGCCAC 3′(SEQ ID
NO：20)；
5′TCGTCTGTAGGCTAGCTACAACGACTGGCAGGT 3′(SEQ ID
NO：21)；
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NO：22)；
5′GCACAGCAAGGCTAGCTACAACGAGCGTCGAGG 3′(SEQ ID
NO：23)；
5′GGGAAGGCAGGCTAGCTACAACGAAGCAATGCG 3′(SEQ ID
NO：24)；
5′GCTTGGGGAGGCTAGCTACAACGAAGAAGCTGA 3′(SEQ ID
NO：25)；
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NO：26)；
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NO：27)；
5′GGGGCAGGAGGCTAGCTACAACGATTGGGGAGG 3′(SEQ ID
NO：28)；
5′CAGAGCTGAGGCTAGCTACAACGAACCATGGCT 3′(SEQ ID
NO：29)；
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NO：30)；
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NO：31)；
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NO：35)；
5′CCATCAGCAGGCTAGCTACAACGAGGGCTCAGT 3′(SEQ ID
NO：36)；and
5′AGAAGTCCAGGCTAGCTACAACGAGTCCGCAAT 3′(SEQ ID
NO：37)。
在特别优选的实施方案中，脱氧核酶具有序列5′GAGGGGGAAGGCTAGCTACAACGAAGTTCGTCC 3′(SEQ ID NO：4)。
在应用基于脱氧核酶的治疗中，优选脱氧核酶在细胞内环境中的降解尽可能地稳定。实现其的一种手段是在脱氧核酶的一个或多个末端掺入3′-3′倒置。更具体地说，3′-3′倒置(本文也简单地称为“倒置”)指在末端核苷酸的3′碳和相邻核苷酸之间的共价磷酸键。这一类型的键与相邻核苷酸的3′和5′碳之间的正常磷酸键相反，所以，术语称为“倒置”。因此，在优选的实施方案中，在与催化域的3′末端邻接的结合域中，3′末端核苷酸残基倒置。除了倒置，本发明的脱氧核酶可以含有修饰的核苷酸或核苷酸键。修饰的核苷酸包括例如，N3′-P5′氨基磷酸酯键、2′-O-甲基取代和肽核酸键。这些都是本领域公知的。
在第二方面，本发明提供包含第一方面的脱氧核酶和药学可接受的载体的药物组合物。
在本发明的上下文中，给予第二方面的药物组合物可以使用本领域技术人员公知的各种方法和递送系统进行。给药可以例如，通过静脉内、口服、通过植入、经粘膜、经皮、局部、肌肉内、关节内、皮下或体外进行。另外，理想地，本发明的药物组合物含有一种或多种常规使用的药学可接受的载体。这样的载体是本领域技术人员公知的。下面的递送系统采用大量常规使用的载体，其仅仅是设想用于给予本发明的组合物的许多实施方案的代表。
经皮递送系统包括药贴、凝胶、带和乳膏，并且可以含有赋形剂如稳定剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)、亲水聚合物(例如，polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)，以及粘合剂和增稠剂(例如，聚异丁烯、聚硅氧烷基粘合剂、丙烯酸酯和聚丁烯)。
经粘膜递送系统包括药贴、片剂、栓剂、阴道栓、凝胶和乳膏，并且可以含有赋形剂如稳定剂和促进剂(例如，丙二醇、胆盐和氨基酸)，以及其它载体(例如，聚乙二醇、脂肪酸酯和衍生物，以及亲水聚合物如羟丙基甲基纤维素和透明质酸)。
可注射递送系统包括溶液、悬浮液、凝胶、微球和聚合物注射液，并且可以包含赋形剂如改变溶解性的试剂(例如，乙醇、丙二醇和蔗糖)和聚合物(例如，聚己酸内酯类和PLGA类)。可植入系统包括棒和盘，并且可以含有赋形剂如PLGA和聚己酸内酯。
口服递送系统包括片剂和胶囊。它们可以含有赋形剂如粘合剂(例如，羟丙基甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、其它纤维素物质和淀粉)、稀释剂(例如，乳糖和其它糖类、淀粉、磷酸二钙和纤维素物质)，崩解剂(例如，淀粉聚合物和纤维素物质)和润滑剂(如，硬脂酸盐和滑石)。
用于可复水(reconstitutable)递送系统的溶液、悬浮液和散剂包括载体如悬浮剂(例如，树胶类、zanthans、纤维素类(cellulosics)和糖类)、湿润剂(例如，山梨醇)、稳定剂(例如，乙醇、水、PEG和丙二醇)、表面活性剂(例如，十二烷基基硫酸钠、斯盘类、吐温类和十六烷基吡啶)、防腐剂和抗氧化剂(例如，对羟基苯甲酸酯类、维生素E和C，以及抗坏血酸)、抗结块剂、包衣剂，以及螯合剂(例如，EDTA)。
局部递送系统包括，例如凝胶和溶液，并且可以含有赋形剂如稳定剂、渗透促进剂(例如，脂肪酸、脂肪酸酯、脂肪醇和氨基酸)，和亲水聚合物(例如，polycarbophil和聚乙烯吡咯烷酮)。在优选的实施方案中，药学可接受的载体是脂质体或可生物降解的聚合物。可以用于本发明的脂质体的例子包括如下：(1)CellFectin，阳离子脂质N，NI，NII，NIII-四甲基-N，NI，NII，NIII-四棕榈基精胺和二油酰基磷脂酰乙醇胺(DOPE)(GIBCO BRL)的1∶1.5(M/M)脂质体配方；(2)Cytofectin GSV，阳离子脂质和DOPE(Glen Research)的2∶1(M/M)脂质体配方；(3)DOTAP(N-(1-(2，3-二油酰氧基)-N，N，N-三甲基-甲基硫酸铵)(Boehringer Manheim)；和(4)Lipofectamine，聚阳离子脂质DOSPA和中性脂质DOPE(GIBCO BRL)的3∶1(M/M)脂质体配方。
核酸剂的递送也可以通过一种或多种以下载体实现：
(a)脂质体和脂质体-蛋白质缀合物和混合物；
(b)聚合物配方如聚氮丙啶(PEI)；
(c)病毒脂质体复合物，如仙台病毒；
(d)肽核酸缀合物；或
(e)胆固醇-核酸缀合物(其中胆固醇优选缀合于寡核苷酸的5′末端)。
为了治疗关节炎，例如，优选将本发明的脱氧核酶以溶液中或脂质体复合物中裸露的DNA的形式直接注射进炎症关节而给药。哮喘可以优选地通过给予本发明的脱氧核酶的气雾剂而治疗。炎症性血管和肠疾病优选地通过腔内给药而治疗。
在第三方面，本发明提供抑制细胞NF-κB活性的方法，所述方法包括向细胞中引入第一方面的脱氧核酶。
在第四方面，本发明提供抑制受试者NF-κB活性的方法，所述方法包括将第二方面的药物组合物给予受试者。
在第五方面，本发明提供治疗受试者炎症性疾病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
在第五方面的优选的实施方案中，炎症性疾病选自以下：炎症性关节炎、哮喘、炎症性肠疾病、败血症性休克和脉管炎。优选地，炎症性关节炎选自类风湿性关节炎、骨关节炎和血清反应阴性关节炎。
在第六个方面，本发明提供治疗受试者动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
在第七方面，本发明提供在治疗受试者癌症或白血病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的第二方面的药物组合物。
根据动物数据使用常规计算方法可以确定本发明的药物组合物的治疗有效剂量。在一个实施方案中，有效剂量含有约0.1毫克至约1克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约1毫克至约100毫克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约10毫克至约50毫克本发明的脱氧核酶。在另一个实施方案中，有效剂量含有约25毫克本发明的脱氧核酶。单一治疗有效剂量可以以对过更小剂量在一定时间内给药。
在第四到第七方面的一个实施方案中，所述方法在体内进行。在另一个实施方案中，所述方法在体外进行。
在本说明书中，词语“包含”将被理解为指包含所述的元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组，但不排除任何其它元素、整数或步骤，或元素组、整数组或步骤组。
本发明将参照以下试验细节被更好地理解，但本领域技术人员容易理解，它们仅仅是本发明的优选方面的说明。另外，在本申请文件中，引用了各种出版物。这些出版物引入本申请文件作参考，从而更完全地说明本发明所属领域的情况。
实施例1脱氧核酶构建体的设计
命名为ND1和ND2的两个DNA构建体根据10-23催化基序设计(Santoro和Joyce，1997)，催化基序侧接有两个底物识别域，两个底物识别域各有9个脱氧核苷酸。在寡脱氧核苷酸的3-引物末端放置倒置的胸苷。这暴露明显的5-引物末端，从而使构建体抵抗3-引物外切核酸酶活性。
构建体ND1是设计以裂解A80和U81之间的AUG翻译起始位点的RelA(p65)信使RNA。构建体ND2是设计以在3′方向中的下一个AU或GU位点裂解RelA(p65)信使RNA，即，在G91和U92之间的裂解。它们各自的对照，ND1c和ND2c含有随机杂交臂。对照寡核苷酸除了在催化基序5′末端单个碱基的改变之外，还具有共有序列10-23催化基序。在ND1c中，有A到C的变化，这与催化基序的一般目的不一致。在ND2c中，有A到G的变化，这与催化活性一致(Santoro和Joyce，1997)。
构建体显示如下，其中杂交臂加有下划线，倒置胸苷在园括号中(T)，共有序列10-23催化基序是黑体的。ND1   5′ GTTCGTCC AGGCTAGCTACAACGA  GGCCGGGGT  (T)3′(SEQ ID NO：3)ND1c  5′GGTGACGC CGGCTAGCTACAACGA CTGCTGGTG  (T)  3(SEQ ID NO：38)RelA(p65) mRNA，ND1，A80/A81 的靶位点61  5′CGCCCCCGGG  ACCCCGGCCA  UGGACGAACU GUUCCCCCUCAUCUUCCCGG-3′110  (SEQ ID NO：39)ND2   5′ GAGGGGGA AGGCTAGCTACAACGA  AGTTCGTCC  (T)3′(SEQ ID NO：4)ND2c 5′GTAGCATG GGGCTAGCTACAACGA TAGGGCAGC  (T)3′(SEQ ID NO：40)RelA(p65) mRNA，ND2，G91/U92的靶位点61  5′CGCCCCCGGG ACCCCGGCCA U GGACGAACU G UUCCCCCUCAUCUUCCCGG -3′110 (SEQ ID NO：39)
实施例2通过脱氧核酶ND1和ND2进行的合成RNA靶的体外裂解
将寡核苷酸ND1、ND1c、ND2和ND2c与RelA(p65)RNA(61-110)在10mM Mg2+中，在37℃保温指示的时间。RNA在与脱氧核酶一起保温之前用32P末端标记。对ND1和ND2，观察到裂解成期望分子量的单一产物(数据未显示)。而对照寡核苷酸ND1c和ND2c没有裂解。ND2的裂解比ND1更有效。实施例3在脂质体，CellFectin的存在下，脱氧核酶ND2对NF-κB和AP-1依赖性萤光素酶报道基因的作用(Life Technoloqies)
HeLa细胞用质粒转染，所述质粒含有从依赖于6个NF-κB结合位点和3个AP-1位点的人工启动子转录的萤光素酶基因(Promega)。脱氧核酶(Dz)与CellFectin以2.5ug/ml的CellFectin 1μM脱氧核酶的比例复合。将Dz给予HeLa细胞后，用10ng/ml白细胞介素-1β诱导萤光素酶。图1显示ND2引起NF-κB依赖性基因表达的浓度依赖性抑制。被ND2抑制在所有浓度下都显著性地高于对照ND2c和单独的载体。最重要的是，ND2或ND2c对AP-1依赖性基因表达没有抑制，表明与另一可诱导的转录因子相比，ND2对转录因子NF-κB的特异性。
实施例4与其对照ND2c相比，脱氧核酶(Dz)ND2对NF-κB依赖件转录的作用
用ND2/CellFectin、ND2c/CellFectin和单独的CellFectin处理HeLa细胞，并用白细胞介素-1β(IL-1β，10ng/ml)诱导，所述Hela细胞是用NF-κB依赖性萤光素酶报道基因稳定转染的。ND2的存在是NF-κB基因表达的特异性抑制所必需的。在多重试验(multiple experiment)中，可诱导的基因表达约有约40％-60％的抑制(图2)。
实施例5在CellFectin的存在下，脱氧核酶(Dz)对HeLa细胞中NF-κBDNA结合的作用
脱氧核酶ND1和ND2，和对照寡核苷酸ND1c和ND2c与脂质体试剂CellFectin复合，并用于治疗HeLa细胞。NF-κB DNA结合用白细胞介素-1β(IL-1β，10ng/ml)诱导，从细胞制备核萃取物，用NF-κB和AP-1作为探针通过电泳迁移变动分析(EMSA)分析萃取物(数据未显示)。通过抗体超级转变(supershift)和与未标记的特异性探针(未显示)表征指示的带(p50/p65、p50/p50和AP-1)。在NF-κB EMSA中较低的带是非特异的。在这些EMSA中，唯一显著性的作用是IL-1β对p50/p65 NF-κB DNA的诱导和ND2使其回到未诱导状态的抑制。
实施例6选择其它的人RelA裂解脱氧核酶
前面的结果已经显示，对于任何给定的序列，通常只有10-20％靶向于嘌呤-尿嘧啶(RU)位点的脱氧核酶对全长底物有活性。但是，其原因还不明了，有人认为脱氧核酶-底物杂交热动力学和RNA底物折叠(二级结构)中的不同在脱氧核酶催化效力中产生显著变化。尽管对异源双链的最近邻近分析可以预示脱氧核酶结合域杂交热动力学，但预测个别脱氧核酶针对长的折叠RNA底物的活性几乎不可能。确定不同脱氧核酶位点沿靶RNA(如RelA)的RNA裂解活性的最可靠的方法是经验性地将它们都进行测试。这一非常困难、劳动强度大和耗时长的任务常常限制这种类型的分析的范围。因此，已经开发了多重裂解分析，其允许在一次试验中进行一系列浓度的所有候选脱氧核酶的高处理量裂解分析(Cairns等，1999)。
人RelA mRNA序列含有126个RU二核苷酸位点，这些位点可能是可由10-23脱氧核酶裂解的。由于在自然条件下，只有一部分这些位点可能有效地被脱氧核酶裂解，所以，采用多重裂解分析以识别有效的裂解位点。在126个可能的位点中，约30个排除在裂解分析以外，因为它们的序列不能经过计算分析达到最小热动力学标准。这些排除基于两种类型的分析而进行：(1)杂交自由能的最近邻近预测(Sugimoto等，1995)，所有结合域-底物异源双链具有ΔG0＜-10千卡/摩尔的预测值，(2)脱氧核酶寡核苷酸二级结构(由内部或自我互补性引起)，如果它们在预测的解链温度(Tm)＝70℃产生稳定的茎-环或“发夹”折叠，就不使用寡核苷酸。由于另外8个脱氧核酶位点没有包含在分析所用的转录物中，因此它们被排除。
其余的88个脱氧核酶是合成的，分成6个根据在RelA转录物上的位置排列的组。然后，将它们与3个不同浓度的放射标记的转录物一起保温。然后通过对各片段特异性的引物延伸反应分析这一多重裂解反应的产物，以发现活性脱氧核酶分子。然后，使用磷光计(phosphorimager)确定各个脱氧核酶裂解带的等同性和强度。通过这些分析，选择最有活性的脱氧核酶(表1)。
                         表1
         用体外多重裂解分析进行的RelA靶位选择
名称  序列  SEQ IDNO. 活性 位置
DT923  TGATCTCCAGGCTAGCTACAACGAATAGGGGcc  5 *** G140
DT925  GCTGCTCAAGGCTAGCTACAACGAGATCTCCac  6 *** A149
DT927  CGCCTGGGAGGCTAGCTACAACGAGCTGCCCgc  7 *** A215
DT928  TTGGTGGTAGGCTAGCTACAACGACTGTGCTcc  8 *** A237
DT929  TGATCTTGAGGCTAGCTACAACGAGGTGGGGtg  9 **** A260
DT933  CCTTTCCTAGGCTAGCTACAACGAAAGCTCGtg  10 *** G350
DT939  TTCTTCACAGGCTAGCTACAACGAACTGGATtc  11 *** G438
DT941  TGGTCTGGAGGCTAGCTACAACGAGCGCTGAct  12 **** A479
DT942  TAGTCCCCAGGCTAGCTACAACGAGCTGCTCtt  13 **. G525
DT946  GGTCCCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCACCtg  14 *** G572
DT947  CCTGCCTGAGGCTAGCTACAACGAGGGTCCCgc  15 *** A583
DT955  ACCTTGTCAGGCTAGCTACAACGAACAGTAGga  16 *** G726
DT956  CTTTCTGCAGGCTAGCTACAACGACTTGTCAca  17 *** G734
DT957  ACACCTCAAGGCTAGCTACAACGAGTCCTCTtt  18 **** A749
DT959  CGGTGCACAGGCTAGCTACAACGACAGCTTGcg  19 **** A807
DT962  TCCGGAACAGGCTAGCTACAACGAAATGGCCac  20 *** G830
DT971  TCGTCTGTAGGCTAGCTACAACGACTGGCAGgt  21 *** A951
DT973  ATCCGGTGAGGCTAGCTACAACGAGATCGTCtg  22 *** G963
DT981  GCACAGCAAGGCTAGCTACAACGAGCGTCGAgg  23 **** A1070
DT982  GGGAAGGCAGGCTAGCTACAACGAAGCAATGcg  24 **. G1076
DT983  GCTTGGGGAGGCTAGCTACAACGAAGAAGCTga  25 *** G1100
DT984  GTAAAGGGAGGCTAGCTACAACGAAGGGCTGgg  26 *** A1125
DT986  GAAACACCAGGCTAGCTACAACGAGGTGGGAaa  27 *** A1175
DT988  GGGGCAGGAGGCTAGCTACAACGATTGGGGAgg  28 **** G1235
DT991  CAGAGCTGAGGCTAGCTACAACGAACCATGGct  29 *** A1279
DT992  GGACTGGGAGGCTAGCTACAACGAAGGGGCTgg  30 **** G1307
DT993  GGGCTAGGAGGCTAGCTACAACGATGGGACAgg  31 *** G1313
DT994  GGCCTCTGAGGCTAGCTACAACGAAGCGTTCct  32 **. G1387
DT995  TCTTCATCAGGCTAGCTACAACGACAAACTGca  33 **. A1416
DT998  AGTTGTCGAGGCTAGCTACAACGAGGATGCCag  34 *** G1484
DT1001  GGGGGGCCAGGCTAGCTACAACGAAGGTATGcc  35 *** G1529
DT1002  CCATCAGCAGGCTAGCTACAACGAGGGCTCAgt  36 **. A1553
DT1008  AGAAGTCCAGGCTAGCTACAACGAGTCCGCAat  37 *** A1697
*、**、***级别用以指降至500nM、50nM和5nM浓度的脱氧核酶活性。****级别用以表示整个测试浓度范围的活性都非常强。**级别用以表示相对于更高的测试浓度，5nM范围显示非常弱活性的脱氧核酶。**级别和更低级别的脱氧核酶没有在这一表格中列出。结论
上面实施例1到5的结果证明了下面的结论：
(1)脱氧核酶ND1和ND2在期望的位点裂解RNA靶。
(2)ND2比ND1更具潜力，所以作为治疗物质是优选的候选物。
(3)ND2以浓度依赖性方式特异性地抑制NF-κB依赖性转录。ND2不抑制不相关的可诱导转录因子，即AP-1，对照寡核苷酸ND2c不抑制NF-κB依赖性转录。
(4)ND2特异性抑制其DNA效应元件中NF-κB蛋白质二聚体p50/p65的可诱导结合。
(5)脂质体试剂促进细胞培养物中NF-κB依赖性转录的抑制。认识到脂质体的类型将随细胞类型而变化。但是，将会认识到，没有脂质体试剂存在，用脱氧核酶治疗动物或人的关节炎关节也是可能的。
本领域技术人员将会理解，在不被离如广泛描述的本发明的实质或范围的前体下，可以对如特定实施方案所示的本发明做各种改变和/或修饰。所以，本发明的实施方案在所有方面都被认为是说明性的，而非限制性的。
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                                序列表<110>尤尼瑟驰有限公司
 强生研究有限公司<120>用脱氧核酶治疗炎症性或恶性疾病<160>40<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1767<212>DNA<213>Homo sapiens<400>1gaattccggc gaatggctcg tctgtagtgc acgccgcggg cccagctgcg accccggccc 60cgcccccggg accccggcca tggacgaact gttccccctc atcttcccgg cagagccagc 120ccaggcctct ggcccctatg tggagatcat tgagcagccc aagcagcggg gcatgcgctt 180ccgctacaag tgcgaggggc gctccgcggg cagcatccca ggcgagagga gcacagatac 240caccaagacc caccccacca tcaagatcaa tggctacaca ggaccaggga cagtgcgcat 300ctccctggtc accaaggacc ctcctcaccg gcctcacccc cacgagcttg taggaaagga 360ctgccgggat ggcttctatg aggctgagct ctgcccggac cgctgcatcc acagtttcca 420gaacctggga atccagtgtg tgaagaagcg ggacctggag caggctatca gtcagcgcat 480ccagaccaac aacaacccct tccaagttcc tatagaagag cagcgtgggg actacgacct 540gaatgctgtg cggctctgct tccaggtgac agtgcgggac ccatcaggca ggcccctccg 600cctgccgcct gtccttcctc atcccatctt tgacaatcgt gcccccaaca ctgccgagct 660caagatctgc cgagtgaacc gaaactctgg cagctgcctc ggtggggatg agatcttcct 720actgtgtgac aaggtgcaga aagaggacat tgaggtgtat ttcacgggac caggctggga 780ggcccgaggc tccttttcgc aagctgatgt gcaccgacaa gtggccattg tgttccggac 840ccctccctac gcagacccca gcctgcaggc tcctgtgcgt gtctccatgc agctgcggcg 900gccttccgac cgggagctca gtgagcccat ggaattccag tacctgccag atacagacga 960tcgtcaccgg attgaggaga aacgtaaaag gacatatgag accttcaaga gcatcatgaa 1020gaagagtcct ttcagcggac ccaccgaccc ccggcctcca cctcgacgca ttgctgtgcc 1080ttcccgcagc tcagcttctg tccccaagcc agcaccccag ccctatccct ttacgtcatc 1140cctgagcacc atcaactatg atgagtttcc caccatggtg tttccttctg ggcagatcag 1200ccaggcctcg gccttggccc cggcccctcc ccaagtcctg ccccaggctc cagcccctgc 1260ccctgctcca gccatggtat cagctctggc ccaggcccca gcccctgtcc cagtcctagc 1320cccaggccct cctcaggctg tggccccacc tgcccccaag cccacccagg ctggggaagg 1380aacgctgtca gaggccctgc tgcagctgca gtttgatgat gaagacctgg gggccttgct 1440tggcaacagc acagacccag ctgtgttcac agacctggca tccgtcgaca actccgagtt 1500tcagcagctg ctgaaccagg gcatacctgt ggccccccac acaactgagc ccatgctgat 1560ggagtaccct gaggctataa ctcgcctagt gacaggggcc cagaggcccc ccgacccagc 1620tcctgctcca ctgggggccc cggggctccc caatggcctc ctttcaggag atgaagactt 1680ctcctccatt gcggacatgg acttctcagc cctgctgagt cagatcagct cctaaggggg 1740tgacgcctgc cctccccaga gcactgg                                     1767<210>2<211>15<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：催化域<400>2ggctagctac aacga                                                    15<210>3<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>3gttcgtccag gctagctaca acgaggccgg ggt                                33<210>4<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>4gagggggaag gctagctaca acgaagttcg tcc                                33<210>5<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>5tgatctccag gctagctaca acgaataggg gcc                                 33<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>6gctgctcaag gctagctaca acgagatctc cac                                 33<210>7<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>7cgcctgggag gctagctaca acgagctgcc cgc                                 33<210>8<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>8ttggtggtag gctagctaca acgactgtgc tcc                                 33<210>9<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>9tgatcttgag gctagctaca acgaggtggg gtg                              33<210>10<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>10cctttcctag gctagctaca acgaaagctc gtg                              33<210>11<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>11ttcttcacag gctagctaca acgaactgga ttc                              33<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>12tggtctggag gctagctaca acgagcgctg act                              33<210>13<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>13tagtccccag gctagctaca acgagctgct ctt                              33<210>14<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>14ggtcccgcag gctagctaca acgatgtcac ctg                              33<210>15<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>15cctgcctgag gctagctaca acgagggtcc cgc                              33<210>16<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>16accttgtcag gctagctaca acgaacagta gga                              33<210>17<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>17ctttctgcag gctagctaca acgacttgtc aca                              33<210>18<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>18acacctcaag gctagctaca acgagtcctc ttt                              33<210>19<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>19cggtgcacag gctagctaca acgacagctt gcg                              33<210>20<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>20tccggaacag gctagctaca acgaaatggc cac                              33<210>21<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>21tcgtctgtag gctagctaca acgactggca ggt                              33<210>22<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>22atccggtgag gctagctaca acgagatcgt ctg                              33<210>23<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>23gcacagcaag gctagctaca acgagcgtcg agg                              33<210>24<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>24gggaaggcag gctagctaca acgaagcaat gcg                              33<210>25<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>25gcttggggag gctagctaca acgaagaagc tga                              33<210>26<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>26gtaaagggag gctagctaca acgaagggct ggg                              33<210>27<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>27gaaacaccag gctagctaca acgaggtggg aaa                              33<210>28<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>28ggggcaggag gctagctaca acgattgggg agg                              33<210>29<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>29cagagctgag gctagctaca acgaaccatg gct                              33<210>30<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>30ggactgggag gctagctaca acgaaggggc tgg                              33<210>31<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>31gggctaggag gctagctaca acgatgggac agg                              33<210>32<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>32ggcctctgag gctagctaca acgaagcgtt cct                              33<210>33<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>33tcttcatcag gctagctaca acgacaaact gca                              33<210>34<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>34agttgtcgag gctagctaca acgaggatgc cag                             33<210>35<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>35ggggggccag gctagctaca acgaaggtat gcc                             33<210>36<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>36ccatcagcag gctagctaca acgagggctc agt                             33<210>37<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>37agaagtccag gctagctaca acgagtccgc aat                             33<210>38<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>38ggtgacgccg gctagctaca acgactgctg gtg                              33<210>39<211>50<212>RNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>39cgcccccggg accccggcca uggacgaacu guucccccuc aucuucccgg            50<210>40<211>33<212>DNA<213>人工序列<220><223>人工序列的描述：脱氧核酶<400>40gtagcatggg gctagctaca acgatagggc agc                             33

Claims (18)

1.特异性地裂解RelA(p65)mRNA的脱氧核酶，所述脱氧核酶包括
(i)在嘌呤：嘧啶裂解位点裂解mRNA的催化域；
(ii)与催化域的5′末端邻接的第一结合域；和
(iii)与催化域的3′末端邻接的第二结合域，
其中结合域与紧密侧接RelA(p65)mRNA的相应于SEQ IDNO：1所示的核苷酸1到1767的区内的嘌呤：嘧啶裂解位点的两个区充分互补，以至于脱氧核酶裂解RelA(p65)mRNA。
2.如权利要求1所述的脱氧核酶，其中每个结合域的长度是9个或更多个核苷酸。
3.如权利要求1或权利要求2所述的脱氧核酶，其中催化域具有核苷酸序列GGCTAGCTACAACGA(SEQ ID NO：2)。
4.如权利要求1到3中的任一权利要求所述的脱氧核酶，其中裂解位点相应于选自以下的位点：(i)         在核苷酸80-81处的AT位点；(ii)        在核苷酸91-92处的GT位点；(iii)       在核苷酸140-141处的GT位点；(iv)        在核苷酸149-150处的AT位点；(v)         在核苷酸215-216处的AT位点；(vi)        在核苷酸237-238处的AT位点；(vii)       在核苷酸260-261处的AT位点；(viii)      在核苷酸350-351处的GT位点；(ix)        在核苷酸438-439处的GT位点；(x)         在核苷酸479-480处的AT位点；(xi)        在核苷酸525-526处的GT位点；(xii)     在核苷酸572-572处的GT位点；(xiii)    在核苷酸583-584处的AT位点；(xiv)     在核苷酸726-727处的GT位点；(xv)      在核苷酸734-735处的GT位点；(xvi)     在核苷酸749-750处的AT位点；(xvii)    在核苷酸807-808处的AT位点；(xviii)   在核苷酸830-831处的GT位点；(xix)     在核苷酸951-952处的AT位点；(xx)      在核苷酸963-964处的GT位点；(xxi)     在核苷酸1070-1071处的AT位点；(xxii)    在核苷酸1076-1077处的GT位点；(xxiii)   在核苷酸1100-1101处的GT位点；(xxiv)    在核苷酸1125-1126处的AT位点；(xxv)     在核苷酸1175-1176处的AT位点；(xxvi)    在核苷酸1235-1236处的GT位点；(xxvii)   在核苷酸1279-1280处的AT位点；(xxviii)  在核苷酸1307-1308处的GT位点；(xxix)    在核苷酸1313-1314处的GT位点；(xxx)     在核苷酸1387-1388处的GT位点；(xxxi)    在核苷酸1416-1417处的AT位点；(xxxii)   在核苷酸1484-1485处的GT位点；(xxxiii)  在核苷酸1529-1530处的GT位点；(xxxiv)   在核苷酸1553-1554处的AT位点；和(xxxv)    在核苷酸1697-1698处的AT位点。
5.如权利要求4所述的脱氧核酶，其中裂解位点相应于在核苷酸91-92处的GT位点。
6.如权利要求1所述的脱氧核酶，其具有选自以下的序列：
5′GTTCGTCCAGGCTAGCTACAACGAGGCCGGGGT 3′(SEQ
ID NO：3)；
5′GAGGGGGAAGGCTAGCTACAACGAAGTTCGTCC 3′(SEQ
ID NO：4)；
5′TGATCTCCAGGCTAGCTACAACGAATAGGGGCC 3′(SEQ
ID NO：5)；
5′GCTGCTCAAGGCTAGCTACAACGAGATCTCCAC 3′(SEQ
ID NO：6)；
5′CGCCTGGGAGGCTAGCTACAACGAGCTGCCCGC 3′(SEQ
ID NO：7)；
5′TTGGTGGTAGGCTAGCTACAACGACTGTGCTCC 3′(SEQ
ID NO：8)；
5′TGATCTTGAGGCTAGCTACAACGAGGTGGGGTG 3′(SEQ
ID NO：9)；
5′CCTTTCCTAGGCTAGCTACAACGAAAGCTCGTG 3′(SEQ
ID NO：10)；
5′TTCTTCACAGGCTAGCTACAACGAACTGGATTC 3′(SEQ
ID NO：11)；
5′TGGTCTGGAGGCTAGCTACAACGAGCGCTGACT 3′(SEQ
ID NO：12)；
5′TAGTCCCCAGGCTAGCTACAACGAGCTGCTCTT 3′(SEQ
ID NO：13)；
5′GGTCCCGCAGGCTAGCTACAACGATGTCACCTG 3′(SEQ
ID NO：14)；
5′CCTGCCTGAGGCTAGCTACAACGAGGGTCCCGC 3′(SEQ
ID NO：15)；
5′ACCTTGTCAGGCTAGCTACAACGAACAGTAGGA 3′(SEQ
ID NO：16)；
5′CTTTCTGCAGGCTAGCTACAACGACTTGTCACA 3′(SEQ
ID NO：17)；
5′ACACCTCAAGGCTAGCTACAACGAGTCCTCTTT 3′(SEQ
ID NO：18)；
5′CGGTGCACAGGCTAGCTACAACGACAGCTTGCG 3′(SEQ
ID NO：19)；
5′TCCGGAACAGGCTAGCTACAACGAAATGGCCAC 3′(SEQ
ID NO：20)；
5′TCGTCTGTAGGCTAGCTACAACGACTGGCAGGT 3′(SEQ
ID NO：21)；
5′ATCCGGTGAGGCTAGCTACAACGAGATCGTCTG 3′(SEQ
ID NO：22)；
5′GCACAGCAAGGCTAGCTACAACGAGCGTCGAGG 3′(SEQ
ID NO：23)；
5′GGGAAGGCAGGCTAGCTACAACGAAGCAATGCG 3′(SEQ
ID NO：24)；
5′GCTTGGGGAGGCTAGCTACAACGAAGAAGCTGA 3′(SEQ
ID NO：25)；
5′GTAAAGGGAGGCTAGCTACAACGAAGGGCTGGG 3′(SEQ
ID NO：26)；
5′GAAACACCAGGCTAGCTACAACGAGGTGGGAAA 3′(SEQ
ID NO：27)；
5′GGGGCAGGAGGCTAGCTACAACGATTGGGGAGG 3′(SEQ
ID NO：28)；
5′CAGAGCTGAGGCTAGCTACAACGAACCATGGCT 3′(SEQ
ID NO：29)；
5′GGACTGGGAGGCTAGCTACAACGAAGGGGCTGG 3′(SEQ
ID NO：30)；
5′GGGCTAGGAGGCTAGCTACAACGATGGGACAGG 3′(SEQ
ID NO：31)；
5′GGCCTCTGAGGCTAGCTACAACGAAGCGTTCCT 3′(SEQ
ID NO：32)；
5′TCTTCATCAGGCTAGCTACAACGACAAACTGCA 3′(SEQ
ID NO：33)；
5′AGTTGTCGAGGCTAGCTACAACGAGGATGCCAG 3′(SEQ
ID NO：34)；
5′GGGGGGCCAGGCTAGCTACAACGAAGGTATGCC 3′(SEQ
ID NO：35)；
5′CCATCAGCAGGCTAGCTACAACGAGGGCTCAGT 3′(SEQ
ID NO：36)；and
5′AGAAGTCCAGGCTAGCTACAACGAGTCCGCAAT 3′(SEQ
ID NO：37)。
7.如权利要求6所述的脱氧核酶，其具有序列5′GAGGGGGAAGGCTAGCTACAACGAAGTTCGTCC  3′。
8.如权利要求1到7中的任一权利要求所述的脱氧核酶，其中3′末端核苷酸残基在与催化域3′末端邻接的结合域中倒置。
9.包含权利要求1到8中的任一权利要求所述的脱氧核酶和药学可接受的载体的药物组合物。
10.抑制细胞中NF-κB活性的方法，所述方法包括向细胞中引入权利要求1到8中的任一权利要求的脱氧核酶。
11.抑制受试者中NF-κB活性的方法，所述方法包括将权利要求9的药物组合物给予受试者。
12.治疗受试者炎症性疾病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的权利要求9的药物组合物。
13.如权利要求12所述的方法，其中炎症性疾病选自炎症性关节炎、哮喘、炎症性肠病、败血症性休克和脉管炎。
14.如权利要求13所述的方法，其中炎症性关节炎选自类风湿性关节炎、骨关节炎和血清反应阴性关节炎。
15.治疗受试者动脉粥样硬化的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的权利要求9的药物组合物。
16.治疗受试者癌症或白血病的方法，所述方法包括给予受试者治疗有效剂量的权利要求9的药物组合物。
17.如权利要求10到15中的任一权利要求所述的方法，其中所述方法在体内进行。
18.如权利要求10到15中的任一权利要求所述的方法，其中所述方法在内外进行。
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