CN1480211A - 食管癌相关基因nmes1及其编码多肽的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了食管癌相关基因NMES1及其编码蛋白质的用途，以及含有它们的药物组合物。
Description
技术领域
本发明涉及食管癌相关基因NMES1。更具体地说，本发明涉及食管癌相关基因NMES1及其编码多肽在消化道肿瘤预防和/或治疗中的用途，以及包含该基因或蛋白质的药物组合物。
背景技术
食管癌是世界上频发的10种恶性肿瘤之一，每年的新病例数超过300,000。我国是食管癌高发区，世界上70％的食管癌病例发生在我国。由于晚期就诊及治疗效果差，食管癌的死亡率与发病率极为相似，五年生存率低于10％。而要想提高食管癌长期生存率，降低发病率，在很大程度上将依赖于对其病因与癌变分子机理的进一步认识。
引发肿瘤的分子基础是一系列基因的结构改变和/或表达异常。利用分子生物学技术，从分子水平认识疾病的病理根源是发现或提供这些疾病的有效治疗方法的有利途径。由于现有技术中还有大量疾病没有找到有效的治疗方法，包括大部分癌症，因此迫切需要找到与这些疾病的病因相关的基因，特别是那些与这些疾病呈负相关、可能用于这些疾病的治疗的基因。
因此，本领域仍然需要新的消化道肿瘤，尤其是食管癌的治疗方法。
发明内容
本发明出乎意料地发现，食管癌相关基因NMES1及其编码多肽在消化道肿瘤的预防和/或治疗中具有有益效果。
因此，本发明一方面涉及一种消化道肿瘤预防和/或治疗方法，该方法包括对患者施用NMES1基因或其编码多肽。在该方法中，还可以任选地组合施用一种或多种其它化学治疗剂和/或放疗。
本发明另一方面涉及NMES1基因或其编码多肽在制备可用于消化道肿瘤预防和/或治疗的药物中的用途。
本发明还涉及包含NMES1基因或其编码多肽以及药学可接受载体的药物组合物。
在本发明内容中，NMES1基因与NMES1多核苷酸同义，包括：
(1)编码具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列或其同源序列或部分的NMES1多肽的多核苷酸；
(2)在中等严谨条件下能与(1)所述的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和
(3)包含(1)或(2)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
本发明的NMES1多核苷酸包括mRNA、DNA、cDNA和基因组DNA.
本发明的多核苷酸可以RNA或DNA的形式存在，其中DNA包括cDNA、基因组DNA和合成的DNA。DNA可以是双链或者单链的，单链也可以是编码链或者非编码(反义)链。该多核苷酸可以具有与SEQID NO：1所示核苷酸序列相同的序列，或者可以是一个不同的编码序列，但由于遗传密码的冗余或简并性，而编码具有与SEQ ID NO：2所示氨基酸序列相同的氨基酸序列的多肽。
本发明的NMES1多核苷酸可以包括：仅仅是成熟多肽的编码序列；成熟多肽的编码序列和任意的另外编码序列及非编码序列，例如内含子或成熟多肽编码序列的5′端和/或3′端非编码序列。
由此，术语“多肽的编码多核苷酸”包括仅含有该多肽编码序列的多核苷酸，也包括含有额外编码和/或非编码序列的多核苷酸。
本发明的NMES1多核苷酸还包括上面所描述的多核苷酸的各种变体，它们编码含有SEQ ID NO：2所示推定氨基酸序列的多肽的片段、类似物和衍生物。这些多核苷酸变体可以是天然存在的等位基因变体或非天然存在的多核苷酸变体。这些多核苷酸变体包括缺失变体、置换变体，添加变体或插入变体，其中发生了一个或多个核苷酸的取代、缺失，插入或添加式，但基本上并不改变所编码的多肽的功能。
本发明进一步涉及可与上述序列杂交的多核苷酸，这两个序列间有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最优选至少97％的一致性。本发明特别涉及在严格条件下与上述多核苷酸杂交的多核苷酸。这里所用的术语“严格条件”意味着两个序列之间有95％，优选至少97％一致性才能发生杂交。在一优选的实施方案中，与上述多核苷酸杂交的多核苷酸编码的多肽基本保持了与具有SEQ ID NO：2所示序列的多肽相同的生物学功能或活性。
在本发明内容中，NMES1多肽是选自下组的多肽：
(1)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；
(2)包含与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列同源的氨基酸序列的多肽；或
(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、变体，类似物和衍生物，它们具有与(1)或(2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性。
本发明的多肽可以是重组多肽、天然多肽或合成多肽。
具有SEQ ID NO：2所示序列或其同源序列的多肽的片段、变体、衍生物和类似物可以是：一个或多个氨基酸残基被保守或非保守的氨基酸残基所取代(优选保守的氨基酸残基)，取代的氨基酸残基是或不是由遗传密码所编码的氨基酸；一个或多个氨基酸残基带有取代基团；成熟多肽与另一化合物融合在一起；一个或多个另外的氨基酸与成熟多肽相融合，诸如帮助纯化成熟蛋白的序列或蛋白原序列；在一端或两端或内部插入和/或添加和/或缺失一个或多个氨基酸。从这些公开内容看，这样的片段、衍生物和类似物相信处于本领域技术人员的知识范围内。
在一个实施方案中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO：2所示序列至少70％同源的氨基酸序列。在另一个实施方案中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO：2所示序列至少75％同源的氨基酸序列。在又一个实施方案中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO：2所示序列至少80％同源的氨基酸序列。在一个更优选的实施方案中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO：2所示序列至少85％同源的氨基酸序列。在一个进一步优选的实施方案中，本发明所述多肽包含与SEQ ID NO：2所示序列至少90％，至少95％，至少97％同源的氨基酸序列，也包括这些多肽的N和/C端和/或内部缺失变体。
如本领域所知，两个多肽的同源性是通过比较一个多肽与另一多肽的氨基酸序列而确定的。
本发明的NMES1多肽或多核苷酸可以用于预防和/或治疗消化道肿瘤。在一个实施方案中，所述消化道肿瘤是食管癌。在另一个实施方案中，所述消化道肿瘤是直肠癌。在又一个实施方案中，所述消化道肿瘤是结肠癌。在还有一个实施方案中，所述消化道肿瘤是小肠癌。
药物组合物
可将本发明的NMES1多肽或多核苷酸与适当的药用载体联合使用以制成药物组合物，用于治疗动物，特别是哺乳动物(如猿、牛、马、猪、野猪(boar)、绵羊、啮齿动物、山羊、狗、猫、鸡、猴、兔、雪貂、鲸和海豚)，尤其是人。这种组合物含有治疗有效量的NMES1多肽或多核苷酸和药学可接受的载体或赋形剂。所述载体包括但不限于盐水，缓冲盐溶液，葡萄糖，水，甘油，乙醇及其联合。制剂应适合施用的模式。
另外，也可将本发明的NMES1多肽或多核苷酸与其它治疗性的化合物一起使用。
具有NMES1活性的多肽可在药物组合物中与一种或多种药学可接受的赋形剂联合施用。应理解当施用于人患者时，护理医生在正确的医学判断范围内可决定本发明药物组合物每天的总用量。任何具体患者的特定治疗有效剂量水平取决于多种因素，包括欲达到的反应的类型和程度，所用其它药剂的特殊组合(如果有的话)；患者的年龄，体重，健康状况，性别和饮食；施用的时间，施用的途径和组合物外泌的速率；治疗的期限；与特定组合物联合或同时使用的药物(如化学治疗剂)；和医学领域众所周知的其它因素。本领域已知的适当制剂见于Remington’sPharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
考虑到各个患者的临床条件，NMES1组合物释放的位点，施用的方法，施用的计划和实际操作人员已知的其它因素，以与良好的医学实践一致的方式配制和服用治疗所用的NMES1组合物。因此，通过上述考虑可确定用于本文目的的“有效量”的NMES1(包括NMES1有效量)。
可以按方便的方式，例如以口服、局部、静膜内、腹膜内、肌肉内、动脉内、皮下或皮内等途径给药。在大多数情况下，NMES1多肽或多核苷酸的剂量为每天大约1μg/kg体重至30mg/kg体重，并考虑到给药途径、病情等。但剂量可低至0.001μg/kg。
在一个实施方案中，用于肾肠道外给药的NMES1多肽或多核苷酸一般是将其以所需纯度，按可注射单位剂型与医药可接受的(即在所用剂量和浓度下对接受者是无毒的，并且是与配方的其他成分相容的)载体相混合而配制的。例如，配方中最好不含有已知对多肽有害的化合物。
通常通过将NMES1均匀和密切地与液体载体或精细分开的固体载体或这两者接触而制备制剂。然后，如有必要，将产物制成所需的制剂形状。优选载体是胃肠外载体，更优选为与受体血液等渗的溶液。这种载体的例子包括水，盐水，Ringer’s溶液和葡萄糖溶液。如固定油和油酸乙酯之类的不含水的载体以及脂质体在本文中也是有用的。本领域中已知的适当的制剂见于Remington’s Pharmaceutical Sciences(最新版)，Mack出版公司，Easton，PA。
载体可适当地含有极少量的添加剂，如增强等渗性和化学稳定性的物质。这种物质在所用剂量和浓度下对受体是无毒性的，包括如磷酸盐，柠檬酸盐，琥珀酸，乙酸，和其它有机酸或其盐的缓冲液；如抗坏血酸之类的抗氧化剂；低分子量(少于约10个残基)的多肽，如多精氨酸或三肽；蛋白质，如血清白蛋白，明胶，或免疫球蛋白；亲水性的聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮；氨基酸，如甘氨酸，谷氨酸，天冬氨酸，或精氨酸；单糖，二糖和包括纤维素或其衍生物，葡萄糖，甘露糖或糊精等的其它碳水化合物；如EDTA之类的螯合剂；如甘露醇或山梨醇之类的糖醇；如钠之类的抗衡离子；和/或非离子型表面活性剂，如聚山梨酯，聚羟亚烃或PEG。
通常，NMES1可作为含水溶液或用于恢复的冻干制剂形式储存在单位剂量或多剂量的容器中，例如，密闭的安瓿瓶或小瓶中。冻干制剂的一个例子是将5ml经除菌过滤的1％(w/v)含水NMES1溶液灌入10ml的小瓶，将所得混合物冻干。通过使用抑菌的注射用水恢复冻干的NMES1可制备灌注溶液。
“药学可接受的载体”是指无毒性的固体，半固体或液体填充剂，稀释剂，包裹材料或任何形式的制剂辅助物。本文所用的术语“胃肠外”指的是包括静脉内，肌内，腹膜内，胸骨内，皮下和动脉内注射和灌注等的施用模式。
基因治疗
可以体内表达多肽，以所谓“基因治疗”方式利用本发明的NMES1多肽。基因治疗方法涉及将编码NMES1多肽的核酸序列导入动物体内，以实现NMES1多肽的表达。这样的基因治疗和输送技术是已知的(如参见WO90/11092，将其引入本文作为参考)。
因此，例如可在体外用包括可操作连接了启动子的NMES1多核苷酸的多核苷酸(DNA或RNA)工程化改造来自体内的病人细胞，然后为需要用NMES1多肽治疗的病人提供此工程化细胞。这样的方法是本领域已知的(例如参见Belldegrun，A.et al.，J.Natl.Cancer Inst.85：207-216(1993))。
同样，可按已知方法体内工程化改造细胞，以使体内表达治疗性多肽。可用任何一种能将构建体之类物质送递到动物细胞内的方法送递构建体，例如注射到组织的胞间隙中。可将构建体加在已知的药用液体或含水载体中送递。
在某些实施方案中，NMES1多核苷酸可作为裸多核苷酸被送递。“裸”多核苷酸是指不含可帮助、促进或有利于进入细胞的任何送递载体的多核苷酸；包括病毒序列、病毒颗粒、脂质体配方、细胞转染剂、沉淀剂等。这些方法是本领域已知的(如参见美国专利5,593,972、5,589,466和5,580,859)。
用于本发明的裸多核苷酸可以是不整合到宿主细胞的基因组中的多核苷酸。其可以是非复制序列，或工程化改造后失去基因组整合能力的特殊复制序列。或者，用于本发明的裸多核苷酸可以通过同源重组整合到宿主细胞的基因组中(详见下文)。裸NMES1多核苷酸构建体最好包含在质粒中。适用的表达载体包括但不只限于pRSVcat(ATCC 37152)、pSVL和MSG(Pharmacia，Uppsala，Sweden)、pSV2dhfr(ATCC 37146)和pBC12MI(ATCC67109)。其他适用的质粒如上文所述。
如上所述，裸多核苷酸可投用于任何组织或器官。在另一个实施方案中，将裸多核苷酸投用于来源组织的组织周围。在另一个实施方案中，通过静脉内注射将裸多核苷酸全身投用。
可用已知方法送递裸多核苷酸，这些方法包括但不只限于直接在送递位点用针注射、静脉内注射(特别是门静脉注射)、局部投用、导管输注及使用所谓“基因枪”。这些送递方法是本领域已知的并在下文中详细讨论。
本领域普通技术人员可根据待治疗的状况和给药途径很容易地确定多核苷酸构建体的适当和有效剂量。
也可使用病毒序列、病毒颗粒、脂质体配方、脂转染体、沉淀剂等送递载体投用构建体。这此送递方法是本领域已知的。例如，可通过Wuet al.，J.Biol.Chem.264：6985-16987(1989)中所述的方法向靶细胞送递多核苷酸构建体。
在某些实施方案中，于体内或离体方式使用含有RNA的反转录病毒颗粒工程化改造细胞，所说的RNA含有与启动子可操作连接的编码NMES1的多核苷酸。可由之衍生反转录病毒质粒载体的反转录病毒包括但不只限于Moloney鼠白血病病毒、脾坏死病毒、Rous肉瘤病毒、Harvey肉瘤病毒、禽白血病病毒、长臂猿白血病毒、人免疫缺陷病毒、骨髓增殖性肉瘤病毒和乳癌病毒。
用反转录病毒质粒载体转导包装细胞系以形成生产细胞系。可被转染的包装细胞包括但不只限于PE501、PA317、φ-2、φ-AM、PA12、T19-14X、VT-19-17-H2、φCRE、φCRIP、GP+E-86、GP+envAm12和Miller(Haman Gene Therapy 1：5-14，1990)所述的DNA细胞系。载体可通过任何已知方法来转导包装细胞。这些方法包括但不只限于电穿孔、使用脂质体和CaPO4沉淀。另外，亦可将反转录病毒质粒载体包裹到脂质体中，或偶联到脂质上，然后投用于宿主。
生产细胞系产生其中包括对可操作连接了启动子之NMES1多核苷酸的反转录病毒载体颗粒。然后可利用这样的反转录病毒载体颗粒于体外或体内转导真核细胞。被转导的真核细胞将表达所需的多肽。
在某些其他实施方案中，使用包含在腺病毒载体中的与启动子可操作地连接的NMES1多核苷酸于体内或离体工程化改造细胞。可加工腺病毒使之编码并表达所需的基因产物，同时它被失活以失去其在正常裂解的病毒生命周期中复制的能力。在病毒DNA没有整合到宿主细胞染色体内的情况下实现腺病毒表达，从而减少插入突变的机会。
用于本发明的腺病毒最好是复制缺陷型的。复制缺陷型腺病毒需要借助于辅助病毒和/或包装细胞以形成感染性颗粒。所得到的病毒能够感染细胞并可表达可操作地连接到启动子上的有用多核苷酸(例如本发明的NMES1多核苷酸)，但不能在大多数细胞中复制。
在某些其他实施方案中，使用腺伴随病毒(AAV)在体内或离体工程化改造细胞。AAV是天然存在的有缺陷病毒，其需要辅助病毒帮助产生感染性颗粒(Muzyczka，N.，Curr.Topics in Microbiol.Immunol.158：87，1992)。该病毒还是少数几种可将其DNA整合到非分裂细胞中的病毒之一。可以包装并可整合含有少至AAV的300个碱基对的载体，但容纳外源DNA的空间限于约4.5Kb。生产和使用这种AAV的方法是本领域已知的(如参见美国专利5,139,941、5,173,414、5,354,678、5,436,146、5,474,935、5,478,745和5,589,377)。
例如，用于本发明的适当的AAV载体将包括DNA复制、包壳和宿主细胞整合所必须的所有序列。使用标准克隆方法(如参见Sambrook etal.，Molecular Cloring：A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor PreSs，1989)将NMES1多核苷酸构建体插入到AAV载体中。然后使用脂转染、电穿孔、磷酸钙沉淀等标准技术，将重组AAV载体转染到被辅助病毒感染的包装细胞中。适用的辅助病毒包括腺病毒、巨细胞病毒、痘苗病毒或疱疹病毒。一旦包装细胞被转染和感染，它们将产生含有NMES1多核苷酸构建体的感染性AAV病毒颗粒。然后用这些病毒颗粒以离体方式或于体内转导真核细胞。被转导的细胞将含有整合到其基因组中的NMES1多核苷酸构建体，并将表达有用的分子。
基因治疗的另一种方法包括通过同源重组(如参见美国专利No.5,641,670(1997年6月24日)、国际公开WO96/29411(1996年9月26日公开)、国际公开WO94/12650(1994年8月4日公开)、Koller et al.，PNASUSA 86：8932-8935(1989)和Zijlstra et al.，Nature 342：435-438(1989))可操作地连接异源性控制区(如启动子)和内源性多核苷酸序列(如NMES1)。该方法包括激活存在于靶细胞中但不能在其中正常表达或以较预期更低的水平表达的基因。
使用本领域已知的标准方法制备多核苷酸构建体，其含有有用的启动子并且启动子的侧翼接有导向序列。导向序列与内源序列互补程度足以使启动子-导向序列与内源序列进行同源重组。导向序列距所需的内源性核苷酸序列的5′足够地近，以致在同源重组后该启动子能与内源序列可操作连接。
作为裸多核苷酸，或与转染促进剂如上文详述的脂质体、病毒序列、病毒颗粒、完整病毒、脂转染体、沉淀剂联合，将启动子-导向序列构建体送递到细胞内。可用于送递启动子-导向序列的方法包括直接针头注射、静脉内注射、局部投用、导管输注、使用颗粒加速器等。下文详细描述这些方法。
启动子-导向序列构建体被细胞摄入，发生构建体和内源序列之间的同源重组，以使内源序列(如NMES1)处于该启动子的控制之下。然后启动子驱动内源序列(如NMES1)的表达。
可将本发明的NMES1多核苷酸用于基因治疗，以治疗本文所述的消化道肿瘤。最好本发明的NMES1多核苷酸可操作地连接到启动子上，以便缓解本文所述待治疗疾病的症状或治愈疾病。
只要使上述多核苷酸构建体的一个或多个分子以足可提供治疗效果的量表达，其任何给药方式均可使用。所说的给药方式包括直接针头注射、全身注射、导管输注、biolistic喷射器、颗粒加速器(即“基因枪”)、凝胶泡沫海绵存储物、其他市售存储材料、渗透泵(如Alza小型泵)、口服或栓剂固体(片剂或丸剂)药物配方，以及手术期间使用的移注或局部应用法。优选的局部给药方法是直接注射。
可依据许多因素来确定待送递之物质的有效量，这些因素包括物质的化学结构和生物学活性、动物的年龄和体重、需要治疗的确切状况和其严重程度，以及给药途径。治疗的用药频率取决于每剂投用的多核苷酸构建体的量及个体的健康状况及病史等许多因素。由临床医生或兽医来确定精确用量、给药次数及疗程。
本发明的治疗组合物可投用于任何动物，特别是哺乳动物和鸟类。优选的哺乳动物包括人、狗、猫、小鼠、大鼠、兔、绵羊、牛、马和猪，特别是人。
本发明将在下面的实施例中进一步描述。但并不限于这些实施例。所有的份和量，除非另有说明都按重量计算。
为便于理解下面的实施例，先解释一些经常出现的方法和/或术语。
“质粒”的命名用一小写的p，在前面和/或后面接大写的字母和/或数字。起始质粒可从商业获得，也可在不受限制的基础上公开获得，或者按已公布的方法从可获得的质粒构建。另外，所描述质粒的等价质在本领域中已知，对于一般的技术人员来说是很清楚的。
“寡核苷酸”指能化学合成的单链多脱氧核糖核苷酸或两条互补的多脱氧核糖核苷酸链。这些合成的寡核苷酸不含有5’端磷酸，所以如果没有在激酶作用下用ATP加上一个磷酸，它就不能与一个寡核苷酸连接。合成的寡核苷酸将与没有被脱磷酸化的片段连接。
“连接”指在两个双链核酸片段间形成磷酸二酯键的过程。除非提供了别的方法，连接可以在已知的缓冲液和条件下进行，即每0.5mg约等摩尔量的用于连接的DNA片段加10个单位的T4连接酶。
除非另有说明，转化均用Graham & Van der Eb：Virology 1973中所描述的方法进行。
附图说明
图1是显示NMES1在食管癌和正常组织中差异表达的Northern杂交。
图2显示NMES1在16种成人组织中主要在消化系统中表达。
图3是食管癌和正常组织中NMES1的RT-PCR分析结果。
图4是NMES1真核重组表达质粒pcDNA3.1-NMES1的示意图。
图5是pcDNA3.1-NMES1所转化细胞的生长曲线。
图6是转染-NMES1(左图)或空载体pcDNA3.1(右图)的食管癌细胞的形态照片。
图7是经RT-PCR检测pcDNA3.1-NMES1转化克隆中NMES1基因表达状况的结果图，以GAPDH作为阳性对照。
具体实施方式
实施例1：NMES1基因全长的获得及鉴定
用Trizol试剂(Life Technologies，USA)按说明书分别提取手术切除的食管癌标本及切端正常组织标本(病理切片证实无癌细胞)的总RNA，用无RNase活性的DNase消化以去除残留的基因组DNA。1.2％琼脂糖凝胶电泳观察总RNA质量。紫外分光光度仪定量后，应用SmartcDNA Synthesis System试剂盒(Clontech)，以1μg总RNA为模板，按照试剂盒操作手册oligol(dT)引物合成cDNA第一链，应用AdvantagePCR试剂盒(Clontech)以及引物FP1(5′GGTTCAAATGTATTTTTCTCCCAT 3′，SEQ ID NO：3)和RP1(5′TTTGGGCTCTGGATAAGGAAT 3′，SEQ ID NO：4)扩增双链cDNA。以正常组织的cDNA为受检者，癌组织的cDNA为驱动者，应用PCR-SelectTMcDNA Subtraction Kit(Clontech)，进行抑制消减杂交(Suppressionsubtractive hybridization，SSH)，操作按说明书进行。但在第二次选择性扩增时用以5′末端带有SalI识别位点的2R+(5′ttgtcgacagcgtggtcgcggccgaggt3′，SEQ ID NO：5)代替2R oligo。所有PCR产物以限制性内切酶NotI、SalI消化消化产物进行1.2％琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下大于300bp的凝胶条带，以QIAEXII DNA纯化试剂盒回收纯化，操作按试剂盒说明书进行。将纯化物克隆入经NotI、SalI消化的pBluescript SK(-)质粒载体上。每一质粒克隆扩增插入片段，按常规反Northern方法筛选出差异表达片段，并用标准Northern印迹法和半定量RT-PCR法检测配对食管癌组织中此片段的差异表达状况。用SMARTTM RACE system(Clontech)及基因特异性引物15GSP1(5′tgcagttattgctgcactcctttaattc3′，SEQ ID NO：6)15GSP2(5′tgtcgactgtagcagaagcagttccgcac3′，SEQ ID NO：7)扩增相应的5′cDNA末端，PCR产物经琼脂糖电泳分离，紫外光下切下cDNA带，用QiagexII试剂盒回收cDNA，并克隆到pGEM-T Easy(Promega)载体上，测序鉴定。应用end-to-end PCR技术及引物15FULF(5′GTCCAGGTGAGTCTCCCATCT 3′，SEQ ID NO：8)和15FULR(5′TATACCTAATCTTTGAGAAATCTTGCA 3′，SEQ ID NO：9)扩增NMES1基因的cDNA全长并将其克隆到pGEM-T Easy载体上从而获得全长NMES1的cDNA克隆。
实施例2 NMES1基因的Northern印记和RT-PCR分析
以克隆的NMES1 3′端序列为探针，用Primer-a-Gene随机引物标记试剂盒，α-32P-dATP/dCTP对探针进行标记。将食管癌和切断正常组织RNA转移至尼龙膜并固定，用标记的探针与之进行常规Northern杂交，并以β-肌动蛋白作为对照。结果表明，NMES1基因在全部8例正常组织中高表达，而在对应的正常组织中表达缺失或明显降低，说明所克隆的NMES1 cDNA片段确实为差异表达，结果见图1。
用Human Adult Normal Tissue Total RNA Northern BlotI，II(Biochain，Hayward，CA)如上进行杂交，并以β-肌动蛋白作为对照，其中泳道1-16分别是心、脑、肾、肝、肺、胰、脾、肌肉、食管、胃、小肠、结肠、子宫、胎盘、膀胱、脂肪组织。结果显示NMES1在16种成人组织中主要在消化系统中表达，见图2。
按照NMES1 3′端序列合成下列引物：FP2(5‘GGTTCAAATGTATTTTTCTCCCAT3’，SEQ ID NO：10)和RP2(5’TTTGGGCTCTGGATAAGGAAT3，SEQ ID NO：11)，
对8对人配对食管癌和正常组织进行RT-PCR分析并以β-肌动蛋白作为对照。RT-PCR分析结果见图3。图中上边一行代表β-肌动蛋白对照，下边一行代表NMES1。 N代表正常组织，C代表食管癌组织。图3可看出，NMES1基因在正常组织标本中均有表达，而在大多数食管癌标本中表达降低甚至没有。由此推定NMES1是与消化道癌发生相关，且在消化道癌中下调的基因。
实施例3 pcDNA3.1-NMES1真核表达质粒的构建
以正常人第一链cDNA为模板，如下建立PCR反应体系，在50μl体积中含39μl水，5μl 10xAdvantage2 PCR反应缓冲液，1.0μl 50xdNTP混合液，2.0μl正常成人食管cDNA，15EXTF(5′TTTGGATCCATTTGGCAATTCTTCGCT 3′，SEQ ID NO：12)和15EXTR(5′TTTCTCGACAAAGAGGCGAGGGCT 3′，SEQ ID NO：13)引物(10μM)分别1.0μl，1.0μl 50xAdvantage2 PolymeraseMIX，混合后，于9600PCR系统(PE)中进行PCR循环。循环参数为：94℃预变性30秒，94℃变性5秒，58℃退火30秒，72℃延伸1分30秒，共进行30个循环。PCR产物经酚/氯仿抽提，乙醇沉淀，重溶于25μl去离子水中，用BamHI和XhoI酶切，凝胶电泳分离，紫外灯下切下cDNA片段，用QiagexII试剂盒回收cDNA。pcDNA3.1(+)质粒也用上述两种酶消化，如前电泳分离，回收纯化。取50ng纯化物与200ng经消化的pcDNA3.1(+)质粒载体在10μl反应体系中，在T4 DNA连接酶作用下于16℃连接过夜。按常规方法转化，挑出阳性克隆，并进行PCR及酶切鉴定后，送大连宝生物公司测序。从而获得NMES1基因的真核表达质粒pcDNA3.1-NMES1，参见图4。
实施例4 pcDNA3.1-NMES1转染人食管癌细胞系并对其生长的影响
(1)细胞转杂
在25cm2培养瓶中接种食管癌细胞系EC9706，用M199(Gibco)培养液(含15％小牛血清、100u/ml青霉素、0.1mg/ml链霉素)培养。用Lipofectamine(Gibco)进行细胞转染，操作按所附说明书进行。转染48小时后，用含200μg/ml新霉素(G418，Gibco)的上述M199培养液，进行筛选，常规换液至克隆形成，并以空白载体pcDNA 3.1进行转染作为对照。
(2)生长曲线绘制
接种105个转染细胞于24孔板，在选择培养基(含200μg/ml新霉素的M199培养液)中常规培养，每隔一天消化收集细胞，显微镜下计数，由此绘制各克隆细胞的生长曲线。如图5和6所示，与转染空载体pcDNA3.1的细胞对照相比，转染pcDNA3.1-NMES1的食管癌细胞生长速度减慢，且细胞形态发生改变。
(3)经RT-PCR分析转染细胞中NMES1基因的表达
培养克隆细胞至70％至80％铺满，用Trizol试剂提取总RNA，按SuperScript Preamplification System for First Strand cDNA Synthesis试剂说明书进行cDNA第一链合成，然后以NMES1的基因特异性引物15EXTF(5′TTTGGATCCATTTGGCAATTCTTCGCT 3′，SEQ IDNO：12)、15EXTR(5′TTTCTCGACAAAGAGGCGAGGGCT 3′，SEQ IDNO：13)进行RT-PCR分析(条件同前)，检测各阳性克隆中NMES1基因的表达状况。从图7中可看到在转染空载体pcDNA3.1的对照组细胞中无NMES1基因的表达(泳道1)，而在转染pcDNA3.1-NMES1所得阳性克隆中均有NMES1基因的表达(泳道2-9，各编号与图5中的生长曲线序列号一致)。
以上结果说明，NMES1多肽和多核苷酸能够抑制食管癌细胞的生长，并使其形态改变。
上文以例示的方式描述了本发明。但根据上面的讲授，本领域普通技术人员可以对本发明进行各种修改和变异，而仍不脱离本发明的精神和范围，因此这些修改和变异均落入所附权利要求的保护范围内。
序列表<110><120>食管癌相关基因NMES1及其编码多肽<130><140><141><150><151><160>13<170>PatentIn Ver.3.1<210>1<211>135<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>1gtcggttccg ggcgttacca tcgtccgtgc gcaccgcccg gcgtccaggt gagtctccca 60tctgcagaga cgcggacgcg ccggcccgca gttggcctgc ggagcgcggt ggacggtttg 120gcgcccacca ggcgatcaat actttggatt tttaatttct agatttggca attcttcgct 180gaagtcatca tgagcttttt ccaactcctg atgaaaagga aggaactcat tcccttggtg 240gtgttcatga ctgtggcggc gggtggagcc tcatctttcg ctgtgtattc tctttggaaa 300accgatgtga tccttgatcg aaaaaaaaat ccagaacctt gggaaactgt ggaccctact 360gtacctcaaa agcttataac aatcaaccaa caatggaaac ccattgaaga gttgcaaaat 420gtccaaaggg tgaccaaatg acgagccctc gcctctttct tctgaagagt actctataaa 480tctagtggaa acatttctgc aaactagatt ctggacacca gtgtgcggaa atgcttctgc 540tacattttta gggtttgtct acattttttg ggctctggat aaggaattaa aggagtgcag 600caataactgc actgtctaaa agtttgtgct tattttcttg taaatttgaa tattgcatat 660tgaaattttt gtttatgatc tatgaatgtt tttcttaaaa tttacaaagc tttgtaaatt 720agattttctt taataaaatg ccatttgtgc aagatttctc aaagattagg tatatattta 780aatggaagag aaaatatttt tatgggagaa aaatacattt gaaccatgaa atttcatctt 840ttaaataaca tccagtacag atatctgtgt aaaaaaaaaa aaaa 884<210>2<211>135<212>PRT<213>Artificial Sequence<400>2SFFQLLMKR KELIPLVVFM TVAAGGASSF AVYSLWKTDV ILDRKKNPEP WETVDPTVPQ 60KLITINQQWK PIEELQNVQR VTK 83<210>3<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>3ggttcaaatg tatttttctc ccat 24<210>4<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>4tttgggctct ggataaggaa t 21<210>5<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>5ttgtcgacag cgtggtcgcg gccgaggt 28<210>6<211>28<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>6tgcagttatt gctgcactcc tttaattc 28<210>7<211>29<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>7tgtcgactgt agcagaagca gttccgcac 29<210>8<211>21<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>8gtccaggtga gtctcccatc t 21<210>9<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>9tatacctaat ctttgagaaa tcttgca 27<210>10<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>10ggttcaaatg tatttttctc ccat 24<210>11<211>135<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>11tttgggctct ggataaggaa t 21<210>12<211>27<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>12tttggatcca tttggcaatt cttcgct 27<210>13<211>24<212>DNA<213>Artificial Sequence<400>13tttctcgaca aagaggcgag ggct 24
Claims (13)
1.NMES1多肽或多核苷酸在制备可用于预防和/或治疗消化道肿瘤的药物组合物中的用途，其中所述多肽选自下组：
(1)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或
(2)包含与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列的多肽；或
(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、变体，类似物和衍生物，它们具有与(1)或(2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；
所述多核苷酸包括：
(a)编码上述(1)，(2)或(3)所述的NMES1多肽的多核苷酸；
(b)在中等严谨条件下能与(a)所述的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和
(c)包含(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
2.根据权利要求1的用途，其中所述多肽包含与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，还更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少99％同源的氨基酸序列。
3.根据权利要求2的用途，其中所述多肽包含SEQ ID NO：2所述的氨基酸序列。
4.根据权利要求1的用途，其中所述多核苷酸具有与SEQ IDNO：1所示核酸序列至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最优选至少97％一致性的序列。
5.根据权利要求4的用途，其中所述多核苷酸具有SEQ ID NO：1所示核酸序列。
6.根据权利要求1-5任一项的用途，其中所述消化道肿瘤是食管癌，小肠癌，直肠癌或结肠癌。
7.一种药物组合物，其中包含有NMES1多肽或多核苷酸以及药学可接受载体，
其中所述多肽选自下组：
(1)具有SEQ ID NO：2所示氨基酸序列的多肽；或
(2)包含与SEQ ID NO：2所述氨基酸序列至少70％同源的氨基酸序列的多肽；或
(3)(1)或(2)所述多肽的功能活性片段、变体，类似物和衍生物，它们具有与(1)或(2)所述多肽基本相同的生物学功能或活性；和/或
所述多核苷酸包括：
(a)编码上述(1)，(2)或(3)所述的NMES1多肽的多核苷酸；
(b)在中等严谨条件下能与(a)所述的多核苷酸杂交并与其有至少70％一致性的多核苷酸；和
(c)包含(a)或(b)所述多核苷酸的多核苷酸片段。
8.根据权利要求7的药物组合物，其中所述多肽包含与SEQ IDNO：2所述氨基酸序列至少75％，优选地至少80％，更优选地至少85％，还更优选地至少90％，甚至更优选地至少95％，最优选地至少99％同源的氨基酸序列。
9.根据权利要求8的药物组合物，其中所述多肽包含SEQ IDNO：2所述的氨基酸序列。
10.根据权利要求7的药物组合物，其中所述多核苷酸具有与SEQID NO：1所示核酸序列至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，至少85％，至少90％，甚至至少95％，最优选至少97％一致性的序列。
11.根据权利要求7的药物组合物，其中所述多核苷酸具有SEQ IDNO：1所示核酸序列。
12.根据权利要求7-11任一项的药物组合物，其用于预防和/或治疗消化道肿瘤。
13.根据权利要求12的药物组合物，其中所述消化道肿瘤是食管癌，小肠癌，直肠癌或结肠癌。
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1315871C (zh) * | 2005-09-15 | 2007-05-16 | 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 | 一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用 |
-
2002
- 2002-09-02 CN CN 02141991 patent/CN1232303C/zh not_active Expired - Fee Related
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN1315871C (zh) * | 2005-09-15 | 2007-05-16 | 中国医学科学院肿瘤医院肿瘤研究所 | 一种肿瘤相关蛋白及其编码基因与应用 |
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| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN1232303C (zh) | 2005-12-21 |
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